JP2628421B2 - 診断試験用キットおよびこれを用いる方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、患者の胸痛が心臓性(c
ardic)の原因によるか評価し、さらに患者の胸痛の初期
兆候において不安定狭心症（アンギナ）と心筋梗塞
（「ＭＩ」）とを識別するための正確、簡単、迅速、か
つ携帯可能な診断方法として用いられる、パネル形態の
新規な一段診断試験に関する。特に、パネル試験は、酵
素免疫サンドイッチ乾燥化学フォーマット(enzyme immu
noassay sandwich dry chemistry format)を用いて、羅
患中あるいは羅患痕の血清または血漿中に見出される３
種のマーカーの血清または血漿レベルを同時に評価す
る。本発明の具体例としては、マーカーをクレアチンキ
ナーゼ（ＣＫ）、ミオグロビンおよびミオシンＬ鎖（Ｍ
ＬＣ）としている。 【０００２】 【従来の技術】心筋梗塞の早期診断は、医師の診断能力
と、患者の症状、例えば、腕から頸に広がることもある
胸痛や胸部圧迫感、疲労感、死の恐怖、息切れ、蒼白、
冷感、抹消チアノーゼまたは細脈(rapid thready puls
e) のような患者の症状とに頼っている。 【０００３】北米では胸痛を感じた患者のほとんどが、
胸痛の発症後６時間内に医師または緊急病院に出向いて
いる。それ故、ＭＩの初期段階において効果的な診断を
行なうことが重要である。各種の心試験(cardiac test)
がＭＩの診断に用いられている。これらの試験として
は、ＥＣＧ、ＳＧＯＴ／ＡＳＴ、ＬＤＨ、ＣＫ−ＭＢ免
疫検定、ＮＡラテックス ミオグロビン粒子強化検定(L
atex Myoglobin Particle Enhanced Assay)が挙げられ
る。しかし、救急班の医師が心臓由来の胸痛か否かを特
定することができる単一の酵素心試験(enzyme cardiac
test) は存在しない。また、心筋梗塞が確認されはじめ
て血栓阻止治療を開始することができる。治療の開始が
早ければ早いほど、患者の全快の可能性が高く、少なく
とも心筋障害を最小に止めることができる。このため
に、医師にとって胸痛が心臓由来か否かを特定すること
が重要である。 【０００４】ＭＩの診断に心電図（ＥＣＧ）を用いるこ
とができる。しかしＥＣＧでは、心臓が著しい障害を受
けるまで診断ができない。胸痛の初期段階におけるＥＣ
Ｇの診断特定率は僅か51％にすぎない。したがって、Ｅ
ＣＧはＭＩの初期診断には不適当である。血清グルタミ
ンオキサルトランスアミナーゼ／アスパラギン酸トラン
スフェラーゼ（ＳＧＯＴ／ＡＳＴ）は心筋中に高濃度で
見出される特徴的な酵素である。ＳＧＯＴのレベルを測
定する血清試験を心筋梗塞の診断に用いることができ
る。しかし、ＳＧＯＴのレベルは、胸痛の発症から８〜
10時間後にはじめて上昇し始め、24〜36時間で最高値と
なり、５〜７日後に平常値に戻る。胸痛の初期段階の緊
急時においては、心筋梗塞の診断にＳＧＯＴはあまり有
用でない。また、ＳＧＯＴは心筋に特異的でない。ＳＧ
ＯＴは骨格筋や肝臓、腎臓などの多くの組織に存在し、
筋肉注射やショックにより放出され、肝臓疾患や肝性う
っ血の羅患中にも放出される。このため、特定の心臓組
織の損傷の診断には有用性が少ない。 【０００５】乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は心臓や骨格
筋、肝臓などの多くの組織中に高濃度で見出される酵素
である。血清中のＬＤＨの存在を検出する試験は心筋梗
塞の診断に用いられている。ＬＤＨには５つのコモンイ
ソタイプがあり、心臓には主としてＬＤＨ１およびＬＤ
Ｈ２が含まれている。ＬＤＨレベルは、胸痛の発症後24
〜36時間で上昇し始め、48〜72時間後に最高値となり、
４〜８日後に正常値に戻る。それ故、ＬＤＨは患者の胸
痛の早期段階におけるＭＩの指示例としては有用でな
い。更に、ＬＤＨは心臓障害に特異的でなく、肺動脈塞
栓症、ヘモリシス(haemolysis)、肝性うっ血、腎疾病お
よび骨格筋損傷により放出される。このように心臓に特
