DE4243648A1

DE4243648A1 - Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid

Info

Publication number: DE4243648A1
Application number: DE19924243648
Authority: DE
Inventors: Helmut Dipl Chem Dr Lill; Frederic Donie; Anneliese Dipl Biol Borgya; Christoph Dr Seidel
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-12-23
Filing date: 1992-12-23
Publication date: 1994-07-07
Also published as: EP0664002A1; WO1994015217A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid, bei dem man eine Blutprobe mit einem Anti körper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid versetzt und den sich bildenden Komplex nachweist sowie die in diesem Ver fahren verwendeten Antikörper und ein Verfahren zur Herstel lung solcher Antikörper.

Die Myofibrillen des quergestreiften Muskels bestehen aus zwei zusammenwirkenden Proteinfilamenten, den dicken Fila menten mit Myosin als Hauptbestandteil und den dünnen Fila menten, die Actin, Tropomyosin und Troponine enthalten. Troponin ist in den Zellen als regulatives Strukturprotein zu einem Komplex zusammengelagert und besteht aus drei ver schiedenen Proteinen:

Troponon C : bindet Calciumionen
Troponin I : eine Actin-bindende Untereinheit
Troponin T : lagert sich an Tropomyosin an.

Die vergleichbare Nomenklatur hat historische Gründe, da ur sprünglich der Komplex als solcher gereinigt und als ein Protein angesehen und mit Troponin benannt wurde.

Von Troponin I sind drei Isoformen bekannt entsprechend ihrem Auftreten im Herzmuskel (TnIc), langsamen Skelettmuskeln (TnIs) und schnellen Skelettmuskeln (TnIf). Kardiales Troponin I unterscheidet sich von skelettärem Troponin I hauptsächlich durch eine zusätzliche N-terminale Sequenz aus 30 Aminosäuren.

Kardiales Troponin I wird nach einem akuten Myokardinfarkt freigesetzt und kann im Blutplasma nachgewiesen werden. Es stellt somit einen Marker für Herzmuskelzellnekrosen dar. Cummins, J. Mol. Cell. Card. 19 (1987), 999-1010 und Cummins and Cummins, Clin. Invest. 113 (1987), 1333-1344 konnten nachweisen, daß TnIc im Serum normalerweise in Konzentra tionen in der Höhe von 10 ng/ml auftritt. Es zeigte sich, daß beim transmuralen Infarkt eine erhöhte Serumkonzentration zu beobachten ist. TnIc war von der 4. bis 168. Stunde nach Schmerzbeginn bei 37 Patienten mit akutem transmuralen Infarkt erhöht. Ähnliche Ergebnisse wurden im Tiermodell er halten. Danach ergibt sich als Zeitintervall für die absolute diagnostische Sensitivität für TnIc die 10-50. Stunde nach dem Infarktereignis.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Bestimmungs verfahren zu entwickeln, das geeignet ist einen akuten Myokardinfarkt möglichst schnell innerhalb der ersten Stunden nach dem Infarktereignis nachzuweisen.

Gelöst wurde die Aufgabe durch die in den Ansprüchen näher charakterisierte Erfindung. Insbesondere durch ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, da durch gekennzeichnet, daß man eine Probe mit mindestens einem Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teil seguenzen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers aus dem Serum bzw. den immortalisierten und klonierten Milz zellen der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren, ver setzt und den sich bildenden Komplex in geeigneter Weise nachweist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immurisierung mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach be kannten Verfahren sowie ein monoklonaler Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und er hältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper pro duzieren und Isolierung des Antikörpers aus den klonierten Zellen nach bekannten Verfahren.

Die Durchführung des immunologischen Bestimmungsverfahrens von Herzmuskelnekrosen erfolgt mit dem Fachmann geläufigen Methoden. Beispielsweise kann die Bestimmung in Proben, das heißt Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Plasma oder Serum, durch einen Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay oder durch Immunfluoreszenz erfolgen. Als Verfahrensvariante sind alle bekannten Verfahren wie kompetitive Immunoassays, Sandwich-Immunoassays und IEMA-Verfahren oder homogene Immunoassays wie CEDIA® anwendbar. Es ist möglich den Test in Form eines Naßtestes oder Trockentestes durchzuführen.

