JP7251982B2 - １ステップ心臓検査デバイス - Google Patents

Description

本発明は、心筋梗塞などの心臓事象の初期段階の間に心臓マーカーを検出するためのイムノアッセイに関する。特に、本発明は、急性心筋梗塞発症後30分もの速さで、2つの血液マーカーの診断的に関連した組合せを検出するためのデバイスを提供する。

米国だけで毎年約百万人が急性心筋梗塞(AMI)に罹っており、そのうちの10%が、その事象の重症度及び治療介入の質によっては1年以内に死亡する場合もある。いずれにしろ、必要に応じて一次経皮的冠動脈インターベンション及び/又は血栓溶解療法を含む医学的支援は、できる限り迅速に提供されるべきである。胸痛発生と再灌流の間の時間を約4時間未満に短縮することは、心筋壊死を低減し、心機能を向上させて、30日死亡率を低下させることにおいて重大な意味をもつことが示された[Ho Y.C.ら、Crit. Care Med. 42 (2014) 1788～96]。AMIの早期診断は重要であるが、虚血性胸痛を示す患者においてAMIを診断するための古典的ECGの感度は、50%にすぎない[The Merck Manual、第17版(1999)、p. 1673]。したがって、血液心臓マーカーは極めて重要である。傷害心筋細胞から血流へ漏出する様々なタンパク質、例えばミオグロビン、又はアスパラギン酸トランスアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、若しくはクレアチンホスホキナーゼのような酵素は、心外傷を評価するのに役立っている。最近では、心筋障害を検出するのに十分特異的であると認められているのは、主にトロポニンである。残念ながら、心筋トロポニンは、AMI事象後2週間まで上昇したままであるにもかかわらず、すぐに出現せず、AMI事象後の数時間後にしか十分測定可能ではないため、正しい診断が最も重要である最初の機会が十分カバーされない。したがって、本発明の1つの目的は、適切な血液マーカーを検出することにより急性心筋梗塞を診断する方法を提供することである。心臓型脂肪酸結合タンパク質(HFBP)はもう1つのAMIマーカーであり、都合の良いことには、そのタンパク質は、AMI事象中、約1時間以内に血液中に出現し、約5時間以内にピークに達することが見出されているが[Tanaka T.ら: Clinical Biochemistry 24 (1991) 195～201; Van Nieuwenhoven F.A.ら: Circulation 92 (1995) 2848～54]、単独マーカーとしてのHFBPの診断精度は、臨床設定において十分ではないことが見出された[Park S.Y.ら: Clin. Neurol. Neurosurg. 115 (2013) 405～10]。本発明のもう1つの目的は、1つより多い血液マーカーを検出することにより急性心筋梗塞を診断する方法を提供することである。

本発明のさらにもう1つの目的は、心筋梗塞の1つより多い血液マーカーを使用する、AMIを診断するためのデバイスを提供することである。

本発明のさらなる目的は、AMI事象後数時間の時間内にAMIを診断するのを助けるデバイスを提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、説明が進むにつれて明らかになるだろう。

Ho Y.C.ら、Crit. Care Med. 42 (2014) 1788～96 The Merck Manual、第17版(1999)、p. 1673 Tanaka T.ら: Clinical Biochemistry 24 (1991) 195～201 Van Nieuwenhoven F.A.ら: Circulation 92 (1995) 2848～54 Park S.Y.ら: Clin. Neurol. Neurosurg. 115 (2013) 405～10

