JPH03156369A - ヒトアルブミンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトアルブミンに特異的なモノクローナル抗
体を利用したヒトアルブミンのｎ１定方法に関するもの
である。

ヒトアルブミンは、分子量的６９．０００で、等電点４
．９の球状タンパク質である。その生理的役割は重要で
、詳しくは種々のイオンや脂肪酸、胆汁色素、他のタン
パク質などの運搬・貯蔵機能や細胞へのアミノ酸の供給
を担っている。臨床的には、糸球体毛細管壁から膜透過
性亢進等で正常血漿成分として比較的容易に尿中にその
ままの形で遊離される（糸球体性蛋白尿）。最近ではこ
の他にも尿と共に排出される蛋白質の存在が明らかにな
っており、その微量物質を正確に定量すれば、臨床的に
病変の存在部位やその進行状態などの診断が可能になっ
た。なかでも尿中ヒトアルブミンを測定は、インスリン
依存型糖尿痛感者（ＩＤＤＭ）やネフローゼ症候群、腎
炎、前硬化症などの腎障害、起立性蛋白尿、キンメルス
チル・ウィルソン病の診断に有用である事が知られてい
る。健常人の一日に排出する尿中のアルブミン量は３〜
３０ｍｇ程度であり、普通３００ｍｇを越えると試験紙
法により陽性と判定される。一般に健常人より多い範囲
のアルブミン尿をマイクロアルブミン尿と臨床的には呼
んでいる。

ＩＤＤＭの発症初期（０〜２年、病期Ｉ）においては尿
中ヒトアルブミンはごく軽度だが、病期１１（２〜１０
年）では運動時の尿中アルブミンの増加が認められる。

さらに発病後１０〜１５年経過すると（病期ＩＩＩ）、
尿中のアルブミンの排出量は３００μｇ　／　ｍ　ｉ　
ｎを越えるほどまでになる。

病期■以降では試験紙法により診断可能となる。

しかしながら試験紙法では尿蛋白が陰性であるが、マイ
クロアルブミン尿の存在するもののうち８４％は糖尿病
性網膜症を合併している例も報告されティる（糖尿病　
ＶＯＬ、３０　ＰＡＧＥ　４２９−４３５１９８７、臨
床　ＶＯＬ、３６　ＰＡＧＥ　ＨＯ９−１３１３１９８
８）　、よって尿蛋白陰性でも網膜症を合併し、尿中ア
ルブミンの増加が認められれば、腎病変の疑いが早期に
診断できる。

特に糖尿病性腎症は、糖尿病における血管障害児の約３
０％を占め、生命予後に影響する大きな合併症である。

１９８３年にはＭ　ｏ　ｇ　ｅ　ｎ　ｓ　ｏ　ｎらによ
り、腎病変の早期に尿中アルブミンを測定することの重
要性が報告されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　ｖｏｌ、
３４　（ｓｕｐｐｌ、２）ＰＡＧＥ６４−６８　１９８
３）。よって尿中アルブミンを精度良く測定することに
より、早期の腎症診断、およびその予防の知見を得るこ
とができる（臨床検査　ＶＯＬ、３３　Ｎｏ、８１９８
９）。

（従来の技術） 尿中ヒトアルブミンの測定法としては、免疫−次拡散法
、免疫比濁法、電気泳動法、４−ハイドロキシアゾベン
ゼン−２−カルボン酸を用いる方法、試験紙法、ｐＨ指
示薬の蛋白誤差反応、ラテックス凝集阻止反応、レート
ネフエロメトリー法、ＲＩＡ法（医学と薬学１８巻４号
１０４１頁、５号１４９９頁、６号１７４７頁、１９８
７年、検査と技術１６巻１２号１３５９頁１９８８年）
、ＥＩＡ法などが知られている。

