CN102690843A

CN102690843A - 一种阳离子聚合物基因载体及制备方法

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Publication number: CN102690843A
Application number: CN2012101639418A
Authority: CN
Inventors: 邢金峰; 张彪; 王重夕; 邓联东; 董岸杰
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2012-05-23
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明公开了一种阳离子聚合物基因载体及制备方法，阳离子聚合物基因载体是由主链聚乙烯吡咯烷酮和支链聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯接枝而成，所述接枝的聚合物接枝度为8.8%-40%。本发明的阳离子聚合物基因载体具有很好的结合DNA的能力；生物相容性好，对人体无刺激毒性低；分子量分布小，反应可控，几乎不生成PDMAEMA均聚物，产物易纯化；运载质粒DNA，细胞转染率高，超过了PDMAEMA均聚物的转染效率。

Description

一种阳离子聚合物基因载体及制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及一种新型阳离子聚合物基因载体的合成。

背景技术

基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治病目的的治疗方法。裸露的外源基因DNA带负电，难以渗入同样带负电的细胞膜且容易被机体或细胞降解，因而难以表达。所以基因治疗的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，使目的基因能够在靶细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达。

基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两类。1.病毒载体转染效率高，但也有能诱导宿主免疫反应、潜在的致瘤性、装载容量有限、代价高等缺点，限制了它们的应用。2.非病毒载体是目前公认可替代病毒载体的基因载体系统，它可避免诸如免疫原性、毒性等病毒载体的缺陷。具有低毒、低免疫反应，外源基因随机整合率低且携带基因大小类型不受限制等优点。虽然非病毒载体安全性好，但存在转染、整合效率低等缺点。

因此，如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因药物载体，如何提高非病毒性基因载体的靶向特异性和体内外转染效率，已经是迫在眉睫的关键问题。

阳离子聚合物载体是一种非病毒性基因载体。它是利用带正电的高聚物静电结合浓缩DNA，再通过静电作用结合细胞膜或通过携带的靶向配体与细胞膜上的带负电荷的受体结合，通过内吞、逃离内体和胞质转运的方式，使DNA进入细胞核，从而表达目的基因。

聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(Poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate),PDMAEMA)是一种具有温度和pH敏感性的高分子，在中性或酸性条件下具有很好地结合DNA的能力。PDMAEMA分子结构中同时具有亲水性的叔胺基、羰基和疏水性的烷基基团，且两类基团在空间结构上互相匹配，当环境改变时会造成氢键的形成与破坏，从而导致高分子相态的变化。类似于聚乙烯亚胺（PEI）,PDMAEMA在生物体内不可降解，高相对分子质量(通常>3万)的PDMAEMA已无法通过肾脏排出，在使用高相对分子质量PDMAEMA作为载体时，会不可避免在体内残留。借鉴改性PEI的方法，低相对分子质量的PDMAEMA可通过体内可断裂的化学键连接起来形成高相对分子质量的PDMAEMA衍生物。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)是一种水溶性酰胺类高分子聚合物，PVP具有很多优良的特性，如优良的溶解性、增溶性、成膜性、络合性、黏接性及一定的表面活性，特别是具有良好的生理相容性，因而使其在医药领域中广泛应用。PVP优良的生理惰性，不参与人体新陈代谢．又具有优良的生物相容性，对皮肤、粘膜、眼等不形成任何刺激。

PVP尤其指PVP水凝胶和PVP与其他聚合物共混或共聚的水凝胶，由于其良好的生理相容性，在医药领域有着广泛的应用,说明了它具有作为基因载体辅料的潜在能力。

发明内容

本发明的目的在于降低现有的聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯的细胞毒性，提供一种转染效率高，细胞毒性小的阳离子聚合物基因载体。

本发明的第二个目的是提供一种阳离子聚合物基因载体的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种阳离子聚合物基因载体，是由主链聚乙烯吡咯烷酮和支链聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯接枝而成，所述接枝的聚合物含有8.8%-40%的接枝度。

