JP3758686B2 - Ｃペプチド特異的アッセイ法 - Google Patents
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Description
本発明は、プロインスリンおよびその中間体、特にｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよび／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに起因する全ての干渉を排除し得る特異的Ｃペプチドアッセイ法に関する。本発明は、このアッセイを実施するための抗体にも関する。
インスリンは、ランゲルハンス島のβ細胞において、前駆体であるプロインスリンから合成される。プロインスリンには、それからインスリン（分子量５８００ダルトン）およびＣペプチド（分子量３０２０ダルトン）を分離させるタンパク質分解酵素が作用する。加水分解には、２つの型のプロテアーゼ（一方はカルボキシペプチダーゼ型、他方はエンドペプチダーゼ型）が使用される。この過程には、ｓｐｌｉｔ３２，３３プロインスリン、ｓｐｌｉｔ６５，６６プロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのような中間体化合物が関与し、これらはインスリンおよびＣペプチドと並行して、インタクトなプロインスリンとともに少ない割合（２％〜６％）で存在する。
門脈インスリンおよびＣペプチドの等モル比は、末梢レベルに反映されない。基底状態の静脈末梢血には、平均でインスリンより３〜６倍多いＣペプチドが存在する。この現象を、これら２つのポリペプチドの間の代謝の差によって説明することができる。インスリンの約５０％は肝臓の通過に際して不活化される。残りの量は、筋肉組織または脂肪組織に主に存在するその末梢受容体において不活化される。対照的に、Ｃペプチドは肝臓を実際上自由に通過し、それゆえインスリンよりずっと長い血漿半減期を有する（Ｃペプチドについては３０分、インスリンについては５分未満）。Ｃペプチドは既知の生物学的作用を有しない。その役割は、膵臓のβ細胞におけるプロインスリン分子の折りたたみに限定されている。Ｃペプチドは、血管セクターにおいて単純な残余として出現し、その後腎臓によってインタクトなまま排除される。
従って、Ｃペプチドの血漿または尿アッセイは、インスリンアッセイよりもずっと信頼性のある、インスリン分泌の評価手段を構成する。Ｃペプチドアッセイは、外因性インスリンの患者への投与の間または、直接的な免疫学的インスリンアッセイを許容しない抗インスリン抗体の存在下においてさえも内因性インスリン生産の評価を可能にする。
ＣペプチドアッセイはＩ型糖尿病とＩＩ型糖尿病の差別的診断、β細胞の残余膵臓機能の評価、Ｉ型糖尿病における緩解期の検出およびモニター、インスリン注射によって引き起こされる人工的低血糖症の検出、インスリノーマの診断、ならびに肝臓疾患の間のインスリン分泌の評価に特に有用である。
Ｃペプチドアッセイは、糖尿病の女性の妊娠をモニターする場合の、胎児の糖尿病予後を確立するためにも使用される。さらに、Ｃペプチドは、全膵切除をモニターする場合に測定される。
Ｃペプチドアッセイ法は公知である。特許出願ＥＰ ２２７３５１は、競合的放射免疫アッセイにおいてＣペプチドを測定するための抗Ｃペプチド抗血清の使用を記載している。放射免疫試験において使用するための抗Ｃペプチドモノクローナル抗体は、Ａｎｇｅｌｏら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８５）補遺１巻，１８−１９頁）にも記載されている。上記の場合のように、抗体は競合的イムノアッセイにおいて使用される。さらに、Ｍａｄｓｅｎら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９８３）１１３，６号，２１３５−２１４４頁）は、ヒトプロインスリンに特異的なモノクローナル抗体の生産および特徴付けを記載している。出願ＥＰ ４８４９６１は、Ｃペプチド検出用の「サンドイッチ」型方法およびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して実施することができるアッセイを記載している。Ｃペプチドを例えばＥＬＩＳＡを使用して評価することができる。
１９９３年３月１７日に公開された特許ＣＳ ２７７５９７も、プロインスリンまたはＣペプチドアッセイのためのモノクローナル抗体の使用を記載している。
ほぼ全ての抗Ｃペプチドモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、プロインスリンならびに、インスリンおよびＣペプチドにに切断される前に生産される中間体形態と多かれ少なかれ交差反応することが知られている。Ｃペプチド単独から生産されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、プロインスリンならびに、インスリンおよびＣペプチドへの切断前に生産される中間体形態中のＣペプチドを認識することができる。なぜなら、遊離のＣペプチドと、プロインスリンを形成するインスリンに結合したＣペプチドとは非常に類似しているからである。
正常対象において、Ｃペプチド濃度はプロインスリン濃度より約５０倍高い（絶食の５〜２５ｐＭに対して約０．５〜１．５ｎＭ）。しかし、ＮＩＤＤ（インスリン非依存性糖尿病）のいくつかの場合、新たに診断されたＩ型糖尿病患者およびその家族において、インスリノーマの間および家族性高プロインスリン血症において、プロインスリンの血漿濃度は増加し、２０００ｐＭを超え得る。このような状況において、血中に存在する主な形態は、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンである。他の中間体は、循環血液中に微量にのみ存在する（Ｒｅａｖｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．（１９９３），１，４４−４８頁）。
従って、全ての病態生理学的状況において信頼性のある結果を提供するためには、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに起因する干渉を排除できる、Ｃペプチドを評価するための特異的方法を使用することが重要である。Ｄｉｎｅｓｅｎｓら（「Ｆｉｒｓｔ ａｓｓａｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｉｎｔａｃｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ」１９９４年９月２７日〜１０月１日、
第３０回年会で発表された報告）は、プロインスリン中のＡＣ連結部（インスリンのＡ鎖とＣペプチドとの間の連結部）およびＢＣ連結部（インスリンのＢ鎖とＣペプチドとの間の連結部）に特異的な２つの抗体を使用する−インスリンに起因する干渉のない−プロインスリンに特異的なアッセイを提唱した。しかし、この著者らは、プロインスリンに起因する干渉を排除できる特異的Ｃペプチドアッセイは提唱しなかった。
関連生物学的物質の存在に起因する干渉を排除するための特異的抗体（「スカベンジャー抗体」）の使用は、既に先行技術に記載されている。例えば、米国特許第４ ７２２ ８８９号は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）も認識できる２つの抗体を使用するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に特異的なサンドイッチ型アッセイ法を記載している。最後の３つのホルモンに起因する干渉を排除するために、ＴＳＨ、ＦＳＨおよびＬＨのβユニットのエピトープを特異的に認識し、ｈＣＧのβユニットに対するより低い親和性を有する第３のスカベンジャー抗体を使用する。なお、干渉抗体が過剰である場合、固相の非特異的抗体は飽和され、従ってアッセイしようとする抗体は過少評価される。対照的に、特異的アッセイを得るために、アッセイしようとする物質および干渉すると考えられるこの物質の前駆体を認識する抗体を使用することが可能であることは、先行技術のどこにも記載されていない。そうすれば、競合型アッセイを含む全ての型のアッセイを意図することが可能である。
出願人らは、ここで、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよび／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに起因する全ての干渉を排除できる特異的Ｃペプチドアッセイ法を見出した。抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍のエピトープを認識する、インタクトなプロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよび／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体の使用によって、生物学的媒質において高い特異性で、高度に正確なＣペプチドアッセイを実施することが可能である。
