CN104714031A - 一种心肌梗死快速检测试剂盒 - Google Patents

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罗国安
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    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Abstract

本发明公开了一种心肌梗死快速检测试剂盒，该试剂盒包括心肌肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂、心肌肌钙蛋白T(cTnT)检测试剂和心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)检测试剂。本发明三项指标并用，集成在一起制备成试剂盒，方便携带，检测过程简单，通过同时对cTnI、cTnT和H-FABP的快速检测，能在发病1小时内诊断或排除AMI，确定发病的阶段，评估病危程度，具有床边和现场快速应用等优点。能够实现极早期确认或排除AMI、危险度分层，达到全程监测AMI目标。三联检测可使AMI的检测时间窗达到最大，并且具有更高的敏感性和较强的特异性(避免假阳性)。

Description

一种心肌梗死快速检测试剂盒
技术领域
本发明涉及疾病检测制剂技术领域，具体涉及一种心肌梗死快速检测试剂盒。
背景技术
心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死的病症。临床症状有剧烈而较持久的胸骨后疼痛，发热、白细胞增多、红细胞沉降率加快，血清心肌酶活力增高及进行性心电图变化，可发生心律失常、休克或心力衰竭。心肌梗死是属于冠状动脉粥样硬化性的一种心脏病。
急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指因持久而严重的心肌缺血所致的部分心肌急性坏死。目前临床上确诊AMI依靠检测心脏标志物、心电图、影像(超声、磁共振)及临床证据，按全球定义标准执行。诊断AMI检测试剂盒的开发与市场化欠规范，产品陈旧，需要新组合产品。2000年AMI全球定义提出检测cTnI、cTnT、MYO、CK-MB作为诊断AMI的第一标准，2007和2012年欧美和全球AMI指南中cTnI和cTnT做为临床诊断依据，不再提MYO、CK-MB。近年来研究发现心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acidbinding protein，H-FABP)，是极早期确定和排除AMI的重要依据。大量研究和临床资料表明心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是极早期诊断和排除AMI的标志物，补充cTnI较迟出现的不足。欧美急诊中心联合应用，H-FABP和cTnI，对诊断AMI的阳性预测和阴性排除都达到90％以上。
当前国内医院多用单独检测cTnI、cTnT、CK、CKMB或应用Myo、CKMB、cTnI三联。单独指标不能早、中、晚全程判断AMI，CK、CKMB、Myo、cTnT的诊断假阳性高达30-50％。目前市场常用的急性心肌梗死检测试剂盒多采用以Au纳米颗粒结合抗体形成复合物，检出待测标志物。Au纳米颗粒与抗体蛋白之间通过范德华力进行结合，其结合力不牢固，易造成检测灵敏度不稳和下降、产品批内和批间一致性较低，差异达不到小于10％要求。
发明内容
为了满足急性心肌梗死早期、快速、高灵敏检测重大临床应用的需求，进一步提高检测的灵敏度、准确率和时效性，以便在发病早期予以准确诊断，本发明提供了一种心肌梗死快速检测试剂盒。
本发明提供的心肌梗死快速检测试剂盒，包括cTnI检测试剂、cTnT检测试剂和H-FABP检测试剂。
优选地，所述cTnI检测试剂为cTnI捕获抗体，所述cTnT检测试剂为cTnT捕获抗体，所述H-FABP检测试剂为H-FABP捕获抗体。
优选地，该试剂盒还包括阴性对照试剂和阳性对照试剂，两种对照试剂和三种检测试剂均以纸基为载体，所述纸基为亲水性多孔层状材料，各试剂在纸基上的包被位置互不交叉；所述阴性对照试剂为PBS溶液或Tris盐酸溶液，阳性对照试剂为cTnI捕获抗体。
其中，PBS溶液或Tris盐酸溶液均可以购买市售商品或者自行配制，属于现有技术内容，二者的pH值均优选在7.4～8.0的范围。
优选地，所述纸基为硝酸纤维素纸。以CELLULOSE NITRATE STRIPS11306-41BL最佳，该型号的硝酸纤维素纸购自Sartorius Stedim。