異的でないので、ＬＤＨの有用性が低くなる。 【０００６】クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は筋肉組織中
に見出される酵素である。ＣＫは、クレアチンとアデノ
シン三リン酸（ＡＴＰ）をホスホクレアチンとアデノシ
ン二リン酸（ＡＤＰ）に転化する触媒作用を有する。数
種のＣＫイソエンザイムのうちＣＫ−ＭＢが心臓組織に
おいて見出される。ＣＫ−ＭＢは、障害を受けた心筋組
織から放出されるので、心筋梗塞の診断に敏感なマーカ
ーである。ＣＫ−ＭＢは放出された患者の血清中に残存
する。図１は時間に関する患者血清中のＣＫ濃度を示し
ている（リーＴ．Ｈ．氏ほか「Ann. Intern. Med. 」10
5 , 221 〜 233(1986) ) 。 【０００７】ＣＫ−ＭＢ免疫検定は心筋梗塞の標準的な
診断試験法である。ＣＫ−ＭＢを用いた診断方法は「Ｃ
Ｋ−ＭＭ心筋梗塞免疫検定」と題する米国特許第4,900,
662号明細書に開示されている。上記米国特許第4,900,6
62 号明細書には心筋梗塞後の患者血清中のＣＫ−ＭＭ
−ａ、ＣＫ−ＭＭのイソフォーム、およびＣＫ−ＭＭ−
ａおよびＣＫ−ＭＭ−ｂの初期の濃度レベル上昇を同時
に測定する方法が開示されている。この方法によると、
梗塞発症時点を正確に評価することができる。血清中の
ＣＫ−ＭＭ−ａとＣＫ−ＭＭ−ｂの混合濃度、およびＣ
Ｋ−ＭＭ−ａの濃度を測定することにより心筋梗塞の急
性期の時点が測定できる。試薬として、ＣＫ−ＭＢやＣ
Ｋ−ＭＭ−ｂ、ＣＫ−ＭＭ−ｃとほとんど結合しないＣ
Ｋ−ＭＭ−ａの新規な多クローン性および単クローン性
抗体；ＣＫ−ＭＢやＣＫ−ＭＭ−ａ、ＣＫ−ＭＭ−ｃと
ほとんど結合しないアンチ−ＣＫ−ＭＭ−ｂ抗体；ＣＫ
−ＭＭ−ａとＣＫ−ＭＭ−ｂには結合するが、ＣＫ−Ｍ
ＢまたはＣＫ−ＭＭ−ｃとはほとんど結合しないアンチ
−ＣＫ−ＭＭ−ａ＋ｂ抗体；これらの抗体の標識誘導
体；これらの抗体を付着する不溶性支持体；および１ま
たは２種以上の上記の試薬からなるキットが挙げられて
いる。酵素標識および放射性標識(radiolabelled) され
たＣＫ試薬が特に有用である。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】ＣＫ−ＭＢを単独で診
断マーカーとして用いるには問題がある。第１に、ＣＫ
−ＭＢの血清レベルは心筋梗塞発症後６〜８時間まで上
昇せず、最高値となるのは12時間後である。このため初
期の緊急診断、治療を行なうことができない。第２に、
ＣＫ−ＭＢ試験は熟練した研究技術者によって研究室に
て行なわれる必要がある。郊外では早急に試験を行い結
果を判読することが困難であり、診断の遅れや受診を待
つ患者のための医療費の増大を招いている。 【０００９】第３に、ＣＫ−ＭＢは通常の骨格筋組織中
にも存在する。したがって、試験は心臓に特異的でな
く、診断は確かでない。ミオグロビンは骨格筋または心
筋細胞膜の近くに存在する他のタンパク質である。細胞
膜が異常に浸透性を増したとき、例えば、心筋虚血羅患
中に可逆状態となったとき、ミオグロビンは細胞から容
易に放出される。ミオグロビンは、胸痛の発症から1.5
時間以内で血清中に検出できる。ミオグロビンは心筋壊
死により放出されるので、心筋損傷の初期マーカーとし
て有用であると、医学研究団体は考えている。図２は時
間に対する血清中のミオグロビンの濃度を示している
（グレナディアーＥ氏ほか「Am. Heart J.」104 , 408
〜416 (1981)；セグインＪ．氏ほか「J. Thorac. Cardi
ovasc. Surg.」95 , 294〜297 (1988) )。 【００１０】胸痛の原因を診断する場合、血清ミオグロ
ビンの増加が胸痛の発症後２〜３時間のうちに検出され
ない場合には、心筋梗塞は否定できる。ＮＡラテックス
ミオグロビン粒子強化検定はミオグロビンの検定用の
一般に入手しうる検定キットである。検定は、ヒト体液
に存在する抗原とポリスチレン粒子に共有結合したアン
チミオグロビン抗体との反応に基づく。試料、Ｎミオグ
ロビン試薬、非特異性反応を除去する溶液およびＮ反応
緩衝液をピペットでキュベットに自動的に移す。12時間