（発明が解決しようとする課題） 従来知られた免疫−次拡散法、免疫比濁法、電気泳動法
、試験紙法、ｐ１１指示薬の蛋白誤差反応、レートネフ
エロメトリー法では、ある程度の測定誤差は免れないし
、またその感度が低く尿を濃縮する必要性も生じる。４
−ハイドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸を用いる
方法においては血色水混入による誤差が大きいことと操
作性に課題がある。抗ヒトアルブミン抗体感作血球によ
る定量法（公開特許公報　昭５４−８０４１０号）、抗
ヒトアルブミン抗体感作ラテックスによる定量法（公開
特許公報　昭５５−３０６５４号）、ＥＩＡ法、ＲＩＡ
法においても、使用する抗体が抗血清であり必ずしも均
一な性質を有していないこと等から７１１定精度に問題
がある。またＲＩＡ法では放射能を扱える施設が必要で
安全性と簡便性に問題がある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、従来技術の課題を解決し、操作が簡単で
測定精度の高いヒトアルブミンの測定方法について鋭意
検討したところ、モノクローナル抗体を使用することで
これら課題を解決できることを見出し、本発明を完成さ
せた。即ち本発明は（ａ）ヒトアルブミンを特異的に認
識する固定化されたモノクローナル抗体、試料、及び酵
素又は蛍光標識されたヒトアルブミンを接触させる工程 （ｂ）遊離の試料及び標識されたヒトアルブミンを除去
する工程 （ｃ）標識を直接又は間接的に検出す、ることにより、
ａで生じた免疫反応生成物を定量する工程 からなることを特徴とするヒトアルブミンの測定方法で
あり、以下詳細に説明する。

本発明に用いられるヒトアルブミンを特異的に認識する
モノクローナル抗体は、それ自体公知である方法（Ｇ、
Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｃ，Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ
、２５６，４９５゜（１９７５））に準じて製造するこ
とができる。

本発明方法に用いられる抗体を固相に固定化する方法は
、公知の方法を採用でき、例えば固相としては、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネ
ート、セファ０一ス粒子、ラテックス、アガロース、セ
ルロース、ポリメタアクリレートなどが使用される。ま
た前記したヒトアルブミンを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体のＦｃ領域を特異的に認識する抗体を化学的
に固相に固定化し、その後、該抗体を介してヒトアルブ
ミンを特異的に認識するモノクローナル抗体を固定化し
ても良い。

またヒトアルブミンの標識には酵素又は蛍光を用いるが
、公知の方法により標識化および検出することができる
。

標識として酵素を用いる場合、標識物質としては例えば
、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グ
ルクロニダーゼなどの酵素が使われる。蛍光物質を使用
する方法としては、例えば、フルオレスカミン、フルオ
レラセンチオシアネート、テトラローダミンイソチオシ
アネート等が常法によりモノクローナル抗体に結合され
る。

好ましくは、安全で高感度ｉｌｌ定が可能な前記した通
常のエンザイムイムノアッセイで使用される酵素等がよ
り好ましい。

これら固定化抗体、試料及び標識化ヒトアルブミンを接
触させ、免疫反応を行わせる。

次いで遊！（間接的に固相に固定化されていない）の試
料及び標工されたヒトアルブミンの除去には、例えば通
常のイムノアッセイで使用されるＢ／Ｆ分離法等の洗浄
等を行えば良い。

標識の検出は、例えば蛍光物質等の標識物質を用いた場
合には、通常の方法により直接標識の検出を行えば良い
。また酵素を標識物質として使用した場合には、該酵素
の作用により検出可能な物質に変化する基質を添加した
後、該検出可能な物質を検出し、その結果に基づいて間
接的に検出すれば良い。

測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、溶解剤、
緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用いられ
る。

（発明の効果） 本発明によれば、簡便な操作により高精度のヒトアルブ
ミンの測定が可能である。標識に酵素又は蛍光を用いる
ため、放射性物質を用いる場合と比較して感度が向上し
、装置、設備なども簡便なものとなり、ヒトアルブミン
濃度は、１〜２５０ｎ　ｇ／ｍ　１の範囲内で測定する
ことができた。

更に、本発明ではモノクローナル抗体の固相への固定化
及び標識物質のヒトアルブミン標準試料への結合を前も
って行っておくことで、更に操作を簡便にし、測定に要
する時間を短縮することが可能である。例えば０．０２
ｍ１以下の極微量の試料で測定可能であり、以前の方法
のように前処理として尿を濃縮する操作等は不必要であ
る。このことは、短時間に多数の検体（試料）を測定す
るという臨床的な要望を解決するものであり、その応用
範囲は広いと考えられる。