Bei den heterogenen Verfahren wird der TnIc-spezifische Anti körper an eine Festphase immobilisiert. Die Immobilisierung kann adsorptiv, kovalent oder über ein spezifisches Bindepaar wie Biotin/ Streptavidin, Antikörper/Antigen oder Zucker/ Lectin erfolgen. Dabei wird der erfindungsgemäße TnIc spezifische Antikörper an einen dieser Bindepartner gebunden. Der andere Bindepartner ist an die Festphase gebunden. Methoden zur adsorptiven oder kovalenten Kopplung sind dem Fachmann bekannt.

Als Festphase bei einem Naßtest können Materialien verwendet werden, wie z. B. Röhrchen (tubes), Kunststoffküvetten, Mikrotiterplatten, Kugeln oder Mikrocarrier aus Kunststoffen wie Polystyrol, Vinylpolymeren, Polypropylen, Polycarbonat, Polysaccariden, Silikone, Gummi oder behandeltes Glas (vgl. beispielsweise E.T. Maggio, Enzyme Immunoassays, CAC. Press, Florida (1980), insbesondere Seiten 175-178, EP-A-0 063 064, Bioengineering 16 (1974), 997-1003, C.J. Senderson und D.V. Wilson, Immunology 20 (1971), 1061-1065). Insbesondere wird als Festphase ein mit Avidin oder Streptavidin beschichtetes Trägermaterial, insbesondere Polystyrol, vorzugsweise herge stellt wie in EP-A-0 269 092 beschrieben, verwendet. Als Festphase bei einem Trockentest sind die hierbei üblichen Vliese wie Cellulose- oder Glasfaservliese als auch Membranen zu verwenden.

Besonders zweckmäßig hat sich der Sandwich-Test erwiesen. Hierbei wird ein immobilisierter Antikörper, der das N-termi nale Peptid von kardialen Troponin I erkennt, in Kombination mit einem zweiten TnIc-spezifischen Antikörper, an den eine bestimmbare Gruppe gekoppelt ist, eingesetzt. Als bestimmbare Gruppe können alle gängigen Markierungsgruppen wie Enzyme oder fluoreszierende oder lumineszierende Reste eingesetzt werden. Der zweite Antikörper, der ebenfalls das N-terminale Peptid von TnIc erkennt, wird so ausgewählt, daß er nicht oder nur unwesentlich die Bindung des ersten Antikörpers an diesem Peptid stört. Beide Antikörper sind also gegen ver schiedene Epitope am N-terminalen Peptid von TnIc gerichtet. Die Testführung kann sowohl sukzessiv, d. h. ein Antikörper wird zunächst mit der Probe inkubiert bevor der zweite Anti körper zugegeben wird, als auch simultan, d. h. alle Reak tionspartner werden im Test gleichzeitig zugegeben, erfolgen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist der kompetitive Test. Dabei wird ein vor oder während der Bestimmung immo bilisierter Antikörper gegen das N-terminale Peptid von TnIc und ein Konjugat aus TnIc oder dem Antigen, das die Amino säuresequenz SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und einer bestimm baren Gruppe verwendet. Werden lediglich Teilsequenzen der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 verwendet, so muß der ver wendete Antikörper mit diesem Teil spezifisch bindefähig sein.

Die kompetitive Testführung ist insbesondere bei homogenen Immunoassays geeignet. Bevorzugt ist der TINIA, der turbidi metrische Inhibierungs-Immunoassay. Eine Probe wird mit einem Polyhapten, das aus einem Mikropartikel, beispielsweise einem Latexpartikel oder Dextran und daran gebundenen N-terminalen TnI-Peptiden, besteht und den erfindungsgemäßen Antikörpern inkubiert. Es bilden sich Immunkomplexe aus Polyhapten oder TnIc und Antikörpern. Die Bindung der Antikörper an das Poly hapten führt zu Aggregaten, die durch Zunahme der Trübung ge messen werden können. Die Bindung von Antikörpern an den freien Analyten führt hingegen zu keinen größeren und damit Trübungsverursachenden Aggregaten, da die von den erfindungs gemäßen Antikörpern erkannten Epitope nur einmal auf dem Analyt vorkommen. Die Agglutination des Polyhaptens wird so mit teilweise inhibiert. Der genaue Gehalt einer Probe an Analyt kann über eine Standardkurve bestimmt werden.