所述聚乙烯吡咯烷酮的相对分子量为10000~60000。

所述每条支链聚甲基丙烯酸N,N二甲氨基乙酯的分子量为1000~4000。

阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)按质量比1:5～20将聚乙烯吡咯烷酮溶于双蒸水中，搅拌1～2h溶解形成水凝胶，按水凝胶与四氯化碳体积比1:2～3加入四氯化碳，搅拌使所述水凝胶分散于四氯化碳中；按N-溴代琥珀亚酰胺与聚乙烯吡咯烷酮质量比为1.6～3:1的比例加入N-溴代琥珀亚酰胺，再按聚乙烯吡咯烷酮与偶氮二异丁腈质量比为1:0.014～0.03加入偶氮二异丁腈，于85-95℃回流反应20～60h；除去四氯化碳有机相，将剩余水相用截止分子量3500~10000的透析袋透析2～5天；产物冷冻干燥后得到大分子引发剂溴化聚乙烯吡咯烷酮，所述溴化聚乙烯吡咯烷酮用PVP-Br表示；

（2）按质量比为1:5~20的比例将PVP-Br溶于双蒸水中，按所述PVP-Br与2,2′-联吡啶的质量比为1:0.08～0.125的比例，加入2,2′-联吡啶；通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；依次加入CuBr和甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，所述PVP-Br、CuBr和甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯的质量比1:0.03～0.1:1.5～14，通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；于58～62℃反应10～15h；用截止分子量3500～10000的透析袋在纯水中透析2～14天；透析产物冷冻干燥后得到含有8.8%-40%的接枝度的阳离子聚合物基因载体。

所述聚乙烯吡咯烷酮的相对分子量为10000~60000。

本发明的优点：

（1）本发明的阳离子聚合物基因载体具有很好的结合DNA的能力。

（2）本发明的阳离子聚合物基因载体生物相容性好，对人体无刺激毒性低；

（3）本发明方法生产的阳离子聚合物基因载体分子量分布小，反应可控，几乎不生成PDMAEMA均聚物，产物易纯化；

（4）用本发明的阳离子聚合物基因载体运载质粒DNA，细胞转染率高，超过了PDMAEMA均聚物的转染效率。

附图说明

图1为PVP、PVP-Br和PVP-g-PDMAEMA的H1NMR的核磁谱图，其中：

PVP(A)、PVP-Br(B)、PVP-g-PDMAEMA(C)。

图2为PVP、PVP-Br和PVP-g-PDMAEMA的红外谱图，其中：

PVP(A)、PVP-Br(B)、PVP-g-PDMAEMA(C)。

图3为PVP-g-PDMAEMA/pDNA复合物的凝胶电泳照片，其中：

PVP-g-PDMAEMA-1/pDNA（a1）、PVP-g-PDMAEMA-2/pDNA（a2）。

图4为PVP-g-PDMAEMA/pDNA复合物的粒径和zeta电位图，其中：

PVP-g-PDMAEMA-1/pDNA（●表示粒径）（▲表示zeta电位）、PVP-g-PDMAEMA-2/pDNA（■表示粒径）（

表示zeta电位）。

图5为PVP-g-PDMAEMA复合DNA纳米粒的透射电镜图。

图6为不同N/P的PVP-g-PDMAEMA复合DNA纳米粒影响下的细胞活性。

图7为不同N/P的PVP-g-PDMAEMA复合DNA纳米粒的细胞转染效率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）将1.99g PVP加入到100mL的三口瓶中，加入20mL双蒸水，搅拌1h溶解形成水凝胶，再加入四氯化碳50mL，搅拌使PVP水溶胶充分分散在四氯化碳中；继续依次加入3.20g纯化的NBS和0.042g AIBN；油浴升温至90°C回流反应30h，反应结束后，旋蒸掉有机相即四氯化碳，将剩余水相在截止分子量8500的透析袋中透析2天；每4h换一次水，透析结束后产物冷冻干燥48h，制得大分子引发剂溴化聚乙烯吡咯烷酮，所述溴化聚乙烯吡咯烷酮用PVP-Br表示；通过GPC测试M_n为58000左右，PDI=1.27；通过核磁和红外表征产物，计算溴化度为8.8%；