温めた後、光散乱を比濁手段で測定し、ミオグロビン濃
度を検量線から算出する。 【００１１】また、ミオグロビンは放射線免疫検定を用
いて検定することもできるが、酵素結合免疫吸着剤検定
（ＥＬＩＳＡ）フォーマットはまだ利用されていない。
診断マーカーとしてミオグロビンを単独で用いるには問
題がある。ミオグロビンによっては心筋梗塞などの心筋
損傷のタイプを特定できない。ミオグロビンはまた、シ
ョックや腎疾病、横絞筋融解症、ミオパシーなどの種々
の条件で放出される。更に、血清や血漿中のミオグロビ
ン濃度は、一般に年令や性別によって異なり、通常健康
人でも広範囲にわたって変化する。健康人では一般に90
μｇ／lの血清中濃度が上限とされている。従って、あ
る個人について通常のレベルが他の個人については容易
ならぬ事態を示唆しているかもしれず、所望の診断精度
が得られない。 【００１２】ミオシンＬ鎖（ＭＬＣ）はミオシン筋原線
維の一部分であるが、この機能は、まだ明らかでない。
ＭＬＣは緩急の心房および心室の筋肉に存在する。ＭＬ
Ｃは心筋虚血に対して極めて敏感であることが知られて
いる。ＭＬＣは血清中に速やかに生じ、そのレベルは心
筋壊死後10日までの間、高いレベルで残留する。図３は
時間に対する患者血清中のＭＬＣの濃度を示している
（ワングＪ氏ほか「Clin. Chimica. Acta 」181 , 325
〜 336 (1989) ；ヤコワスキーＧ氏およびシメスＪ．Ｃ
氏ほか「Circulation Suppl.」 1180 , 355 (1989) )。
また、ＭＬＣは血栓治療の測定の予後値を示す。ＭＬＣ
の高い値は悪い予後を指示し、また著しい梗塞に相当す
る。数日にわたるレベルの降下は患者の回復傾向を指示
するのに対して、スパイキングまたはスタジコパターン
は梗塞傾向を示し治療（intervention) の必要性を指示
する。 【００１３】ＭＬＣには主にＭＬＣ１とＭＬＣ２として
知られる２つの主要タイプがある。これらは、梗塞細胞
の細胞形質中の可溶性プール (soluble pool) として存
在し、またミオシン筋原線維と一体化している。心室筋
中では、ＭＬＣ２、そしておそらくはＭＬＣ１も緩骨格
筋中にあるイソタイプと同一である。ＭＬＣ１は胸痛を
覚えた患者の80〜85％で上昇が見られる。ＭＬＣ１は不
安定狭心症や虚血性心臓疾患に極めて敏感な指示剤であ
る。 【００１４】他の心マーカー (cardiac markers)として
は、低分子量心タンパク質（ＬＭＷＣＰ）がある。この
心マーカーの例としては、収縮性器官の成分、すなわ
ち、トロポニン、トロポニン−Ｔ、トロポニン−Ｉおよ
びトロポニン−Ｃ、トロオースＰイソメラーゼ等のミト
コンドリア酵素、心臓から放出されやすい低分子量ポリ
ペプチド、並びに虚血発症後すぐに放出される筋細胞膜
タンパク質またはタンパク質フラグメント、特に心特異
性の15 kd 筋細胞タンパク質および100 kd複合糖タンパ
ク質を挙げることができる。 【００１５】心イソタイプ(cardiac isotype) トロポニ
ン−Ｉは、心筋の収縮間の休止期間中、アクチン分子と
ミオシン分子との相互反応を抑制する。トロポニン−Ｉ
はＭＩ発症後４〜６時間で患者の血清中に現れ、７〜８
日にわたり高い割合で残留する。図４は時間に対するト
ロポニン−Ｉの濃度を示している（クミンスＢ．；アウ
クランドＭ．Ｌ．；およびクミンスＰ．氏「Am. Heart
J.」 113 , 1333 〜1344 (1987) ）。トロポニン−Ｉは
心特異性であり、心筋損傷が骨格筋損傷かを鑑定するう
えで他のマーカーに比べ極めて敏感である。 【００１６】トロポニン−Ｔは細いフィラメントのトロ
ポニン−トロポミオシン複合体の一部であり、トロポミ
オシン骨格とトロポニン−Ｉ−トロポニン−Ｃ複合体と
の間の結合剤として作用する。トロポニン−Ｔは塩基性
タンパク質であり、心筋、および緩急の骨格筋中にイソ
タイプがある。トロポニン−ＴはＭＩ後血清中に３時間
のうちに生じ、少なくとも10日にわたって高い割合で残
留する。図５は時間に対するトロポニン−Ｔの濃度を示
している（カツＨ．Ａ氏ほか「J. Mol. Cell Cardiol.