Geeignet ist auch ein homogener Immunoassay, bevorzugt ein CEDIA® (vergleiche Henderson et al., Clin. Chem. 32 (1986) 1637-1641). Das Peptidantigen, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, wird an ED gekoppelt.

Unter einem Antikörper im Sinne der Erfindung ist ein kompletter Antikörper oder bi- oder monovalente Fragmente hiervon zu verstehen. Die Antikörper können sowohl monoklonal als auch polyklonal sein. Bevorzugt ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern, die das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennen. Das Verfahren be steht darin, daß man Versuchstiere, vorzugsweise Schafe, mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, in Kombination mit einem Adjuvans, über mehrere Monate (vorzugsweise 4-6 Monate) mindestens vier mal in vier- bis sechs-wöchigem Abstand immunisiert, Roh serum gewinnt und dieses mit dem Fachmann bekannten Methoden reinigt. Zur Immunadsorption werden Adsorber verwendet, die ein Peptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge kovalent gebunden haben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennen. Das Verfahren be steht darin, daß man Versuchstiere, vorzugsweise Inzucht- Mäuse, mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, in Kombination mit einem Adjuvans, über mehrere Monate mit mindestens vier Immunisierungen in vier- bis sechswöchigem Abstand intraperitoneal immunisiert, Milzzellen gewinnt und mit einer permanenten Myelom-Zellinie fusioniert, die Klone isoliert und hieraus die Antikörper ge winnt.

Bevorzugt wird als Adjuvans Aluminiumhydroxid zusammen mit Bordetella pertussis oder Freund′schem Adjuvans eingesetzt. Das Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, kann an ein Trägerprotein zur Erhöhung der Antigenität gekoppelt werden.

Die bei der Fusionierung nach dem bekannten Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495-497) gewonnenen Primär-Kulturen von Hybridzellen, werden in üblicher Weise, zum Beispiel unter Verwendung eines handelsüblichen Zell sorters oder durch "limiting dilution" kloniert. Es werden jeweils die Kulturen weiterverarbeitet, die positiv gegenüber dem N-terminalen Peptid von kardialem Troponin I reagieren. Man erhält auf diese Weise Hybridoma-Zellinien, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren. Nach bekannten Methoden können diese Zellinien kultiviert und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden.

Die erfindungsgemäßen polyklonalen oder monoklonalen Anti körper eignen sich hervorragend dazu, in einer Probe, bei spielsweise Serum oder Plasma, sehr schnell nach dem Infarkt- Ereignis Herzmuskelnekrosen spezifisch zu bestimmen. Für diese Bestimmungsverfahren können die Antikörper als solche oder Fragmente hiervon, welche die entsprechenden immuno logischen Eigenschaften aufweisen, beispielsweise Fab-Frag mente verwendet werden. Unter dem Begriff Antikörper werden daher sowohl vollständige Antikörper als auch deren Fragmente verstanden.

Als Immunogen, Screeningreagenz bei der Auswahl der mono klonalen Antikörper, Standardmaterial im Immunoassay und Polyhapten beim TINIA-Test wird ein Antigen eingesetzt, das die Aminosäuresequenz

SEQ ID NO 1: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYA

oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält.

Als besonders geeignet haben sich die Antigene erwiesen, die die Aminosäuresequenzen

SEQ ID NO 2: MADGSSDAAR
SEQ ID NO 3: SDAAREPRPA
SEQ ID NO 4: EPRPAPAPIR
SEQ ID NO 5: PAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 6: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 7: APAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 8: PAPIRRRSSNY

enthalten.

