CN108653749B - 一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束及载药胶束的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束,包括亲水端、连接链、疏水端,将所述亲水端、连接链、疏水端合成了锁核酸纳米载药胶束单体。其制备方法如下:(一)、胶束单体疏水头基与连接链结构的构建;(二)、胶束单体亲水头基与连接链结构的构建;(三)、锁核酸纳米载药胶束合成;(四)、胶束结构表面修饰细胞穿膜肽TAT;(五)、药物载体转染组织细胞;(六)、抗癌药物紫杉醇的释放与检测。本发明构建了一种新颖的锁核酸纳米载药胶束药物载体,由于其良好的生物相容性和刺进响应性,使其可以更好的在生物体内传递,直达病灶,提高药效。
Description
技术领域
本发明涉及药物载体合成领域,具体为一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束及载药胶束的制备方法。
背景技术
纳米粒子作为药物运输载体,已经有较成熟的发展。如图1所示,以碳纳米管(a)为例,其粒径控制在100 nm 以下,装载药物(b)后封口。当进入体液循环系统后,通过胞吞、巨胞饮等作用进入肿瘤细胞,基于pH灵敏性、温度灵敏性,光灵敏性等释放药物,达到杀死肿瘤细胞的目的。但是金属纳米粒子极其不稳定,且难以排除生物体内,富集效应会对生物体造成很大危害。目前,纳米粒子载药应用于多方面:运载多肽和蛋白类药物用于内分泌系统及其他疾病治疗;输送免疫调节剂、抗肿瘤药用于抗肿瘤治疗、输送抗菌药用于细胞内化疗和输送抗病毒药物防治多种疾病等。
目前,抗癌药物以紫杉醇、喜树碱、阿霉素为主。大部分小分子抗癌药物的疏水性使其难以通过循环系统到达病灶。合成药物衍生物的方法受到越来越多的关注,改变药物的亲疏水性,提高药物在体内运输的稳定性。例如,通过对某些官能团的选择性衍生化进而对药性进行研究,筛选活性更高的药物。喜树碱是由A、B、C、D、E五环骈合而成,对于A环或B环进行结构修饰后能得到抗肿瘤效果较好的喜树碱衍生物,而E环取代使α羟基内脂或20位C的立体结构发生变化,其抗肿瘤特性基本消失。但是其缺点也是显而易见的,例如合成过程中路线较长,总产率低等。
现在纳米材料的合成方法主要包括单体聚合法和聚合物分散法。单体聚合法通过诱导单体进入乳液或溶解于聚合物非溶剂中,发生成核和生长两个阶段。聚合物分散法先将高分子材料和药物共同溶于某溶剂中,制成肢体溶液或乳剂,再通过加热、溶剂蒸发、盐析等方法使高分子材料固化,形成粒径较小的纳米球。由于聚合法制备的纳米粒子中可能留有未反应的有毒繁体和寡聚物,需要较复杂的纯化过程,耗时较长,故而在实际应用中还存在较大的问题需要解决。
纳米核酸结构,其粒径可控,易于合成和修饰,以及可编码性和多种刺激靶向性,成为新颖的治疗肿瘤细胞方法。例如DNA水凝胶有较好的延展性,一种新型的生物材料,但是由于是作为大分子交联,其稳定性不能得到较好的保证。
目前,影响细胞内吞的因素主要包括:纳米粒尺寸、纳米粒形状、纳米粒表面电荷、纳米粒亲疏水性、纳米粒浓度、孵育温度、孵育时间、细胞类型和细胞状态、培养基类型和血清蛋白等。例如,不同形状的聚乙烯二醇修饰的介孔二氧化硅纳米粒子进入海拉细胞主要通过网格依赖蛋白途径,而长与径的比值越高,倾向于通过小窝蛋白途径进入细胞,故有更高的细胞积聚量,更高的细胞毒性。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束,其生物相容性好、结构稳定、可编码性强、易于修饰的锁核酸作为亲水头基,抗癌药物紫杉醇作为疏水头基;3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与癸硫醇的相互作用作为连接链,用于交联氨基,提供二硫键;使用带有大量正电荷的穿膜肽(TAT),通过非胞吞的方式使锁核酸纳米载药胶束进入细胞。构建了一种新型锁核酸纳米载药胶束作为药物传递载体的平台,其既具有一般金属纳米材料的稳定性,又能改善合成药物衍生物对药效影响的问题,并且双重释放效果,使药物能够更快的发挥药效,杀死肿瘤细胞。。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束,包括亲水端、连接链、疏水端,将所述亲水端、连接链、疏水端合成了锁核酸纳米载药胶束单体,其中所述亲水端是由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸(MIC)、修饰有氨基的锁核酸(BC)和修饰有羧基荧光素(FAM)的反义锁核酸(antisense MIC)三条链组成,所述连接链是由3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和癸硫醇连接形成有机长链,所述疏水端是紫杉醇。