」 21 , 1349〜1353 (1989) ) 。トロポニン−Ｔは二
相放出パターン (biphasic release pattern) に従う。
トロポニン−Ｔは心特異性で、ＭＩに極めて敏感であ
る。 【００１７】ミオシンＨ鎖（ＭＨＣ）およびトロポミオ
シンは心マーカーとして用いられる高分子量タンパク質
である。ＭＨＣは筋肉の主要な収縮性タンパク質の一つ
である。ＭＨＣのフラグメントは、心筋細胞壊死やその
後の不可逆性膜の損傷により心室から血清中に放出され
る。ＭＨＣフラグメントは心筋細胞壊死直後には血清中
に出現しないが、ＭＨＣはＭＩ発症後少なくとも１０日
間は高濃度で残留する。ＭＨＣの最高値はＭＩ発症後４
日後に観察される。図６は時間に対するＭＨＣ濃度を示
している。（レガ−Ｊ．Ｏ．Ｃ．氏ほか「Ｅｕｒ．Ｊ．
ｏｆ Ｃｈｉｎ．Ｉｎｖｅｔ．」１５，４２２〜４２９
（１９８５）；セグウインＪ．Ｒ．氏ほか「Ｊ．Ｔｈｏ
ｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．」９８，３
９７〜４０１（１９８９））。ＭＨＣ放出曲線下の面積
は心筋細胞の損傷の広まりと極めてよく相関する。しか
し、ＭＨＣのレベルはＭＩの進行中にはあまり臨床的に
有用でない。 【００１８】トロポミオシンは、筋収縮における調整シ
ステムの部分である２種のポリペプチドから形成した二
量体である。トロポミオシンは、心筋梗塞後、約７〜８
時間で血清中に検出され、ＣＫ−ＭＢと同様、心筋梗塞
に極めて敏感である。図７は時間に対するトロポミオシ
ン濃度を示している（クミンスＰ氏ほか「Ｃｌｉｎ．Ｓ
ｃｉ．」６０，２５１〜２５９（１９８１））。しかし
ながら、トロポミオシンは骨格筋損傷でも高値を示し特
異的ではない。 【００１９】現在の標準的な心筋梗塞診断方法には限界
がある。胸痛の発症後すぐに、例えば救急車や病院で実
施できる高感度で正確、迅速、簡単な診断試験は開発さ
れていない。本発明は、胸痛の発症後早期に患者の血液
や血漿中に現れる、少なくとも３種の異なる心筋損傷マ
ーカーを組合わせ測定することにより、不安定狭心症と
ＭＩの早期段階において使用できる心筋梗塞の改良診断
方法を提供するものである。 【００２０】 【課題を解決するための手段】本発明は従来技術の欠点
を解決するために、患者の血清中の少なくとも３種の心
筋損傷により摘出されるマーカーを検出する、緊急時に
用いる一段階で、正確、迅速かつ携帯できるパネル診断
試験を提供するものである。試験結果から、患者が不安
定狭心症にかかっているか否か、または心筋梗塞か否か
を鑑別できる。ＭＩの早期診断は血栓阻止治療を早期に
始めることを可能とする。それ故、心臓損傷を最小に止
めることができ、患者の生存率を高めることができる。
パネル試験の結果により、初期症状から数日後でも、不
安定狭心症と心筋梗塞とを識別することができる。パネ
ル試験は酵素免疫検定サンドイッチドライケミストリー
以下乾燥化学という）フォーマットを利用する。パネル
による一連の測定により、医師は、心筋損傷の範囲およ
び血栓阻止の成功に関する予後を知ることができる。本
発明の具体例としては、３種のマーカーはクレアチンキ
ナーゼ（ＣＫ）、ミオグロビンおよびミオシンＬ鎖（Ｍ
ＬＣ）である。 【００２１】本発明を利用することにより、心筋梗塞を
患者の胸痛の早期兆候において検出する診断試験用キッ
トが得られる。試験用キットは、血液または血清を保持
する容器と、試料に連結する検出手段とからなる。検出
手段は、キャリヤーに担持されている少なくとも３種の
単クローン性抗体または多クローン性抗体であって、各
々が心筋梗塞の初期段階に心筋により放出される異なる
タンパク質に相補（以下合致という）する抗体と、合致
タンパク質と反応する各抗体に各々応答する対応試薬と
を含んでいる。 【００２２】 【実施例】次に、本発明を添付図面に基づいて説明す
る。本発明の概要を図８に示す。好適例では、本発明の
キットはパネルフォーマット１からなる。パネルフォー
マットとしては公知の市販のものを用いることができ
る。このパネルフォーマットは妊娠試験に一般に用いら
れているフォーマットと似たもので、商標登録「ＢＩＯ
ＳＩＧＮ」として一般に入手できる。 【００２３】パネルは正面パネル10および裏面パネル12
を有するポリプロピレン カードからなる。図９に示す
ように、正面パネル10は各心マーカーについての表示ウ
インドー14および試料ウインドー16を有している。正面
パネル10の下には露出乾燥化学膜18があり、この膜18は
正面パネル10の背後に適当な手段で固定されている。裏
面パネル12にはリップ20が設けられている。このリップ
20は正面パネル10をスナップ止めできるように裏面パネ
ル12の周辺に延在し、これにより膜18を正面パネルと裏
面パネルとの間にシールしている。 【００２４】正面パネルおよび裏面パネルは共にスナッ
プ止めするように記載しているが、当業技術者に知られ
ている両パネルを接合する他の多くの適当な方法を用い
ることができる。正面パネル10には患者の氏名や身元を
記載するための領域13を設けることもできる。更に試験
結果を記載できるスペースもある。図10に示すように、
膜18は単クローン性または多クローン性抗体のキャリヤ
ーである。好適例においては、血液または血漿は一端か
ら他端に矢印で示すように流れる。端部22は試料ウイン