Die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 entspricht den 30 N-termi nalen Aminosäuren des humanen cardialen TnI. Die Sequenz von humanem TnIc ist aus Vallins et al., FEBS Letters 270 (1990) 57-61 bekannt. Es war allerdings überraschend, daß durch die Verwendung von Antikörpern, die mittels Peptidimmunogenen hergestellt wurden, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthalten, Herzmuskelnekrosen schon kurz nach dem Infarktereignis nachgewiesen werden konnten. In einigen Fällen gelingt es, erhöhte Serumwerte mit dem erfindungs gemäßen Verfahren schon 30 bis 45 Minuten nach Beginn von Thoraxschmerzen mit Herzbeteiligung festzustellen. Mit den bisher üblichen Immunoassays konnten Herzmuskelnekrosen erst mit Sicherheit 10 Stunden nach dem Infarktereignis nachge wiesen werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt dieser Nachweis schon erheblich früher.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, der in einem Behältnis mindestens einen erfindungsgemäßen polyklonalen oder mono klonalen Antikörper enthält. In mindestens einem weiteren Behältnis sind die übrigen zur Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens notwendigen Komponenten und Reagenzien, wie beispielsweise die Festphase, die mit Streptavidin be schichtet sein kann, weitere einfindungsgemäße Antikörper, die markiert sein können, Polyhaptene, Hilfsstoffe, wie Puffer oder Entstörreagenzien, enthalten.

Anhand der nachfolgenden Beispiele soll die Erfindung ver deutlicht werden:

Beispiel 1 Synthese von Peptiden zur Immunogensynthese am Beispiel H- Cys(-Acm)-εAca-Pro-Ala-Pro-Ile-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Asn-Tyr- Amid (entspricht SEQ ID NO 8)

Das Peptid wurde an 180 mg 4-(2′,4′-Dimethoxyphenyl-Fmoc aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/g synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von Fmoc als temporärer und Pmc/tBu/Trt als permanente Schutz gruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgender Aminosäure-Derivate verwendet:

Fmoc-Cys(-Acm)-OH
Fmoc-ε-Aminocapronsäure
2×Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ile-OH
3×Fmoc-Arg(-Pmc)-OH
2×Fmoc-Ser(-tBu)-OH
Fmoc-Asn(-Trt)-OH
Fmoc-Tyr(-tBu)-OH.

Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Diiso propylcarbodiimid/H-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die Amino säurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungszeiten betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 äquivalenten Amino säure-Derivaten zweimal durchgeführt. Die temporäre Schutz gruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 20 Minuten abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durch geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen, außer Acm, erfolgte mit einem Gemisch aus 95% Trifluoressigsäure, 3% Ethandithiol und 2% Anisol innerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösung wurde abfiltriert, mit der 10fachen Menge Diisopropylether versetzt und der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20- %iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Es fielen 107 mg weißes Lyophilisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kon trolliert (92% Area), die Identität mittels Massenspektro skopie (MH+: 1603) geprüft.
Abkürzungen:

Abkürzungen:
Fmoc-:
Fluorenylmethyloxycarbonly-
-tBU:	tertiär Butyl-
Trt-:	Trityl-
Acm-:	Acetamidomethyl-
HPLC:	Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Pmc-:	Pentamethylchroman-

Beispiel 2 Herstellung von Immunogenen Synthese und Charakterisierung von Troponin I-Immunogenen

5 Peptidimmunogene, die die Aminosäuren 1-10, 6-15, 11-20, 16-26 und 1-30 des N-terminalen Troponin I umfassen, wurden unter Verwendung der folgenden Peptide hergestellt:

Peptid 1:
TropI, H(1-10) Cys(-Acm)-NH₂ (MADGSSDAARZC)
[Entspricht SEQ ID NO 2]

Peptid 2:
TropI, Cys(-Acm) 6-15-NH₂ (CZSDAAREPRPA)
[Enspricht SEQ ID NO 3)

Peptid 3:
TropI, Cys(-Acm) 11-20) NH₂ (CZEPRPAPAPIR)
[Entspricht SEQ ID NO 4]

Peptid 4:
TropI, Cys(-Acm) 16-26-NH₂ (CZPAPIRRRSSNY)
[Entspricht SEQ ID NO 5]

Peptid 5:
TropI, H (1-30) Cys-NH₂ (MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYAC)
[Entspricht SEQ ID NO 1]

C: Cys(-Acm)-OH
Z: ε-AHS-OH.