本发明中,进一步的,修饰有羧基荧光素(FAM)的所述反义锁核酸(antisenseMIC)与所述锁核酸(MIC)的碱基键互补配对。
本发明中,进一步的,所述连接链可平衡所述亲水端的长度。
一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束的制备方法,
(一)、胶束单体疏水头基与连接链结构的构建
1)、制备纳米金粒子:纳米金粒子的制备所用容器经王水浸泡24 h以上,保证干净,制备方法:量取浓度为0.01%的氯金酸,用0.45 μm滤膜过滤氯金酸;然后,将50 mL氯金酸加入三口烧瓶中,进行搅拌且加热回流,当溶液沸腾时,迅速加入3 mL柠檬酸钠;保持加热至溶液由黑色到深紫色,再到紫红色,最终变为酒红色;此时,停止加热,冷凝回流至室温,纳米金粒子放置于4℃下,备用;
2)、制备磁珠连接纳米金颗粒:将巯基修饰的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后,取100 μL清洗好的磁珠加入5 mL纳米金粒子,置于37℃的摇床中,反应24 h,将制备完成的纳米金粒子功能化的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后,再分散于二甲基亚砜中,备用,
3)、制备纳米金粒子功能化的磁珠连接癸硫醇:将0.48 mmol的癸硫醇加入到已清洗的纳米金粒子功能化的磁珠,将混合液置于37℃的摇床中,反应12 h,将制备完成的磁珠-纳米金粒子-癸硫醇(产物2)用二氯甲烷清洗三次后,分散于二氯甲烷中,备用,
4)、制备产物3:将产物2和0.223 mmol的三乙胺混合,溶于5 mL二氯甲烷,将0.074mmol三光气溶液缓慢的加入混合液中,匀速搅拌,温度保持4℃,反应30 min,取出产物3用二氯甲烷清洗三次后,再分散于二氯甲烷中,备用,
5)、制备产物4:将0.82 mmol三乙胺和一定量的4-氨基吡啶加入到0.0586 mmol紫杉醇和产物3的混合液中,匀速搅拌且温度保持25℃,反应2 h,取出产物4用二氯甲烷清洗三次后,再分散于二氯甲烷中,备用,
6)、制备产物5:将0.2 g碘化钠溶于1mL二甲基亚砜中,将200 μL碘化钠加入到产物4,置于37℃的摇床中,反应4 h,通过磁性分离,得到上清液,即产物5,
(二)、胶束单体亲水头基与连接链结构的构建
1、制备锁核酸连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯:将10 μL,10-5 M氨基修饰的锁核酸BC链和10 μL,10-5 M由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸MIC链分别加入到100 μL,10-5 M的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中,置于37℃的摇床中,反应6h,
(三)、锁核酸纳米载药胶束合成
1)、制备锁核酸纳米载药胶束单体:将50 μL锁核酸MIC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物和50 μL锁核酸BC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物加入到100 μL产物5中,置于37℃的摇床中,反应6 h,
2)、制备锁核酸纳米载药胶束单体连接修饰荧光基团FAM的锁核酸antisenseMIC:向上述混合液中加入10 μL,10-5 M的修饰荧光基团的锁核酸antisense MIC,置于37℃的摇床中,反应2 h,
(四)、胶束结构表面修饰细胞穿膜肽TAT
1)、制备穿膜肽TAT功能化的锁核酸纳米载药胶束:向锁核酸纳米载药胶束中加入等当量的水,充分摇匀后,加入50 μL,10-5 M细胞穿膜肽TAT,置于37℃的摇床中,反应2 h,
(五)、药物载体转染组织细胞
1)、将制备好的基于细胞穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束置于于离心管中,加入血清浓度为20%的1640细胞培养液1 mL,充分混匀后,加入细胞培养皿中进行细胞培养,置于37℃,5%的二氧化碳培养箱中,培养2 h,