优选地，所述PBS溶液的pH值为7.4～8.0，经过包被的纸基位置由10％(w/v)BSA(牛血清白蛋白)溶液封闭。
优选地，该试剂盒还包括经标记物标记的cTnI、cTnT和H-FABP检测抗体混合液(即经标记物标记的cTn I检测抗体、经标记物标记的cTn T检测抗体和经标记物标记的H-FABP检测抗体三者的混合液)；cTnI阳性对照样品、样本洗涤液1和样本洗涤液2；样本洗涤液1为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7.4～7.8；样本洗涤液2为含有0.2％(v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7.4～7.8；当标记物为酶时，该试剂盒还包括该酶的对应反应底物；当标记物为生物素时，该试剂盒还包括对应结合该生物素的亲和素。其中Tween-20为现有常规试剂，可直接购买市售商品。
优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。
另外，本发明的心肌梗死快速检测试剂盒还配有标准曲线测定纸基芯片。标准曲线测定纸基芯片上有多个检测单元。
标准曲线测定纸基芯片，检测浓度范围为0-100ng。每个试剂盒配有标准曲线测定纸基芯片，多个检测单元均包被同一种蛋白捕获抗体。下面以cTn I为例进行说明：
(1)测定标准曲线时，在检测单元的检测区滴加不同浓度的cTn I(或cTnT、H-FABP)蛋白1μL，阴性对照检测单元的检测区滴加1μL PBS溶液，在室温下晾干5min。
(2)将纸基芯片浸入10％(w/v)BSA溶液中进行封闭，30min后取出。
(3)将1μL的cTn I(或cTn T、H-FABP)蛋白检测抗体滴加到检测区，2min后，将芯片放于含有0.05％(v/v)Tween-20的3mLPBS溶液(pH7.4)中，洗涤3min，取出。
(4)取250μL混合化学发光底物于纸基芯片上，2min后吸出。
(5)将纸基芯片放于化学发光检测器(Las4000)中检测，曝光时间10min，得到化学发光图像。
(6)处理得到化学发光图像，用Photoshop软件处理读数，读取检测区的灰度值，计算得到测定cTnI(或cTn T、H-FABP)蛋白的标准曲线。
本发明还提供上述心肌梗死快速检测试剂盒的制备方法，步骤为：
(1)采用一对相互啮合、边缘锋利的金属模具，按照设计尺寸以压印的方式在室温下制作纸基，其中预留的待包被区直径为4～6mm；
(2)在纸基芯片不同的待包被区分别滴加cTnT捕获抗体、cTnI捕获抗体、H-FABP捕获抗体、阴性对照试剂和阳性对照试剂(不同试剂滴加在不同待包被区，也就是检测区)，室温晾干；
(3)晾干后的纸基用10％(w/v)BSA溶液室温封闭30min，润湿状态密封后置于2～8℃环境下保存。
本发明的试剂盒，还有另一种优选的技术方案，即所述cTnI检测试剂为经标记物标记的cTnI检测抗体，所述cTnT检测试剂为经标记物标记的cTnT检测抗体，所述H-FABP检测试剂为经标记物标记的H-FABP检测抗体。
优选地，该试剂盒还包括cTnI阳性对照样品，10％(w/v)BSA溶液和样本洗涤液；所述样本洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7.4～7.8；当标记物为酶时，该试剂盒还包括该酶的对应反应底物；当标记物为生物素时，该试剂盒还包括对应结合该生物素的亲和素。其中所述标记物为辣根过氧化物酶最佳。
本发明具有以下有益效果：
本发明三项指标并用，集成在一起制备成试剂盒，方便携带，检测过程简单，通过同时对心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的快速检测，能在发病1小时内诊断或排除AMI，确定发病的阶段，评估病危程度，具有床边和现场快速应用等优点。实现极早期确认或排除AMI，危险度分层，达到全程监测AMI目标。
相较于现有技术中H-FABP和cTnI的联合使用，本发明的研究发现，cTnT在心肌梗死患者中的增高倍数和持续时间要优于cTnI。H-FABP在心肌损伤后可快速释放入血液，对于心肌梗死发作6小时(尤其3h)内的诊断灵敏度最好；cTn I和cTn T在心肌梗死发生早期诊断灵敏度低，但持续时间优于H-FABP，尤其是cTnT，最长可持续到14天，即患者在发病10天后仍能检测是否患AMI。但cTn T的特异性不如cTn I，骨骼肌的损伤、肾脏疾病会影响cTn T的检测，出现假阳性。三联检测可使AMI的检测时间窗达到最大，并且具有更高的敏感性和较强的特异性(避免假阳性)。
附图说明
图1是双抗体夹心法的纸基芯片示意图。
图2是单抗体夹心法的纸基芯片示意图。