Die Synthese wird am Beispiel von TropI, H(1-10)Cys-NH₂ mit der Aminosäuresequenz MADGSSDAARZC beschrieben.

Als Trägerprotein wird Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), das mit Maleimido-hexanoyl-N-hydroxysuccinimid aktiviert wurde (KLH-MH, Boehringer Mannheim Biochemica), verwendet.

Abspaltung der Acetamidomethyl- (Acm)-Schutzgruppe am Cystein

Alle Lösungen werden vor Gebrauch mit Argon gespült, da die Acm-Schutzgruppe unter Ausschluß von Sauerstoff abgespalten wird. 35,4 mg (28 µmol) des Peptids 1 werden in 20 ml 50- %iger Essigsäure (v/v, pH = 4) gelöst. Dazu gibt man 117 mg (0,7 mmol) Silberacetat und rührt die Lösung unter Argon im Dunkeln für 20 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird für 15 Minuten Argongas eingeleitet, danach 30 Minuten lang H₂S (g). Das restliche H₂S-Gas wird durch nochmaliges Ein leiten vor Argon (10 Minuten) ausgetrieben. Man zentrifugiert bei 4000 U/min den schwarzen Niederschlag ab und filtriert die Lösung über einen 0,45 µm Filter. Die Lösung wird 1 : 1 mit bidest. Wasser verdünnt und lyophilisiert. Die Freisetzung der SH-Gruppe wird durch Reversed-Phase-HPLC überprüft. Dazu wird das Peptid mit 6-Maleinimidohexansäure derivatisiert, Acm-geschütztes und MH-derivatisiertes Peptid lassen sich dann aufgrund unterschiedlicher Retensionszeit auf der HPLC unterscheiden (Vydac C18, 5 µm, 300 A, 4,6×250 mm; 0-45% B in 30 Minuten; A: 0,1% TFA in H₂O; B: 0,1% TFA in Acetonitril/H₂O 65 : 35).

Eine Quantifizierung der Sulfhydrylgruppe wurde nach Ellman, G.L. (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77 durchgeführt. Man erhielt 35 mg (97% d. Th.) ungeschütztes Peptid.

Konjugation an Maleinidohexanoyl aktiviertes KLH

Als Trägerprotein wird Maleimidohexanoyl aktiviertes Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH-MH, Boehringer Mannheim Biochemica) verwendet. Unmittelbar vor der Peptidkopplung wird die Proteinkonzentration durch BCA-Proteinbestimmung (Bicin choninic acid, Pierce Company, Rockford, IL, USA) und der MH- Gehalt von KLH-MH anhand es Ellman′s Testes bestimmt. Zu 16,7 mg (5,4 nmol) KLH-MH mit einer Beladung von 547 MH-Gruppen pro Äquivalent KLH in 6,6 ml Phosphatpuffer (20 mM K₂HPO₄, 20 mM KH₂PO₄, 10 mM CaCl, 0,2% Saccharose, pH7) werden tropfen weise 10,5 mg (8,8 µmol) des entschützten Peptids in 3 ml Phosphatpuffer gegeben. Der pH-Wert wird mit verdünnter NaOH auf 6-7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur langsam geschüttelt. Zur Abtrennung des überschüssigen Peptids wird der Reaktionsansatz auf eine Gel filtrationssäule geladen (AcA 202, 24×4 cm, IBF Bio technics) und das Protein/Peptid-Konjugat mit oben erwähntem Phosphatpuffer eluiert.

Die Proteinkonzentration wird wiederum durch BCA bestimmt, die Peptidkopplungseffizienz mittels Ellman′s Test. Man er hielt 14,8 mg (72% d. Th.) des Immunogens mit einer Beladung von 547 Peptid/KLH-MH.

Analog dieser Vorschrift wurden auch alle anderen Peptid- Immunogene hergestellt.