（実施例） 以下本発明を更に詳細に説明するために実施例をしめす
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（モノクローナル抗体の調製） モノクローナル抗体の調製は、前記したＧ、Ｋｏｈｌｅ
ｒとＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒ
　ｅ、　２５６．４９５．（１９７５）　）に従った。

（Ａ）ヒトアルブミン感作動物細胞の調製Ｂａ１ｂ／Ｃ
マウス（♀）をヒトアルブミンで免疫した。免疫は、マ
ウスの腹腔にフロイントの完全アジュバントとヒトアル
ブミン７０μｇ／匹とを乳化させた試料１００μｌを投
与した。それから−ケガ後に追加免疫としてヒトアルブ
ミン７０μｇ／匹をフロイントの不完全アジュバントと
乳化させたちの１００μｌをマウス腹腔に投与した。二
週間後に最終免疫としてヒトアルブミン７０μｇ／匹を
リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０．
０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に溶解
したちの１００μｌを腹腔内に同じく投与した。３日後
この処置マウスの肺臓を無菌的に取出し、氷冷しておい
たデイツシュに１０％子牛脂児血清（以下１０％ＦＣ３
と省略する）を含むＤＭＥＭを入れ、ナイロンメツシュ
をつけておいた。そのメディウムに浸ったナイロンメツ
シュの上に肺臓をゆっくりと置き、肺臓を挟むようにナ
イロンメツシュを半分におり、ピペットで牌臓をつぶし
て牌臓細胞をデイツシュに流出させた。流出液を遠心チ
ューブに入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠心分離して
上澄をすて、更に細胞ペレット中の赤血球を０．１５Ｍ
塩化アンモニウム溶液（１ｍＭエチレンジアミン４酢酸
−２ナトリウム塩（以下ＥＤＴＡと省略する）を含む０
．０１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離
した。さらに細胞ペレットをＤＭＥＭで２回同様に遠心
洗浄して牌細胞とした。

（Ｂ）骨髄腫細胞の調製 骨髄肝細胞としてはＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウス由来
の８−アザグアニン耐性株であるＳＰ２１０−Ａｇ１４
　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１　：以下５Ｐ２１０と省略
する）を使用した。細胞融合を行う１週間前まで２０μ
ｇ　／　ｍ　１の８−アザグアニン。

１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養し、その後細胞融合
日まで１５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭを使用した。細胞融
合直前に、Ｓ　Ｐ　２１０は無菌的にＤＭＥＭで１１０
００ｒｐで１０分間遠心洗浄を２回繰り返し調製した。

（ｃ）細胞融合 上記（Ａ）項で調製した牌臓細胞と上記（Ｂ）項で調製
した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１０００ｒ
ｐｍ、１０分）し細胞ペレットを集めた。遠心チューブ
を軽くたたいて細胞ペレ、ットを壁面にうずく広げ、そ
の中に３７℃に暖めておいた５０％ＰＥＧ　（ＭＥＲＫ
社製ポリエチレングリコール４０００）を含むＤＭＥＭ
溶液０．５ｍｌを遠心チューブを回しながら少しずつ滴
下した。１分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混合
した後、３０秒に１ｍｌの割合で遠心チューブを回転し
ながら３７℃に加温しておいたＤＭＥＭを１０回加えた
。つぎにＦｅ２を２ｍｌゆっくりと入れ、１１０００ｒ
ｐ、１０分間遠心した。細胞ペレットを１０％ＦＣ５と
Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍヒボキサンチン、４　Ｘ　１０−’
Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ　１０−’Ｍチアゾリン含
むＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心
洗浄（１０００ｒｐｍ、１０分間）し、この培養液を９
６ウエルプレート（Ｆａ　１ｃｏｎ＃３０４２）に５Ｘ
１０’細胞個／ウェルになるように２００μｌずつ分注
した。３日日ごとにＨＡＴ培地を１００μｌ／ウエル交
換した。３週間後からは、ｌＸ１０−４Ｍヒボキサンチ
ン、１．６Ｘ１０−’Ｍチアゾリン１０％ＦＣ８を含む
ＤＭＥＭ　（以下ＨＴ培地と省略する）を培地交換に用
いた。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択 ９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められる１０日
目前後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ヒ
トアルブミン抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエルイムノプレート平底（インターメッド社製）
に、ヒトアルブミン２μｇ／ｍｌを５０μｌ／ウェル分
注し、３７℃で１．５時間静置した。ウェルに残ってい
る溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイーン（ｔｗｅ
ｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗
浄した後、０．２％ゼラチンを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液
４００μｌを各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間ブ
ロッキング処理した。つぎに各ウェルに上記培養上清を
１００μｌずつ分注し３７℃で１．５時間静置し、これ
らのウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオ
キシダーゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクツ
、ン社製）４０００倍希釈を５０μｌ／つ±２ルずつ分
注し、３７℃で１．５時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で
３回洗浄したのち、基質溶液（１，２％２．２′−アジ
ノジ−（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモ
ニウム塩ＣＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２
０２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，１
））を各ウェルに１００μｌ添加した。３０分間室温で
放置し、２００ｍＭシニウ酸溶妓を１００μｌを加えて
酵素反応を停止させ、４１５ｎｍでの吸光度を測定し、
酵素活性が認められたウェルに抗ヒトアルブミン抗体を
産生ずるハイブリドーマが存在することから、そのウェ
ルのハイブリドーマをスケールアップし成育させた。以
上のようにして、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマ
を取得した。