ドー16と一列に並んでいる。固定捕捉された抗体24は抗
体−酵素抱合体26と積層または結合されている。この抱
合体26は抗体24により認識される以外の抗原の異なるエ
ピトープに対して選ばれる。抗体24はミオシン タンパ
ク質に合致(complementary) する。同様に、抗体28は対
応試薬30に積層されている。抗体28はＣＫ−ＭＢに合致
する。同様に、抗体32は試薬34に積層されている。抗体
32はミオシンＬ鎖に合致する。抗体36は正常な血清また
は血液に見出されるいかなるタンパク質にも合致する。
抗体36は試薬38に積層されている。 【００２５】単クローン性および多クローン性抗体は、
多クローン性抗体の生成に用いられる任意の哺乳動物を
用いた通常の方法によって生成することができる。好適
例では、標識試薬を用いる。抗体試薬は標識化され、ま
たは識別可能なモイエティー(moiety)と化学的に結合さ
れる。モイエティーは、血清や血液中または乾燥化学膜
上の抗体の存在を確認し定量するために観測・計量でき
るものである。診断具として用いられる本発明の抗体と
結合するリガンドや基は、それらと結合する抗体から識
別できるような物理的化学的性質を有する元素、化合物
または生物学的物質を含んでいる。 【００２６】各心マーカー毎に、モノ／ポリ、ウサギ／
ポリ、ヤギ／ポリの少なくとも２種の抗体が必要であ
る。抗体をその特異的心免疫原に対して親和精製 (affi
nity purified)し、次いで非関連種に対して交差吸収す
ることにより更に精製して、非特異的免疫グロブリンを
除去する。使用の際には、診断医、例えば医師や救急技
師、看護婦が患者の血清または血液を３滴または100 ml
以下試料ウインドウ16に加える。試料は、毛細管現象に
より膜18に沿って移動し、抗体と試薬の対24と26、28と
30、32と34、36と38に順次接触する。 【００２７】特定のマーカーが試料中に存在する場合、
そのマーカーは膜に固定された抗体に結合する。また、
対応試薬にも反応し、試薬の色の変化によって視覚化さ
れる。色の変化は試料におけるマーカーの濃度に比例す
る。それ故、試験用キットを時間をおいて用いる場合に
は、マーカー濃度の増減を測定することができ、診断に
用いることができる。試験は３〜５分内で完了する 【００２８】好適例では、試料中に存在する各心マーカ
ーを青色バンドによって示す。バンドの色の強度は反射
計によって定量できる。これにより色の強度と特定マー
カーの濃度レベルとを対応付ける。反射計にはマイクロ
プロセッサーを設け、パネル中の各心マーカーの定量結
果を患者別に各マーカーの濃度としてプリントアウトす
ることができる。 【００２９】試験は、３滴または100 μl 未満の血清ま
たは血漿を用い、試験間の精度計数の変化と試料間の精
度計数の変化が15％以下で、0.5 ng／ml〜25ng／mlのマ
ーカー濃度に敏感となるようにすることが好ましい。マ
ーカーの特性によって試験に用いられる心マーカーが選
ばれる。好適例では、図８に示すように、ミオグロビ
ン、ＭＬＣおよびＣＫ−ＭＢを有するパネルが用いられ
ている。 【００３０】ミオグロビンは心筋細胞から極めて容易に
放出され、心特異的ではないが、心筋梗塞つまり心筋壊
死に極めて高い敏感さを有しており、壊死が起こらない
程度の酸素欠乏によっては放出されない。ＭＬＣは心特
異的であり、胸痛が心臓由来か否かの識別を可能とし、
容易に放出される。しかし、ミオグロビンほど容易に放
出されない。ＣＫ−ＭＢは心筋梗塞と狭心症とを識別で
きるが、胸痛の発症後約６時間経過しないと検出でき
ず、このために緊急診断試験として、単独で用いること
ができない。 【００３１】図１，２および３に示すように、使用する
心マーカーがＣＫ−ＭＢ、ミオグロビンおよびＭＬＣで
ある場合には、以下の試験結果の解釈により診断でき
る。パネル試験結果がＭＬＣについてポジティブであり
ミオグロビンおよびＣＫ−ＭＢについてネガティブであ
る場合、患者の胸痛が心臓由来のものであり不安定狭心
症が原因であることを示唆する。 【００３２】ミオグロビンおよびＭＬＣがポジティブで
あり、ＣＫ−ＭＢがネガティブである場合には、初期の
心筋梗塞の進行を示唆し、治療を開始することができ
る。３種のマーカーすべてがポジティブである場合に
は、心筋梗塞を示唆する。 【００３３】ＭＬＣおよびＣＫ−ＭＢがポジティブで、
ミオグロビンがネガティブである場合には、心筋梗塞を
示唆する。ミオグロビンおよびＣＫ−ＭＢがポジティブ
でありＭＬＣがネガティブである場合には、患者は骨格
筋損傷を有する（偽陽性）が心筋梗塞に羅患している。 【００３４】ＭＬＣ放出曲線が時々僅かな下降を有して
いるため、患者が僅かな心内膜下梗塞を有している場合
であっても「下降(dip) 」時に試験された可能性がある
ので、この場合試験は偽陽性と「僅かな」心筋梗塞とを
識別することができない。梗塞が僅かな場合には、「下
降」はほとんど正常レベルにまで下がり、それ故、患者
はＭＬＣについてネガティブを示すことがある。ＣＫ−
ＭＢの存在によってポジティブ診断を行うこととなる。 【００３５】患者が著しい心筋梗塞を有する場合には、
ＭＬＣレベルにおける「下降」は正常レベルにまで下が
るほど大きくはなく、それ故ＭＬＣはそのまま検出され
る。他の実施例では、試験パネルとして同様のフォーマ