Beispiel 3 Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen ein Peptid der N-terminalen Sequenzen des Troponin I Proteins

Balb/c-Mäuse, 8-12 Wochen alt, wurden mit je 100 µg Peptid- Immunogenen aus dem Beispiel 2, mit komplettem Freund′schem Adjuvans, intraperitoneal immunisiert. Nach 6 Wochen wurden drei weitere Immunisierungen in 4wöchigem Abstand durchge führt. Dabei wurden jeweils 50 µg Immunogen, an Aluminium hydroxid und Bordetella pertussis adsorbiert, intraperitoneal verabreicht. Eine Woche nach der letzten Immunisierung er folgte eine Blutentnahme und die Bestimmung des Antikörper titers im Serum der Versuchstiere. Bei positivem Verlauf der Immunisierung wurde fusioniert. Vier Tage vor der Fusionie rung wurde jeweils noch einmal mit 50 µg Immunogen in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung intravenös immunisiert. In Anlehnung an Galfre, (Methods in Enyzmology, 73 (1981) und Köhler, Milstein, Nature 256 (1975), s. 495-497) wurden 1× 10⁸ Milzzellen einer immunisierten Maus mit 2×10⁷ Myelom zellen (P3x63Ag8-653, ATCC-CRL 8375) gemischt und mit PEG- Lösung fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden mit 5×10⁴ Zellen pro Vertiefung in 24well-Platten ausplattiert und in Selektionsmedium kultiviert. Nach 7-10 Tagen, wenn Klon wachstum sichtbar war, wurde der Kulturüberstand der Primär kulturen auf Spezifität im ELISA-Verfahren getestet. Die Primärkulturen, die antigen-spezifische Antikörper ent hielten, gehen mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierenden Zell sorters (FACS) in die Einzelzellablage. Die erhaltenen Klone wurden kultiviert und auf Spezifität im ELISA-Verfahren ge testet. Aus positiven Klonen wurden Hybridoma-Zellinien etabliert und größere Mengen an Antikörpern, mittels Zell fermenter beziehungsweise Aszitesproduktion hergestellt.

Für die Bestimmung der Spezifität der Antikörper wurde ein ELISA-Verfahren als Testprinzip verwendet.

Mikrotiterplatten (Firma Nunc) wurden mit T-RSA (thermisch aggregiertes RSA) beschichtet und mit 1µg/ml biotinyliertem Peptid beladen. Nach einem Waschschritt erfolgte die Inkuba tion der Antikörperprobe. Nach einem erneuten Waschschritt erfolgte die Inkubation des Nachweisantikörpers, mit poly klonalem Schaf-anti-Maus-Fcg, Fab-Peroxidase-Konjugat. Nach einem weiteren Waschschritt wurde die Peroxidaseaktivität mit Farbsubstrat (ABTS) bestimmt.

Beispiel 4 Synthese von Peptiden als Teststandards Synthese von H-Met-Ala-Asp-Gly-lSer-Ser-lAsp-Ala-Ala-Arg-Glu- Pro-Arg-Pro-Ala-Pro-Ile-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Asn-Tyr-Amid (entspricht SEQ ID NO 6)

Das Peptid wurde an 120 mg 4-(2′,4′-Dimethoxyphenyl-Fmoc aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/g synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von Fmoc als temporärer und Pmc/tBU/Trt/OtBu als permanente Schutzgruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgender Fmoc-Aminosäure-Derivate verwendet:

Met
5×Ala
2×Asp(-OtBu)
Gly
4×Ser(tBU)
5×Arg(-Pmc)
Glu(OtBu)
4×Pro
Ile
Asn(-Trt)
Tyr(-tBu).

Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Diiso propylcarbodiimid/N-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die Amino säurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungszeiten betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 Äquivalenten Amino säure-Derivat zweimal durchgeführt. Die temporäre Schutz gruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 30 Minuten abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durch geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen erfolgte mit einem Gemisch aus 95% Trifluoressigsäure, 3% Ethandithiol und 2% Anisol innerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösung wurde abfiltriert, mit der 10fachen Menge Diisopropylether versetzt und der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20%iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Es fielen 29.5 mg weißes Lyo philisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kontrolliert (60 % Area). Das Rohpeptid wurde über eine 20 mm×300 mm RP- HPLC-Säule (Säulenmaterial: C-18, 5µ, 300 A) mit einem Gradientensystem von 0% B auf 100% B in 100 Minuten (Puffer A: 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser, Puffer B: 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril 40 : 60) auf eine Reinheit lt HPLC von 97% gereinigt.

