JPH01302162A

JPH01302162A - ヒトミオグロビンの測定方法

Info

Publication number: JPH01302162A
Application number: JP13168988A
Authority: JP
Inventors: Koichi Morimoto; 康一森本; Nobuyuki Kawai; 信之河合; Kuniyo Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1988-05-31
Filing date: 1988-05-31
Publication date: 1989-12-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ヒトミオグロビンを特異的に認識するモノク
ローナル抗体を使用した、試料中のヒトミオグロビンの
測定方法に関するものである。

ヒトミオグロビンは、１５３アミノ酸残基を有する分子
量的１７５００の、１本のポリペプチド鎖と１個のヘム
基からなる金属蛋白質であり、筋肉細胞等の筋組織にお
ける酸素の運搬、貯蔵機能等を担っている。臨床的には
、分子量が小さいために比較的容易に血液あるいは尿中
に遊離する。

従って、遊離したヒトミオグロビンをａｌｌＪ定するこ
とにより心筋、骨格筋等の病理診断が可能である。

例えば健康な成人の血液中のヒトミオグロビン濃度は約
５０　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌと報告されているが、急性心
筋硬水では血液中のヒトミオグロビン濃度が上昇するこ
とが知られている。他にも遊離ミオグロビンを測定する
ことで筋ジストロフィー症、筋炎等の骨格筋疾患、更に
は甲状腺疾患、腎不全、アルデステロン症等の内分泌疾
患等を診断することができる。近年では、ヒトミオグロ
ビンが横紋筋肉肚の腫瘍マーカーであるとの報告もある
（Ｂｒｏｏｋｓ　Ｊ、Ｊ、、Ｃａｎｃｅｒ、５０．１７
５７１９８２年）。

（従来の技術）ヒトミオグロビンの測定方法としては、ポリエチレング
リコール法、ポリクローナル抗体を用いたＲＩＡ法（日
本臨床４３巻秋季臨時増刊号１９８５年、特開昭５４−
１１２３０号、特開昭５４−１１２３１号、Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｌｃｌｎｅｖｏｌ、６．Ｎｏ５９
９１〜９９５頁　１０００年）が知られている。

（発明が解決しようとする課ｍ）従来知られたポリエチレングリコール法においては、操
作性あるいは測定精度に課題かあり、ＲＩＡ法において
も、使用する抗体がかならずしも均一な性質を有してい
ないことから、ｌ１ｌｌｌ＋定精度に問題がある。

本発明者らは従来技術の課題を解決した、操作が簡単で
測定精度の高いヒトミオグロビンの測定方法について鋭
意検討したところ、モノクローナ明は、　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　又（ａ）ヒトミオグロビンを
特異的に認識する固定化されたモノクローナル抗体（１
）と試料を接触させる工程（ｂ）ａで生じる免疫反応生成物と、モノクローナル抗
体（１）とは異なる部位でヒトミオグロビンを特異的に
認識する、標識された又は標識されていないモノクロー
ナル抗体（２）を接触させる工程（ｃ）ｂで標識されていないモノクローナル抗体を使用
した場合には、ｂで生じる免疫反応生成物と、モノクロ
ーナル抗体（２）を特異的に認識する標識された抗体を
接触させる工程（ｄ）遊離の標識された抗体を除去する工程（ｅ）標識
を直接的又は間接的に検出してｂ又はＣで生じる免疫反
応生成物を定量する工程からなることを特徴とするヒト
ミオグロビンの測定方法、（以下１の方法と略す）及び
、（ａ）ヒトミオグロビンを特異的に認識する固定化さ
れたモノクローナル抗体と、試料及び標識されたヒトミ
オグロビンを接触させる工程（ｂ）遊離の標識されたヒ
トミオグロビンを除去する工程（ｃ）標識を直接的又は間接的に検出してａで生じる免
疫反応生成物を定量する工程からなることを特徴とするヒトミオグロビンの７１Ｐ１
定方法（以下２の方法と略す）を提供するものであり、以下詳細に説明する。

