CN113769087B - 仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒及其制备和应用，具体涉及细胞膜包裹的共组装肿瘤光疗纳米粒制备方法及其应用，包括无载体型共组装纳米粒的构建，生物膜包裹的仿生纳米粒的构建，还涉及利用两种光敏剂间的荧光共振能量转移来提升抗肿瘤光敏剂递送安全性的技术。本发明用两种光敏剂DiR和二氢卟吩e6(Ce6)通过一步纳米沉淀法制备形成的纳米组装体，然后在纳米粒表面包被红细胞膜以增加纳米粒的稳定性并改善药动学性质。本发明的制备方法稳定可靠，制备工艺简单，制得的红细胞膜包被共组装生物仿生纳米粒具有超高的载药量，可以实现多种光敏剂的高效共载和光热‑光动程序性协同诊疗。

Description

仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒及其制备和应用，具体涉及细胞膜包裹的共组装肿瘤光疗纳米粒制备方法及其应用，包括无载体型共组装纳米粒的构建，生物膜包裹的仿生纳米粒的构建，还涉及利用两种光敏剂间的荧光共振能量转移来提升抗肿瘤光敏剂递送安全性的技术。
背景技术
乳腺癌严重威胁女性健康。目前，多数早期发现的乳腺癌都可以得到有效的控制和治疗，然而，三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)仍然是临床癌症治疗的难点。TNBC对化疗药的敏感性非常差，且大部分化疗药治疗窗窄，疗效不佳且毒副作用严重。除了传统的全身性的化疗方案，光热治疗(Photothermal therapy,PTT)和光动力学治疗(Photodynamic therapy,PDT)通过局部激光使得局部温度升高或活性氧(Reactiveoxygen species,ROS)蓄积，能诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死，发挥抗肿瘤作用。与化疗药不同，PTT和PDT不依赖特定细胞受体的表达，是更安全有效的癌症治疗策略。
然而，单独使用PTT或PDT的抗肿瘤效果都十分有限。PTT产生的局部温度升高并不能完全消除肿瘤区域的所有肿瘤细胞。PDT产生ROS的过程非常依赖氧气(O2)，肿瘤局部缺氧会极大地限制其疗效的发挥。将PTT与PDT联合应用非常有前途。PTT产生的热量不仅能杀伤肿瘤细胞，还能缓解肿瘤组织的乏氧情况，从而促进PDT产生ROS的能力；PDT产生的ROS则能进一步杀伤残余的肿瘤细胞。但是，PDT光敏剂在未从体内代谢干净之前，患者要长时间处于避光的暗室，防止光毒性。因此，如何既能实现应用于PTT和PDT光敏剂的高效联合递送，又能最大程度减小PDT光敏剂的光毒性问题，将有望进一步提高TNBC治疗的安全性和有效性。
发明内容
本发明的目的在于利用分子共组装纳米技术、特定光敏剂分子间的荧光能量共振转移(FRET)、以及细胞膜包衣仿生技术，构建光敏剂分子共组装仿生纳米递药系统。首先，基于光敏剂分子间的组装特性制备共组装纳米粒，由于分子自组装纳米给药系统具有超高载药量的优点，可以实现多种光敏剂的高效共载和同步递送；其次，基于光敏剂分子间的FRET作用，在光敏剂分子共组装的过程中，分子间距离缩短，可以实现对低激发波长PDT光敏剂的“预淬灭”，大幅提升其安全性，在肿瘤部位，采取双波长程序性激光激活，可以实现对TNBC的光热-光动程序性协同诊疗。此外，细胞膜包衣将延长共组装纳米粒的体内循环时间，增强肿瘤部位的蓄积。本发明将为TNBC的“高效低毒”联合治疗提供一种新的药物传递策略。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明所述的仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒，是由两种光敏剂通过非共价作用力形成的纳米组装体，组装过程会淬灭低激发波长光敏剂，也可以在纳米组装体表面包裹细胞膜实现功能化。
所述的双光敏剂由两类光敏剂组成，一种为光动治疗光敏剂，另一种为光热治疗光敏剂；光动治疗光敏剂与光热治疗光敏剂的摩尔比为：1:1～1:5。所述的光动治疗光敏剂，选自二氢卟吩e6或叶绿素衍生物；所述的光热治疗光敏剂为吲哚花菁类染料，选自DiR、ICG。
当光动治疗光敏剂与光热治疗光敏剂的摩尔比为1:1.5～1:3时，可以形成较好的共组装纳米粒并能有效淬灭光动治疗光敏剂。