Nach Vereinigung der Hauptfraktionen, Eindampfen im Wasser strahlvakuum auf 30% und Lyophilisation wurden 9.75 mg weißes Lyophilisat erhalten. Die Identität wurde mittels Massenspektroskopie (MH+: 2827) geprüft.

Abkürzungen
Fmoc-:
Fluorenylmethyloxycarbonyl-
-tBU:	tertiär Butyl-
-Trt:	Trityl-
-OtBu:	tertiär Buthylester
HPLC:	Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Pmc-:	Pentamethylchroman-
Boc-:	tertiär Butyloxycarbonyl.

Beispiel 5 Synthese von biotinylierten Peptiden als Sceeningreagenzien Synthese von H-Lys(-Bi)-βAla-εAca-βala-Ala-Pro-Ala-Pro-Ile- Arg-ARg-Arg-Ser-Ser-Asu-lTyr-lAmid (entspricht SEQ ID NO 7)

Das Peptid wurde an 30 mg 4-(2′,4′-Dimethoxyphenyl-Fmoc aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/g synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von Fmoc als temporärer und Pmc/tBU/Trt/DmTr/Boc als permanente Schutzgruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgender Fmoc-Aminosäure-Derivate verwendet:

DmTR-Biotin
Boc-Lys(-Fmoc)-OH
2×Fmoc-βAla-OH
Fmoc-ε-Aminocapronsäure
2×Fmoc-Ala-OH
2×Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ile-OH
3×Fmoc-Arg(-Pc)-OH
2×Fmoc-Ser(-tBU-OH
Fmoc-lAsn (-Trt)-OH
Fmoc-Tyr(-tBu)-OH.

Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Diisopropylcarbodiimid/N-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die Aminosäurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungs zeiten betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 Äquivalenten Aminosäure-Derivat zweimal durchgeführt. Die temporäre Schutzgruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 20 Minuten abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durch geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen erfolgte mit einem Gemisch aus 95% Trifluoressigsäure, 3% Ethandithiol und 2% Anisol innnerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösung wurde abfiltriert, mit der 10-fachen Menge Diisopropylether versetzt und der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20%iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Es fielen 22,5 mg weißes Lyo philisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kontrolliert (82 % Area), die Identität wurde mittels Massenspektroskopie (MH+: 1996) geprüft.

Abkürzungen
Fmoc-:
Fluorenylmethyloxycarbonyl-
-tBU:	tertiär Butyl-
-Trt:	Trityl-
HPLC:	Hochdruckflüssigkeitschromatographie
DmTr:	Dimethoxyltrityl
Boc-:	tertiär Butyloxycarbonyl

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskel nekrosen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe mit mindestens einem Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das die Amino säuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers aus dem Serum bzw. den immortalisierten und klonierten Milz zellen der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren, versetzt und den sich bildenden Komplex in geeigneter Weise nachweist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunogen eine der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO 2-8 enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines Sandwich-Assays erfolgt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines kompetitiven Immunoassays erfolgt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines homogenen Immunoassays, wie beispielsweise einem CEDIA® erfolgt.

6. Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immuni sierung mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des Anti körpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren.

7. Monoklonaler Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das die Sequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6 Amino säuren Länge enthält, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren und Isolierung des Antikörpers aus den klonierten Zellen nach bekannten Verfahren.

8. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5 zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskel nekrosen.

9. Verwendung eines Immunogens, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält zur Herstellung von poly klonalen oder monoklonalen Antikörpern, als Standard material bei Immunoassays oder als Polyphapten in kompetitiven Immunoassays.

10. Testkit zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Behältnis mindestens ein Antikörper gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 und in mindestens einem weiteren Behältnis die übrigen für den Immunoassay notwendigen Komponenten enthalten sind.