(六)、抗癌药物紫杉醇的释放与检测;
1)、取出培养2 h后的细胞培养皿,去除其中的混合培养液,向培养皿中加入1640培养液,重复冲洗,最后,加入1 mL含有20%血清的培养液,待用,
2)、在激光共聚焦显微镜下观察海拉细胞内FAM的荧光,以488 nm为激发光源,采集550 nm与650 nm的发射光,明显观测到:海拉细胞质中有较强的FAM绿色荧光,随着时间的推移,细胞皱缩,至凋亡只需要5 h,表明此载药胶束具有较好的治疗效果。
本发明的有益效果:
1、使用生物体自源材料作为基本骨架之一,构建了一种新颖的锁核酸纳米载药胶束药物载体,由于其良好的生物相容性和刺进响应性,使其可以更好的在生物体内传递,直达病灶,提高药效。结构表面通过氨基和羧基脱水缩合作用,成功修饰穿膜肽(TAT),使其表面带有正电,通过非胞吞作用,改善核酸结构不易被细胞胞吞的缺陷,实验药物的精准释放。
2、其中锁核酸纳米载药胶束单体的合成过程中,引入磁性微球作为有机合成反应的基底,通过磁性分离,操作简单,准确的将未反应物分离弃去。避免了柱层析分离法等操作复杂,耗时长等特点。
3、通过使用3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯成功引入二硫键。谷胱甘肽的分子结构中存在活泼的巯基,能够切断双硫键,成功释放抗癌药物紫杉醇。
4、使用锁核酸刚性结构,具有更高的稳定性,不易在未进入细胞前分解,保持较好的胶束结构进入肿瘤细胞。肿瘤细胞微环境为弱酸性,pH值为4.5-5.5。核酸在pH<6时,双链易水解,达到释放药物的目的。
5、实现了之前纳米材料载药高效运输以外的更多功能,推动该方向的发展。在诸如精准高效释放药物、检测肿瘤细胞高表达小分子等生物分析领域有更好的研究研制上,集成细胞成像分析、 细胞生理状态指示及抗癌药物效果实时评估等功能的靶向药物运输系统将成为细胞实时动态分析检测、新型抗癌药物开发、 临床治疗及监测领域研究的得力工具。
6、相对于之前的复杂操作程序,本案中的纳米载体构建所需的反应条件与工艺过程简便,对设备要求低,利于实际生产。
附图说明
图1为现有的纳米管及所装载的药物的结构示意图;
图2为基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束的单体的合成原理图;
图3为基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束的药物释放原理图;
图4为基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束透射电镜表征;
图5为为基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束连接穿膜肽TAT的电位验证图;
图6为基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束作用于海拉细胞的效果的验证图;
图7为基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束的抗酶降解效果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体图示,进一步阐述本发明。
如图2所示,一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束,包括亲水端、连接链、疏水端,将所述亲水端、连接链、疏水端合成了锁核酸纳米载药胶束单体,其中所述亲水端是由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸(MIC)、修饰有氨基的锁核酸(BC)和修饰有羧基荧光素(FAM)的反义锁核酸(antisense MIC)三条链组成,所述连接链是由3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和癸硫醇连接形成有机长链,所述疏水端是紫杉醇。修饰有羧基荧光素(FAM)的所述反义锁核酸(antisense MIC)与所述锁核酸(MIC)的碱基键互补配对。所述连接链可平衡所述亲水端的长度。其中所示的锁核酸分别是由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸MIC和修饰有氨基的锁核酸BC两条链。