本発明は、Ｃペプチドを含有し得る試料を、１つ以上の抗Ｃペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的なこの抗プロインスリン抗体とインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な該抗プロインスリン抗体との混合物
と接触させることを特徴とするＣペプチドアッセイ法に関する。
本発明の特定の実施態様において、Ｃペプチドを含有し得る試料を：
・抗Ｃペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、
− もしくは、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体と、
・または、第１の抗Ｃペプチド抗体ならびにインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、第１の抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、
ならびに、第２の抗Ｃペプチド抗体ならびにインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、第２の抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、第２の抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体の混合物と；
のいずれかと接触させ、
この第１および第２の抗Ｃペプチド抗体は所望により同一である。
この第１および第２の抗Ｃペプチド抗体が同一である場合、Ｃペプチドを含有し得る試料を、抗Ｃペプチド抗体、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体、ならびにインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体に接触させる。
本発明の好ましい実施態様において、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗体が認識するエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置し：
配列
好ましくは配列
より好ましくは配列
から選択されるペプチド配列を含む。
本発明の抗プロインスリン抗体は、抗Ｃペプチド抗体と同じ濃度で存在する場合、好ましくは、抗Ｃペプチド抗体のプロインスリンへの結合の少なくとも５０％を阻害する。
本発明の別の好ましい実施態様において、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体が認識するエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのＢＣ連結部に位置し、ペプチド配列：
Arg Arg
を含む。
本発明の方法を実施するために使用する抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、少なくとも１つのモノクローナル抗体を使用する。
ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な特定の抗体は、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍またはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉するモノクローナル抗体であり、このエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置し、この配列は：
Lys Arg、
好ましくは配列：
より特定すると配列：
から選択されるペプチド配列を含む。
抗体は、特に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒに１９９７年６月４日に登録番号Ｉ−１８７３の下に寄託されたハイブリドーマから得られるモノクローナルＡＣ１Ｄ４抗体であり得る。
本発明の方法には、ｄｅｓ−６４，６５プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を使用し得、この抗体は抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍またはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉し、このエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのＢＣ連結部に位置し：
配列
配列
配列
配列
から選択されるペプチド配列を含む。
好ましくは、配列：
または
に対応するエピトープを認識するｄｅｓ−６４，６５プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を使用する。
明らかに、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗体を使用すれば、抗Ｃペプチド抗体のｓｐｌｉｔ３２，３３プロインスリンへの結合に起因する干渉を回避することが可能である。同様に、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体を使用すれば、抗Ｃペプチド抗体のｓｐｌｉｔ６５，６６プロインスリンへの結合に起因する干渉が回避される。
本発明の方法を、血漿、血清または尿のような生物学的試料中のＣペプチドをアッセイするために使用することができる。
本発明による好ましいアッセイ法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗Ｃペプチド抗体が固相に固定され得る「サンドイッチ」型アッセイである。好ましくは、抗Ｃペプチドは、モノクローナル抗体である。アッセイのために生物学的試料と接触させた後、トレーサー（例えば、酵素トレーサー）に結合させた第２の抗Ｃペプチド抗体を添加する。本発明によるＣペプチドの特異的アッセイを可能にする抗体（特に、ｄｅｓ３１，３２プロインスリンに特異的な抗体およびおそらくｄｅｓ６４，６５プロインスリンに特異的な抗体）は、第２の抗Ｃペプチド抗体と同時か、またはその前のいずれかに使用することができる。アッセイを１段階または２段階で実施することができ、Ｃペプチドをいずれかの検出方法（酵素検出、または放射性、蛍光性もしくは化学蛍光性剤を使用する検出のような）を使用して評価することができる。
本発明の方法において使用できるアッセイのさらなる型は、「競合的」放射免疫アッセイである。この型のアッセイにおいて、モノクローナルまたはポリクローナル抗Ｃペプチド抗体（固相に結合させてもよい）を、アッセイしようとする生物学的試料と接触させる。次いで、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗体および／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体、ならびに検出可能なトレーサー（上記の薬剤のような）で標識したＣペプチドを導入する。
抗Ｃペプチド抗体ならびにｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体ならびに／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を含有するキットも、本発明の一部を形成する。これらのキットは、特異的Ｃペプチドアッセイ法の実施を可能にする。本発明のキットは、サンドイッチまたは競合のいずれかの型の特異的Ｃペプチドアッセイに使用される。
ＡＣ１Ｄ４モノクローナル抗体の生産および特徴付け：
１．生産
ＡＣ１Ｄ４モノクローナル抗体をリンパ球ハイブリッド形成によって得た。
６週齢雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスに総数４回のヒトプロインスリンの腹腔内注射を与えた。１日目に、マウスに、５０μｇのヒトプロインスリンを、完全フロイントアジュバントの存在下で腹腔内に免疫した。３週間後に、マウスに、５０μｇのヒトプロインスリンを、不完全フロイントアジュバントの存在下で再度免疫した。第３の免疫を、以前と同じ条件下で、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中のヒトプロインスリンの溶液を使用して、３週間後に実施した。血液試料を、第２および第３の注射の後に、各注射の１２日後にマウスから採取した。血清を、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＳＰＯＴ（Ｆｒａｎｃｋ Ｒ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，（１９９２），４８，９２１７−９２３２頁）を使用して、ヒト抗プロインスリン抗体の存在について試験した。
