CN108066285A - 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法 - Google Patents

一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108066285A
CN108066285A CN201711235718.9A CN201711235718A CN108066285A CN 108066285 A CN108066285 A CN 108066285A CN 201711235718 A CN201711235718 A CN 201711235718A CN 108066285 A CN108066285 A CN 108066285A
Authority
CN
China
Prior art keywords
micelles
copolymer
targeting
drug
gal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711235718.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108066285B (zh
Inventor
尹健
胡静
彼特·泽贝格
叶舟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201711235718.9A priority Critical patent/CN108066285B/zh
Priority to KR1020207018562A priority patent/KR102237234B1/ko
Priority to PCT/CN2017/116185 priority patent/WO2019104760A1/zh
Publication of CN108066285A publication Critical patent/CN108066285A/zh
Priority to US16/215,395 priority patent/US10512605B2/en
Application granted granted Critical
Publication of CN108066285B publication Critical patent/CN108066285B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法，属于生物医药领域。本发明将多个功能整合在一个生物相容性和安全性良好的载体中，具有pH刺激响应功能的核酸/药物装载的共聚物部分[接枝有聚(3‑叠氮基‑2‑羟丙基甲基丙烯酸酯)(PGMA‑N3)的聚甲基丙烯酸N,N‑二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)]组成，基于荧光的成像组分罗丹明B(RhB)，和半乳糖作为靶向配体。本发明提供的药物输送系统是安全的，能够发挥基因/药物治疗的协同作用，有望在临床应用上发挥巨大作用。

Description

一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法
技术领域
本发明涉及一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法，尤其是一种具有肝肿瘤组织靶向性、示踪性的可装载核酸类物质和药物的共聚物纳米胶束，属于生物医药领域。
背景技术
数十年来肝癌一直是全球范围内第二大常见的癌症诱发死亡的主要原因，每年大约有75万例新发病例。并且，肝癌的发病率和死亡率呈逐年增加趋势，严重威胁着我国乃至全球人民健康和生命。肝癌发病率和死亡率的高发率主要归因于该疾病的晚期诊断和有限的可用治疗方法。另外，由于缺乏可用的移植供体，手术治疗不适合大多数患者。因此，开发新的肝癌治疗策略已迫在眉睫。纳米技术的蓬勃发展能够很好的改善目前肝癌治疗存在的弊端。由于纳米材料的物理化学性质可以通过调节其化学成分、尺寸、形状、结构、形态以及表面修饰等精确的改善，从而可以作为潜在的共同输送核酸类物质和药物的载体用于肝癌治疗。然而，目前的纳米载体因其会产生免疫原性，低转染效率和毒副作用等缺点阻碍了其临床应用的发展。此外，由于肝癌肝内和肝外转移复杂，目前用于肝癌治疗的纳米材料在皮下实体瘤小鼠模型研究体内治疗效果远远不够。
阳离子聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)因其含有大量的氨基，近年来被大量用作负载带有负电荷的核酸形成稳定的复合物用于基因治疗。在酸性条件下可以触发海绵效应引起内含体逃逸，从而进行基因转染。此外，该聚合物可以通过自由基聚合技术很容易的与其他疏水片段形成共聚物，并通过亲水疏水相互作用将疏水药物包裹在这一疏水片段中。这些优点使PDMAEMA与其他聚合物结合成为实现用于肝癌治疗的核酸和抗癌药物共同输送的理想载体。对于肝靶向识别，由于肝细胞表面过量表达有去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)能够特异性识别配体从而减少毒副作用。半乳糖因其价格低廉、来源广泛及易于修饰等特点，已经被广泛用于修饰纳米材料应用于研究特异性靶向人体肝癌细胞在体外和体内(皮下实体瘤小鼠模型)抗肿瘤效应。另外，在纳米系统中引入荧光标记可以使得纳米材料在体内被实时监测，提高临床诊断和治疗的潜力。
尽管为了获得能够实现核酸和抗癌药物的共同输送的纳米材料已经有很多相关研究，但是这些用于肝癌治疗的系统尚未被充分利用，将示踪分子和靶向分子引入到具有刺激性响应功能的核酸和抗癌药物共输送载体上也未见报道，将多种功能整合于同一种纳米载体用于肝癌靶向治疗仍是一种挑战。
发明内容
本项目针对将多种功能集中在同一纳米材料载体的难点问题，提出了一种新型整合治疗系统，通过设计一系列反应将多个功能性片段整合在一个生物相容性和安全性良好的载体中。首先，具有荧光成像功能的荧光分子(例如罗丹明B，RhB)经修饰成含溴的大分子引发剂，可以触发单体3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯(GMA-N3)和甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)发生自由基聚合反应，从而形成与荧光分子的共价相连聚合物，该聚合物中PGMA-N3通过亲疏水相互作用具备装载疏水性药物的功能，PDMAEMA部分因其含有大量的氨基可以包覆核酸类物质，并且在酸性条件下质子化，触发海绵效应引起内含体逃逸，从而进行基因转染并促进疏水药物药物释放。另一方面，具有肝靶向功能的半乳糖端基位经修饰含有炔基基团可通过与共聚物中PGMA-N3部分的叠氮基进行click反应共价键连在共聚物上，为载体提供稳定的靶向功能。该目标共聚物可以通过自组装形成集靶向、示踪、酸敏感与可同时装载药物和基因等多功能于一体的纳米胶束。
本发明提供的纳米系统的生物相容性和细胞毒性已被认真评估，本发明所设计的整合纳米胶束还未见于报道。在体外研究了同时载有核酸和药物的共聚物纳米胶束的稳定性及酸性pH触发药物释放，在HepG2和Huh7细胞系中都研究药物输送，基因转染情况，以及基因/药物治疗的协同作用。此外，在皮下实体瘤和原位瘤小鼠模型中都进行了体内行为示踪和治疗功效评定。
本发明首先提供一种用于治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统，可用于基因治疗与化疗联合靶向治疗肝脏疾病，所述输送系统为下面1式所示的化合物：
上面的式1中，