图3是本发明一种纸基芯片的示意图。
图4是纸基芯片Ⅰ在化学发光检测器中曝光后得到化学发光图像(以AMI患者3为例)。
图5是纸基芯片Ⅱ在化学发光检测器中曝光后得到化学发光图像以AMI患者3为例)。
图6是实施例7中纸基芯片I线性测定结果，检测区1为阴性对照，2-5分别为1、10、50、100μg/mL的cTnI标准蛋白。
图7是实施例7中纸基芯片I测定cTnI蛋白的标准曲线。
图8是实施例8中纸基芯片Ⅱ线性测定结果，检测区1为阴性对照，2-5分别为1、10、50、100μg/mL的cTnI标准蛋白。
图9是实施例8中纸基芯片Ⅱ测定cTnI蛋白的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
cTnI捕获抗体、cTnT捕获抗体、H-FABP捕获抗体、cTnI标准品均购自Abcam公司。
10％(w/v)BSA溶液的配制：10g BSA加入100mL PBS溶液中，混匀，4℃保存。
含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液的配制(pH 7.4～7.8)：500μLTween-20加入1000mL PBS溶液中，混匀，4℃保存。
PBS溶液(磷酸盐缓冲液)配方：氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g，调pH7.4～7.8，定容1L。
实施例1：用于检测心肌梗死的三联纸基芯片的制备:(抗体夹心法原理，此三联纸基芯片简称纸基芯片Ⅰ)
具体步骤：
1.制作纸基芯片：硝酸纤维素纸用一对相互啮合、边缘锋利的金属模具，按照设计尺寸以压印的方式在室温下制作成有五瓣花瓣的花朵状纸基芯片。
2.芯片检测区分布如图3所示。cTnI、cTnT和H-FABP检测区分别滴加1μLcTnI、cTnT及H-FABP捕获抗体，阴性对照检测区滴加1μL PBS溶液，阳性对照检测区滴加1μL cTnI捕获抗体，室温晾干。
3.将上述晾干后的纸基芯片用10％(w/v)BSA溶液室温封闭30min。
4.润湿状态密封后，放置于2～8℃冰箱储存待用。
实施例2：心肌梗死快速检测试剂盒
检测试剂盒包括：实施例1制备好的纸基芯片Ⅰ；分别经辣根过氧化物酶标记的cTnI、cTnT和H-FABP检测抗体混合液；阳性对照样品(cTnI标准品)、样本洗涤液1、样本洗涤液2和辣根过氧化物酶底物。
样本洗涤液1为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液(pH 7.4～7.8)；样本洗涤液2为含有0.2％(v/v)Tween-20的PBS溶液(pH 7.4～7.8)。
实施例3：纸基芯片Ⅰ临床实际血清样本的检测
1.血清样本来源：正常和患者血清来自医院检验科。
2.样本检测：使用实施例2的心肌梗死快速检测试剂盒进行检测。纸基芯片Ⅰ的cTnI、cTnT、H-FABP及阴性对照检测区各滴加1μL的血清样本，阳性对照检测区滴加1μL阳性对照样品。2min后，将芯片放于样本洗涤液1中洗掉多余样本，3min/3次。
3.分别滴加1μL的检测抗体混合液到各检测区，静置2min，以形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。随后将纸基芯片Ⅰ放入样本洗涤液2(含0.2％v/vTween-20的PBS溶液)中，3min/3次。
4.混合辣根过氧化物酶的化学发光底物(Miilipore，Immobilon WesternChemiluminescent Substrate for HRP，WBKLS0500)，取250μL于洗涤后纸基芯片Ⅰ上，3min后吸出。
5.将纸基芯片Ⅰ放于化学发光检测器(Las4000)中检测，曝光时间10min，得到化学发光图像，见图4。
6.按上述方法测定3个正常人和3个患者血清，得到化学发光图像用软件处理，得到结果如表1所示。同时，实验结果与市售ELISA试剂盒的检测结果进行了对比。
表1纸基芯片(双抗体夹心法)与ELISA试剂盒的对比
注：ND表示未检测到。
从表1中可以看出，本发明的纸基芯片Ⅰ对正常对照和三种疾病中各3位患者血清的检测结果和与ELISA试剂盒的检测结果基本接近，cTnI和cTnT的表达水平与医院测定的结果趋势一致，相比于医院提供的测定结果(分别于两家不同的医院测定)，纸基芯片和ELISA试剂盒的测定结果可以准确区分急性心肌梗死、急性心肌炎和不稳定心绞痛患者。急性心肌梗死的患者都呈阳性表达；急性心肌炎呈弱阳性表达；不稳定心绞痛患者H-FABP和cTnI表达呈阴性，cTnT表达呈弱阳性。