高い血清抗プロインスリン抗体レベルを有するマウスをリンパ球融合のために選択した。選択したマウスに、第３の注射の１ヶ月後に最後のプロインスリンの注射を与えた。２０μｇの用量を２つのアリコートで注射した。３日後、マウスを断頭し、脾臓を取り出した。脾臓をすりつぶした後、リンパ球を、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３株由来のミエローママウス細胞と、ポリエチレングリコールの存在下で融合させた。使用したリンパ球ハイブリッド形成技術は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＩｎｃのＣｌｏｎａＣｅｌｌTM技術であった（フランスにおいては、ＴＥＢＵ，Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ Ｙｖｅｌｉｎｅｓによって配給される）。抗体分泌ハイブリドーマの選択を、ＥＬＩＳＡ（固定化ヒトプロインスリンを使用）およびＲＩＡ（ヨウ素化ヒトプロインスリンを使用）を使用する平行して実施した一連の試験によって行った。分泌ハイブリドーマをその抗ＡＣまたはＢＣ連結部活性についてＳＰＯＴ分析した。
ＥＬＩＳＡ法については、ＮＵＮＣマイクロプレートを、ＰＢＳ中のヒトプロインスリンの溶液（Ｃ＝０．１μｇ／ｍｌ）１００μｌを使用して、ヒトプロインスリンでコートした。プレートを一晩＋４℃でインキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したリン酸緩衝化生理食塩水溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した後、２００μｌの培養上清または１００μｌの精製抗体をマイクロプレートに漸減濃度で沈殿させ、３時間室温でインキュベートした。次いで、マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、第２の抗体を添加した。マウスＩｇＧ（γ特異性）に対するこの抗体をペルオキシダーゼに結合させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に希釈しておいた（希釈１／３０００）。マイクロプレートを１時間３７℃でインキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄した。０．０３％の過酸化水素を含有するクエン酸緩衝溶液（ｐＨ＝５）中の溶液（Ｃ＝３０ｍｇ／ｍｌ）中のオルトフェニルジアミンを基質として使用して、反応を明らかにした。吸光度をλ＝４５０ｎｍで、室温での遮光した２０分間のインキュベーションの後に測定した。酵素反応を５０μｌの４Ｎ硫酸を用いて停止し、測定をλ＝４９０ｎｍで実施した。
ＲＩＡ法については、１００μｌの培養上清または１００μｌの精製抗体を、ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体でコートしたチューブ中に漸減濃度で沈殿させた。室温で３時間インキュベートした後、チューブを２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、その後、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳの溶液中のヨウ素化プロインスリン１００μｌ（３０００ｃｐｍ）を添加した。チューブを一晩室温でインキュベートし、次いでＰＢＳ（２ｍｌ／チューブ）で３回洗浄し、次いでガンマカウンターに読み取りのために導入した。
ハイブリドーマの１つがＡＣ１Ｄ４であった。このハイブリドーマを限界希釈によってクローン化した（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ＩおよびＷａｌｄｍａｎ Ｓ．１９７９，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。この技術において、５細胞／ｍｌを含有する溶液が得られるまで細胞懸濁液を１０倍希釈した。この溶液を細胞培養マイクロプレートに１ウェル当り１００μｌの割合で分注した。倒立顕微鏡検査によって、細胞発達をモニターし、単一クローンを含むウェルを保持した。
２．特徴付け
２．１．抗原特異性
アイソタイプＩｇＧ１ ＡＣ１Ｄ４抗体は以下を認識する：
− ＥＬＩＳＡフォーマット（固定化プロインスリン）において、ヒトプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリン；ならびに
− ＲＩＡフォーマット（溶液中のヨウ素化プロインスリン）においてヒトプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリン。
これらの研究の結果を図１および２に示す。
図１は、ＡＣ１Ｄ４抗体のＥＬＩＳＡ用プロインスリンへの結合を示す。
図２は、ＡＣ１Ｄ４抗体のＲＩＡ用標識プロインスリンへの結合を示す。
２．２．交差反応
インスリンおよびヒトＣペプチドによる、ＡＣ１Ｄ４抗体のヨウ素化ヒトプロインスリンへの結合の競合試験を、ＲＩＡを使用して実施した。実験条件は、プロインスリンのインキュベーション工程以外、上記のＲＩＡ法の条件と同一であった（生産以下を参照のこと）。ここで、ＡＣ１Ｄ４抗体をチューブ中でインキュベートした後（続いて洗浄する）、インスリンまたはＣペプチド（１０μｇ／ｍｌ）をヨウ素化プロインスリンと同時にインキュベートした。
結果は、ヒトインスリンおよびＣペプチドがＡＣ１Ｄ４のヨウ素化プロインスリンへの結合を阻害しないことを示す。
２．３．エピトープ配列のアッセイ
エピトープ配列をＳＰＯＴTMを使用して決定した。８アミノ酸が重複する９アミノ酸からなるペプチドをニトロセルロース膜上に合成した。合成したペプチドはヒトプロインスリン分子の全体をカバーした（すなわち、総数７８個のペプチド）。この膜を試験中のモノクローナル抗体によって認識される配列を分析するための抗原性支持体とした。
以下のプロトコルをペプチド合成後の免疫学的反応のために使用した：
膜を、１０％のＣＲＢ（ＧＥＮＯＳＹＳのＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｒｅｆ：ＳＵ−０７−２５０）、０．５％のＴｗｅｅｎおよび５％のサッカロースをＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）中に含有する飽和緩衝液中で飽和させた。一晩室温で攪拌した後、膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、飽和緩衝液中で希釈したＡＣ１Ｄ４抗体（Ｃ＝１μｇ／ｍｌ）を添加した。次いで、得られたものを攪拌しながら１．５時間３７℃でインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合させた抗マウスＩｇＧ抗体を添加することによって、研究しようとする抗体の存在を、１時間室温で攪拌しながらインキュベートした後、明らかにした。形成された複合体を、塩化マグネシウムおよびＴｈｉａｚｏｌｙｌブルーをクエン酸緩衝生理食塩水（ＣＢＳ）溶液中に含有するＢＣＩＰ基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートトルイジニウム塩）を添加することによって可視化した。
ＡＣ１Ｄ４抗体によって認識されるペプチドは以下の配列を有するペプチドであった：
この配列はインスリンＡ鎖とＣペプチドとの連結部に位置している。
２．４．反応速度パラメーター
パラメーターをＢＩＡｃｏｒｅTMシステムを使用して決定した。このシステムは抗体とその抗原との間の結合をリアルタイムで測定する。測定値の単位はＲＵであり、この方法によって会合速度定数（Ｋｏｎ）、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および最後に測定しようとするヒトインスリンへの抗体の結合についての定数（ＫＡ）が得られる。この研究の結果を表Ｉに示す。
２．５．ＡＣ１Ｄ４抗体の存在下および非存在下での抗Ｃペプチドモノクローナル抗体のヒトプロインスリンへの結合