本発明は、ヒト血液試料において急性心筋梗塞(AMI)マーカーを検出するためのデバイスであって、少なくとも心筋トロポニン(CT)及び心臓型脂肪酸結合タンパク質(HFBP)と反応する、少なくとも2つの抗体又は抗体コンジュゲートの混合物を含む、デバイスを提供する。前記マーカーは、好ましくは、CT及びHFBPを含み、前記抗体コンジュゲートは、前記血液試料中に存在する前記マーカーと同時に反応し、それにより、前記マーカーのそれぞれの濃度が、ある特定のあらかじめ決定された閾値より高い場合には、可視シグナルを提供する。抗体又は抗体コンジュゲートは、血液細胞から血漿を分離した後のみ、前記血液マーカーと反応する。血液細胞は最初にプレフィルター上で除去されるため、専門家に知られているように、血液細胞は前記抗体と接触せず、通常、血漿が、抗体又は抗体コンジュゲートへ向かって移動して、マーカー-抗体複合体又はマーカー-抗体コンジュゲート複合体を形成し、その複合体が、それ自体により、又は追加の試薬と反応した後、可視シグナルを提供する。各マーカーについての閾値は、健康な集団におけるその血液中濃度の分布から導かれる。本発明の一実施形態において、前記閾値は、マーカーのそれぞれについての前記分布における95パーセンタイルより高い。本発明の別の実施形態において、前記閾値は、マーカーのそれぞれについての前記分布における99パーセンタイルより高い。本発明の好ましい実施形態において、各マーカーについての前記閾値は、前記マーカーが試料中に単独で存在する場合には、前記抗体又は抗体コンジュゲートとの反応中、可視シグナルを提供しない血液中のマーカーの最大濃度より低い。一実施形態において、本発明によるデバイスにおいて、CTについての前記閾値は0.5ng/mlであり、HFBPについての前記閾値は5ng/mlである。別の実施形態において、CTについての前記閾値は、約1ng/mlであり、HFBPについての前記閾値は約10ng/mlである。一実施形態において、本発明のデバイスは、前記血液試料中のCTの濃度が少なくとも0.5ng/mlであり、同時に、前記血液試料中のHFBPの濃度が少なくとも5ng/mlである場合には、可視シグナルを提供する。他の実施形態において、本発明のデバイスは、前記血液試料中のCT及びHFBPの濃度が、それぞれ、少なくとも1ng/ml及び5ng/mlである場合には、可視シグナルを提供する。さらに他の実施形態において、本発明のデバイスは、前記血液試料中のCT及びHFBPの濃度が、それぞれ、少なくとも1ng/ml及び10ng/mlである場合には、可視シグナルを提供する。前記トロポニンは、トロポニン-C、トロポニン-I、トロポニン-T、前記トロポニンの複合体、又は前記トロポニンの少なくとも2つを含む混合物から選択されるタンパク質を含み得る。好ましくは、トロポニン-I又はトロポニン-Tは、心臓マーカーとして使用される。抗体又は抗体コンジュゲートの前記混合物は、通常、本発明のデバイスにおいて、イムノアッセイストリップに固定化されている。前記ストリップは、イムノアッセイデバイス、例えば、ラテラルフローイムノアッセイキットの一部であり得る。一実施形態において、前記イムノアッセイデバイスはELISAを含む。抗体又は抗体コンジュゲートの前記混合物は、イムノアッセイストリップに1つの狭いバンドとして固定化されており、そのバンドは、抗原、すなわち、前記AMI血液マーカーの存在下で色を変化させるように構成される。したがって、前記可視シグナルは、マーカーの抗体コンジュゲートとの発色反応により引き起こされる、前記バンドの色変化である。本発明の別の態様において、抗体又は抗体コンジュゲートの前記混合物は、前記あらかじめ決定された閾値が異なり、かつ前記マーカーの異なる濃度で可視シグナルを提供する(感度が異なる)、数個の狭いバンドとして前記ストリップに固定化され得る。本発明のデバイスは、有利には、前記血液試料と接触する前又は後のいずれかで相対的な色強度を示す参照バンドを含み得る。比較バンドは、典型的な血液タンパク質(アルブミン、免疫グロブリンなど)と反応する抗体又は抗体コンジュゲートを含み得、その抗体又は抗体コンジュゲートは、前記血液試料と接触して、所望の強度の色シグナルを提供するような様式でコンジュゲートされ、かつそのような量で固定化される。比較バンドは、前記試料を接触させる前にデバイス内に存在する所望の強度の色を含み得、前記試料を接触させた後も安定であり得る。所望の強度の前記色は、血液試料中の関連マーカー濃度により提供される予想される色シグナルに対応し得る。比較バンドのセットは、血液心臓マーカー又はマーカーの組合せにより提供される可視シグナルを比較バンドのセットと比較した時、血液試料において心臓マーカーの濃度を評価することを可能にする。