所述的共组装纳米粒表面包裹的细胞膜为红细胞膜。
所述共组装纳米粒与红细胞膜质量比是1：2～1：10；进一步优选的质量比是1∶3～1∶5。
本发明所述的双光敏剂共组装纳米粒通过如下方法制备：
将一定量的光敏剂混合物溶解到适量的有机溶剂中，搅拌下，将该溶液缓慢滴加到水中，自发形成均匀的纳米粒。所述的有机溶剂为乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜或任意两种的组合。
所制备的共组装纳米粒表面可以包裹红细胞膜进而延长共组装纳米粒的体内循环时间。
进一步地，本发明优选的双光敏剂共组装纳米粒为DiR与Ce6共组装纳米粒(DiR-Ce6 NPs)。所述的DiR-Ce6共组装纳米粒，是DiR与Ce6通过非共价作用力包括π-π堆积、疏水作用、分子间氢键等形成的纳米组装体。其中，Ce6与DiR的摩尔比为：1:1.5～1:3。
所述的DiR-Ce6共组装纳米粒的制备方法如下：
将一定量的DiR与Ce6溶解到适量有机溶剂乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜或者以上两种的混合溶剂中，优选为乙醇和四氢呋喃混合溶剂(乙醇与四氢呋喃的比例为2:1～1:1)中(DiR浓度范围为1.5mg/mL～2.0mg/mL，Ce6浓度范围为0.5mg/mL～1.0mg/mL)，搅拌下，将含药溶液缓缓滴加到水中，自发形成均匀的纳米粒，制备完成后有机溶剂通过旋蒸除去。所述的共组装纳米粒表面包裹的细胞膜为红细胞膜。
细胞膜包覆方法如下：将共组装纳米粒与一定量的红细胞膜混悬液混合，然后使用物理挤出的方式分别过孔径为400～800nm、200～400nm和100～200nm的高分子材料膜进行挤出，来回挤出4～16次后，即得。所述高分子材料膜是聚碳酸酯膜；孔径分别为：400、200和100nm。
进一步地，所述红细胞膜混悬液的制备方法是：取新鲜血液，离心收集红细胞，洗涤，用0.25PBS缓冲液溶胀红细胞破膜，离心收集细胞膜，洗涤，用去离子水分散，并用细胞破碎超声仪处理。冻干后，保存待用，临用前用与纳米粒等体积的去离子水分散。
所述细胞破碎超声仪处理条件为100W,总处理时间10分钟(工作3秒，间歇3秒)。
所述的细胞膜冻干条件为，-60℃预冻5小时，真空干燥24小时。
优选地，所述纳米粒与红细胞膜质量比是1:3～1:5；进一步优选的质量比是1:4～1:5。
本发明具有以下有益效果：(1)利用光敏剂独特的分子纳米组装特性，构建无载体型共组装纳米粒，因分子自组装纳米给药系统具有超高载药量的优点，可以实现光敏剂的高效共载和同步递送；(2)利用红细胞膜的免疫逃逸及作用，构建膜包被型的共组装仿生纳米粒，细胞膜延长纳米粒的体内循环时间，可以实现共组装纳米粒的高效递送；(3)利用Ce6与DiR分子间的荧光共振能量转移作用，在它们共组装的过程中，分子间距离缩短，实现DiR对Ce6的“预淬灭”，大幅提升其安全性，在肿瘤部位，采取808nm-660nm双波长程序性激光激活，可以实现对TNBC的光热-光动程序性协同诊疗；(4)在体外和体内TNBC细胞和动物模型中，膜包覆型光敏剂共组装纳米粒的光热-光动程序性协同诊疗效果良好，可以在一定程度上实现“高效低毒”双波长程序性联合诊疗，具有一定的临床转化潜力。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同光敏剂比例的共组装纳米粒在0与24h，在含10％胎牛血清的磷酸盐缓冲液中的粒径。
图2为本发明实施例2中不同细胞膜与纳米粒比例的制剂在0与12h，在含10％胎牛血清的磷酸盐缓冲液中的粒径。
图3为本发明实施例2的红细胞包膜前后纳米粒的表征。
A：包膜前后的纳米制剂照片及透射电镜照片。
B:包膜前后的纳米粒的粒径变化及电位变化。
图4为本发明实施例3的包膜与未包膜的共组装纳米粒在含10％胎牛血清的PBS中的稳定性。
图5为本发明实施例4的红细胞包膜的共组装纳米粒的SDS-PAGE表征。
图6为本发明实施例5的红细胞包膜的共组装纳米粒的Western-blot表征。
图7为本发明实施例6的不同浓度的包膜共组装纳米粒在808nm激光照射下的温度变化。
图8为本发明实施例7的包膜纳米粒经808nm激光漂白前后的紫外光谱。