（2）取PVP-Br 0.2g，加入至反应管中，用2mL双蒸水完全溶解，加入16.4mg 2,2′-联吡啶；重复三次液氮冷冻-抽真空-融化-通氮气的操作完全除去体系中的氧；再依次加入CuBr 7.85mg和DMAEMA0.44g；再重复三次液氮冷冻—抽真空—融化-通氮气的操作完全除去体系中的氧；置于60℃水浴反应12h；用截止分子量8500的透析袋在纯水中透析2天，每4h换一次水；透析结束后离心，取上层清液冷冻干燥48h，得到PVP-g-PDMAEMA。通过核磁和红外表征产物（见图1和图2），通过GPC计算接枝度8.8%和支链PDMAEMA的聚合度为15，支链平均分子量为2000。

实施例2

阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）按质量比1:8将聚乙烯吡咯烷酮（相对分子量为10000）溶于双蒸水中，搅拌1h溶解形成水凝胶，按水凝胶与四氯化碳体积比1:2加入四氯化碳，搅拌使所述水凝胶分散于四氯化碳中；按NBS与PVP质量比为1.6:1的比例加入NBS，再按PVP与AIBN质量比为1:0.02加入AIBN，于85℃回流反应60h；旋蒸除去四氯化碳有机相，将剩余水相用截止分子量3500的透析袋中透析2天；产物冷冻干燥后得到大分子引发剂PVP-Br；

（2）按质量比为1:5的比例将PVP-Br溶于双蒸水中，按所述PVP-Br与2,2′-联吡啶的质量比为1:0.08的比例，加入2,2′-联吡啶；通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；依次加入CuBr和DMAEMA，所述PVP-Br、CuBr和DMAEMA的质量比1:0.03:1.1，通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；于58℃水浴反应15h；用截止分子量3500的透析袋在纯水中透析2天；透析产物冷冻干燥后得到含有10%的接枝度的阳离子聚合物基因载体，支链PDMAEMA的聚合度为8，支链平均分子量为1000。

实施例3

阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）按质量比1:5将聚乙烯吡咯烷酮（相对分子量为30000）溶于双蒸水中，搅拌2h溶解形成水凝胶，按水凝胶与四氯化碳体积比1:3加入四氯化碳，搅拌使所述水凝胶分散于四氯化碳中；按NBS与PVP质量比为1.8:1的比例加入NBS，再按PVP与AIBN质量比为1:0.014加入AIBN，于95℃回流反应20h；减压蒸馏除去四氯化碳有机相，将剩余水相用截止分子量10000的透析袋中透析5天；产物冷冻干燥后得到大分子引发剂PVP-Br；

（2）按质量比为1:20的比例将PVP-Br溶于双蒸水中，按所述PVP-Br与2,2′-联吡啶的质量比为1:0.125的比例，加入2,2′-联吡啶；通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；依次加入CuBr和DMAEMA，所述PVP-Br、CuBr和DMAEMA的质量比1:0.1:4，通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；于62℃水浴反应10h；用截止分子量10000的透析袋在纯水中透析5天；透析产物冷冻干燥后得到含有20%的接枝度的阳离子聚合物基因载体，支链PDMAEMA的聚合度为14，支链平均分子量为1900。