A为选自如下的一个或多个相同或不同的具有荧光示踪功能的荧光分子，例如罗丹明B、异硫氰酸荧光素、氟硼二吡咯等。
B为选自如下的一个或多个相同或不同的具有半乳糖或半乳糖胺残基的单糖或寡糖类分子的靶向糖分子，其可以特异性识别肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体；
式1中包含甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)的单体结构，m表示其聚合度，m＝25；
式1中包含3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯(GMA-N3)的单体结构，n表示其聚合度，n＝50；
在本发明的一种实施方式中，荧光分子罗丹明B、DMAEMA与GMA-N3的摩尔比例为1:25:50，所述靶向糖分子与GMA-N3的比例为1:1。
本发明还提供制备所述用于基因治疗与化疗联合靶向治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统的方法，是将示踪分子罗丹明B及靶向分子半乳糖分别通过引发剂修饰和click反应引入到共聚物中，包含以下步骤：
步骤一、目标共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal的制备
溴代罗丹明B引发剂，单体DMAEMA及单体GMA-N3按照摩尔比1:25:50加入到25mL圆底烧瓶中，用2mL四氢呋喃溶解，通30分钟氩气以除去瓶内氧气。其中单体DMAEMA需要预先出去其中的稳定剂，即将DMAEMA粗品快速通过碱性氧化铝柱。在氮气保护条件下，先后加入溴化亚铜和五甲基二亚乙基三胺，密封烧瓶，在氮气保护条件下室温反应8h。反应结束后，向反应液中加入四氢呋喃(10mL)，充分搅拌溶解瓶内反应液，通过中性氧化铝柱以除去混合溶液中的铜配体，收集所得液体旋转蒸发除去溶剂后，将瓶内粘稠液体逐滴缓慢滴加于石油醚(500mL)中，进行沉淀，反复沉淀三次，真空干燥所得沉淀物可得到罗丹明B修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3。
将炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖与罗丹明B修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3溶于5mL DMF中，然后再将硫酸铜与抗坏血酸钠溶于5mL水中，再滴加入上面的反应液中，反应液在室温下搅拌48h。将反应液过滤，水溶液中透析(透析袋截留分子量：8-10kDa)，即可得到目标共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal。
步骤二、靶向治疗系统胶束Gal-micelles的制备
1)步骤一所述的目标共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal用DMSO溶解，搅拌5小时；
2)在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得胶束溶液；
3)将胶束溶液经冷冻干燥机冻干,制得胶束Gal-micelles。
步骤三、载药靶向治疗系统胶束DOX@Gal-micelles的制备
1)步骤一所述的目标共聚物和药物分别用DMSO溶解，将两种溶液混合搅拌5小时；
2)混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得载药胶束溶液；
3)将聚合物胶束溶液经过0.45μm的微膜过滤除去未负载的药物，经冷冻干燥机冻干，制得负载药物的胶束DOX@Gal-micelles。
步骤四、同时载质粒DNA(pGFP)/药物靶向治疗系统胶束DOX@Gal-micelles/pGFP的制备
将步骤三中的载药DOX@Gal-micelles胶束溶于PBS缓冲液，将质粒pGFP用双蒸水稀释为储备液。按照共聚物中单体DMAEMA中含氮量与核酸中含磷量的摩尔比值为30:1配置共聚物与DNA的复合物。将两者混合后混匀，室温静置30分钟，即可得到同时载有核酸和药物的共聚物胶束即DOX@Gal-micelles/pGFP。
步骤五、同时载小分子干扰RNA(Bcl-2siRNA)/药物靶向治疗系统胶束DOX@Gal-micelles/siRNA的制备
将步骤三中的载药DOX@Gal-micelles胶束溶于PBS缓冲液，将小分子干扰RNA(Bcl-2siRNA)用双蒸水稀释为储备液。按照共聚物中单体DMAEMA中含氮量与核酸中含磷量的摩尔比值为30:1配置共聚物与RNA的复合物。将两者混合后混匀，室温静置30分钟，即可得到同时载有核酸和药物的共聚物胶束即DOX@Gal-micelles/siRNA。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一中的罗丹明B引发剂，DMAEMA单体结构单元与3-叠氮-2-羟基甲基丙烯酸丙酯投入料的摩尔比值为1：25:50；
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一中的罗丹明B引发剂，溴化亚铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺反应的摩尔比值为1:1:1。
在本发明的一种实施方式中，步骤二所形成的纳米胶束的平均粒径为155nm。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二中共聚物的浓度为10-50mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二中共聚物的DMSO用量为0.5-1mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤三中，共聚物的浓度为10-50mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤三中，阿霉素的浓度为2-10mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤三中共聚物的DMSO用量为0.5-1mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤四中，载药共聚物的浓度约为3.5mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤四中，小分子RNA的浓度约为20μg/mL。
本发明还涉及所述的基因治疗与化疗联合靶向治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统的用途。具体地，化疗药物为抗癌药物、抗肿瘤药物，具体地，所述抗癌药物为阿霉素。
本发明的还涉及所述的基因治疗与化疗联合靶向治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统的用途。具体地，基因治疗采用的核酸为质粒DNA或者小分子干扰RNA，具体地，所述核酸类物质为pGFP或者Bcl-2siRNA。
本发明涉及的基因治疗与化疗联合靶向治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统中GMA单体是为了提供疏水部分，与疏水性的抗癌药物阿霉素相互所用将其包裹在其输水内核；DMAEMA单体一方面是为了提供亲水部分，另一方面是为了通过静电相互作用将带有负电荷的小分子核算包覆在内。通过调节单体DMAMEA与GMA-N3的比例，从而可以调节形成纳米胶束的大小，达到控制载药量和包封率的效果。纳米胶束的外层为单糖或寡糖分子，使胶束具有好的生物相容性，并且这类分子具有很好的靶向性，能够携带抗癌药物及基因过细胞膜，甚至是核膜进入细胞核，可作为各类药物和核酸的输送载体。