（Ｅ）コンデショニングメデウムの調製２６ゲージの注
射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいた０、３
４Ｍサッカロース溶液を吸い取り、Ｂａ１ｂ／ｃマウス
（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を注
入した。注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射
針をつけ氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収し
た。氷冷しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込
み、１１０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心後上清
を廃棄し、細胞ベレットに１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭを加
え攪拌しプッシュに入れた。

３７℃、５９６炭酸ガス濃度、９５％湿度で一晩培養し
、培養上清を集め、０．２２μｍのメンブレンフィルタ
ーで濾過し、これをコンデショニングメデウムとした。

（Ｆ）クローニング 抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培地２０ｍ
１を用意し、クローニングしたいハイブリドーマ細胞を
各ウェルに１個になるように上記培養液中に調整し、２
００μｌ／ウエルずつ９６ウエルプレー）（Ｆａｌｃｏ
ｎ＃３０４２）に分注した。培養１０日目前後から細胞
コロニーが認められるウェルについて、上記（Ｄ）項に
記載した固相酵素免疫測定法をに準じて抗ヒトアルブミ
ン抗体産生ノーイブリドーマを選択し、さらに再度クロ
ーニングを繰り返し単一ノ１イブリドーマを樹立した。

最終的に２７クローンのハイブリドーマを確立した。

（Ｇ）抗ヒトアルブミン抗体の精製 Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃ　マウス（♂）６〜１０週令の
腹腔にブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）を０．５ｍｌ／匹投与し、２週間後上記
（Ｆ）項で得られた抗ヒトアルブミン抗体産生ハイブリ
ドーマ株をマウス腹腔内に各クローンについて２Ｘ１０
’細胞個／匹移植した。

１０日目前後に生成した腹水を、１８ゲージの注射針を
腹腔に差し込み、１／２Ｃ１の０．２Ｍ・ＥＤＴＡをい
れた遠心チューブに滴下させて、遠心チューブを４００
Ｏｒ　ｐｍで１０分間遠心し、上清を集めた。採取した
上清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にしたがって
粗精製し、ＰＢＳ溶液に透析後、ＴＳＫ−ゲル　ＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷイオン交換クロマトグラフイー、ゲル濾過を
おこない精製した。メルカプトエタノール還元下での１
２％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で１本の重鎮
と１本の軽鎖の２本のバンドになったことで抗体の純度
を確認した。

以上の方法により、ヒトアルブミンを特異的に認識する
複数種の精製モノクローナル抗体を得た。

これらのモノクローナル抗体を用いて、以下の競合法に
よるヒトアルブミンの測定を行った。

（ヒトアルブミンの定量） （Ａ）抗ヒトアルブミン抗体の固定化 未処理マイクロタイタープレート（９６ウエル・タンク
プレート、インターメツド社製）の各ウェルにＯ，１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した５μｇ
　／　ｍ　１のマウス由来の抗ヒトアルブミンモノクロ
ーナル抗体の溶液１００μｌを加えて、４℃で一夜イン
キユベートした。次に、各ウェルの溶液を除去し、ＰＢ
Ｓ−Ｔで３回洗浄した後、０．２％ゼラチンを溶解した
ＰＢＳ溶液４００μｌを各ウェルに加えて、４℃でブロ
ッキング処理しそのまま保存した。