并且，纸基芯片检测技术相较于ELISA检测技术还具有以下优势：(1)可以大大缩短检测时间，从上样到检测，只需不到25分钟，完成整个检测及图像数据分析总计用时也不到一个小时。而普通ELISA试剂检测所需时间为3个小时左右。(2)减小需要的生物样本(血清或血浆)，该实施例检测样本用量为1μL，而ELISA实验最少用量为20μL，利于某些微量或珍贵样本的测定。并且，对于捕获抗体和酶标检测抗体的昂贵试剂，纸基芯片可以减少用量，约为常规试剂用量的1/20，降低样本测定成本。
实施例4：用于检测心肌梗死的三联纸基芯片的制备(单抗体测定法原理，此三联纸基芯片简称纸基芯片Ⅱ)
具体步骤：
1.制作纸基芯片：将硝酸纤维素纸用一对相互啮合、边缘锋利的金属模具，按照设计尺寸以压印的方式在室温下制作成纸基芯片。
2.纸基芯片用PBS溶液(pH 7.4～7.8，7.7最优)浸湿后密封，放置于2～8℃冰箱储存待用。
实施例5：心肌梗死快速检测试剂盒
该试剂盒包括：实施例4的纸基芯片Ⅱ；辣根过氧化物酶标记的cTnI检测抗体；辣根过氧化物酶标记的cTnT检测抗体；辣根过氧化物酶标记的H-FABP检测抗体；阳性对照样品(cTnI标准品)；封闭液(10％(w/v)BSA溶液)；样本洗涤液和辣根过氧化物酶底物。三种检测抗体单独包装。
实施例6：纸基芯片Ⅱ临床实际血清样本的检测
1.血清样本来源：正常和患者血清来自医院检验科。
2.样本检测：用实施例5的试剂盒进行检测，在纸基芯片Ⅱ的cTnI、cTnT、H-FABP检测区各滴加1μL的血清样本，阳性对照检测区滴加1μL阳性对照样品，阴性对照检测区滴加1μL PBS。室温晾干。
3.将上述晾干后的纸基芯片Ⅱ用10％(w/v)BSA溶液室温封闭30min。
4.分别滴加1μL的检测抗体到对应的蛋白检测区，静置2min，阳性对照和阴性对照检测区均滴加cTnI检测抗体，以形成抗体-抗原-酶标抗体复合物(抗原是我们要检测的，本身在样本中)。随后将纸基芯片放入含0.2％v/v Tween-20的PBS溶液中，3min/3次。
5.混合化学发光底物(辣根过氧化物酶底物，Miilipore，Immobilon WesternChemiluminescent Substrate for HRP，WBKLS0500)，取250μL于洗涤后纸基芯片Ⅱ上，3min后吸出。
6.将纸基芯片Ⅱ放于化学发光检测器(Las4000)中检测，曝光时间10min，得到化学发光图像，见图5。
7.按上述方法测定3个正常人和3个急性心肌梗死患者血清，得到化学发光图像用软件处理，得到结果如表2所示。
表2纸基芯片Ⅱ(单抗体法)的测定结果
从表2中可以看出，改进后的单抗体纸基芯片检测方法(单抗体法)可以达到双抗体夹心法纸基芯片一致的检测精度，除了具有检测时间短、所需体积少等优点外，由于在芯片的制作过程不用捕获抗体，节约了成本，并减少了操作步骤，可减少操作过程中引入的人为误差。
实施例7：纸基芯片I线性测试(以cTnI蛋白为例)
1.按实施例1步骤1制备纸基芯片，除预留阴性对照检测区外，在其余4个检测区均滴加1μL cTnI捕获抗体，阴性对照检测区滴加1μL PBS，在室温下晾干。
2.将上述晾干后的纸基芯片用10％(w/v)BSA溶液室温封闭30min。
3.四个检测区滴加cTnI蛋白标准溶液(1μL)，浓度分别为：1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，静置2min后，将芯片放于含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液(pH 7.4～7.8)中，洗掉多余样本，3min/3次。
4.分别滴加1μL的cTnI检测抗体到各检测区，静置2min，以形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。随后将纸基芯片放入含0.2％v/v Tween-20的PBS溶液中，3min/3次。
5.混合化学发光底物(Miilipore，Immobilon Western ChemiluminescentSubstrate for HRP，WBKLS0500)，取250μL于洗涤后纸基芯片上，3min后吸出。
6.将纸基芯片放于化学发光检测器(Las4000)中检测，曝光时间10min，得到化学发光图像，如图6所示。
将图6化学发光图像用Photoshop软件处理读数，读取检测区的灰度值，计算得到测定cTnI蛋白的标准曲线，如图7所示。标准曲线方程为y＝1.044x+50.77，R2＝0.9992说明该方法线性良好，可以进行定量分析。
实施例8：纸基芯片Ⅱ线性测试(以cTnI蛋白为例)
1.按实施例4制备纸基芯片。