图9为本发明实施例7的包膜纳米粒经808nm激光漂白前后的荧光光谱。
图10为本发明实施例7的包膜纳米粒经808nm激光漂白前后的产生单线态氧能力的水平。
图11为本发明实施例7的包膜纳米粒的细胞摄取考察。
图12为本发明实施例7的光热效应对包膜共组装纳米粒的渗透性影响。
图13为本发明实施例7的纳米粒经808nm激光激活前后细胞毒比较。
图14为本发明实施例7的纳米粒的联合光动光热与单独的光动光热细胞毒对比。
图15为本发明实施例7的共组装纳米粒的药动学考察。
图16为本发明实施例7的纳米粒在多次注射中加速清除情况的考察。
A:包膜共组装纳米粒的二次注射药动学实验。
B:PEG化共组装纳米粒的二次注射药动学实验。
图17为本发明实施例7的共组装纳米粒的离体组织分布。
图18为本发明实施例7的经808nm激光激活后肿瘤部位Ce6的荧光信号变化。
图19为本发明实施例7的共组装纳米粒的体内光热效果。
图20为本发明实施例7的光热治疗前后肿瘤缺氧区域的变化。
图21为本发明实施例7的经药物治疗后各组小鼠肿瘤体积随时间变化曲线。
图22为本发明实施例7的经药物治疗后各组小鼠体重随时间变化曲线。
图23为本发明实施例7的经药物治疗后各组小鼠的生化指标变化。
图24为本发明实施例7的包膜纳米粒与Ce6溶液剂在660激光照射下对正常组织的光毒性的H&E染色照片。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：Ce6-DiR共组装纳米粒的制备
DiR首先溶解在乙醇(5mg/mL)中，Ce6溶解在四氢呋喃(THF)(5mg/mL)中。然后,将含0.5mg的DiR的有机溶剂与不同摩尔比的Ce6的有机溶剂混合，并用乙醇与四氢呋喃的混合溶液(体积比，乙醇：四氢呋喃＝2:1)稀释至300μL。在2000转/分的搅拌速度下，将300μL混合溶液滴入2mL去离子水中，避光搅拌。5分钟后，旋蒸去除有机溶液，调整溶液体积为1mL。
所得纳米粒的粒径分布及电位如表1所示。当Ce6与DiR的摩尔比大于1：1时二者不能形成共组装纳米粒，而当Ce6与DiR的摩尔比小于1：1时，能形成共组装纳米粒，当Ce6与DiR的摩尔比超过1：3时，纳米粒的电位由负变正不利于包裹细胞膜。因此，优选的双光敏剂比例为1:1.5～1:3(Ce6:DiR)。
表1共组装纳米粒的比例筛选
Figure BDA0002532575870000051
进一步利用稳定性实验对共组装纳米粒的比例进行了筛选。将制得的含不同比例光敏剂的共组装纳米粒取出200μL，加入到4mL含有10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育24小时，并且通过动态光散射法测定其在0与24h时纳米粒粒径变化。结果如图1所示，Ce6与DiR的摩尔比为1:1.5～1:2时，共组装纳米粒具有最好的胶体稳定性。
实施例2：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的制备
红细胞膜的提取方式：先用1×PBS对SD大鼠红细胞进行3次洗涤。去除PBS后，将红细胞在4℃条件下，在0.25×PBS的低渗介质中孵育3h，然后以10000×g离心10min，离心后用冰水反复洗涤3次。收集离心得到的红细胞膜，分散后超声(100W,10min)，然后冷冻干燥，并在-80℃下保存。
将红细胞膜包覆于共组装纳米粒的方法：先将细胞膜的冻干粉复溶，然后用探头超声仪进行超声(100W,10min)处理，最后将细胞膜溶液与共组装纳米粒(Ce6与DiR的摩尔比为1:1.5)按不同的质量比混合。
所制得的红细胞膜包裹的共组装纳米粒粒径分布及电位如表2所示。当共组装纳米粒与红细胞膜的质量比小于1:3时，二者主要形成沉淀，而当共组装纳米粒与红细胞膜的质量比大于1：3时，二者能形成较好膜包覆的纳米结构，因此，选择的共组装纳米粒与红细胞膜的质量比为1:3～1:5。
表2红细胞膜与共组装纳米粒的质量比例筛选
Figure BDA0002532575870000061
进一步利用稳定性实验对纳米粒细胞模的比例进行了筛选。将不同比例的制剂取出200μL，加入到4mL含有10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在室温下孵育12小时，并且通过动态光散射法测定其在0与12h的纳米粒粒径变化。结果如图2所示，共组装纳米粒与红细胞膜的质量比为1:4～1:5时，具有最好的胶体稳定性，因此，选择该比例作为共组装纳米粒的处方比例。