ＰＥＰ００１抗Ｃペプチドモノクローナル抗体およびＡＣ１Ｄ４抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅTMシステムを使用して、デキストランに結合させたプロインスリンに同時に固定する能力について試験した。ＤＡＫＯのＰＥＰ００１モノクローナル抗体は、以下の配列に対応するＣペプチドエピトープを認識する：
このエピトープは、ヒトプロインスリン上でＡＣ１Ｄ４抗体によって認識されるエピトープに隣接していた。
この試験に、漸増量のＡＣ１Ｄ４抗体を使用した。この研究の結果を図３に示す。
− 曲線１は、ＡＣ１Ｄ４抗体の非存在下でのＰＥＰ００１抗体のプロインスリンへの結合を表す。
− 曲線２は、ＰＥＰ００１抗体と同じ濃度のＡＣ１Ｄ４抗体の存在下でのＰＥＰ００１抗体のプロインスリンへの結合を表す。この場合、ＡＣ１Ｄ４抗体によるＰＥＰ００１抗体の結合の５０％阻害が観察された。
− 曲線３は、ＰＥＰ００１抗体の濃度より１０倍高い濃度のＡＣ１Ｄ４抗体の存在下でのＰＥＰ００１抗体のプロインスリンへの結合を表す。この場合、ＡＣ１Ｄ４抗体によるＰＥＰ００１抗体の結合の７０％阻害が観察された。
下記の実施例によって本発明を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１：
血清における特異的Ｃペプチドアッセイ法 「サンドイッチ」型酵素免疫アッセイ 至適条件の評価
自動ＡｃｃｅｓｓTM型機器をこの試験を実施するために使用した。２０μｌの血清を使用して試験を実施した。２つのプロインスリン特異的抗体を使用した：
・プロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンを特異的に認識するＡＣ１Ｄ４抗体、ならびに
・プロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンを特異的に認識するＢＣ９Ｂ６抗体。
この後者の抗体は以下のペプチド配列に対応するＢＣ連結部のエピトープを認識する：
漸増濃度のこれらの抗体を単独でまたは混合物として使用して、インタクトなプロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに起因する干渉を排除するために必要なＡＣ１Ｄ４およびＢＣ９Ｂ６抗体の濃度を決定した。
使用した固相は、抗Ｃペプチドモノクローナル抗体ＰＥＰ００１が共有結合によって結合された鉄ラテックスビーズ
であった。
以下を順番に読み取りチューブ中に導入した：
１．抗Ｃペプチドモノクローナル抗体でコートしたビーズ５０μｌ、
２．活性炭で事前に処理し、漸増濃度のプロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンまたはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンを導入した血清２０μｌ、３．０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび保存剤から構成されるｐＨ＝８緩衝液８０μｌ、ならびに
４．ｐＨ＝８緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ2、２ｍＭ、０．１Ｍ ＺｎＣｌ2、０．１５Ｍ ＮａＣｌから構成され、タンパク質および保存剤を添加）中の、ＡＣ１Ｄ４モノクローナル抗体およびＢＣ９Ｂ６モノクローナル抗体を種々の濃度（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）で含有する抗Ｃペプチドヤギポリクローナル抗体に結合させたアルカリホスファターゼ５０μｌ。
３７℃で３０分間インキュベートした後、これをｐＨ−８緩衝液（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび保存剤から構成される）で３回洗浄し、２００μｌのＬｕｍｉ−ＰｈｏｓTM５３０基質を添加した。これを５分間３７℃で再度インキュベートし、反応によって生成した発光をルミノメーターを使用して測定した。
この研究の結果を表ＩＩ〜ＩＶに示す。結果を交差反応の百分率として表す。
表ＩＶの結果は、各々２０μｇ／ｍｌの濃度のＡＣ１Ｄ４およびＢＣ９Ｂ６抗体の混合物を添加することによって、５％未満のプロインスリンとの交差反応、１５％未満のｄｅｓ−３１，３２プロインスリンとの交差反応および１０％未満のｄｅｓ−６４，６５プロインスリンとの交差反応が生じることを示す。
実施例２：
尿用の特異的Ｃペプチドアッセイ法 「サンドイッチ」型酵素免疫アッセイ
尿中のＣペプチドをアッセイするために、最初に尿試料を１／２０に希釈して、実施例１に記載のように進めることが可能である。
３０μｇ／ｍｌの濃度のＡＣ１Ｄ４抗体および５μｇ／ｍｌの濃度のＢＣ９Ｂ６を添加して、５％未満のプロインスリンに起因する干渉、１０％未満のｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに起因する干渉および２０％未満のｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに起因する干渉を得ることが可能である。
実施例３：
血清における特異的Ｃペプチドアッセイ法 競合的放射免疫アッセイ．
このアッセイは、ヨウ素（Ｉ25）で標識した固定量のｔｙｒ−Ｃペプチドと
参照溶液または測定しようとする試料中に含有されるＣペプチドとの間の、限定数の抗Ｃペプチド抗体部位に対する競合に基づいた。
アッセイを、ＰＥＰ００１抗Ｃペプチドモノクローナル抗体でコートしたポリスチレンチューブを使用して以下のように実施した：
以下を各チューブに導入した：
− タンパク質を添加し、０．１％の窒化ナトリウムを含有するｐＨ＝６．８リン酸緩衝溶液中の０．２ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌのＣペプチドを含有する標準溶液１００μｌまたはアッセイしようとする試料１００μｌ、ならびに
− ０．１％の窒化ナトリウムおよび２０μｇ／ｍｌの量のプロインスリン分子のＡＣ連結部に対する特異的ＡＣ１Ｄ４抗体を含有するリン酸緩衝液中で希釈した１ヨウ素Ｔｙｒ−Ｃペプチドを含有する溶液５０μｌ。
チューブをＰａｒａｆｉｌｍTMで覆った。２時間室温で水平に攪拌しながらインキュベートした後、反応媒質を吸引によって除去し、０．０５Ｍイミダゾール、０．００２５％アジ化ナトリウムおよび保存剤を含有するｐＨ＝７．４緩衝溶液２ｍｌで洗浄した。この溶液を吸引によって除去し、洗浄をさらに２回繰り返した。
各チューブの放射能を、Ｉ125を測定するように調整したガンマシンチレーターを使用して測定した。計数を１分間にわたって実施した。
Ｃペプチドの量を、参照スケールに対して評価した。この方法の検出限界は０．１５ｎｇ／ｍｌであった。
このアッセイの特異性を評価するために、異なる濃度の２つの血清にプロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンを過負荷した。
試験をＡＣ１Ｄ４抗体（Ｃ＝２０μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下で実施した。この試験の結果を表Ｖ〜ＶＩＩに示す。
この研究の結果は、プロインスリン中のＡＣ連結部に特異的なモノクローナル抗体の存在によって、そのエピトープがＡＣ１Ｄ４のエピトープに近いＰＥＰ００１抗体を使用するＣペプチドのアッセイにおいて、プロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに起因する干渉を排除することができることを示す。
インスリンは、ランゲルハンス島のβ細胞において、前駆体であるプロインスリンから合成される。プロインスリンには、それからインスリン（分子量５８００ダルトン）およびＣペプチド（分子量３０２０ダルトン）を分離させるタンパク質分解酵素が作用する。加水分解には、２つの型のプロテアーゼ（一方はカルボキシペプチダーゼ型、他方はエンドペプチダーゼ型）が使用される。この過程には、ｓｐｌｉｔ３２，３３プロインスリン、ｓｐｌｉｔ６５，６６プロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのような中間体化合物が関与し、これらはインスリンおよびＣペプチドと並行して、インタクトなプロインスリンとともに少ない割合（２％〜６％）で存在する。
門脈インスリンおよびＣペプチドの等モル比は、末梢レベルに反映されない。基底状態の静脈末梢血には、平均でインスリンより３〜６倍多いＣペプチドが存在する。この現象を、これら２つのポリペプチドの間の代謝の差によって説明することができる。インスリンの約５０％は肝臓の通過に際して不活化される。残りの量は、筋肉組織または脂肪組織に主に存在するその末梢受容体において不活化される。対照的に、Ｃペプチドは肝臓を実際上自由に通過し、それゆえインスリンよりずっと長い血漿半減期を有する（Ｃペプチドについては３０分、インスリンについては５分未満）。Ｃペプチドは既知の生物学的作用を有しない。その役割は、膵臓のβ細胞におけるプロインスリン分子の折りたたみに限定されている。Ｃペプチドは、血管セクターにおいて単純な残余として出現し、その後腎臓によってインタクトなまま排除される。