实施例4

阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）按质量比1:20将聚乙烯吡咯烷酮（相对分子量为10000）溶于双蒸水中，搅拌1.5h溶解形成水凝胶，按水凝胶与四氯化碳体积比1:2.5加入四氯化碳，搅拌使所述水凝胶分散于四氯化碳中；按NBS与PVP质量比为3:1的比例加入NBS，再按PVP与AIBN质量比为1:0.03加入AIBN，于90℃回流反应40h；旋蒸除去四氯化碳有机相，将剩余水相用截止分子量3500的透析袋中透析3天；产物冷冻干燥后得到大分子引发剂PVP-Br；

（2）按质量比为1:12的比例将PVP-Br溶于双蒸水中，按所述PVP-Br与2,2′-联吡啶的质量比为1:0.09的比例，加入2,2′-联吡啶；通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；依次加入CuBr和DMAEMA，所述PVP-Br、CuBr和DMAEMA的质量比1:0.05:10，通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；于59℃水浴反应13h；用截止分子量8500的透析袋在纯水中透析3天；透析产物冷冻干燥后得到含有40%的接枝度的阳离子聚合物基因载体，支链PDMAEMA的聚合度为17，支链平均分子量为2400

实施例5

阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）按质量比1:12将聚乙烯吡咯烷酮（相对分子量为60000）溶于双蒸水中，搅拌1.2h溶解形成水凝胶，按水凝胶与四氯化碳体积比1:2加入四氯化碳，搅拌使所述水凝胶分散于四氯化碳中；按NBS与PVP质量比为2:1的比例加入NBS，再按PVP与AIBN质量比为1:0.02加入AIBN，于92℃回流反应30h；旋蒸除去四氯化碳有机相，将剩余水相用截止分子量6500的透析袋中透析4天；产物冷冻干燥后得到大分子引发剂PVP-Br；

（2）按质量比为1:8的比例将PVP-Br溶于双蒸水中，按所述PVP-Br与2,2′-联吡啶的质量比为1:0.1的比例，加入2,2′-联吡啶；通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；依次加入CuBr和DMAEMA，所述PVP-Br、CuBr和DMAEMA的质量比1:0.08:8，通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；于61℃水浴反应12h；用截止分子量6500的透析袋在纯水中透析14天；透析产物冷冻干燥后得到含有20%的接枝度的阳离子聚合物基因载体，支链PDMAEMA的聚合度为27，支链平均分子量为4000。

表1 5个实施例中PVP-g-PDMAEMA的接枝度和支链长度

实施例	PVP-Br(g)	DMAEMA(g)	H₂O(mL）	PVP-Br(Mn）	接枝度（%）	支链PDMAEMA聚合度
							PVP-g-PDMAEMA-1	0.2	0.44	2	58000	8.8	15
PVP-g-PDMAEMA-2	0.2	0.22	1	10000	10	8
							PVP-g-PDMAEMA-3	0.2	0.80	4	30000	20	14
PVP-g-PDMAEMA-4	0.2	2.00	3.6	10000	40	17
							PVP-g-PDMAEMA-5	0.2	1.6	1.6	60000	20	27

实施例6制备和表征PVP-g-PDMAEMA和质粒DNA组成的复合物纳米粒

（1）制备复合物

将实施例1、实施例2制备的阳离子聚合物基因载体分别溶于PBS，调节pH至7.2，用0.22μm的Millipore膜过滤除菌后在4℃保存，备用；将质粒（EGFP-N1质粒）DNA用PBS（pH=7.2）配制成50μL（24孔板）和25μL（96孔板）的DNA稀释液，浓度为0.2mg/mL；按照选定的N/P值5至50（以5、15、30、50为例）将阳离子聚合物溶液稀释后缓慢滴加至DNA稀释液中，混匀，室温静置30分钟。其中N代表阳离子聚合物中氨基基团摩尔数，P代表DNA中磷酸基团摩尔数。