（課題を解決するための手段）まず、１の方法について詳細に説明する。使用するモノ
クローナル抗体（１）及び（２）は、Ｇ、Ｋ”ｔ５ｈ１
ｅｒ、Ｃ，Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ
、２５６　４９５．１９７５年）に従って、例えば後の
参考例の様にして調製すれば良い。本発明の参考例では
、ヒトミオグロビンに対する親和定数が１０　〜１０　
　である、数種のモノクローナル抗体が得られた。

モノクローナル抗体（１）を固定化するには、通常知ら
れた化学的方法等を用いれば良いが、更には、例えば固
相に前記したモノクローナル抗体（１）のＦｃ領域を特
異的に認識する抗体を化学的に固定化し、その後、該抗
体を介してモノクローナル抗体（１）を固定化しても良
い。固相としては、例えばポリスチレン、ポリエチレン
、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロース粒
子、ラテックス、アガロース、セルロース、ポリメタク
リレート等を用いることが出来る。

試料としては、例えば尿、血液等を用いれば良く、特別
の制限はない。

（頂識されたモノクローナル抗体（２）は、標識物質と
前記した様にして得られるモノクローナル抗体を通常知
られた化学的方法により結合させることで調製出来る。

標識としては、例えば３Ｈ１１２５１３１１等の放射性
物質を用いることも出来るが、安全性、管理の容品さ等
の面から、例えばフルオレスカミン、フルオレラセンチ
オシアネート、テトラローダミンインチオシアネート等
の通常のイムノアッセイで使用される蛍光物質等が好ま
しく、更には、微量のヒトミオグロビンの測定か可能な
、例えばペルオキシダーゼ、β−Ｄガラクトシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、
β−グルクロニダーゼ等の、通常のエンザイムイムノア
ッセイで使用される様な酵素等がより好ましい。

標識されていないモノクローナル抗体（２）を用いた場
合には、前記した様な標識物質で標識された、モノクロ
ーナル抗体（２）のＦｃ領域を特異的に認識する抗体を
使用して、固相上に標識物質を有する免疫反応複合体を
形成させる。この複合体は詳しくは、固相−５５−モノクローナル抗体（１）−ヒトミオグロ
ビン−モノクローナル抗体（２）−５５−標識物質と表される。ここで、−５Ｓ−は前記した様にモノクロ
ーナル抗体（１）又は（２）とは異なる、ポリクローナ
ル又はモノクローナル抗体を介しても良い結合である。

ただし、本発明で同一のサブクラスに属するモノクロー
ナル抗体（１）及び（２）を使用する場合には制限が生
じる。即ち、同一のサブクラスに属するモノクローナル
抗体は、そのＦｃ領域が同一であることから、例えばモ
ノクローナル抗体（２）のＦｃ領域を認識する様に調製
された、標識された抗体が誤ってモノクローナル抗体（
１）を認識し、複合体固）ｌ−５−モノクローナル抗体（１）−外一標詭物質を形成する可能性があるからである。従って本発明では
、抗体の調製等の操作を簡便にするためにも固相に化学
的に結合したモノクローナル抗体（１）及び標識物質と
化学的に結合したモノクローナル抗体（２）の２種のモ
ノクローナル抗体を使用することが好ましい。ヒトミオ
グロビンを特異的に認識するモノクローナル抗体（１）
、（２）以外の抗体を用いる場合には、サブクラスの異
なるモノクローナル抗体（１）、（２）を使用したり、
あるいは少なくとも標識物質と直接（他の抗体を介さず
）結合したモノクローナル抗体（２）を使用することが
好ましい。

標識されたモノクローナル抗体゛（１）又は（２）のう
ち、遊離の（間接的に固相に固定化されていない）標識
された抗体の除去には、例えば通常のイムノアッセイで
使用されるＢ／Ｆ分離法等の洗浄法等を行えば良い。