従って、Ｃペプチドの血漿または尿アッセイは、インスリンアッセイよりもずっと信頼性のある、インスリン分泌の評価手段を構成する。Ｃペプチドアッセイは、外因性インスリンの患者への投与の間または、直接的な免疫学的インスリンアッセイを許容しない抗インスリン抗体の存在下においてさえも内因性インスリン生産の評価を可能にする。
ＣペプチドアッセイはＩ型糖尿病とＩＩ型糖尿病の差別的診断、β細胞の残余膵臓機能の評価、Ｉ型糖尿病における緩解期の検出およびモニター、インスリン注射によって引き起こされる人工的低血糖症の検出、インスリノーマの診断、ならびに肝臓疾患の間のインスリン分泌の評価に特に有用である。
Ｃペプチドアッセイは、糖尿病の女性の妊娠をモニターする場合の、胎児の糖尿病予後を確立するためにも使用される。さらに、Ｃペプチドは、全膵切除をモニターする場合に測定される。
Ｃペプチドアッセイ法は公知である。特許出願ＥＰ ２２７３５１は、競合的放射免疫アッセイにおいてＣペプチドを測定するための抗Ｃペプチド抗血清の使用を記載している。放射免疫試験において使用するための抗Ｃペプチドモノクローナル抗体は、Ａｎｇｅｌｏら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８５）補遺１巻，１８−１９頁）にも記載されている。上記の場合のように、抗体は競合的イムノアッセイにおいて使用される。さらに、Ｍａｄｓｅｎら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９８３）１１３，６号，２１３５−２１４４頁）は、ヒトプロインスリンに特異的なモノクローナル抗体の生産および特徴付けを記載している。出願ＥＰ ４８４９６１は、Ｃペプチド検出用の「サンドイッチ」型方法およびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して実施することができるアッセイを記載している。Ｃペプチドを例えばＥＬＩＳＡを使用して評価することができる。
１９９３年３月１７日に公開された特許ＣＳ ２７７５９７も、プロインスリンまたはＣペプチドアッセイのためのモノクローナル抗体の使用を記載している。
ほぼ全ての抗Ｃペプチドモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、プロインスリンならびに、インスリンおよびＣペプチドにに切断される前に生産される中間体形態と多かれ少なかれ交差反応することが知られている。Ｃペプチド単独から生産されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、プロインスリンならびに、インスリンおよびＣペプチドへの切断前に生産される中間体形態中のＣペプチドを認識することができる。なぜなら、遊離のＣペプチドと、プロインスリンを形成するインスリンに結合したＣペプチドとは非常に類似しているからである。
正常対象において、Ｃペプチド濃度はプロインスリン濃度より約５０倍高い（絶食の５〜２５ｐＭに対して約０．５〜１．５ｎＭ）。しかし、ＮＩＤＤ（インスリン非依存性糖尿病）のいくつかの場合、新たに診断されたＩ型糖尿病患者およびその家族において、インスリノーマの間および家族性高プロインスリン血症において、プロインスリンの血漿濃度は増加し、２０００ｐＭを超え得る。このような状況において、血中に存在する主な形態は、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンである。他の中間体は、循環血液中に微量にのみ存在する（Ｒｅａｖｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．（１９９３），１，４４−４８頁）。
従って、全ての病態生理学的状況において信頼性のある結果を提供するためには、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに起因する干渉を排除できる、Ｃペプチドを評価するための特異的方法を使用することが重要である。Ｄｉｎｅｓｅｎｓら（「Ｆｉｒｓｔ ａｓｓａｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｉｎｔａｃｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ」１９９４年９月２７日〜１０月１日、
関連生物学的物質の存在に起因する干渉を排除するための特異的抗体（「スカベンジャー抗体」）の使用は、既に先行技術に記載されている。例えば、米国特許第４ ７２２ ８８９号は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）も認識できる２つの抗体を使用するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に特異的なサンドイッチ型アッセイ法を記載している。最後の３つのホルモンに起因する干渉を排除するために、ＴＳＨ、ＦＳＨおよびＬＨのβユニットのエピトープを特異的に認識し、ｈＣＧのβユニットに対するより低い親和性を有する第３のスカベンジャー抗体を使用する。なお、干渉抗体が過剰である場合、固相の非特異的抗体は飽和され、従ってアッセイしようとする抗体は過少評価される。対照的に、特異的アッセイを得るために、アッセイしようとする物質および干渉すると考えられるこの物質の前駆体を認識する抗体を使用することが可能であることは、先行技術のどこにも記載されていない。そうすれば、競合型アッセイを含む全ての型のアッセイを意図することが可能である。
出願人らは、ここで、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよび／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに起因する全ての干渉を排除できる特異的Ｃペプチドアッセイ法を見出した。抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍のエピトープを認識する、インタクトなプロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよび／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体の使用によって、生物学的媒質において高い特異性で、高度に正確なＣペプチドアッセイを実施することが可能である。
本発明は、Ｃペプチドを含有し得る試料を、１つ以上の抗Ｃペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的なこの抗プロインスリン抗体とインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な該抗プロインスリン抗体との混合物
と接触させることを特徴とするＣペプチドアッセイ法に関する。
本発明の特定の実施態様において、Ｃペプチドを含有し得る試料を：
・抗Ｃペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、
− もしくは、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体と、
・または、第１の抗Ｃペプチド抗体ならびにインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、第１の抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、
ならびに、第２の抗Ｃペプチド抗体ならびにインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、第２の抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、第２の抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体の混合物と；
のいずれかと接触させ、
この第１および第２の抗Ｃペプチド抗体は所望により同一である。
この第１および第２の抗Ｃペプチド抗体が同一である場合、Ｃペプチドを含有し得る試料を、抗Ｃペプチド抗体、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体、ならびにインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体に接触させる。