本发明涉及的基因治疗与化疗联合靶向治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统及其制备方法具有以下有益效果：
(1)本发明的输送系统DOX@Gal-micelles/siRNA在输送过程中(pH 7.4)可稳定存在，能够有效降低药物泄露；而在酸性pH环境下，可加速药物释放、提高药物释放量。
(2)本发明的输送系统因其含有共价键连的罗丹明B分子，从而可以促进体内体外的实时成像。
(3)本发明的输送系统因其含有共价键连的半乳糖分子，从而可以靶向肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR),实现靶向输送的目的。
(4)本发明的输送系统通过共同输送核酸类物质和抗癌药物，可以在皮下实体瘤小鼠模型和原位瘤小鼠模型体内发挥协同作用，提高抗癌效率。
本发明合成的基因治疗与化疗联合靶向治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统具有较低的细胞毒性，在实验的条件下，不同比例的共聚物胶束在不同浓度下和人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞，人胚肾细胞HEK293细胞共同孵育48小时，在高达400μg/mL的浓度下，细胞存活率均高于80％。并且表面键连半乳糖的载基因/药物胶束具有高的穿过细胞膜的能力，甚至是能够穿过核膜进入细胞核。通过荧光共聚焦显微镜测试和流式细胞仪分析证明了表面键连了半乳糖分子的载核酸/药物共聚物胶束可以被细胞膜表面有过度表达的去唾液酸糖蛋白受体的HepG2和Huh7细胞内吞，而只有少量的胶束可以被细胞膜表面有低表达的去唾液酸糖蛋白受体的HEK293细胞内吞，说明胶束对特定癌细胞或组织具有靶向性。通过皮下实体瘤小鼠模型和原位瘤小鼠模型体内研究，证明了其具有较高的体内抗癌效率。
附图说明
图1：共聚物胶束Gal-micelles和载核酸/药物后胶束DOX@Gal-micelles/pGFP的粒径分布情况。a)共聚物胶束Gal-micelles的透射电镜图；b)载核酸/药物后胶束DOX@Gal-micelles/pGFP的透射电镜图；c)共聚物胶束Gal-micelles的动态光散射粒径分布图；d)共聚物胶束Gal-micelles的动态光散射粒径分布图。
图2：人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞，人胚肾细胞HEK293细胞在不同浓度共聚物胶束Gal-micelles存在条件下培养48小时后的相对存活率。
图3：人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞，人胚肾细胞HEK293细胞在无半乳糖竞争和有半乳糖竞争条件下，与共聚物胶束Gal-micelles孵育后的激光共聚焦实验结果图。
图4：人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞，人胚肾细胞HEK293细胞的流式结果，a)空白参照，b)在含有半乳糖竞争条件下共聚物胶束Gal-micelles被细胞内吞的实验结果，c)无半乳糖竞争条件下的共聚物胶束Gal-micelles被细胞内吞的实验结果。
图5：人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞，人胚肾细胞HEK293细胞在无半乳糖竞争和有半乳糖竞争条件下，与载药物/基因共聚物胶束DOX@Gal-micelles/pGFP孵育后的激光共聚焦实验结果图。
图6：人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞的流式结果，a)空白参照，b)在含有半乳糖竞争条件下载核酸/药物共聚物胶束DOX@Gal-micelles/pGFP被细胞内吞的实验结果，c)在无半乳糖竞争条件下载核酸/药物共聚物胶束DOX@Gal-micelles/pGFP被细胞内吞的实验结果。
图7：不同处理组的皮下实体瘤小鼠肿瘤体积变化图与最终代表性实验图，不同处理组分别是，a)注射生理盐水组，b)注射空白共聚物胶束Gal-micelles组，c)注射载有阿霉素和Bcl-2siRNA的无靶向作用的胶束DOX@Glc-micelles/siRNA组，d)注射载有阿霉素的共聚物胶束DOX@Gal-micelles组，e)注射载有Bcl-2siRNA的共聚物胶束Gal-micelles/siRNA组，f)注射阿霉素和siRNA复合物组，g)注射载有阿霉素和Bcl-2siRNA的靶向共聚物胶束DOX@Gal-micelles/siRNA组。
图8：不同处理组的原位瘤小鼠最终肿瘤数目与体积及最终代表性实验图，不同处理组分别是，a)注射生理盐水组，b)注射空白共聚物胶束Gal-micelles组，c)注射载有阿霉素和Bcl-2siRNA的无靶向作用的胶束DOX@Glc-micelles/siRNA组，d)注射载有阿霉素的共聚物胶束DOX@Gal-micelles组，e)注射载有Bcl-2siRNA的共聚物胶束Gal-micelles/siRNA组，f)注射阿霉素和siRNA复合物组，g)注射载有阿霉素和Bcl-2siRNA的靶向共聚物胶束DOX@Gal-micelles/siRNA组。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：溴代罗丹明B引发剂的制备
称取15.52g(25.00mmol)乙二醇和1.01g(10.00mmol)三乙胺盛于100mL锥形瓶中搅拌，冰水浴至0℃，氮气氛围下逐滴加入溶有1.20mL(10.00mmol)2-溴异丁酰溴，然后缓慢升温至室温，磁力搅拌3h。反应后的溶液加入100mL去离子水淬灭，再用二氯甲烷(100mL×3)萃取。收集的有机相用去离子水(100mL×3)萃取。在萃取所得的有机相中加入适量无水硫酸镁，干燥12h。过滤后旋蒸得到油状粗产物，减压蒸馏(85℃，30mTorr)得到无色粘稠产物异溴丁酸羟乙酯。
取4.81g(10.00mmol)罗丹明B，2.90g(15.00mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及3.22g(15.00mmol)化合物异溴丁酸羟乙酯溶于40mL无水二氯甲烷中搅拌，冰水浴至0℃后加入4-二甲氨基吡啶1.82g(15μmol)，然后缓慢升温至室温反应12h。用0.1M HCl(50mL×3)萃取反应液，再分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过滤，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝体积比10:1)分离得到溴代罗丹明B引发剂。具体方法可参考文献(Marcromolecules，2011,44,2050-2057)。
实施例2：3-叠氮-2-羟基甲基丙烯酸丙酯GMA-N3的制备