標識の検出は、例えば標識物質として放射性物質または
蛍光物質等のそれ自体検出可能な物質を用いた場合には
、通常の方法により直接行えば良い。例えば酵素を標識
物質として使用した場合には、該酵素の作用により検出
可能な物質に変化する基質を添加した後、該検出可能な
物質を検出しその結果に基づいて間接的に検出すれば良
い。

続いて本発明が提供する第２の方法について詳細に説明
する。

使用するモノクローナル抗体は、第１の方法において説
明した様にして調製すれば良い。モノクローナル抗体を
固定化するための方法及び固相についても同様である。

第２の方法においては、他のモノクローナル又はポリク
ローナル抗体を用いることに同等制限はない。標識され
たヒトミオグロビンの調製方法としては、例えば、市販
のヒトミオグロビンと標識物質を、公知の方法に従って
化学的に結合させれば良く、標識物質としては第１の方
法で説明した様なものが使用出来る。

試料、遊離の標識されたヒトミオグロビンを除去する方
法及び標識物質の検出方法についても第１の方法と同様
に行えば良い。

（発明の効果）本発明によれば、簡便な操作により高精度のヒトミオグ
ロビンの測定が可能である。参考例で説明される様にし
て得られたヒトミオグロビンに対するモノクローナル抗
体を用いた場合には、実施例で示される様に１〜２００
ｎｇ／ｍｌの範囲内でのヒトミオグロビンの測定をも可
能である。

更に、本発明ではモノクローナル抗体の固相への固定化
及び標識物質のモノクローナル抗体あるいはヒトミオグ
ロビンへの結合を前もって行っておくことで、更に操作
を簡便にし、要する時間を短縮することが可能である。

このことは、短時間に多数の検体（試料）を測定すると
いう臨床的な要望を解決するものである。

以下に本発明の実施例で使用したモノクローナル抗体の
調製の手順を参考例として詳説するが、モノクローナル
抗体の調製は、本参考例に限定されるものではない。

（参考例）モノクローナル抗体の調製は、前記した様にＧ、に６ｈ
ｌｅｒとＣ１旧１ｓｔｅｌｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、
２５８゜４９５．１９７５年）に従った。

（１）ヒトミオグロビン感作動物細胞の調製Ｂａ１ｂ／
ｃマウス（メス）をヒトミオグロビンで免疫した。免疫
は、マウスの腹腔にマウス当り、アジュバント（Ｆｒｅ
ｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｊｕｖａｎｔ　　；
ギブコ社製）と市販のヒトミオグロビン（ケンブリッジ
社製）１００Ｐｇを乳化させた試料１００ＪＪＩを投与
して行った。２週間後、追加免疫としてマウス当り前記
ヒトミオグロビン１００Ｊ、１ｇとアジュバント（Ｆｒ
ｃｕｎｄ’ｓ　１ａｃｏＩｌｐｌｅｔｃ　ａｊｕｂａｎ
ｄ　　；ギブコ社製）を乳化した試料１００ＪＪＩを腹
腔に投与した。その１週間後、最終免疫としてマウス当
りヒトミオグロビン１１００Ｐを溶解したリン酸緩衝化
生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１％リン酸
緩衝液；以下ＰＢＳと略す）１００）ＩＩを腹腔に投与
した。最終免疫の３日後、マウスの肺臓を無菌的に抽出
し、１５％子牛脂児血清（以下１５％ＦＣＳと略す）を
含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｃｃｃｏ’ｓ　ｌ１ｏｄｉｆｉ
ｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｓｅｄｌｕｍ　；ギブコ社製）
を用いて肺臓細胞を還流流出させた。流出液をナイロン
メツシュで濾過し、遠心チューブに入れ、１０００　ｒ
　ｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を捨て、０．１５Ｍ
塩化アンモニウム、１ｍＭＥＤＴＡを含む０．０１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ７，２）を用いて細胞ペレット中の赤血
球を溶血させ、遠心分離し、更に細胞ペレットをＤＭＥ
Ｍで２回遠心洗浄して牌細胞とした。