胶束形成时, antisense MIC和MIC杂交,荧光猝灭,整个胶束无荧光产生。锁核酸胶束形成后,在与富含精氨酸和赖氨酸的细胞穿膜肽(TAT)以酰胺键相连,形成一种基于穿膜肽的锁核酸胶束。胶束中通过使用生物还原型的二硫键连接拴系疏水性PTX,细胞内的还原性硫醇类物质切割二硫键,使胶束在细胞摄取后释放PTX。同时肿瘤微环境是呈弱酸性(pH为6.5),使这个亲水头基团骨架散开,失去其双螺旋结构,从而使猝灭的荧光得以恢复。以此来判定胶束进入细胞。如图二所示。通过流式细胞术和荧光显微镜证明锁核酸纳米载药胶束的细胞摄取率高。构造的纳米胶束高度稳定,尺寸适中,分散性好,具有较好的治疗潜力。此外,该体系还可以应用于检测海拉细胞中的谷胱甘肽含量。
其中,锁核酸(MIC)、锁核酸(BC) 、反义锁核酸(antisense MIC)的核酸序列如下表:
Name | Sequence(5’-3’) |
Antisense MIC | TTT TCT CCC AGC GTG CGC CAT-FAM |
MIC | BHQ<sub>1</sub>-ATGGCGCACGCTGGGAGAAAA-(CH<sub>2</sub>)<sub>7</sub>-NH<sub>2</sub> |
BC | NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>6</sub>-ATGCGCCGCGCTCGCAGATTT-(CH<sub>2</sub>)<sub>7</sub>-NH<sub>2</sub> |
一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束的制备方法,
(一)、胶束单体疏水头基与连接链结构的构建
1)、制备纳米金粒子:纳米金粒子的制备所用容器经王水浸泡24 h以上,保证干净,制备方法:量取浓度为0.01%的氯金酸,用0.45 μm滤膜过滤氯金酸;然后,将50 mL氯金酸加入三口烧瓶中,进行搅拌且加热回流,当溶液沸腾时,迅速加入3 mL柠檬酸钠;保持加热至溶液由黑色到深紫色,再到紫红色,最终变为酒红色;此时,停止加热,冷凝回流至室温,纳米金粒子放置于4℃下,备用;
2)、制备磁珠连接纳米金颗粒:将巯基修饰的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后,取100 μL清洗好的磁珠加入5 mL纳米金粒子,置于37℃的摇床中,反应24 h,将制备完成的纳米金粒子功能化的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后,再分散于二甲基亚砜中,备用,
3)、制备纳米金粒子功能化的磁珠连接癸硫醇:将0.48 mmol的癸硫醇加入到已清洗的纳米金粒子功能化的磁珠,将混合液置于37℃的摇床中,反应12 h,将制备完成的磁珠-纳米金粒子-癸硫醇(产物2)用二氯甲烷清洗三次后,分散于二氯甲烷中,备用,
4)、制备产物3:将产物2和0.223 mmol的三乙胺混合,溶于5 mL二氯甲烷,将0.074mmol三光气溶液缓慢的加入混合液中,匀速搅拌,温度保持4℃,反应30 min,取出产物3用二氯甲烷清洗三次后,再分散于二氯甲烷中,备用,
5)、制备产物4:将0.82 mmol三乙胺和一定量的4-氨基吡啶加入到0.0586 mmol紫杉醇和产物3的混合液中,匀速搅拌且温度保持25℃,反应2 h,取出产物4用二氯甲烷清洗三次后,再分散于二氯甲烷中,备用,
6)、制备产物5:将0.2 g碘化钠溶于1mL二甲基亚砜中,将200 μL碘化钠加入到产物4,置于37℃的摇床中,反应4 h,通过磁性分离,得到上清液,即产物5,
(二)、胶束单体亲水头基与连接链结构的构建
1)、制备锁核酸连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯:将10 μL,10-5 M氨基修饰的锁核酸BC链和10 μL,10-5 M由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸MIC链分别加入到100 μL,10-5 M的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中,置于37℃的摇床中,反应6h,
(三)、锁核酸纳米载药胶束合成
1)、制备锁核酸纳米载药胶束单体:将50 μL锁核酸MIC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物和50 μL锁核酸BC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物加入到100 μL产物5中,置于37℃的摇床中,反应6 h,