本発明の好ましい実施形態において、CTとHFBPの両方に対して同時に特異的な1つ以上の抗体混合物を含む、AMI事象を検出するためのデバイスが提供され、その抗体又は抗体コンジュゲートは、イムノアッセイストリップに1個又は数個の狭いバンドとして固定化されており、少なくとも1つの血液試料における心臓マーカーCT及びHFBPと反応して、前記マーカーのそれぞれの濃度がある特定のあらかじめ決定された閾値より高い場合には、可視シグナルを提供し、前記ストリップは、前記血液試料と接触する前又は後のいずれかで相対的な色強度を示す参照バンドをさらに含み、前記数個の狭いバンドが、任意で、前記血液試料中の前記マーカーと異なる感度で反応して、異なるマーカー濃度で前記可視シグナルを提供する。本発明のデバイスは、前記シグナルの強度を前記比較強度と比較すること、又は2つの異なるマーカー濃度に対応する2つのシグナルを比較することに基づいた、前記試料におけるCT及び/又はHFBP濃度の評価を提供する。本発明の一態様において、前記試料におけるCT及び/又はHFBP濃度の評価は、試料採取からAMI事象までに経過した時間の評価を提供する。本発明によるデバイスの一例において、前記あらかじめ決定された閾値は、前記数個の狭いバンドの1個に関して、CTについて0.5ng/ml、及びHFBPについて10ng/mlであり、陽性シグナルは、AMI事象が、前記試料のドナーにおいて少なくとも1時間前に起きたことを示す。本発明によるデバイスの別の例において、前記あらかじめ決定された閾値は、前記数個の狭いバンドの1個に関して、CTについて1ng/ml、及びHFBPについて20ng/mlであり、陽性シグナルは、AMI事象が、前記試料のドナーにおいて少なくとも3時間前に起きたことを示す。本発明によるデバイスの他の例において、前記あらかじめ決定された閾値は、前記数個の狭いバンドの1個に関して、CTについて4ng/ml、及びHFBPについて80ng/mlであり、陽性シグナルは、AMI事象が、前記試料のドナーにおいて少なくとも9時間前に起きたことを示す。数個の「よく調整された」バンドの組み合わされたシグナルは、より正確な評価を可能にする。例えば、本発明によるデバイスは、CTについて0.5ng/mlの閾値及びHFBPについて10ng/mlの閾値を有するバンド、並びにCTについて1ng/mlの閾値及びHFBPについて20ng/mlの閾値を有する別のバンドを含み得、前者のバンドにおける陽性シグナルに加えた後者のバンドにおける陰性シグナルは、AMI事象が、前記試料のドナーにおいて約3時間前～約6時間前の時点で起きたことを示す。

本発明は、心臓事象、特にAMIを診断する方法であって、そのような事象を疑われる対象、例えば、虚血性胸痛を患う対象の血液試料を採取するステップ、並びに少なくともCT及びHFBPと反応する少なくとも2つの抗体又は抗体コンジュゲートの混合物を含むイムノアッセイデバイス上にその試料をアプライするステップを含む方法を提供する。本発明の別の態様において、少なくとも2つの試料が、2つの異なる時点で採取され、前記2つの試料でCT及び/又はHFBPを濃度評価することが、AMI事象の時点を評価することにおける精度を向上させる。