ットで異なる抗体の組み合わせを用い、異なる心マーカ
ーを評価することができる。パネル試験により、患者の
胸痛の初期段階における心臓組織の損傷を検出できるよ
うにするため、ＣＫ、ミオシンＬ鎖またはミオグロビン
のような心筋損害の初期段階において多量に摘出される
マーカーに対応する少なくとも１種の抗体を用いる必要
がある。また、ＣＫ、ミオシンＬ鎖またはミオグロビン
の特質および特性を有する低分子量心タンパク質をキッ
トに用いることもできる。 【００３６】適当なタンパク質および酵素としては、ト
ロポニン、トロポニン−Ｉ、トロポニ−Ｃ、トロポニン
−Ｔおよび筋線繊維タンパク質、トリオースホスフェー
ト（以下Ｐ−という）イソメラーゼ、またはクレアチン
キナーゼ、ミオグロビンまたはミオシンＬ鎖の特質およ
び特性を有する任意の高分子量心タンパク質から選択す
ることができる。また、トロポミオシンおよびミオシン
Ｈ鎖のような他のタンパク質をキットに加えることがで
きる。この場合、胸痛から長時間を経過したＭＩの後期
段階であってもキットをＭＩの診断に用いることができ
る。 【００３７】第２実施例では、膜１８に補促された抗体
１２４と対応試薬１２６の層を設けることができる。同
様に、各マーカーを検出することができるように、抗体
と対応試薬の対１２８と１３０、１３２と１３４、およ
び対照対１３６と１３８を設ける。使用の際には、上述
のように試料を各対に接触させてその結果を読み取る。 【００３８】乾燥化学膜１１８は吸収性材１２０により
支持することもできる。吸収材１２０により膜を通る血
清の摘出が向上する。試験キットの他の実験例として、
一般に用いられている血液試料管が用いられる。管の内
壁を単クローン性および多クローン性抗体と試薬の支持
体として用いることができる。試験者が単に管を振るだ
けで抗体と血液とを反応させることができる。血液中に
心臓性タンパク質がある場合、上述のように色の変化が
生じる。 【００３９】上述において、本発明の好適例を記載した
が、本発明はこれらの具体例に限定されるものではな
い。本明細書および特許請求の範囲に記載された発明の
本旨を逸脱しない限り、様々な変更を行なうことができ
る。

【図面の簡単な説明】 【図１】時間に対する血清中のＣＫのレベルを示すグラ
フである。 【図２】時間に対する血清中のミオグロビンのレベルを
示すグラフである。 【図３】時間に対する血清中のＭＬＣのレベルを示すグ
ラフである。 【図４】時間に対する血清中のトロポニン−Ｉのレベル
を示すグラフである。 【図５】時間に対する血清中のトロポニン−Ｔのレベル
を示すグラフである。 【図６】時間に対する血清中のＭＨＣのレベルを示すグ
ラフである。 【図７】時間に対する血清中のトロポミオシンのレベル
を示すグラフである。 【図８】本発明の診断試験用キットの１例構造を示す表
面図である。 【図９】図８に示す構造の分解図である。 【図１０】図８に示すキット構造の膜の斜視図である。 【図１１】図10に示す膜の変形構造の斜視図である。 【符号の説明】 １ パネル フォーマット 10 正面パネル 12 裏面パネル 14 表示ウインドー 16 試料ウインドー 18 膜 20 リップ 22 端部 24 固定捕捉抗体 26 抗体−酵素抱合体（試薬） 28, 32, 36, 128, 132 抗体 30, 34, 38, 126, 134 試薬 118 膜 120 吸収性材料 136, 138 対照対

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−59069（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−142463（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−61664（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−63865（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−262471（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−157859（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−11231（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−302162（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−151192（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−233298（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−501982（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 不安定狭心症と心筋梗塞症との間の鑑別
   診断をするための診断用キットにおいて、 （ｉ） 血液または血清試料を保持する容器と、 （ｉｉ） 該容器に連結する検知手段であって、ａ）互
   いに所定の位置にある固体単体上に別々に支持された３