将3.71g(57.00mmol)叠氮化钠，3.81g(45.20mmol)碳酸氢钠溶于60mL四氢呋喃/水(5:1v/v)中搅拌，缓慢加入5.42g(37.80mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯，常温反应48h。过滤除去不溶盐物质后旋蒸除去溶剂，将得到的浓缩物用二氯甲烷萃取两次，再将得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯体积比＝9:1)分离得到3-叠氮-2-羟基甲基丙烯酸丙酯。具体方法可参考文献(Polymer Chemistry，2015,6,3875-3884；Soft Matter,2009,5,4788-4796)。
实施例3：罗丹明B修饰的共聚物(RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3)的制备
准确称取70.0mg(0.10mmol)溴代罗丹明B引发剂，484.0mg(2.75mmol)单体DMAEMA及1.01g(5.50mmol)化合物3-叠氮-2-羟基甲基丙烯酸丙酯加入到25mL圆底烧瓶中，用2mL四氢呋喃溶解，通30分钟氩气以除去瓶内氧气。其中单体DMAEMA需要预先除去其中的稳定剂，即将DMAEMA粗品快速通过碱性氧化铝柱。在氮气保护条件下，先后加入18.9mg(0.10mmol)CuBr和PMDETA(28μL，0.10mmol)，密封烧瓶，在氮气保护条件下室温反应8h。反应结束后，向反应液中加入四氢呋喃(10mL)，充分搅拌溶解瓶内反应液，通过中性氧化铝柱以除去混合溶液中的铜配体，收集所得液体旋转蒸发除去溶剂后，将瓶内粘稠液体逐滴缓慢滴加于石油醚(500mL)中，进行沉淀，反复沉淀三次，真空干燥所得沉淀物可得到罗丹明B修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3。
其他比例的共聚物，分别在反应起始添加不同浓度的单体DMAEMA，即可得到不同单体比例的共聚物RhB-PDMAEMA-c-PGMA-N3，包括RhB-PDMAEMA10-c-PGMA50-N3和RhB-PDMAEMA50-c-PGMA50-N3。
实施例4：炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖的制备
将6.21g(15.90mmol)全乙酰半乳糖溶解于75mL无水二氯甲烷中，加入1.0mL(18.00mmol)炔丙醇，冷却到0℃搅拌5分钟，在15分钟内逐滴加入3.0mL(24.30mmol)三氟化硼乙醚。继续在0℃搅拌10分钟后，室温反应10h。用饱和碳酸钾溶液终止反应，用二氯甲烷萃取有机相，用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过滤，旋蒸除去溶剂，炔丙基修饰的全乙酰半乳糖。
取2.01g(5.20mmol)炔丙基修饰的全乙酰半乳糖溶解于50mL 0.30mol/L的甲醇钠甲醇溶液中，常温反应。点板检测直至原料消失，加入H+交换树脂将反应液调至中性，过滤，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇体积比＝10:1)分离得到炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖。具体方法可参考文献(Bioconjugate Chemistry,2012,23,1166-1173)。
实施例5：半乳糖修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal的制备
将350.0mg实施例4中的炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖与200.1mg实施例3中的罗丹明B修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3溶于5mL DMF中，然后再将98.0mg(0.61mmol)硫酸铜与242.0mg(1.2mmol)抗坏血酸钠溶于5mL水中，再滴加入上面的反应液中，反应液在室温下搅拌48h。将反应液过滤，水溶液中透析(透析袋截留分子量：8-10kDa)，即可得到目标共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal。
实施例6：其他不同比例的共聚物RhB-PDMAEMA-c-PGMA-Gal的制备
将实施例3中得到的不同单体比例的共聚物RhB-PDMAEMA-c-PGMA-N3替代实施例5中的RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3，其他操作同实施例5，分别得到不同单体比例的罗丹明B修饰的含有半乳糖残基的共聚物RhB-PDMAEMA-c-PGMA-Gal，包括RhB-PDMAEMA10-c-PGMA50-Gal和RhB-PDMAEMA50-c-PGMA50-Gal。
实施例7：共聚物胶束的制备
将实施例5中的RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal用DMSO溶解，搅拌5小时。在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得胶束溶液。之后将胶束溶液经冷冻干燥机冻干，制得共聚物胶束Gal-micelles。
实施例8：其他胶束的制备
分别用实施例6中的RhB-PDMAEMA-c-PGMA-Gal代替实施例7中的RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal，其它操作同实施例7。分别制备得到相应的胶束。
实施例9：载药物胶束的制备
将实施例5中的RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal和阿霉素盐酸盐标准品分别用DMSO溶解，在阿霉素盐酸盐标准品DMSO溶液中加入三乙胺。将两种溶液混合搅拌5小时。混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得负载阿霉素的胶束溶液。
之后将聚合物胶束溶液经过0.45μm的微膜过滤除去未负载的阿霉素，经冷冻干燥机冻干，制得负载阿霉素的胶束DOX@Gal-micelles。
将制得的胶束充分溶解在DMSO里，用酶标仪测定483nm下溶液的吸光度，根据阿霉素DMSO溶液制得的标曲即可得到相应的载药胶束中阿霉素的浓度。
得到的胶束的载药量＝胶束中阿霉素质量/胶束质量，为12.6±0.03％；包封率＝胶束中阿霉素质量/起始给药质量，为58.0±3.4％。
实施例10：载基因/药物共聚物胶束的制备
将实施例9中的载药DOX@Gal-micelles胶束溶于PBS缓冲液(140mM NaCl，2.7mMKCl，10Mm Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)中，配成3.5mg/mL的储备液。将质粒pGFP或者小分子干扰RNA(Bcl-2siRNA)用双蒸水稀释为20μg/mL储备液。按照共聚物中单体DMAEMA中含氮量与核酸中含磷量的摩尔比值为30:1配置共聚物与核酸的复合物。将两者混合后混匀，室温静置30分钟，即可得到同时载有基因和药物的共聚物胶束即DOX@Gal-micelles/pGFP或DOX@Gal-micelles/siRNA。
实施例11：共聚物胶束的表征
将实施例7、8和10中制得的Gal-micelles和DOX@Gal-micelles/pGFP通过动态光散射技术测得起粒径分布，比较载基因/药物前后粒径变化情况。
如图1所示，通过动态光散射粒径检测，Gal-micelles能形成粒径约为155nm的胶束，在装载有基因和药物之后粒径仍在155nm左右。而RhB-PDMAEMA10-c-PGMA50-Gal和RhB-PDMAEMA50-c-PGMA50-Gal均不能形成均一的胶束。