2.除预留阴性对照检测区外，在其余四个检测区滴加cTnI蛋白标准溶液(1μL)，浓度分别为：1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，在室温下晾干。
3.将上述晾干后的纸基芯片Ⅱ用10％(w/v)BSA溶液室温封闭30min。
4.分别滴加1μL的cTnI检测抗体到除阴性对照检测区外的四个检测区，静置2min，阳性对照和阴性对照检测区均滴加cTnI检测抗体，以形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。随后将纸基芯片放入含0.2％v/v Tween-20的PBS溶液中，3min/3次。
5.混合化学发光底物(辣根过氧化物酶底物，Miilipore，Immobilon WesternChemiluminescent Substrate for HRP，WBKLS0500)，取250μL于洗涤后纸基芯片Ⅱ上，3min后吸出。
6.将纸基芯片Ⅱ放于化学发光检测器(Las4000)中检测，曝光时间10min，得到化学发光图像，如图8所示。
将图8化学发光图像用Photoshop软件处理读数，读取检测区的灰度值，计算得到测定cTnI蛋白的标准曲线，如图9所示。标准曲线方程为y＝-0.0104x2+1.5949x+18.397，R2＝0.9973，说明该方法线性良好，可以进行定量分析。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，包括cTnI检测试剂、cTnT检测试剂和H-FABP检测试剂。
2.根据权利要求1所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，所述cTnI检测试剂为cTnI捕获抗体，所述cTnT检测试剂为cTnT捕获抗体，所述H-FABP检测试剂为H-FABP捕获抗体。
3.根据权利要求1或2所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照试剂和阳性对照试剂，两种对照试剂和三种检测试剂均以纸基为载体，所述纸基为亲水性多孔层状材料，各试剂在纸基上的包被位置互不交叉；所述阴性对照试剂为PBS溶液或Tris盐酸溶液，阳性对照试剂为cTnI捕获抗体。
4.根据权利要求3所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，所述纸基为硝酸纤维素纸。
5.根据权利要求3所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，所述PBS溶液的pH值7.4～8.0，经过包被的纸基位置由10％(w/v)BSA溶液封闭。
6.根据权利要求3所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，还包括经标记物标记的cTnI、cTnT和H-FABP检测抗体混合液；cTnI阳性对照样品、样本洗涤液1和样本洗涤液2；样本洗涤液1为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7.4～7.8；样本洗涤液2为含有0.2％(v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7.4～7.8；当标记物为酶时，该试剂盒还包括该酶的对应反应底物；当标记物为生物素时，该试剂盒还包括对应结合该生物素的亲和素。
7.根据权利要求6所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。
8.根据权利要求1所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，所述cTnI检测试剂为经标记物标记的cTnI检测抗体，所述cTnT检测试剂为经标记物标记的cTnT检测抗体，所述H-FABP检测试剂为经标记物标记的H-FABP检测抗体。
9.根据权利要求8所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，还包括cTnI阳性对照样品，10％(w/v)BSA溶液和样本洗涤液；所述样本洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7.4～7.8；当标记物为酶时，该试剂盒还包括该酶的对应反应底物；当标记物为生物素时，该试剂盒还包括对应结合该生物素的亲和素。
10.根据权利要求9所述的心肌梗死快速检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。
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