本発明の好ましい実施態様において、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗体が認識するエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置し：
配列
本発明の抗プロインスリン抗体は、抗Ｃペプチド抗体と同じ濃度で存在する場合、好ましくは、抗Ｃペプチド抗体のプロインスリンへの結合の少なくとも５０％を阻害する。
本発明の別の好ましい実施態様において、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体が認識するエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのＢＣ連結部に位置し、ペプチド配列：
Arg Arg
を含む。
本発明の方法を実施するために使用する抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、少なくとも１つのモノクローナル抗体を使用する。
ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な特定の抗体は、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍またはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉するモノクローナル抗体であり、このエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置し、この配列は：
Lys Arg、
好ましくは配列：
抗体は、特に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒに１９９７年６月４日に登録番号Ｉ−１８７３の下に寄託されたハイブリドーマから得られるモノクローナルＡＣ１Ｄ４抗体であり得る。
本発明の方法には、ｄｅｓ−６４，６５プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を使用し得、この抗体は抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍またはこのエピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉し、このエピトープはプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのＢＣ連結部に位置し：
配列
好ましくは、配列：
明らかに、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗体を使用すれば、抗Ｃペプチド抗体のｓｐｌｉｔ３２，３３プロインスリンへの結合に起因する干渉を回避することが可能である。同様に、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体を使用すれば、抗Ｃペプチド抗体のｓｐｌｉｔ６５，６６プロインスリンへの結合に起因する干渉が回避される。
本発明の方法を、血漿、血清または尿のような生物学的試料中のＣペプチドをアッセイするために使用することができる。
本発明による好ましいアッセイ法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗Ｃペプチド抗体が固相に固定され得る「サンドイッチ」型アッセイである。好ましくは、抗Ｃペプチドは、モノクローナル抗体である。アッセイのために生物学的試料と接触させた後、トレーサー（例えば、酵素トレーサー）に結合させた第２の抗Ｃペプチド抗体を添加する。本発明によるＣペプチドの特異的アッセイを可能にする抗体（特に、ｄｅｓ３１，３２プロインスリンに特異的な抗体およびおそらくｄｅｓ６４，６５プロインスリンに特異的な抗体）は、第２の抗Ｃペプチド抗体と同時か、またはその前のいずれかに使用することができる。アッセイを１段階または２段階で実施することができ、Ｃペプチドをいずれかの検出方法（酵素検出、または放射性、蛍光性もしくは化学蛍光性剤を使用する検出のような）を使用して評価することができる。
本発明の方法において使用できるアッセイのさらなる型は、「競合的」放射免疫アッセイである。この型のアッセイにおいて、モノクローナルまたはポリクローナル抗Ｃペプチド抗体（固相に結合させてもよい）を、アッセイしようとする生物学的試料と接触させる。次いで、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗体および／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗体、ならびに検出可能なトレーサー（上記の薬剤のような）で標識したＣペプチドを導入する。
抗Ｃペプチド抗体ならびにｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体ならびに／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を含有するキットも、本発明の一部を形成する。これらのキットは、特異的Ｃペプチドアッセイ法の実施を可能にする。本発明のキットは、サンドイッチまたは競合のいずれかの型の特異的Ｃペプチドアッセイに使用される。
ＡＣ１Ｄ４モノクローナル抗体の生産および特徴付け：
１．生産
ＡＣ１Ｄ４モノクローナル抗体をリンパ球ハイブリッド形成によって得た。
６週齢雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスに総数４回のヒトプロインスリンの腹腔内注射を与えた。１日目に、マウスに、５０μｇのヒトプロインスリンを、完全フロイントアジュバントの存在下で腹腔内に免疫した。３週間後に、マウスに、５０μｇのヒトプロインスリンを、不完全フロイントアジュバントの存在下で再度免疫した。第３の免疫を、以前と同じ条件下で、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中のヒトプロインスリンの溶液を使用して、３週間後に実施した。血液試料を、第２および第３の注射の後に、各注射の１２日後にマウスから採取した。血清を、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＳＰＯＴ（Ｆｒａｎｃｋ Ｒ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，（１９９２），４８，９２１７−９２３２頁）を使用して、ヒト抗プロインスリン抗体の存在について試験した。
高い血清抗プロインスリン抗体レベルを有するマウスをリンパ球融合のために選択した。選択したマウスに、第３の注射の１ヶ月後に最後のプロインスリンの注射を与えた。２０μｇの用量を２つのアリコートで注射した。３日後、マウスを断頭し、脾臓を取り出した。脾臓をすりつぶした後、リンパ球を、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３株由来のミエローママウス細胞と、ポリエチレングリコールの存在下で融合させた。使用したリンパ球ハイブリッド形成技術は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＩｎｃのＣｌｏｎａＣｅｌｌTM技術であった（フランスにおいては、ＴＥＢＵ，Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ Ｙｖｅｌｉｎｅｓによって配給される）。抗体分泌ハイブリドーマの選択を、ＥＬＩＳＡ（固定化ヒトプロインスリンを使用）およびＲＩＡ（ヨウ素化ヒトプロインスリンを使用）を使用する平行して実施した一連の試験によって行った。分泌ハイブリドーマをその抗ＡＣまたはＢＣ連結部活性についてＳＰＯＴ分析した。
ＥＬＩＳＡ法については、ＮＵＮＣマイクロプレートを、ＰＢＳ中のヒトプロインスリンの溶液（Ｃ＝０．１μｇ／ｍｌ）１００μｌを使用して、ヒトプロインスリンでコートした。プレートを一晩＋４℃でインキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したリン酸緩衝化生理食塩水溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した後、２００μｌの培養上清または１００μｌの精製抗体をマイクロプレートに漸減濃度で沈殿させ、３時間室温でインキュベートした。次いで、マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、第２の抗体を添加した。マウスＩｇＧ（γ特異性）に対するこの抗体をペルオキシダーゼに結合させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に希釈しておいた（希釈１／３０００）。マイクロプレートを１時間３７℃でインキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄した。０．０３％の過酸化水素を含有するクエン酸緩衝溶液（ｐＨ＝５）中の溶液（Ｃ＝３０ｍｇ／ｍｌ）中のオルトフェニルジアミンを基質として使用して、反応を明らかにした。吸光度をλ＝４５０ｎｍで、室温での遮光した２０分間のインキュベーションの後に測定した。酵素反応を５０μｌの４Ｎ硫酸を用いて停止し、測定をλ＝４９０ｎｍで実施した。