稳定性是纳米载体最重要的性质之一，应用于生物医药领域的纳米粒子必须能够稳定分散在一定浓度范围的盐溶液或者培养基中。将本实验中制备的共聚物纳米胶束分散在水溶液、磷酸缓冲液(pH＝7.4)及含有10％胎牛血清的培养基中测定其粒径变化，7天之内没有明显粒径变化，表明该共聚物纳米胶束具有很好的稳定性。
实施例12：共聚物胶束Gal-micelles细胞毒性的实验
将实施例7中的共聚物胶束Gal-micelles加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测定细胞的相对存活率，具体实验方法可参考：Chem.Eur.J.2016,22,15216–15221。
分别将人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞，人胚肾细胞HEK293细胞以每孔5ⅹ103的密度种植在96孔板上，细胞经过48小时的孵育在孔板中稳定生长后，分别加入实施例7中的共聚物胶束Gal-micelles，浓度分别为0,10,25,50,100,150,200,400和500μg/mL。材料与细胞共孵育48小时后，将培养基移除，用PBS洗三遍，然后在每个孔中加入100μL未添加酚红的含有0.5mg/mL MTT的培养基，然后每个孔中加入100μL DMSO。已显色的96孔板，用酶标仪检测板中所有孔的吸光度值(λ＝490nm)。每种样品重复做6组平行实验。其中，将没有经过材料作用的细胞组定义为100％细胞活性，将只有DMSO溶液而没有细胞的孔定义为空白对照，用以校正各孔中的吸光值。
细胞存活情况计算如下：
细胞存活率％＝(ODsample/ODcontrol)×100％
式中，ODsample是实验样品组的吸光度值，ODcontrol是没有经过材料作用的细胞组的吸光度值。
图2为Gal-micelles细胞毒性的结果图，结果显示，在实施例7共聚物胶束的浓度从0-500μg/mL浓度范围内，三种细胞的存活率都大于80％，显示该共聚物胶束有较低的毒性和很好的生物相容性。
类似地，验证了其它实施例中制备的本发明的胶束，结果显示，细胞的存活率较高，显示这些胶束的毒性非常小或没有毒性。
实施例13：激光共聚焦实验证明共聚物胶束Gal-micelles能够特异性靶向识别肝癌细胞HepG2和Huh7细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体
将实施例8中所得的空白共聚物胶束Gal-micelles加入到培养液中与HEK293细胞进行细胞培养实验，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚染细胞核。在激光共聚焦显微镜观察下，可以看出，Gal-micelles胶束只有少量进入HEK293细胞内。
将实施例7中所得的空白共聚物胶束Gal-micelles加入到培养液中与HepG2和Huh7细胞分别进行细胞培养实验，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚染细胞核。激光共聚焦显微镜实验结果如图3所示，在HepG2和Huh7细胞中可以看到明显的来自胶束的罗丹明B的荧光，而COS7和HEK293细胞中几乎观察不到该荧光；并且当在有半乳糖竞争的环境下，HepG2和Huh7细胞内也观测不到罗丹明B的荧光。该实验证明Gal-micelles胶束能够通过半乳糖-去唾液酸糖蛋白受体识别并进入HepG2和Huh7细胞中。
实施例14：流式细胞仪检测证明共聚物胶束Gal-micelles能够特异性靶向识别肝癌细胞HepG2和Huh7细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体
在流式细胞仪的检测实验中，将各种细胞培养在含10％新生牛血清的DMEM培养基(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，并放置37℃，5％CO2的培养箱中生长。转染前24h，取对数生长期的细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化液消化以后以每孔5×104个细胞接种于24孔板，每孔加1mL完全培养液，将培养板置于培养箱，培养24h。其中一组添加终浓度为1mmol/L的半乳糖，继续培养24小时后，当每孔细胞密度达到70％时，除去培养液，将Gal-micelles纳米胶束加入490μL无血清和无抗生素的培养液，混匀后分别加入不同的孔中。37℃培养5h后将24孔板中样品溶液吸出，每孔加入1mL完全培养基，继续培养20h。用胰酶将细胞消化下来，以1000rpm的转速离心3分钟，倒掉上清液，将聚集的细胞用PBS重悬，吹散。这一离心过程重复三遍，以除去残留的培养基和胶束溶液，减少对荧光检测的干扰。最后，将细胞用PBS分散，置于流式管中，用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。
实验中，我们用了两种方式培养HEK293，HepG2及Huh7细胞，分别是含有半乳糖的培养基培养(表面受体提前被半乳糖饱和)和用不含半乳糖的培养基培养(表面去唾液酸糖蛋白受体不受影响)。
三种细胞在经同样的Gal-micelles纳米胶束作用后，用流式细胞仪检测了细胞内罗丹明B分子的荧光强度。
如图4所示，HEK293细胞在不同环境下，Gal-micelles纳米胶束进入细胞的速度基本没有差别，与未经过Gal-micelles纳米胶束处理的对照组基本无差别。这是由于HEK293细胞表面只有低表达的去唾液酸蛋白受体，因此胶束无法通过表面半乳糖-去唾液酸糖蛋白受体靶向介导的内吞作用快速进入细胞内。然而HepG2和Huh7细胞在不同环境下，Gal-micelles纳米胶束进入细胞的速度明显不同。对于表面去唾液酸糖蛋白受体被提前饱和的情况下，Gal-micelles纳米胶束无法通过表面键连的半乳糖识别HepG2和Huh7细胞，只能通过非靶向的内吞作用进入到肿瘤细胞中，因此罗丹明B的荧光强度很低；而对于表面受体过度表达的细胞，Gal-micelles纳米胶束能够通过表面键连的半乳糖快速的与肿瘤细胞表面去唾液酸糖蛋白受体结合，然后通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞中。
该实验证明了Gal-micelles纳米胶束能够特异性靶向识别HepG2和Huh7细胞表面的受体，并成功被内吞进入细胞。
实施例15：激光共聚焦显微镜照片证明载基因核酸/药物共聚物胶束DOX@Gal-micelles/pGFP具有很强的共输送核酸和药物的能力
实施例10中所得的载核酸/药胶束DOX@Gal-micelles/pGFP加入到培养液中分别与HEK293，HepG2及Huh7细胞进行细胞培养实验，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染细胞核。激光共聚焦显微镜实验结果如图5所示，可以看出在HepG和Hu7细胞中有明显的阿霉素DOX，绿荧光蛋白GFP以及胶束中罗丹明B的荧光，而在有半乳糖竞争的环境下，几乎观察不到以上三种荧光。实验结果表明DOX@Gal-micelles/pGFP可以选择性的进入HepG2和Huh7细胞，并能够将药物和核酸共同输送到此两种细胞内，并且成功的进行了基因转染。
实施例16：流式细胞仪检测证明DOX@Gal-micelles/pGFP胶束能够靶向识别HepG2和Huh7细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体，并成功进行药物输送和基因转染