   以上の単クローン性抗体または多クローン性抗体で、各
   々の抗体は心筋の損傷に際し心筋から放出される夫々異
   なったマーカータンパク質に合致する抗体であり、かつ
   試料に接触し得る各々の抗体は、少なくとも１つの抗体
   が狭心症に特異的なマーカータンパク質に合致し、また
   少なくとも別の１つの抗体が心筋梗塞に特異的なマーカ
   ータンパク質に合致し、而もｂ）抗体／タンパク質結合
   体が生成した場合夫々に独立して反応性があり、かつ不
   安定狭心症または心筋梗塞のいずれであるかを指示する
   応答をひとまてめにして提示するに必要な試薬とを有す
   る不安定狭心症と心筋梗塞との間の鑑別診断をするため
   の診断用キット。 【請求項２】 合致するタンパク質と反応する各抗体に
   応じて該試薬によりもたらされる応答が可視色変化示さ
   れる請求項１記載の診断用キット。 【請求項３】 容器および検出手段が抗体と試薬とを乾
   燥化学品の形で含む一体化構造である請求項１または２
   記載の診断用キット。 【請求項４】 試料を受け入れる試料ウインドーおよび
   試薬を表示するための表示ウインドーを有する正面パネ
   ル、裏面パネルおよび検出手段を正面パネルと裏面パネ
   ルとの間に挟んで一体化ユニットを形成する正面パネル
   と裏面パネルとを保護するための封入手段を有し、カー
   ド形態の請求項３記載の診断用キット。 【請求項５】 抗体のキャリヤーが乾燥化学膜である請
   求項４記載の診断用キット。 【請求項６】 膜が検出手段への試料の摘出を高めるた
   めの吸収材により支持されている請求項５記載の診断用
   キット。 【請求項７】 膜が試料ウインドーから表示ウインドー
   へ延在しており、抗体と対応試薬とが表示ウインドー内
   の試料ウインドーから隔てられた位置に配置されている
   請求項６記載の診断用キット。 【請求項８】 正面パネルが、タンパク質抗体反応の位
   置を表示するためにマークを施されたものである請求項
   ４ないし７記載の診断用キット。 【請求項９】 正面パネルにさらに試料中のタンパク質
   濃度を定量するための反射計を設けた請求項８記載の診
   断用キット。 【請求項１０】 容器が封止可能な透明容器であり、そ
   して検出手段が容器の側面に設置されている請求項３記
   載の診断用キット。 【請求項１１】 検出手段（ｉｉ）はａ）３以上の第１
   の抗体が固体キャリヤー上の異なった位置に固相化され
   ており、かつ夫々は心筋梗塞の発作に際し心筋から放出
   される別個のマーカータンパク質に合致するものであ
   り、ｂ）これに相応して、３以上の第２の抗体で夫々検
   出し得る標識を有しており、そして夫々は該マーカータ
   ンパク質上の別個のエピトープに合致するものであり、
   従って結合したマーカータンパク質に結合する能力を有
   しており、それによって結合したタンパク質の存在を夫
   々の標識を経て表示する、請求項１ないし１０記載の診
   断用キット。 【請求項１２】 第２の標識抗体が検出し得る標識と
   して活性酵素を有する抗体−酵素抱合体であり、そして
   検出手段が適当な酵素基質であり、基質の存在下酵素の
   活性を検出する請求項１１記載の診断用キット。 【請求項１３】 該抗体がつぎの３以上のタンパク質
   または酵素、即ちクレアチンキナーゼ、ミオグロビン、
   ミオシンＬ鎖タンパク質、ミオシンＨ鎖タンパク質、ト
   ロポミオシン、トロポニン、トロポニン−Ｉ、トロポニ
   ン−Ｃ、トロポニン−Ｔ、筋線維膜タンパク質、トリオ
   ースＰ−イソメラーゼ、またはクレアチンキナーゼ、ミ
   オグロビンもしくはミオシンＬ鎖タンパク質の特徴およ
   び特性を有する低分子量心タンパク質であって、一方は
   ミオグロビンに合致し、他方はミオシンＬ鎖に合致する
   ものである、請求項１ないし１２記載の診断用キット。 【請求項１４】 ３つの抗体がクレアチンキナーゼ、ミ
   オグロビンおよびミオシンＬ鎖タンパク質のいずれかに
   夫々合致するものである、請求項１３記載の診断用キッ
   ト。 【請求項１５】 検出手段が血清中に通常見い出される
   タンパク質と合致する対照抗体、および合致するタンパ
   ク質と反応する対照抗体に反応する試薬に対応し、それ
   によって試験が機能していることを示しているものであ
   る請求項１ないし１４記載の診断用キット。 【請求項１６】 対照抗体および相当するタンパク質
   が、テストの実質的な終了を示すために試料ウインドー
   から最も遠く離れているキャリヤー上に位置している請
   求項４、５および６に従属した請求項１５記載の診断用
   キット。 【請求項１７】 １００μ未満の試料を用い、試験間の
   精度計数の変化と試料間の精度係数の変化が１５％以下
   で、０．５ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌのマーカー濃度
   に感受性である請求項１ないし１６記載の診断用キッ
   ト。 【 請求項１８】 互いに所定の位置にあるキャリヤー上
   またはキャリヤー内に支持された複数の単クローン性抗
   体または多クローン性抗体を含有し、各々の抗体が心筋
   の損傷時に心筋から放出する少なくとも３つのマーカー