本発明者らは、抗体又は抗体コンジュゲートの混合物を使用することによる2つの心臓血液マーカーの同時検出が、例えば、虚血性胸痛又は他の症状の場合における心臓事象の早期確認を目的とする以前の方法の弱点を除去し得ることを見出した。本発明は、心臓事象、特に、急性心筋梗塞(AMI)を疑われる対象における、その事象から数時間の最も重大な時間内の迅速な診断評価を可能にする、1ステップ心臓検査デバイスを提供する。一態様において、本発明は、それぞれが1つの心臓マーカーに対して特異的である2つの抗体又は抗体コンジュゲートの混合物を含む定性的ラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイであって、心臓事象の初期段階に特徴的な低濃度の両方のマーカーの同時検出を目的とし、さらに、ある特定の閾値レベルを超える、両方のマーカーにより提供される組み合わされたイムノアッセイシグナルが、その事象を示す、定性的ラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイを提供する。本発明の好ましい実施形態において、マーカーの1つが心筋トロポニン(CT)であり、他方が心臓型脂肪酸結合タンパク質(HFBP)である。一実施形態において、HFBPは、発症の後約30分で検出され、その時点でのそのレベルが約5ng/mlであるが(健康な集団の95%における基底レベルは0.5～3.5の範囲内である)、トロポニン-Iは、症状の約3時間後に検出可能になり、その時、そのレベルは1ng/mlより上である。例えば、臨床結果は、2つのマーカーの相加効果を示し、それぞれ単独では特定の濃度(通常、トロポニンについて1ng/ml、及びHFBPについて5ng/ml)未満で検出不可能であったが、その同じ濃度でそれらの両方を一緒にすると、真の陽性結果が得られた。一例において、0.14ng/mlトロポニンも4.92ng/ml FABPも検出不可能であったが、4.92ng/ml HFBPと共に0.14ng/mlトロポニンを含有する試料は検出可能になった。

本発明の記載において「抗体」と述べられる場合、その言及は、抗体、加えて、抗体誘導体又は抗体コンジュゲートを指し、関連する側面は、抗原、すなわち、心臓マーカーと反応するその作用物質の能力である。本発明によるデバイス又は方法における抗体の混合物は、1つのマーカーに対する1つより多い抗体を含み得る。その混合物は、マーカーの数個の型に対する、例えば、数個の型のトロポニンに対する、又は同じマーカー上の数個のエピトープに対する抗体を含み得る。当然ながら、本発明によるデバイス及び方法は、抗体-抗原の複合体の別の抗体又は抗体コンジュゲートとの反応などの、当技術分野において知られた反応を使用し、その目的は、必要に応じた強い可視シグナルである。本発明の一実施形態において、例えば、デバイスは、CTとの反応のための2つの抗体、及びHFBPとの反応のための1つの抗体、並びにさらに、CT複合体と反応するための2つの抗体コンジュゲート、及びHFBP複合体と反応するための1つの抗体コンジュゲートを含む。

一態様において、アッセイは、診断される対象の全血の試料におけるHFBP及びトロポニンIの定性的決定を目的とし、前記マーカーは、通常、別々に調べられる場合、心筋障害後、それぞれ、1時間以内及び4時間以内に血液中で検出可能であり、本実施がHFBPのみの検出に頼っていないことは留意されるべきである。