ＲＩＡ法については、１００μｌの培養上清または１００μｌの精製抗体を、ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体でコートしたチューブ中に漸減濃度で沈殿させた。室温で３時間インキュベートした後、チューブを２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、その後、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳの溶液中のヨウ素化プロインスリン１００μｌ（３０００ｃｐｍ）を添加した。チューブを一晩室温でインキュベートし、次いでＰＢＳ（２ｍｌ／チューブ）で３回洗浄し、次いでガンマカウンターに読み取りのために導入した。
ハイブリドーマの１つがＡＣ１Ｄ４であった。このハイブリドーマを限界希釈によってクローン化した（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ＩおよびＷａｌｄｍａｎ Ｓ．１９７９，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。この技術において、５細胞／ｍｌを含有する溶液が得られるまで細胞懸濁液を１０倍希釈した。この溶液を細胞培養マイクロプレートに１ウェル当り１００μｌの割合で分注した。倒立顕微鏡検査によって、細胞発達をモニターし、単一クローンを含むウェルを保持した。
２．特徴付け
２．１．抗原特異性
アイソタイプＩｇＧ１ ＡＣ１Ｄ４抗体は以下を認識する：
− ＥＬＩＳＡフォーマット（固定化プロインスリン）において、ヒトプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリン；ならびに
− ＲＩＡフォーマット（溶液中のヨウ素化プロインスリン）においてヒトプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリン。
これらの研究の結果を図１および２に示す。
図１は、ＡＣ１Ｄ４抗体のＥＬＩＳＡ用プロインスリンへの結合を示す。
図２は、ＡＣ１Ｄ４抗体のＲＩＡ用標識プロインスリンへの結合を示す。
２．２．交差反応
インスリンおよびヒトＣペプチドによる、ＡＣ１Ｄ４抗体のヨウ素化ヒトプロインスリンへの結合の競合試験を、ＲＩＡを使用して実施した。実験条件は、プロインスリンのインキュベーション工程以外、上記のＲＩＡ法の条件と同一であった（生産以下を参照のこと）。ここで、ＡＣ１Ｄ４抗体をチューブ中でインキュベートした後（続いて洗浄する）、インスリンまたはＣペプチド（１０μｇ／ｍｌ）をヨウ素化プロインスリンと同時にインキュベートした。
結果は、ヒトインスリンおよびＣペプチドがＡＣ１Ｄ４のヨウ素化プロインスリンへの結合を阻害しないことを示す。
２．３．エピトープ配列のアッセイ
エピトープ配列をＳＰＯＴTMを使用して決定した。８アミノ酸が重複する９アミノ酸からなるペプチドをニトロセルロース膜上に合成した。合成したペプチドはヒトプロインスリン分子の全体をカバーした（すなわち、総数７８個のペプチド）。この膜を試験中のモノクローナル抗体によって認識される配列を分析するための抗原性支持体とした。
以下のプロトコルをペプチド合成後の免疫学的反応のために使用した：
膜を、１０％のＣＲＢ（ＧＥＮＯＳＹＳのＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｒｅｆ：ＳＵ−０７−２５０）、０．５％のＴｗｅｅｎおよび５％のサッカロースをＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）中に含有する飽和緩衝液中で飽和させた。一晩室温で攪拌した後、膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、飽和緩衝液中で希釈したＡＣ１Ｄ４抗体（Ｃ＝１μｇ／ｍｌ）を添加した。次いで、得られたものを攪拌しながら１．５時間３７℃でインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合させた抗マウスＩｇＧ抗体を添加することによって、研究しようとする抗体の存在を、１時間室温で攪拌しながらインキュベートした後、明らかにした。形成された複合体を、塩化マグネシウムおよびＴｈｉａｚｏｌｙｌブルーをクエン酸緩衝生理食塩水（ＣＢＳ）溶液中に含有するＢＣＩＰ基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートトルイジニウム塩）を添加することによって可視化した。
ＡＣ１Ｄ４抗体によって認識されるペプチドは以下の配列を有するペプチドであった：
２．４．反応速度パラメーター
パラメーターをＢＩＡｃｏｒｅTMシステムを使用して決定した。このシステムは抗体とその抗原との間の結合をリアルタイムで測定する。測定値の単位はＲＵであり、この方法によって会合速度定数（Ｋｏｎ）、解離速度定数（Ｋｏｆｆ）および最後に測定しようとするヒトインスリンへの抗体の結合についての定数（ＫＡ）が得られる。この研究の結果を表Ｉに示す。
ＰＥＰ００１抗Ｃペプチドモノクローナル抗体およびＡＣ１Ｄ４抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅTMシステムを使用して、デキストランに結合させたプロインスリンに同時に固定する能力について試験した。ＤＡＫＯのＰＥＰ００１モノクローナル抗体は、以下の配列に対応するＣペプチドエピトープを認識する：
この試験に、漸増量のＡＣ１Ｄ４抗体を使用した。この研究の結果を図３に示す。
− 曲線１は、ＡＣ１Ｄ４抗体の非存在下でのＰＥＰ００１抗体のプロインスリンへの結合を表す。
− 曲線２は、ＰＥＰ００１抗体と同じ濃度のＡＣ１Ｄ４抗体の存在下でのＰＥＰ００１抗体のプロインスリンへの結合を表す。この場合、ＡＣ１Ｄ４抗体によるＰＥＰ００１抗体の結合の５０％阻害が観察された。
− 曲線３は、ＰＥＰ００１抗体の濃度より１０倍高い濃度のＡＣ１Ｄ４抗体の存在下でのＰＥＰ００１抗体のプロインスリンへの結合を表す。この場合、ＡＣ１Ｄ４抗体によるＰＥＰ００１抗体の結合の７０％阻害が観察された。
下記の実施例によって本発明を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１：
血清における特異的Ｃペプチドアッセイ法 「サンドイッチ」型酵素免疫アッセイ 至適条件の評価
自動ＡｃｃｅｓｓTM型機器をこの試験を実施するために使用した。２０μｌの血清を使用して試験を実施した。２つのプロインスリン特異的抗体を使用した：
・プロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンを特異的に認識するＡＣ１Ｄ４抗体、ならびに
・プロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンを特異的に認識するＢＣ９Ｂ６抗体。
この後者の抗体は以下のペプチド配列に対応するＢＣ連結部のエピトープを認識する：
使用した固相は、抗Ｃペプチドモノクローナル抗体ＰＥＰ００１が共有結合によって結合された鉄ラテックスビーズ
以下を順番に読み取りチューブ中に導入した：
１．抗Ｃペプチドモノクローナル抗体でコートしたビーズ５０μｌ、
２．活性炭で事前に処理し、漸増濃度のプロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンまたはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンを導入した血清２０μｌ、３．０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび保存剤から構成されるｐＨ＝８緩衝液８０μｌ、ならびに
４．ｐＨ＝８緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ2、２ｍＭ、０．１Ｍ ＺｎＣｌ2、０．１５Ｍ ＮａＣｌから構成され、タンパク質および保存剤を添加）中の、ＡＣ１Ｄ４モノクローナル抗体およびＢＣ９Ｂ６モノクローナル抗体を種々の濃度（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）で含有する抗Ｃペプチドヤギポリクローナル抗体に結合させたアルカリホスファターゼ５０μｌ。