优选了纳米粒与细胞的质量比1：5作为该制剂的最佳比例。然后将所得的膜包覆纳米粒通过一系列聚碳酸酯膜(400nm、200nm和100nm)挤压至少10个周期。所得的红细胞膜包覆纳米粒保存在4℃，以备进一步使用。包膜前后，粒径电位变化，及透射电镜如图3所示。包膜前后纳米粒的粒径增大了30nm左右，电位有所降低。另外，透射电镜也显示了细胞膜成功包裹于纳米粒表面。
实施例3：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的胶体稳定性试验
将实施例2中制备的红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒及未经包膜的纳米粒在37℃的条件下，在含有10％FBS的pH 7.4的PBS中孵育12h，并且在预定的时间点(0，2，4，8，12h)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图4所示，红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒在12小时内粒径无明显变化，显示出良好的胶体稳定性。
实施例4：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的膜表面标志物表征。
对于共组装纳米粒红细胞包膜上的CD47分子的表征，采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫蛋白印迹(Western blotting)的方法。首先，用蛋白提取试剂盒(提取样品的全部细胞蛋白，电泳分离后，用考马斯亮蓝对分离的蛋白进行染色，结果如图5所示，在47-55kDa内有明显的目标分子条带。将提取分离后的蛋白转移到PVDF膜上。然后用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜。经一级和二级抗体孵育后，用飞克特超敏ECL发光液(大连美仑生物科技有限公司)对PVDF膜进行处理，最后进行成像，成像结果如图6所示。结果表明包膜纳米粒表面的CD47分子保持良好。
实施例5：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的体外光热效果实验
红细胞膜包裹的共组装纳米粒的体外光热效应利用红外热像仪(Fotric 226)测量。将不同浓度的纳米粒置于功率密度为2.0W cm-2的808nm激光器(MDL-N-5W，长春新产业光电技术有限公司)下照射5min，记录照射过程中的温度变化。结果如图7所示，溶液的温度随照射时间和DiR浓度的增加而升高。当纳米粒的浓度达到25.0μg mL-1以上时,最大温度可达到50℃以上并维持3分钟,这可对肿瘤细胞形成不可逆的损伤。
实施例6：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒光照前后的紫外与荧光光谱实验
共组装纳米粒及红细胞膜包裹的共组装纳米粒以Ce6 25μg mL-1的浓度添加到96孔板,然后利用多功能酶标仪扫描其紫外和荧光光谱。纳米粒经1.0W cm-2的808-nm激光照射5min后，以同样方式得到他们的紫外与荧光光谱。结果如图8-9所示，从紫外光谱可以看出激光照射前后对Ce6的吸收基本无影响，但DiR在700-800nm处的吸光度明显下降。说明808nm激光照射对DiR进行了漂白(消耗了DiR)，但不影响Ce6。从荧光光谱可以看出，激光照射前，纳米粒中的Ce6荧光很弱(处于淬灭状态)，而激光照射后，Ce6的荧光明显恢复。说明利用808nm激光对DiR进行光漂白可以控制Ce6的感光能力。
实施例7：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的体外单线态氧检测实验