（２）骨髄細胞腫細胞の調製骨髄腫細胞としては、Ｂ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウス由
来の８−アザグアニン耐性株であるＳ　Ｐ　２１０−Ａ
ｇ１４　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１　：以下５ｐ２１０
と略す）を使用した。細胞融合を行う１週間前までＳ　
Ｐ　２１０を２０ｐｇ／ｍｌの８−アザグアニン、１５
％ＦＣ９を含むＤＭＥＭで培養し、その後細胞融合をお
こなう日まで１５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭで培養した。

細胞融合直前に５Ｐ２１０を無菌的にＤＭＥＭを用いて
１１０００ｒｐ、１０分間の遠心分離で洗浄した。

（３）細胞融合１の様にして調製した牌細胞と２の様にして調製した骨
髄腫細胞を５：１の割合で混合し、１゜００　ｒ　ｐｍ
で１０分間遠心分離して細胞ペレットを得た。遠心チュ
ーブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面に薄く広げ、そ
の中に３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレングリコ
ール（Ｍ　Ｅ　ＲＫ社製ポリエチレングリコール４００
０）を含むＤＭＥＭ溶液０．５ｍｌをチューブを回しな
がら少しずつ滴下した。１分間チューブを回転させてペ
レットと混合させた後、３０秒に１ｍｌの割合でＤＭＥ
Ｍを１０回加えた。次に、Ｆｅ２を２ｍｌゆっくりと加
え、１１０００ｒｐで１０分間遠心した。細胞ペレット
を１５％ＦＣＳとＩ×１０　　Ｍヒポキサンチン、４Ｘ
１０−７Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジ
ンを含むＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ培地と略す）を用いて
２回、１０００　ｒ　ｐｍ、１０分間の遠心洗浄した後
、同溶液でペレットを懸濁し、９６ウエルのプレート（
Ｆａ　１ｃｏｎ＃３０７２）に２００７Ｊ　１ずつ分注
した。なお、該懸濁２００ＪＪ　１中には、５Ｘ１０５
個の細胞が存在していた。

分注後、３日ごとにＨＡＴ培地を１００）＋　１／ウエ
ルずつ交換し、３週間後からはＩ　Ｘ　１０−”　Ｍヒ
ボキサンチン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジン、１５％Ｆ
Ｃ３を含むＤＭＥＭ　（以下ＨＴ培地と略す）を交換培
地として用いた。

（４）ハイブリドーマの選択９６ウエルのプレートに細胞懸濁液を分注した後、１０
日後に細胞コロニーが認められた。そこで、Ｅ　Ｌ　Ｉ
　Ｓ　Ａ　（Ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ　；酵素免疫＋１）Ｊ定法
）を行い、培地上澄の抗ヒトミオグロビン抗体の存在を
調査した。

まず、９６ウエルのイミュノプレート（インターメット
社製）に２ｐｇ／ｍｌのヒトミオグロビン溶液を５０）
＋　１ずつ分注し、３７℃で１．５時間放置した。ウェ
ル中の溶液を除去し、０．０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ
）−２０を含むＰＢＳ（以下ＰＢＳ−Ｔと略す）で３回
洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ
と略す）を含むＰＢＳ−Ｔ溶液３００ｐ　１を各ウェル
に添加し、３７℃で１．５時間ブロッキング処理した。