在流式细胞仪的检测实验中，将各种细胞培养在含10％新生牛血清的DMEM培养基(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，并放置37℃，5％CO2的培养箱中生长。转染前24h，取对数生长期的细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化液消化以后以每孔5×104个细胞接种于24孔板，每孔加1mL完全培养液，将培养板置于培养箱，培养24h。其中一组添加终浓度为1mmol/L的半乳糖，继续培养24小时后，当各组细胞密度达到70％时，除去培养液，将DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束加入490μL无血清和无抗生素的培养液，混匀后分别加入不同的孔中。37℃培养5h后将24孔板中样品溶液吸出，每孔加入1mL完全培养基，继续培养20h。用胰酶将细胞消化下来，以1000rpm的转速离心3分钟，倒掉上清液，将聚集的细胞用PBS重悬，吹散。这一离心过程重复三遍，以除去残留的培养基和胶束溶液，减少对荧光检测的干扰。最后，将细胞用PBS分散，置于流式管中，用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。
实验中，我们用了两种方式培养HEK293，HepG2及Huh7细胞，分别是含有半乳糖的培养基培养(表面受体提前被半乳糖饱和)和用不含半乳糖的培养基培养(表面去唾液酸糖蛋白受体不受影响)。
如图6所示，三种细胞在经同样的DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束作用后，用流式细胞仪检测了细胞内不同荧光分子的荧光强度。结果显示HEK293细胞在不同环境下，DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束进入细胞的速度基本没有差别，与未经过DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束处理的对照组基本无差别。这是由于HEK293细胞表面只有低表达的去唾液酸蛋白受体，因此胶束无法通过表面半乳糖-去唾液酸糖蛋白受体靶向介导的内吞作用快速进入细胞内。然而HepG2和Huh7细胞在不同环境下，DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束进入细胞的速度明显不同。对于表面去唾液酸糖蛋白受体被提前饱和的情况下，DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束无法通过表面键连的半乳糖识别HepG2细胞，只能通过非靶向的内吞作用进入到肿瘤细胞中，因此罗丹明B和绿荧光蛋白的荧光强度都很低；而对于表面受体过度表达的细胞，DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束能够通过表面键连的半乳糖快速的与肿瘤细胞表面去唾液酸糖蛋白受体结合，然后通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞中，成功的输送阿霉素与基因转染。
该实验证明了DOX@Gal-micelles/pGFP纳米胶束能够特异性靶向识别HepG2和Huh7细胞表面的受体，并成功的输送药物和基因。
实施例17：DOX@Gal-micelles/siRNA在皮下实体瘤小鼠模型中抑制肿瘤的生长
对于皮下实体瘤小鼠模型的建立，取5周龄平均体重为15-18g的雄性BALB/c裸鼠，在右腋窝处接种0.1mL 1ⅹ108个细胞/mL PBS的细胞数。两周后待肿瘤尺寸超过30mm3(体积＝0.5ⅹ肿瘤长度×肿瘤宽度2)时，将小鼠分为7组，每组5只小鼠。分别注射生理盐水，空白共聚物胶束Gal-micelles，载有阿霉素和Bcl-2siRNA的无靶向作用的胶束DOX@Glc-micelles/siRNA，载有阿霉素的共聚物胶束DOX@Gal-micelles，载有Bcl-2siRNA的共聚物胶束Gal-micelles/siRNA，阿霉素和siRNA复合物DOX/siRNA，载有阿霉素和Bcl-2siRNA的靶向共聚物胶束DOX@Gal-micelles/siRNA，一周三次剂量，一共三周，每隔2-3天记录肿瘤组织体积，最后一天将肿瘤组织从体内分离出来记录。
如图7所示，DOX@Gal-micelles，Gal-micelles/siRNA和DOX@Gal-micelles/siRNA都有很好的抑制肿瘤生长效果，并且DOX@Gal-micelles/siRNA组抑制效率高于单独的DOX@Gal-micelles和Gal-micelles/siRNA组总和。根据最后一个实验天得到的各组肿瘤体积数据计算出肿瘤抑制效率(肿瘤抑制效率＝(1-实验组肿瘤体积平均值/生理盐水对照组肿瘤体积平均值)×100％)，DOX@Gal-micelles/siRNA组抑制效率为84％，而DOX@Gal-micelles和Gal-micelles/siRNA分别为42％和40％。可以得出结论，DOX@Gal-micelles/siRNA能够最大化抑制肿瘤生长。
实施例18：DOX@Gal-micelles/pGFP在原位瘤小鼠模型中抑制肿瘤的生长
对于原位瘤小鼠模型的建立，取5周龄平均体重为15-18g的雄性BALB/c裸鼠，开腹后暴露肝叶，挤出肝脏左外叶，接种0.1mL 1×108个细胞/mLPBS的细胞数后缝合关腹。两周后将小鼠分为7组，每组5只小鼠。分别注射生理盐水，空白共聚物胶束Gal-micelles，载有阿霉素和Bcl-2siRNA的无靶向作用的胶束DOX@Glc-micelles/siRNA，载有阿霉素的共聚物胶束DOX@Gal-micelles，载有Bcl-2siRNA的共聚物胶束Gal-micelles/siRNA，阿霉素和siRNA复合物，载有阿霉素和Bcl-2siRNA的靶向共聚物胶束DOX@Gal-micelles/siRNA，一周三次剂量，一共三周，最后一天将肝脏组织从体内分离出来观察癌细胞在肝内转移情况，并且记录肝脏中肿瘤的数目和体积。
如图8所示，DOX@Gal-micelles/siRNA组中肿瘤的数目和体积是所有实验组中最少和最小的，具有最高抑制肿瘤生长的效率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，是具有pH敏感性的单体甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯DMAEMA与疏水的单体3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯PGMA-N3形成的共聚物，所述共聚物一端修饰有具有荧光示踪功能的罗丹明B，另一端修饰有肝靶向功能的半乳糖残基。
2.根据权利要求2所述的一种应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，所述肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统用于共同装载用于基因治疗的核酸和用于化疗的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，所述共聚物具有如式1所示的结构式：
A为选自如下的一个或多个相同或不同的具有荧光示踪功能的荧光分子，例如罗丹明B、异硫氰酸荧光素、氟硼二吡咯等；