３７℃で３０分間インキュベートした後、これをｐＨ−８緩衝液（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび保存剤から構成される）で３回洗浄し、２００μｌのＬｕｍｉ−ＰｈｏｓTM５３０基質を添加した。これを５分間３７℃で再度インキュベートし、反応によって生成した発光をルミノメーターを使用して測定した。
この研究の結果を表ＩＩ〜ＩＶに示す。結果を交差反応の百分率として表す。
実施例２：
尿用の特異的Ｃペプチドアッセイ法 「サンドイッチ」型酵素免疫アッセイ
尿中のＣペプチドをアッセイするために、最初に尿試料を１／２０に希釈して、実施例１に記載のように進めることが可能である。
３０μｇ／ｍｌの濃度のＡＣ１Ｄ４抗体および５μｇ／ｍｌの濃度のＢＣ９Ｂ６を添加して、５％未満のプロインスリンに起因する干渉、１０％未満のｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに起因する干渉および２０％未満のｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに起因する干渉を得ることが可能である。
実施例３：
血清における特異的Ｃペプチドアッセイ法 競合的放射免疫アッセイ．
このアッセイは、ヨウ素（Ｉ25）で標識した固定量のｔｙｒ−Ｃペプチドと
参照溶液または測定しようとする試料中に含有されるＣペプチドとの間の、限定数の抗Ｃペプチド抗体部位に対する競合に基づいた。
アッセイを、ＰＥＰ００１抗Ｃペプチドモノクローナル抗体でコートしたポリスチレンチューブを使用して以下のように実施した：
以下を各チューブに導入した：
− タンパク質を添加し、０．１％の窒化ナトリウムを含有するｐＨ＝６．８リン酸緩衝溶液中の０．２ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌのＣペプチドを含有する標準溶液１００μｌまたはアッセイしようとする試料１００μｌ、ならびに
− ０．１％の窒化ナトリウムおよび２０μｇ／ｍｌの量のプロインスリン分子のＡＣ連結部に対する特異的ＡＣ１Ｄ４抗体を含有するリン酸緩衝液中で希釈した１ヨウ素Ｔｙｒ−Ｃペプチドを含有する溶液５０μｌ。
チューブをＰａｒａｆｉｌｍTMで覆った。２時間室温で水平に攪拌しながらインキュベートした後、反応媒質を吸引によって除去し、０．０５Ｍイミダゾール、０．００２５％アジ化ナトリウムおよび保存剤を含有するｐＨ＝７．４緩衝溶液２ｍｌで洗浄した。この溶液を吸引によって除去し、洗浄をさらに２回繰り返した。
各チューブの放射能を、Ｉ125を測定するように調整したガンマシンチレーターを使用して測定した。計数を１分間にわたって実施した。
Ｃペプチドの量を、参照スケールに対して評価した。この方法の検出限界は０．１５ｎｇ／ｍｌであった。
このアッセイの特異性を評価するために、異なる濃度の２つの血清にプロインスリン、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンを過負荷した。
試験をＡＣ１Ｄ４抗体（Ｃ＝２０μｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下で実施した。この試験の結果を表Ｖ〜ＶＩＩに示す。
Claims (19)
- Ｃペプチドを含有し得る試料を、１つ以上の抗Ｃペプチド抗体ならびに
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を干渉する抗プロインスリン抗体、または
− インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な該抗プロインスリン抗体とインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な該抗プロインスリン抗体との混合物
と接触させることを特徴とするＣペプチドアッセイ法。 - インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体がプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置するエピトープを認識し、該エピトープがペプチド配列：
Lys Arg
を含む、請求項１記載のＣペプチドアッセイ法。 - インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体がプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置するエピトープを認識し、該エピトープがペプチド配列：
を含む、請求項１または２記載のＣペプチドアッセイ法。 - インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体がプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置するエピトープを認識し、該エピトープがペプチド配列：
を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のＣペプチドアッセイ法。 - インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的な抗プロインスリン抗体がプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのＢＣ連結部に位置するエピトープを認識し、該エピトープがペプチド配列：
Arg Arg
を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のＣペプチドアッセイ法。 - Ｃペプチドを含有し得る試料を、抗Ｃペプチド抗体ならびに、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンへの結合を妨害する抗プロインスリン抗体と接触させる、請求項１〜５のいずれか１項記載のＣペプチドアッセイ法。
- Ｃペプチドを含有し得る試料を、抗Ｃペプチド抗体ならびに、インタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンに特異的であり、抗Ｃペプチド抗体のエピトープの近傍もしくは該エピトープに重複するエピトープを認識し、抗Ｃペプチド抗体のインタクトなプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンへの結合を妨害する抗プロインスリン抗体と接触させる、請求項１〜５のいずれか１項記載のＣペプチドアッセイ法。
- 抗体の少なくとも１つがモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載のＣペプチドアッセイ法。
- 試料が血清、血漿または尿から得られる、請求項１〜８のいずれか１項記載のＣペプチドアッセイ法。
- 請求項１〜９のいずれか１項記載の「サンドイッチ」型Ｃペプチドアッセイ法。
- 請求項１〜９のいずれか１項記載の競合的放射免疫アッセイ型Ｃペプチドアッセイ法。
- ペプチド配列：
を認識する、ｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体。 - Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒに１９９７年６月４日に登録番号Ｉ−１８７３の下に寄託されたハイブリドーマ。
- 請求項１３記載のハイブリドーマから得られる請求項１２記載のｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびプロインスリンに特異的なモノクローナル抗体。
- 請求項１〜６および８〜１１のいずれか１項記載のアッセイ法を実施するための、ペプチド配列：
Lys Arg
を含むプロインスリンおよびｄｅｓ−３１，３２プロインスリンのＡＣ連結部に位置するエピトープを認識するモノクローナル抗体の使用。 - 配列
配列
から選択される配列を含むエピトープを認識するモノクローナル抗体の、請求項１５記載の使用。 - 請求項１〜５および７〜１１のいずれか１項記載のアッセイ法を実施するための、ペプチド配列：
Arg Arg
を含むプロインスリンおよびｄｅｓ−６４，６５プロインスリンのＢＣ連結部に位置するエピトープを認識するモノクローナル抗体の使用。 - 配列
配列
配列
から選択されるペプチド配列に対応するエピトープを認識するモノクローナル抗体の、請求項１７記載の使用。 - Ｃペプチドをアッセイするための、抗Ｃペプチド抗体、ならびにｄｅｓ−３１，３２プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体、ならびに／またはｄｅｓ−６４，６５プロインスリンおよびプロインスリンに特異的な抗体を含むキットの使用。
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