次に各ウェルに培地上澄を１００）ＩＩずつ分注し、３
７℃で１．５時間放置した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで
３回洗浄し、ＰＢＳで４０００倍希釈したペルオキシダ
ーゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製
）を５０）１１ずつ分注して３７℃で１．５時間放置し
た。続いてＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、基質溶液（１，２
％２．２−アミノジー（３−エチルベンズチアゾリン硫
酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）　及び０．０１％
過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，１
））を各ウェルに１００ＪＪＩずつ添加した。３０分後
、２００ｍＭシュウ酸溶液１００ＪＪＩを添加して酵素
反応を停止させ、４１５ｎｍでの吸光度を測定し、抗体
の存在を確認した。

（５）コンディショニングメディウムの調製Ｂ　ａ　１
　ｂ　／　ｃマウス（メス）をを椎脱臼させ、無菌的に
その腹腔内に冷蔵しておいた０、３４Ｍサッカロース溶
液を注入した。３分後、左側腹部より腹腔内溶液を回収
し、１１０００ｒｐで５分間遠心分離した。上澄を廃棄
し、細胞ペレットに１５％ＦＣ３−ＤＭＥＭを添加して
撹拌した後、３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％湿度条
件下で一晩培養し、上澄を集め、０．２２ＪＪｍのメン
ブレンフィルターで濾過してこれをコンディショニング
メディウムとした。

（６）クローニング抗体産生が認められたハイブリドーマについて限界希釈
法により単一クローニングした。（５）で３８’Ａした
コンディショニングメディウム１ｍｌを含むＨＡＴ培地
２０ｍ１に、ハイブリドーマを懸濁し、２００Ｐｌずつ
９６ウエルのプレート（Ｆａ　ｌ　ｃｏｎ＃３０７２）
に分注した。なお、各ウェルについて１個のハイブリド
ーマが分注される様にハイブリドーマ量を調整した。１
０日後、細胞コロニーが認められたウェルについて（４
）において行った様にＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により抗ヒトミ
オグロビン抗体産生ハイブリドーマを選択し、さらに上
記の様なりローニング操作を再度行って単一ハイブリド
ーマ２７Ｆｌを得た。

（７）抗ヒトミオグロビン抗体の精製退会６〜１０のＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃ　マウス（メス
）ノ腹腔に、マウス当り０．５ｍｌのブリスタン（２゜
６．１０．１４−テトラメチルペンタデカン：アルドリ
ッチ社製）を投与した。２週間後、（６）で得られた抗
ヒトミオグロビン抗体産生ハイブリドーマ株をマウスの
腹腔内に１ｆ！Ｉｉ当り２Ｘ１０６細胞個移植した。１
０日後、生成した腹水を注射針を用いて１／２０量の０
．２Ｍ　　ＥＤＴＡを入れた遠心チューブ内に滴下し、
４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い上澄を得た
。採取した上澄を５０％硫酸アンモニウム沈澱分画法に
従って粗精製した後、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過をおこなって精製した。

抗体の純度はメルカプトエタノール還元下での１２％５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い確認した。こ
のとき、検出されたバンドは、１本の重鎮と１本の軽鎖
の２本のバンドだけであった。

（８）親和定数の７＃Ｊ定得られたモノクローナル抗体のヒトミオグロビンに対す
る親和定数は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｔｈｅＥｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　ｖｏ
ｌ、１．ｃｈａｐｔｅｒ　３ｇに記載された方法により
測定した。その結果、本参考例で得られたモノクローナ
ル抗体は、１０−７〜１０　　　Ｍの親和定数を有して
いた。

以下本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）（１）抗ヒトミオグロビン抗体の固定化未処理のマイク
ロタイタープレート（９６ウエル・ヌンクプレート、イ
ンターメッド社製）の各ウェルに、マウスから参考例の
様にして得た抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体を
３Ｈｇ／ｍｌの割合で含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９
，６）を２００Ｐｌ添加し、４℃にて一晩インキエベー
トした。次に、各ウェルから炭酸緩衝液を除去し、０．
０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含むリン酸緩衝
化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１を含む０．０１％リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２））（以下ＰＢＳ−Ｔと略す）
で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（以下
ＢＳＡと略す）を含むＰＢＳ−Ｔ溶液３００Ｐｌを各ウ
ェルに添加し、４℃でブロッキング処理した。