（2）琼脂糖凝胶电泳实验

取10μL步骤（1）制备的复合物溶液与2μL上样缓冲液(6×，大连宝生生物)充分混合后加入到0.8%琼脂糖(含0.5μg/mL溴化乙锭)凝胶中。电泳缓冲液为1×TAE,电压为120V，电泳时间为40min，然后在紫外下观察DNA电泳图谱并照相。结果如图3所示，这说明本发明阳离子聚合物基因载体具有很强的DNA结合能力。在N/P比大于3时，两种样品都能完全阻滞DNA。

（3）复合物粒径和Zeta电位分析

将步骤（1）制备的复合物溶液，采用英国Malvern公司的Nano-ZS ZEN3600型激光粒度仪来测定聚合物/DNA复合物的粒径、粒径分布以及Zeta电位。测量温度为25°C，角度为173°，入射光波长633nm。结果如图4所示，结果表明在N/P比大于15时，复合物纳米粒粒径在200nm左右，表面电位为0-5mv。

（4）复合物纳米粒的电镜分析

将步骤（1）制备复合物溶液（实施例1），沾于制成Formvar膜的铜网上，待网上液滴将干未干的时滴加1滴磷钨酸溶液进行复染，镊起铜网，用滤纸吸取多余染液，室温下自然晾干。然后用JEM-100CXⅡ型透射电镜观察，加速电压80KV，并于合适区域拍摄纳米粒形态照片，依照片分析纳米粒的粒径及其分布。从图5中可以看出，复合物主要呈球形，尺寸分布比较单一，直径大约在160nm左右。由于TEM测试的是粒子的干态尺寸，因此结果和粒度仪结果略有偏差。

实施例7

实施例1和2制备的阳离子聚合物基因载体的体外细胞毒性实验

(1)在96孔板中接种1×10⁴个HepG2细胞/孔，每孔培养基体积为100μL，5%CO₂，37℃孵育过夜；

(2)加入50μL含0.2μgEGFP-N1质粒的复合物溶液（实施例1和2制备），同时设置调零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同体积的复合物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，5%CO₂，37℃孵育24h；

(3)每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，继续5%CO₂，37℃孵育4h；

(4)小心弃去孔内上清培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置低速震荡仪上振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值；

(5)计算各个样品孔细胞相对活力，将各孔吸光值减去调零孔吸光值，得到修正后吸光值OD490′。计算对照孔修正后吸光值的平均值avg(OD490C′)。

各样品孔细胞相对活力定义为：

结果如图6所示，对照美国药典中细胞相对增值率与细胞毒性分级的关系可以看出在N/P=5时，PVP-g-PDMAEMA的毒性分级为1级，即无细胞毒性；同时毒性小于商品化的转染试剂25kDa枝化PEI。

实施例8.体外转染实验

转染复合物颗粒的制备：参照实施例6的方法制备一系列N/P比的载体与质粒DNA的复合物。

（1）细胞培养

在24孔板中接种2×10⁵个HepG2细胞/孔，培养基体积为0.5mL。培养18h后，细胞融合率达到60-80%；转染前，将培养基换成无血清无抗生素的DMEM，每孔0.5mL；

（2）细胞转染

将100μL含2.0μgEGFP-N1质粒的PVP-g-PDMAEMA/EGFP-N1（实施例1制备）复合物溶液加入24孔板中，每样设3个平行孔；37℃及5%CO2浓度下培养4h后将孔中液体吸出，换为含2%FBS的DMEM维持培养液，0.5mL/孔；37℃的5%CO2孵箱中继续培养48h后，检测绿色荧光蛋白的表达情况。绿色荧光蛋白的表达，通过倒置荧光显微镜(Olympus IX70,Olympus,Tokyo,Japan)原位定性检测阳性细胞。结果如图7，看出当、N/P比为15时，具有较长阳离子接枝链段的PVP-PDMAEMA-1（实施例1制备）与DNA的复合物的转染效率接近商品化的转染试剂25kDa枝化PEI。