HFBP及びトロポニンIを別々に検出するための手段が記載されているが、本発明は、2つの別々の反応を組み合わせて、1つの表示シグナルを生じる1つの効果にする。本発明の重要な態様において、2つの心臓マーカーに対して特異的な抗体又は抗体コンジュゲートの混合物を含むデバイスは、心筋トロポニンI及び/又はHFBPの組み合わされた最小レベルを同時に検出する。本発明の一実施形態において、前記最小レベルは、別々に測定される場合、ほとんど検出不可能であり得る。有利なことには、本発明のデバイスは、数分で、例えば、10～15分で、結果を提供する。非常に重要なことには、その結果は、心臓事象から最も重大な最初の数時間以内、例えば、4時間以内、例えば、3時間以内又は2時間以内に得られ得る。対象における疑われる心臓事象後のHFBP及びCTのいずれか1つのレベルの増加を検出することにおける陽性結果は、緊急事態を示し、対象を病院へ向かわせることは事実である。両方のマーカーを組み合わせて単一のラインにするという新規な態度は、すぐに使用可能な結果の解釈を簡単にする。さらに、2つの心臓マーカーについての共通検査ラインは、検査の感度を向上させ、その検査において、抗HFBP及び抗トロポニンIなどのより多くの抗体又は抗体コンジュゲートの複合体が、同じバンドの強度に寄与する。この累積効果のおかげで、別々の抗体又は抗体コンジュゲートを含む2つの別々のバンドにおいてより、抗体混合物を含む1つのバンドにおいて低いマーカー量が検出可能である。しかしながら、新しいデバイス及び方法の主要な利点は、AMI事象から1～4時間の間の重大な時間における、シグナル組合せの平均化効果であり、これは迅速かつ信頼できる結果をほぼオンラインで提供する。

本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、例証される。

CT、HFBP、又はヒト血清アルブミンとの色反応を提供する抗体コンジュゲート、特に抗トロポニンI、抗HFBP、及び抗HSAを得た。抗体コンジュゲートを、抗体コンジュゲートを固定化するように構成されたキャピラリーベッドのストリップ上の狭いバンドにおける固定化に使用した。そのストリップを、ラテラルフローイムノアッセイデバイス(LFID)を調製するのに使用した。一連のコンジュゲート量/濃度(バンドにおける発色試薬の異なる総量に対応する、コンジュゲート固定化のためにストリップ上にアプライされるある特定の濃度の体積)を固定化することにより、及び異なる抗原濃度を含有する一連の試料とバンドを反応させることにより、所望のシグナル強度のために必要とされる試薬量を、全ての抗原について決定した。以下の閾値量/濃度を決定した:試料中の1ng/mlトロポニンIを検出するための抗トロポニンIの量、及び試料中の5ng/ml HFBPを検出するための抗FABP-3の量、その閾値量は、知覚できない色シグナルを提供する最大量に対応する。3ng/mlトロポニン-I又は15mg/ml HFBPのいずれかを含む試料は、同じ条件下で、かなり明らかな色バンドを提供した。抗HASを、強いシグナル(トロポニンバンドに関して3ng/mlトロポニン-Iより約10倍強い)を提供し、LFIDが主として機能する対照として役立つような量で使用した。抗体コンジュゲートの混合物を、前記閾値量の抗トロポニンI及び前記閾値量のFABP-3を混合することにより調製した。

9個のLFIDを調製し、全部が対照HASバンドを含み、3個が1ng/mlトロポニン-Iを検出するための閾値量を含み、3個が5ng/ml HFBPを検出するための閾値量を含み、3個が、抗トロポニン-Iと抗HFBPの両方の前記閾値量を含む混合された抗体コンジュゲートを有するバンドを含んでいた。健康なドナー由来のヒト血液の試料(非常に低レベルの心臓マーカー)を3つの部分に分けた:トロポニン-Iを、第1部分に1ng/mlの濃度まで添加し、HFBPを、第2部分に5ng/mlの濃度まで添加し、第3部分において、両方のマーカーを、それぞれ、1及び5ng/mlの濃度で添加した。各部分を、関連抗体を含むLFID上にアプライした。表1に示されているように、デバイスにおいて、知覚できるシグナルが出現したか(+)又は出現しなかった(-)。

表は、デバイス(3連)により提供された、一貫した結果を示している。2つのマーカーそれぞれの1及び5ng/mlの濃度は、心臓事象のごく初期段階に対応する。表は、本発明によるデバイスが、AMIを早期に診断することに寄与する関連情報を提供し得ることを示している。