なお、このモノクローナル抗体を固定化したプレートは
、測定まで４℃条件下で保存した。

（２）モノクローナル抗体の標識標識物質としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＴＯＹ
ＯＢＯ社製；以下ＨＲＰと略す）を用いた。

５　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの割合でＨＲＰを含む０．３Ｍ
重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に、１％１−フ
ルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液を
０．１ｍｌ添加し、室温にて１時間反応させた後、０．
０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を１ｍｌ添加し、更に
３０分間反応させた。

０．１６Ｍエチレングリコール１ｍｌを添加して未反応
の過ヨウ素酸ナトリウムを除去した後、０、ＯＩＭの炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に対して透析し、続
いてマウスから参考例の様にして得た抗ヒトミオグロビ
ンモノクローナル抗体を５ｍｇ添加し、５時間反応させ
、水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加して４℃で一晩
放置した。

未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するため、０．
８５％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４℃で一晩撹拌しながら
透析した後、高速液体クロマトグラフィー（東ソー（株
）社製、ＴＳＫゲルＧ−３０００ＳＷ）を用いて精製し
た。

（３）試料中のヒトミオグロビンの測定１の様にして調
製したプレートを室温に戻し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄し
た後、既知量のヒトミオグロビンを含む標準試料を各ウ
ェルにそれぞれ２０）１１添加した。次に２の様にして
調製したＨＲＰ標識モノクローナル抗体をＰＢＳ−Ｔで
希釈し、各ウェルに２００ｕ　ｌずつ添加した。室温で
３時間インキュベートした後、各ウェルの溶液を除去し
、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。

各ウェルに、１．２％　２，２−アジノジー（３−エチ
ルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）及び０．０１％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ５，１）を話質溶液として２００Ｐｌ添加
し、室温で３０分間反応させた後、０．２Ｍシュウ酸溶
液を１００Ｊｕｌ添加して酵素反応を停止させた。自動
マイクロタイタープレートリーダー（東ソー（株）社製
、ＭＰＲ−Ａ４）を用いて波長４１５ｎｍ、対照波長４
９２ｎｍで各ウェルの吸光度を測定したところ、１〜２
００ｎｇ／ｍｌの範囲でヒトミオグロビンを測定するこ
とが出来た。

Claims

【特許請求の範囲】１）（ａ）ヒトミオグロビンを特異的に認識する固定化され
たモノクローナル抗体（１）と試料を接触させる工程（ｂ）ａで生じる免疫反応生成物と、モノクローナル抗
体（１）とは異なる部位でヒトミオグロビンを特異的に
認識する、標識された又は標識されていないモノクロー
ナル抗体（２）を接触させる工程（ｃ）ｂで標識されていないモノクローナル抗体を使用
した場合には、ｂで生じる免疫反応生成物と、モノクロ
ーナル抗体（２）を特異的に認識する標識された抗体を
接触させる工程（ｄ）遊離の標識された抗体を除去する工程（ｅ）標識
を直接的又は間接的に検出してｂ又はｃで生じる免疫反
応生成物を定量する工程からなることを特徴とするヒトミオグロビンの測定方法
。２）（ａ）ヒトミオグロビンを特異的に認識する固定化され
たモノクローナル抗体と、試料及び標識されたヒトミオ
グロビンを接触させる工程（ｂ）遊離の標識されたヒトミオグロビンを除去する工
程（ｃ）標識を直接的又は間接的に検出してａで生じる免
疫反応生成物を定量する工程からなることを特徴とするヒトミオグロビンの測定方法
。３）モノクローナル抗体が、ヒトミオグロビンに対して
１０＾−＾７〜１０＾−＾１＾１の親和定数を有するも
のであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法
。