2)、制备锁核酸纳米载药胶束单体连接修饰荧光基团FAM的锁核酸antisenseMIC:向上述混合液中加入10 μL,10-5 M的修饰荧光基团的锁核酸antisense MIC,置于37℃的摇床中,反应2 h,
如图3所示:
(四)、胶束结构表面修饰细胞穿膜肽TAT
1)、制备穿膜肽TAT功能化的锁核酸纳米载药胶束:向锁核酸纳米载药胶束中加入等当量的水,充分摇匀后,加入50 μL,10-5 M细胞穿膜肽TAT,置于37℃的摇床中,反应2 h,
(五)、药物载体转染组织细胞
1)、将制备好的基于细胞穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束置于于离心管中,加入血清浓度为20%的1640细胞培养液1 mL,充分混匀后,加入细胞培养皿中进行细胞培养,置于37℃,5%的二氧化碳培养箱中,培养2 h,
(六)、抗癌药物紫杉醇的释放与检测;
1)、取出培养2 h后的细胞培养皿,去除其中的混合培养液,向培养皿中加入1640培养液,重复冲洗,最后,加入1 mL含有20%血清的培养液,待用,
2)、在激光共聚焦显微镜下观察海拉细胞内FAM的荧光,以488 nm为激发光源,采集550 nm与650 nm的发射光,明显观测到:海拉细胞质中有较强的FAM绿色荧光,随着时间的推移,细胞皱缩,至凋亡只需要5 h,表明此载药胶束具有较好的治疗效果。
如图4所示,其中所制备的锁核酸纳米载药胶束用醋酸双氧铀染色后,可观测到,其分散性较好,且粒径较均一,为20 nm左右。
如图5所示,其中单链锁核酸电位是负值,而细胞穿膜肽TAT是一类带正电的短肽。通过电位测定表明,所合成的锁核酸纳米载药胶束是带负电,将细胞穿膜肽连接到锁核酸纳米载药胶束后的电位表明是正电。证明成功将细胞穿膜肽TAT连接到锁核酸纳米载药胶束。
如图6所示,其中bright为共聚焦显微镜明场中所示的细胞状态图,PTX(FITC)为荧光紫杉醇在明场通道中的细胞成像图,PTX-LNA为锁核酸纳米载药胶束在明场中的细胞成像图像,PTX-LNA-TAT为基于细胞穿膜肽TAT的锁核酸纳米载药胶束在明场中的细胞成像图像,荧光基团FAM作为发光基团,Merge为上述通道的叠加图像。图中可见海拉细胞基本不吞噬单纯的FITC和锁核酸纳米载药胶束,而基于细胞穿膜肽TAT的锁核酸纳米载药胶束有明显的绿色荧光,说明在细胞中结构破坏,释放药物。
如图7所示,核酸纳米胶束在DNA酶不同时间作用下的电泳表征图,时间分别为1h、5 h、10 h、15 h、24 h。如图所示:1号样为空白样,2-6号样是与DNA酶作用时间增加。可以明显观察到锁核酸纳米载药胶束有略微分解,仍然保持较高的稳定性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点,本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内,本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束及载药胶束的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
Claims (4)
1.一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束,其特征是:包括亲水端、连接链、疏水端,将所述亲水端、连接链、疏水端合成了锁核酸纳米载药胶束单体,其中所述亲水端是由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸MIC、修饰有氨基的锁核酸BC和修饰有羧基荧光素的反义锁核酸antisense MIC三条链组成,所述连接链是由3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和癸硫醇连接形成有机长链,所述疏水端是紫杉醇,其中,锁核酸MIC、锁核酸BC 、反义锁核酸antisense MIC的核酸序列如下表:
。
2.根据权利要求1所述的一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束,其特征是:修饰有羧基荧光素的所述反义锁核酸antisense MIC与所述锁核酸MIC的碱基键互补配对。
3.根据权利要求1所述的一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束,其特征是:所述连接链可平衡所述亲水端的长度。
4.一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束的制备方法,其特征是:
(一)、胶束单体疏水头基与连接链结构的构建
1)、制备纳米金粒子:纳米金粒子的制备所用容器经王水浸泡24 h以上,保证干净,制备方法:量取浓度为0.01%的氯金酸,用0.45 μm滤膜过滤氯金酸;然后,将50 mL氯金酸加入三口烧瓶中,进行搅拌且加热回流,当溶液沸腾时,迅速加入3 mL柠檬酸钠;保持加热至溶液由黑色到深紫色,再到紫红色,最终变为酒红色;此时,停止加热,冷凝回流至室温,纳米金粒子放置于4℃下,备用;
2)、制备磁珠连接纳米金颗粒:将巯基修饰的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后,取100 μL清洗好的磁珠加入5 mL纳米金粒子,置于37℃的摇床中,反应24 h,将制备完成的纳米金粒子功能化的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后,再分散于二甲基亚砜中,备用,
3)、制备纳米金粒子功能化的磁珠连接癸硫醇:将0.48 mmol的癸硫醇加入到已清洗的纳米金粒子功能化的磁珠,将混合液置于37℃的摇床中,反应12 h,将制备完成的磁珠-纳米金粒子-癸硫醇(产物2)用二氯甲烷清洗三次后,分散于二氯甲烷中,备用,
4)、制备产物3:将产物2和0.223 mmol的三乙胺混合,溶于5 mL二氯甲烷,将0.074mmol三光气溶液缓慢的加入混合液中,匀速搅拌,温度保持4℃,反应30 min,取出产物3用二氯甲烷清洗三次后,再分散于二氯甲烷中,备用,
5)、制备产物4:将0.82 mmol三乙胺和一定量的4-氨基吡啶加入到0.0586 mmol紫杉醇和产物3的混合液中,匀速搅拌且温度保持25℃,反应2 h,取出产物4用二氯甲烷清洗三次后,再分散于二氯甲烷中,备用,
6)、制备产物5:将0.2 g碘化钠溶于1mL二甲基亚砜中,将200 μL碘化钠加入到产物4,置于37℃的摇床中,反应4 h,通过磁性分离,得到上清液,即产物5,
(二)、胶束单体亲水头基与连接链结构的构建
1)、制备锁核酸连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯:将10 μL,10-5 M氨基修饰的锁核酸BC链和10 μL,10-5 M由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸MIC链分别加入到100 μL,10-5 M的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中,置于37℃的摇床中,反应6 h,
(三)、锁核酸纳米载药胶束合成
1)、制备锁核酸纳米载药胶束单体:将50 μL锁核酸MIC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物和50 μL锁核酸BC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物加入到100 μL产物5中,置于37℃的摇床中,反应6 h,
2)、制备锁核酸纳米载药胶束单体连接修饰荧光基团FAM的锁核酸antisense MIC:向上述混合液中加入10 μL,10-5 M的修饰荧光基团的锁核酸antisense MIC,置于37℃的摇床中,反应2 h,
(四)、胶束结构表面修饰细胞穿膜肽TAT
1)、制备穿膜肽TAT功能化的锁核酸纳米载药胶束:向锁核酸纳米载药胶束中加入等当量的水,充分摇匀后,加入50 μL,10-5 M细胞穿膜肽TAT,置于37℃的摇床中,反应2 h,
(五)、药物载体转染组织细胞
1)、将制备好的基于细胞穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束置于于离心管中,加入血清浓度为20%的1640细胞培养液1 mL,充分混匀后,加入细胞培养皿中进行细胞培养,置于37℃,5%的二氧化碳培养箱中,培养2 h,
(六)、抗癌药物紫杉醇的释放与检测;
1)、取出培养2 h后的细胞培养皿,去除其中的混合培养液,向培养皿中加入1640培养液,重复冲洗,最后,加入1 mL含有20%血清的培养液,待用,
2)、在激光共聚焦显微镜下观察海拉细胞内FAM的荧光,以488 nm为激发光源,采集550nm与650 nm的发射光,明显观测到:海拉细胞质中有较强的FAM绿色荧光,随着时间的推移,细胞皱缩,至凋亡只需要5 h,表明此载药胶束具有较好的治疗效果。
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