本发明中用溴化PVP做ATRP反应的大分子引发剂，溴化部位为α-羰基位的碳原子。通过ATRP反应制得PDMAEMA接枝的PVP。通过凝胶渗透色谱测定PVP-Br的分子量及其分布，用核磁谱图计算溴化的程度。大分子引发剂的合成步骤和纯化方法见实施例1。

本发明用聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）来结合DNA。通过相对分子质量对PDMAEMA体外基因传递的影响研究，发现相对分子质量不影响细胞内吞的效率，而是影响PDMAEMA／DNA复合物进入细胞内的运输过程。相对分子质量高的PDMAEMA负载DNA的转染效率高于相对分子质量低的，原因是叔胺基含量高的相对分子质量大的PDMAEMA与DNA的结合能力强，可有效避免DNA的酶解。但是高相对分子质量(通常>3万)的PDMAEMA已无法通过肾脏排出，在使用高相对分子质量PDMAEMA作为载体时，会不可避免在体内残留。本发明将PDMAEMA接枝到生物相容性好的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）上，形成相对高分子量的PVP-g-PDMAEMA，提高转染效率同时降低细胞毒性。用GPC测得所得PVP-g-PDMAEMA的分子量分布，用核磁计算得其接枝程度。详细的合成步骤见实施例1。

本发明的载体与外源DNA复合物的制备方法。将合成的两种不同支链长度的PVP-g-PDMAEMA用PBS溶液溶解，每种支链长度的聚合物配成不同N/P比的聚合物与质粒DNA复合物纳米粒。具体步骤见实施例6步骤（1）。

本发明通过透射电镜表征载体与DNA复合物的形态，考察其尺寸能否满足被细胞内吞的要求。具体步骤见实施例6步骤（4）。

本发明用合成的两种不同支链长度的聚合物载体进行体外细胞转染实验，验证基因载体的转染效果。通过和均聚PDMAEMA对比，说明接枝聚合物提高转染效率的有效性。具体实验步骤见实施例8。

本发明测试了载体的细胞毒性。接枝聚合物PVP-g-PDMAEMA与未接枝的PDMAEMA均聚物相比，最明显的优势之一在于其降低了细胞毒性。为考察接枝后的聚合物载体细胞毒性，采用MTT实验测试，其检测原理为：黄色的四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenyltertrazolium bromide,MTT)能被活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶转化成蓝紫色的结晶物，二甲基亚砜能溶解该蓝紫色的结晶物，用酶标仪检测在570纳米波长处测定吸光度值，吸光度的大小与活细胞数量呈正相关。而死细胞无此功能，故可用此方法间接反应细胞活性。具体实验步骤见实施例7。

Claims

1.一种阳离子聚合物基因载体，其特征是由主链聚乙烯吡咯烷酮和支链聚甲基丙烯酸N,N-甲氨基乙酯接枝而成，所述接枝的聚合物接枝度为8.8%-40%。

2.如权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体，其特征是所述聚乙烯吡咯烷酮的相对分子量为10000~60000。

3.如权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体，其特征是所述每条支链聚甲基丙烯酸N,N二甲氨基乙酯的分子量为1000~4000。

4.权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征包括以下步骤：

（2）按质量比为1:5~20的比例将PVP-Br溶于双蒸水中，按所述PVP-Br与2,2′-联吡啶的质量比为1:0.08～0.125的比例，加入2,2′-联吡啶；通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；依次加入CuBr和甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，所述PVP-Br、CuBr和甲基丙烯酸N,N-甲氨基乙酯的质量比1:0.03～0.1:1.5～14，通过抽真空通氮气完全除去体系中的氧；于58～62℃反应10～15h；用截止分子量3500～10000的透析袋在纯水中透析2～14天；透析产物冷冻干燥后得到含有8.8%-40%的接枝度的阳离子聚合物基因载体。

5.根据权利要求4所述的阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征是所述聚乙烯吡咯烷酮的相对分子量为10000~60000。