B为选自如下的一个或多个相同或不同的具有半乳糖或半乳糖胺残基的单糖或寡糖类分子，其可以特异性识别肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体。
4.根据权利要求3所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，式1中包含DMAEMA的单体结构，m表示其聚合度，m＝25；式1中包含GMA-N3的单体结构，n表示其聚合度，n＝50；荧光分子为罗丹明B，罗丹明B、DMAEMA与GMA-N3的摩尔比例为1:25:50，所述靶向糖分子与GMA-N3的比例为1:1。
5.根据权利要求2所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，所述用于化疗的药物为疏水性抗癌药物、抗肿瘤药物，包括阿霉素。
6.根据权利要求2所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，所述用于基因治疗的核酸，包括为质粒DNA或者小分子干扰RNA。
7.根据权利要求1～6任一所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，纳米胶束的平均粒径为155nm。
8.权利要求1-7任一所述的应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统的制备方法，其特征在于，将具有荧光成像功能的荧光分子经修饰成大分子引发剂，触发单体3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯(GMA-N3)和甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)发生自由基聚合反应，从而形成与荧光分子的共价相连聚合物，该聚合物中PGMA-N3通过亲疏水相互作用具备装载疏水性药物的功能，PDMAEMA部分因其含有大量的氨基可以包覆核酸类物质，并且在酸性条件下质子化，触发海绵效应引起内含体逃逸；具有肝靶向功能的半乳糖端基位经修饰含有炔基基团可通过与共聚物中PGMA-N3部分的叠氮基进行click反应共价键连在共聚物上，为载体提供稳定的靶向功能。
9.权利要求1-7任一所述的应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。
10.权利要求1-7任一所述的应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统在开发用于治疗肝癌的药物中的应用。
CN201711235718.9A 2017-11-30 2017-11-30 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法 Active CN108066285B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711235718.9A CN108066285B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法
KR1020207018562A KR102237234B1 (ko) 2017-11-30 2017-12-14 간 표적성을 갖는 유전자/약물을 공동으로 운반하는 통합식 나노 시스템 및 이의 제조 방법
PCT/CN2017/116185 WO2019104760A1 (zh) 2017-11-30 2017-12-14 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法
US16/215,395 US10512605B2 (en) 2017-11-30 2018-12-10 Integrated nano system for liver-targeting co-delivery of genes/drugs and preparation method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711235718.9A CN108066285B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108066285A true CN108066285A (zh) 2018-05-25
CN108066285B CN108066285B (zh) 2019-06-07

Family

ID=62157484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711235718.9A Active CN108066285B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR102237234B1 (zh)
CN (1) CN108066285B (zh)
WO (1) WO2019104760A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108653749A (zh) * 2018-07-09 2018-10-16 青岛科技大学 一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束及载药胶束的制备方法
WO2019104760A1 (zh) * 2017-11-30 2019-06-06 江南大学 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法
US10512605B2 (en) 2017-11-30 2019-12-24 Jiangnan University Integrated nano system for liver-targeting co-delivery of genes/drugs and preparation method
CN110993020A (zh) * 2019-11-01 2020-04-10 电子科技大学 一种miRNA海绵互作对的识别方法
CN111000826A (zh) * 2019-12-31 2020-04-14 江南大学附属医院（无锡市第四人民医院） 一种协同化学光热疗法、靶向治疗肝癌的药物及制备方法
WO2020211317A1 (zh) * 2019-04-17 2020-10-22 江南大学 一种检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113425682A (zh) * 2021-08-03 2021-09-24 宁夏医科大学 一种药物靶向聚合胶束及其制备方法和应用
CN114642734B (zh) * 2022-01-27 2023-07-11 苏州大学 药物及siRNA共递送纳米复合物及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102000340A (zh) * 2009-09-11 2011-04-06 江西科技师范学院 一种靶向性高分子药物载体及制备方法和应用
CN102076328A (zh) * 2008-05-13 2011-05-25 华盛顿大学 用于胞内递送治疗剂的胶束
CN105646892A (zh) * 2016-03-14 2016-06-08 中科院广州化学有限公司南雄材料生产基地 两亲性二元分子刷聚合物及其制备的酸敏性靶向纳米胶囊