共组装纳米粒的单态氧产生能力采用单态氧传检测(SOSG)试剂盒检测。将经808nm激光辐照前后的共组装纳米粒,以及Ce6溶液剂,与SOSG混合，Ce6浓度3μM，SOSG的浓度2μM。然后用660nm激光在10mW cm-2下照射样品5min。在预定的时间间隔，用多功能酶标仪检测荧光信号强度(激发波长504nm，发射波长525nm)。结果如图10所示，包膜与未包膜的纳米粒在808nm辐照之前显示非常低的单线态制氧产生能力。相比之下,辐照后,单线态氧产生能力明显恢复。说明利用808nm激光对纳米粒中的DiR进行漂白，可以控制纳米粒中Ce6单线态氧的产生能力。
实施例7：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的细胞摄取实验
将4T1细胞以100000cells/mL的密度接种到12孔板上，置培养箱中孵育24h使其贴壁，待细胞贴壁后加入Ce6的溶液剂以及包膜和未包膜的共组装纳米粒。Ce6的浓度为400ng/mL。将细胞在37℃下与制剂孵化0.5h或2h。另外两组细胞与包膜和未包膜的纳米粒孵育后在检测前用808nm激光照射，(1W cm-2,5min)。最后将细胞清洗，收集并分散在PBS中，用流式细胞仪考察细胞对纳米粒的摄取情况。结果如图11所示，在0.5和2.0h，未经808nm激光照射的纳米粒在细胞中仅有较弱的Ce6信号，而检测前经过808nm激光照射的纳米粒，在2h细胞中发现有较强的Ce6信号，且纳米粒组的Ce6信号强度强于溶液剂组。说明细胞在2h时对纳米粒有较好的摄取，并且光敏剂分子组装为纳米粒后的细胞摄取有提升，同时Ce6在纳米粒中处于淬灭状态需要808nm激光的激活才可观察。
实施例8：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的肿瘤球渗透性实验
肿瘤球的构建：将4T1细胞以1.0×105细胞/孔的密度接种于超低细胞黏附24孔板中，并按正常细胞培养流程培养4天。
肿瘤球渗透性实验：将Ce6溶液及包膜纳米粒与肿瘤球共同孵育4h。另一组包膜纳米粒在与肿瘤球孵育2h时进行808nm激光辐照(2W cm-2,5min)，然后继续培养2h。在用共聚焦显微镜观察之前,所有的细胞都进行808nm激光辐照(1W cm-2，5min)。
共聚焦图像如图12所示，未经808nm激光照射的包膜纳米粒渗透较弱，照射后细胞球内Ce6的信号明显增强。说明DiR激发后发挥光热作用可以增加纳米粒在肿瘤组织中的渗透。
实施例9：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的细胞毒实验
将4T1细胞以2.0×103/孔的密度接种于96孔板。为了评价光热治疗和光动治疗联合治疗的效果，24h后，将不同浓度的DiR与Ce6的溶液剂以及包膜与未包膜的纳米粒与肿瘤细胞孵育。孵育12小时后，将细胞分别置于808nm激光(3.0W cm-2)下3分钟或660nm激光(2mWcm-2)下5分钟，或依次置于808-660nm激光下。经激光照射后，细胞继续培养24小时，MTT法检测细胞毒性。结果如表3及图13所示，与单独的光动或光热治疗相比，联合光动与光热治疗，对4T1三阴性乳腺癌细胞的抑制明显提升，说明这种光动与光热的联合具有更好的抗肿瘤效果。
表3.共组装纳米粒光动光热联合治疗的细胞毒考察
Figure BDA0002532575870000091
为了评估Ce6在淬灭和激活状态下的细胞毒性，4T1细胞分别与Ce6溶液剂以及包膜和未包膜的纳米粒孵育。12h后，将这些细胞置于弱的808nm激光下(1W cm-2)照射5min，未照射的细胞作为对照。然后，所有细胞用660nm激光(2mW cm-2)照射5min，培养24h,MTT法测定。实验结果如表4和图14所示，由于DiR的淬灭作用，未经808nm激光照射的纳米粒细胞毒性较弱。相比之下，对DiR进行光漂白后，细胞毒性明显提升，说明Ce6的光毒性可以通过DiR的漂白来进行控制。
表4.激活与淬灭状态的Ce6细胞光毒性考察
Figure BDA0002532575870000101
实施例10：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的药代动力学研究