なお、このモノクローナル抗体を固定化したプレートは
、測定まで４℃の条件下で保存した。

（Ｂ）ヒトアルブミンの標識化 標識物質としては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＴＯＹ
ＯＢＯ社製−以下ＨＲＰと省す）を用いた。

純水に溶解し３　ｍ　ｇ　／　ｍ　１に調製したＨＲＰ
溶液溶液１セｌ０．１５Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム０．
２ｍｌを添加し、さらに３０分間反応させた。

更に、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）に−晩４℃で
透析した。一方ヒトアルブミンは、０．１５Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９，５）にて−晩四℃で透析した。

その後、調製ＨＲＰ溶液１ご０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，５）を少しづつ添加し、溶液のｐＨを９
〜９．５の範囲内に調製したと同時に、透析しておいた
ヒトアルブミン溶液を加え、室温で２〜３時間静置し反
応させた。シッフ塩基を還元し標識アルブミンを安定化
するため、４ｍｇ／ｍｌ水素化ホウ素ナトリウム溶液０
．１ｍｌを添加して４℃中で２時間静置した。この後、
未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去し、かつ標識ヒ
トアルブミンと未標識アルブミンとを分離するため、Ｔ
ＳＫ−ゲルＧ　３０００５ＷＸＬＸ　（東ソー株式会社
製、商品名）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーにてゲル濾過し、精製ＨＲＰ標１ヒトアルブミンを得
た。ＨＲＰ標識ヒトアルブミンの定量は、１ステツプサ
ンドイツチアツセイ（ＥＩＡ法）、又はＨＲＰ標詭標上
ヒトアルブミン０３ｎｍと２８０ｎｍの吸光度から計算
して求めることが可能である。

（ｃ）試料中のヒトアルブミンの定量 本実施例中の（Ａ）で記述した方法で作製したマイクロ
タイタープレートを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗
浄した後、ＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈したのＨＲＰ標詭ヒト
アルブミン標準試料（ａ度＝４０３ｎｍの吸光度で０．
００５）を各ウェルにそれぞれ１００μｌとヒトアルブ
ミン０−５００μｇ　／　ｍｌの試料を各ウェルに２０
μｌづつ添加した。室温で３時間インキュベートした後
、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。

各ウェルに、０．３ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ及び０．０１
％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ４，１）がら成る基質溶液を各ウェルに１
００μｌ添加し、室温で２０分間酵素反応させた後、１
００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停
止させた。

上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて、波
長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光度を自動マイ
クロタイタープレートリーダー（東ソー株式会社製、Ｍ
ＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を第１図に示す。

縦軸Ｂ　／　Ｂ　ｏは試料中のヒトアルブミン０μｇ　
／　ｍｌのときの吸光度に対する各濃度のヒトアルブミ
ン試料を加えたときの吸光度の割合を示す。図からも明
らかなように、試料中のヒトアルブミンは１〜２５０ｎ
ｇ／ｍｌの範囲で定量できることが確認された。また第
２図にヒトアルブミン濃度の対数とＯ，Ｄ、の関係を示
す。このように非常によい相関関係が得られた。

第１図

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例で測定したヒトアルブミン濃度と吸光度
との関係を示す図、第２図は、実施例におけるヒトアル
ブミン濃度の対数とＯ，Ｄ、との関係を示す図である。 ヒトアルブミン濃度　Ωｕｇ／ｍｊ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ａ）ヒトアルブミンを特異的に認識する固定化された
   モノクローナル抗体、試料、及び酵素又は蛍光標識され
   たヒトアルブミンを接触させる工程 （ｂ）遊離の試料及び標識されたヒトアルブミンを除去
   する工程 （ｃ）標識を直接又は間接的に検出することにより、ａ
   で生じた免疫反応生成物を定量する工程 からなることを特徴とするヒトアルブミンの測定方法。