この発明は、いくつかの具体的な例に関して記載されているが、多くの改変及びバリエーションが可能である。したがって、添付された特許請求の範囲の範囲内で、本発明が、具体的に記載されている以外に実現され得ることは、理解される。

Claims (10)

1. ヒト血液試料において急性心筋梗塞（ＡＭＩ）マーカーを検出するためのイムノアッセイデバイスであって、少なくとも心筋トロポニン（ＣＴ）及び心臓型脂肪酸結合タンパク質（ＨＦＢＰ）と反応する、少なくとも２つの抗体又は抗体コンジュゲートの混合物を含み、
   抗体又は抗体コンジュゲートの前記混合物がイムノアッセイストリップにおいて、ＣＴ及びＨＦＢＰの両方と反応する１個のバンド中に固定化され、
   ＣＴについての閾値濃度が少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌであり、ＨＦＢＰについての閾値濃度が少なくとも５ｎｇ／ｍｌである、
   デバイス。
2. 前記ヒト血液試料中のＣＴ及びＨＦＢＰの濃度が、それぞれ少なくとも１ｎｇ／ｍｌ及び５ｎｇ／ｍｌである場合には、前記抗体又は抗体コンジュゲートが可視シグナルを提供する、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記ヒト血液試料中のＣＴ及びＨＦＢＰの濃度が、それぞれ、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌである場合には、前記抗体又は抗体コンジュゲートが可視シグナルを提供する、請求項１に記載のデバイス。
4. 前記心筋トロポニンが、トロポニン－Ｃ、トロポニン－Ｉ、トロポニン－Ｔ、前記心筋トロポニンの複合体、及び前記心筋トロポニンの少なくとも２つを含む混合物からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１に記載のデバイス。
5. 前記イムノアッセイストリップが、ラテラルフローイムノアッセイキットの一部である、請求項１に記載のデバイス。
6. 前記可視シグナルが前記バンドの色変化である、請求項２又は３に記載のデバイス。
7. 前記ヒト血液試料と接触する前又は後のいずれかで相対的な色強度を示す参照バンドをさらに含む、請求項５又は６に記載のデバイス。
8. ＣＴとＨＦＢＰの両方に対して同時に特異的な抗体又は抗体コンジュゲートの１つ以上の混合物を含み、抗体又は抗体コンジュゲートが、イムノアッセイストリップに１個のバンドとして固定化されており、少なくとも１つのヒト血液試料における前記ＡＭＩマーカーと反応して、前記ＡＭＩマーカーのそれぞれの濃度が前記閾値濃度より高い場合には、可視シグナルを提供し、前記イムノアッセイストリップが、前記ヒト血液試料と接触する前又は後のいずれかで相対的な色強度を示す参照バンドをさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
9. 前記可視シグナルの強度を前記相対的な色強度と比較することに基づいた、前記ヒト血液試料におけるＣＴ及び／又はＨＦＢＰ濃度の評価を提供する、請求項８に記載のデバイス。
10. ヒト血液試料において急性心筋梗塞（ＡＭＩ）マーカーを検出するためのイムノアッセイデバイスであって、少なくとも心筋トロポニン（ＣＴ）及び心臓型脂肪酸結合タンパク質（ＨＦＢＰ）のマーカーと反応する、少なくとも２つの抗体又は抗体コンジュゲートの混合物を含み、
    前記ＡＭＩマーカーが、前記ヒト血液試料中の前記ＡＭＩマーカーのそれぞれの濃度が、ある特定のあらかじめ決定された閾値より高い場合には、可視シグナルを提供し、
    抗体又は抗体コンジュゲートの前記混合物がイムノアッセイストリップに複数個のバンドとして固定化されており、
    前記バンドが、前記あらかじめ決定された閾値において異なり、かつ前記ＡＭＩマーカーの異なる濃度で前記可視シグナルを提供し（感度が異なる）、
    ＣＴについての前記閾値が少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌであり、ＨＦＢＰについての前記閾値が少なくとも５ｎｇ／ｍｌである、
    デバイス。