取体重在210-260g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别尾静脉注射DiR溶液剂(DiR Sol)以及实施例1中制备的共组装纳米粒(Ce6:DiR＝1:1.5)及实施例2中制备的红细胞膜包裹的共组装纳米粒(纳米粒：细胞模＝1:5)。DiR的剂量为1mg kg-1。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。利用甲醇沉淀蛋白提取DiR,并通过多功能酶标仪测定血浆中的药物浓度。实验结果如表5和图15所示，与DiR溶液剂相比，共组装纳米粒的血液循环时间明显延长，半衰期(t1/2)、最大血药浓度(Cmax)、AUC、MRT等药动参数均有提高，说明成功构建的共组装纳米粒对DiR分子有较好的保护作用，可以改善其药动学行为。此外，与DiR溶液剂和未包膜纳米粒相比，包膜的纳米粒在血液中的保留时间明显延长，这可能是由于其改善了纳米粒的稳定性并提供了免疫逃逸表面，这进一步提升了其药动行为。
表5.共组装纳米粒的药动学参数
Figure BDA0002532575870000102
为了研究多次给药对光敏剂药代动力学的影响，首先给SD大鼠注射包膜的纳米粒或PEG化的共组装纳米粒。得到血浆后，在-80℃保存。5天后，再给大鼠注射与第一次相同的制剂。然后收集血浆并与第一批一起测定。结果如表6和图16所示，PEG化的共组装纳米粒的第二次注射的血液循环时间明显降低，半衰期(t1/2)、最大血药浓度(Cmax)、AUC、MRT等药动参数明显降低，而包膜的共组装纳米粒的第二次注射呈现与第一针相似的药代动力学趋势与药动学参数。说明红细胞膜的包裹能改善PEG化纳米粒在多次注射中的加速清除效应。
表6.共组装纳米粒二次注射的药动学参数
Figure BDA0002532575870000111
实施例11：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的体内分布实验
将4T1细胞悬液接种于BALB/c小鼠，当肿瘤体积达到400mm3时，尾静脉注射DiR溶液剂及包膜和未包膜的共组装纳米粒。DiR的给药剂量为2mg kg-1。在预定的时间间隔，小鼠被麻醉。采用小动物活体成像系统记录DiR的荧光信号。24h时处死小鼠，收集肿瘤及主要脏器进行成像定量分析。结果如图17所示，注射给药后，DiR在肿瘤部位的荧光信号持续增强。与DiR溶液剂和未包膜的共组装纳米粒相比，包膜后的纳米粒在肿瘤部位的蓄积明显增强。这些结果说明包膜的共组装纳米粒能更好的蓄积于肿瘤细胞。
为了评价808nm激光对Ce6的体内激活作用，给4T1荷瘤小鼠注射了包膜纳米粒24h后，用808nm激光照射(2W cm-2,5min)照射肿瘤部位。然后，所有小鼠均被处死，取出肿瘤进行成像分析。结果如图18所示，肿瘤部位的DiR经过光漂白后，Ce6在肿瘤组织中的荧光强度约为照射前的两倍，说明Ce6能否在体内激活也可通过对DiR的光漂白控制。
实施例12：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的体内光热效果实验
分别给4T1荷瘤BALB/c小鼠，注射DiR溶液剂及包膜与未包膜的纳米粒(DiR剂量5mg kg-1)。24小时后，将小鼠暴露于808nm激光(2W cm-2)下5分钟。PBS注射小鼠作为对照。在预先设定的时间间隔内，记录红外热像图和温度变化。结果如图19所示，注射包膜纳米粒的小鼠，肿瘤部位经808nm激光照射后，温度明显高于溶液剂及未包膜纳米粒组。说明红细胞包膜纳米粒可以显著提高光敏剂的体内光热效果。
实施例13：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒缓解肿瘤部位缺氧实验
肿瘤组织缺氧状态的评估使用盐酸哌莫硝唑(HypoxyprobeTM,USA)。给4T1荷瘤小鼠静脉注射包膜纳米粒(DiR剂量5mg kg-1)。24h后，用808nm激光(2.0W cm-2,5min)照射小鼠。未接受激光照射的小鼠作为对照。然后腹腔注射1.5mg盐酸吡莫硝唑给每只小鼠。90min后处死小鼠，收集肿瘤组织并用福尔马林固定、石蜡包埋，然后对标本进行免疫染色。分别用CD31抗体和Hyproxyprobe-1MAb1对血管和缺氧部位进行染色。二抗孵育后，用荧光显微镜观察。结果如图20所示，经激光照射前，肿瘤部位缺氧面积较大，经激光照射后肿瘤缺氧明显减轻。说明经过光热治疗后，肿瘤部位的升温能使肿瘤部位的缺氧状况改善，这种缺氧的缓解有利于体内光动治疗效果的提升。
实施例14：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的体内抗肿瘤实验