   タンパク質の異なった１つに合致するものである診断検
   出手段に、血液または血清試料を接触させ、次にそれら
   タンパク質の夫々がそれらタンパク質に対する夫々の抗
   体と結合する場合に、少なくともそれら抗体の１つが狭
   心症に特異的なマーカータンパク質に合致する抗体であ
   り、また別の抗体の少なくとも１つが心筋梗塞に特異的
   なマーカータンパク質に合致する抗体であるようにし、
   抗体と結合するか否かを検出する方法。 【請求項１９】 マーカータンパク質と、それらの抗体
   との結合が可視的に検出される請求項１８記載の方法。 【請求項２０】 単クローン性抗体または多クローン性
   抗体の夫々が、夫々のマーカータンパク質と夫々の抗体
   との結合を可視的に検出するための検出システムとキャ
   リヤー内またはキャリヤー上で結合する際、該検出シス
   テムの夫々が夫々のマーカータンパク質上の異なったエ
   ピトープに合致する第２の単クローン性抗体または多ク
   ローン性抗体を有し、該第２の各抗体は可視的に検出さ
   れ得る標識で標識されている、請求項１９記載の方法。 【請求項２１】 標識が酵素標識であり、検出システム
   がキャリヤー内またはキャリヤー上に既に取り込まれて
   いる結合標識の可視的検出を可能にするに必要な試薬で
   ある請求項２０記載の方法。 【請求項２２】 キャリヤーが乾燥ストリップキャリヤ
   ーであって、その上に第一の単クローン性または多クロ
   ーン性抗体を３つ以上の別々の位置に、しかも第２の抗
   体上に結合した標識を可視的に検出するに必要な試薬と
   共に固定してあり、標識された上記第２の抗体は乾燥ス
   トリップキャリヤーの内部または上であって、夫々の固
   定化された抗体から離れた而もキャリヤーに対しては移
   動性の領域に組入れられており、それらの配置は、血清
   または血液試料が診断検出手段と接触するや否や、先づ
   試料と、可動性で且つ標識抗体を有する領域とを接触さ
   せて、最初に夫々のマーカータンパク質と結合させ、そ
   の結合体を血液または血清試料と共に隣接領域に移動さ
   せ、当該隣接領域には夫々の固定化抗体および、その固
   定化抗体とサンドイッチ複合体を形成して標識の検出を
   可能ならしめるに必要な試薬を含有させておく請求項２
   １記載の方法。 【請求項２３】 複数の単クローン性抗体または多クロ
   ーン性抗体に合致するマーカータンパク質がクレアチン
   キナーゼ、ミオグロビン、ミオシンＬ鎖タンパク質、ミ
   オシンＨ鎖タンパク質、トロポミオシン、トロポニン−
   Ｉ、トロポニン−Ｃ、トロポニン−Ｔ）筋線維膜タンパ
   ク質、トリオースＰ−イソメラーゼ、またはクレアチン
   キナーゼ、ミオグロビンあるいミオシンＬ鎖タンパク質
   の特質および特性を有する低分子量心筋タンパク質の少
   なくとも３つのを含有し、その少なくとも１つはミオグ
   ロビンであり、他の１つはミオソンＬ鎖である請求項１
   ８ないし２２記載の方法。 【請求項２４】 ３つのマーカータンパク質がクレアチ
   ンキナーゼ、ミオグロビンおよびミオシンＬ鎖である請
   求項２３記載の方法。 【請求項２５】 請求項１に記載の診断用キットを使用
   する請求項１８ないし２４記載の方法。 【請求項２６】 不安定狭心症と心筋梗塞との間の鑑
   別診断のための診断用キットであって、該キットは、血
   清または血漿の試料を受け取る試料ウインドーおよび表
   示ウインドーを有する正面パネルと、裏面パネルと、少
   なくとも上記表示ウインドー内で表示のために設置され
   た、しかも正面パネルと裏面パネルとの間に封止された
   乾燥化学膜とを有し、該膜は試料領域と対照領域とを有
   し、試料領域は試料ウインドーから試料を受け入れる位
   置にあり、少なくとも３つの抗体対が試料領域と対照領
   域との間にある膜に添って分離した位置に配置され、該
   抗体対は抗体試薬部と固定捕捉抗体部とを有し、各捕捉
   抗体部は相当する抗体試薬部よりも対照領域に近い膜上
   に配置され、各抗体対は各抗体対の抗体試薬部にラベル
   されたか、化学的に結合されている測定可能ないし観察
   可能なモイエティーを有し、抗体対は単クローン性また
   は多クローン性であって、ミオグロビンに特異的に結合
   する第１の抗体対、ミオシンＬ鎖に特異的に結合する第
   ２の抗体組、およびＣＫ−ＭＢ、トロポニン−Ｉおよび
   トロポニン−Ｔからなる群より選ばれた少なくとも１つ
   のタンパク質に特異的に結合する第３の抗体対を有し、
   試料を試料ウインドーに加えると、試料中に存在し且つ
   抗体対に合致する検体が対照領域に向って移動し、検体
   の夫々と抗体対とを結合させ試料中に存在する各検体に
   比例して色変化を生じさせることを特徴とする診断用キ
   ット。 【請求項２７】 請求項２６記載の診断用キットを用い
   る方法であって、診断用キットの試料ウインドー中に血
   清または血漿試料を貯留し、次に対照領域に移動させ、
   該領域内で抗体対に合致し、夫々の抗体対に結合して試
   料中に存在する検体の各濃度に比例した色変化を生成さ
   せ、その色変化を視覚化または測定する方法。