当肿瘤体积达到200mm3时，将小鼠随机分为:(1)生理盐水对照组；(2)采用660nm激光照射(10.0mW cm-2,5min)的Ce6溶液剂组；(3)使用808纳米激光(2.0W cm-2,5min)的DiR溶液剂组；(4)单独660nm激光照射的包膜纳米粒组；(6)-(7)808nm和660nm激光连续照射组，注射制剂分别为未包膜纳米粒包膜纳米粒激光处理时间与强度与上述相同。这些制剂的剂量为2.0mg kg-1的Ce6或5.0mg kg-1的DiR)每隔一天静脉给药小鼠，共五次注射。给药后12小时，小鼠暴露于808nm激光(2W cm-2)下5分钟。给药后24小时，小鼠按分组说明处理。每2天记录肿瘤体积及体重变化。所有的操作避光进行。最后一次给药3天后处死小鼠，收集血液进行肝肾功能分析。
结果如图21所示，由于Ce6处于猝灭状态，单独660nm激光照射下包膜纳米粒治疗组肿瘤体积迅速增大，与生理盐水处理组相同。与传统的光动或光热治疗(DiR和Ce6溶液剂组)相比，未包膜纳米粒优势不明显，肿瘤生长迅速。其原因可能是纳米粒循环时间较短。相比之下，包膜共组装纳米粒在连续的局部激光照射下表现出最强的肿瘤抑制活性，肿瘤体积几乎没有进展。这些结果证明了仿生共组装在协同光热/光动力治疗中的巨大优势。如图22-23所示，各组经治疗后的小鼠肝肾功能及体重均未见明显变化，说明这些制剂具有良好的生物安全性。
实施例15：红细胞膜包裹的Ce6-DiR共组装纳米粒的在光动治疗中对正常组织的保护实验
用脱毛BALB/c小鼠进行体内光动治疗光毒性的研究。静脉注射Ce6溶液剂和包膜共组装纳米粒(n＝3)，Ce6剂量为3.0mg kg-1。对照组为注射PBS的小鼠。在给药后3小时，所有小鼠均暴露于5.0mW cm-2的660nm激光下1小时，8小时后处死小鼠，取皮肤、肾脏和脾脏进行H&E染色。结果如图24所示，与生理盐水对照组相比，包膜共组装纳米粒处理小鼠未见明显的组织学损伤。与之相反，Ce6溶液处理组小鼠皮肤和肾脏有明显坏死区域。这些结果表明，红细胞包膜仿生纳米粒作为一种强大的纳米平台有望缓解常规光动治疗中可能出现的正常组织损伤。

Claims (8)

1. 仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒，其特征在于，两种光敏剂通过非共价作用力共组装，两种光敏剂的摩尔比为1:1.5~1:2，所述共组装纳米粒表面包裹红细胞膜，共组装纳米粒与红细胞膜质量比是1：3 ~ 1：5，所述的光敏剂由光热治疗光敏剂和光动治疗光敏剂组成，所述的光动治疗光敏剂选自二氢卟吩e6；所述的光热治疗光敏剂选自DiR。
2.如权利要求1所述的仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒，其特征在于，两种光敏剂通过π-π堆积、疏水作用、分子间氢键共组装。
3.如权利要求1所述的仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将一定量的光敏剂混合物溶解到适量的有机溶剂中，搅拌下，将该溶液缓慢滴加到水中，自发形成均匀的共组装纳米粒，将共组装纳米粒与红细胞膜混悬液混合，然后使用物理挤出的方式分别过孔径为400～800nm、200～400nm和100～200nm的高分子材料膜进行挤出，来回挤出4～16次后，得红细胞膜包裹的双光敏剂共组装纳米粒。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜或任意两种的组合。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高分子材料膜是聚碳酸酯膜。
6.权利要求1所述的仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒在制备药物传递系统中的应用。
7.权利要求1所述的仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.权利要求1所述的仿生预淬灭双光敏剂共组装纳米粒在制备注射给药系统中的应用。
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