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006094269A2 (en) * 2005-03-03 2006-09-08 Covx Technologies Ireland Limited Anti-angiogenic compounds
CN101259284A (zh) * 2008-04-15 2008-09-10 华东师范大学 一种基于树形聚合物肝靶向抗癌纳米前药系统、制备及用途
WO2013059528A2 (en) * 2011-10-18 2013-04-25 City Of Hope Encapsulated diagnostics and therapeutics in nanoparticles-conjugated to tropic cells and methods for their use
KR101721752B1 (ko) * 2015-04-15 2017-03-31 성균관대학교산학협력단 금나노 입자를 함유하는 암세포 특이적 siRNA 전달체의 제조 방법
CN108066285B (zh) * 2017-11-30 2019-06-07 江南大学 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102076328A (zh) * 2008-05-13 2011-05-25 华盛顿大学 用于胞内递送治疗剂的胶束
CN102000340A (zh) * 2009-09-11 2011-04-06 江西科技师范学院 一种靶向性高分子药物载体及制备方法和应用
CN105646892A (zh) * 2016-03-14 2016-06-08 中科院广州化学有限公司南雄材料生产基地 两亲性二元分子刷聚合物及其制备的酸敏性靶向纳米胶囊

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019104760A1 (zh) * 2017-11-30 2019-06-06 江南大学 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法
US10512605B2 (en) 2017-11-30 2019-12-24 Jiangnan University Integrated nano system for liver-targeting co-delivery of genes/drugs and preparation method
CN108653749A (zh) * 2018-07-09 2018-10-16 青岛科技大学 一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束及载药胶束的制备方法
CN108653749B (zh) * 2018-07-09 2020-08-28 青岛科技大学 一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束及载药胶束的制备方法
WO2020211317A1 (zh) * 2019-04-17 2020-10-22 江南大学 一种检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体的方法
CN110993020A (zh) * 2019-11-01 2020-04-10 电子科技大学 一种miRNA海绵互作对的识别方法
CN110993020B (zh) * 2019-11-01 2021-05-14 电子科技大学 一种miRNA海绵互作对的识别方法
CN111000826A (zh) * 2019-12-31 2020-04-14 江南大学附属医院（无锡市第四人民医院） 一种协同化学光热疗法、靶向治疗肝癌的药物及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR102237234B1 (ko) 2021-04-06
WO2019104760A1 (zh) 2019-06-06
CN108066285B (zh) 2019-06-07
KR20200085348A (ko) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108066285B (zh) 一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法
Zhong et al. Hyaluronic acid-shelled acid-activatable paclitaxel prodrug micelles effectively target and treat CD44-overexpressing human breast tumor xenografts in vivo
Fang et al. In vitro/vivo evaluation of novel mitochondrial targeting charge-reversal polysaccharide-based antitumor nanoparticle
CN102123698B (zh) 载体纳米颗粒和相关的组合物、方法和系统
US11478493B2 (en) Fabrication and application of a hetero-targeted nano-cocktail with traceless linkers
CN104056275B (zh) 多功能主动靶向透明质酸‑聚乳酸载体合成及其抗肿瘤药物胶束制备方法
Xu et al. Hyaluronic acid-decorated redox-sensitive chitosan micelles for tumor-specific intracellular delivery of gambogic acid
CN107158014A (zh) 无载体共组装肿瘤靶向抗癌纳米药物及其制备方法与应用
CN106995516B (zh) 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法
CN103131005B (zh) 氨基酸嵌段共聚物及其制备方法和复合物
CN108187068B (zh) 一种光敏剂复合纳米多功能材料的制备及其应用
CN105189614A (zh) 用硝基苯硼酸组合物稳定的纳米粒子
CN105007905A (zh) 靶向纳米粒子
CN107349429B (zh) 一种核酸适配体-熊果酸的偶联物无载体自组装纳米粒及其制备和应用
CN111632153B (zh) 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
US10512605B2 (en) Integrated nano system for liver-targeting co-delivery of genes/drugs and preparation method
CN110229323A (zh) 还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其在制备治疗肝癌药物中的应用
CN105999299A (zh) 一种小分子胶束纳米载药系统及其制备方法与应用
Luo et al. Arginine modified polymeric micelles as a novel drug delivery system with enhanced endocytosis efficiency
CN105859990B (zh) 侧链含硫辛酰基的聚合物、其制备方法及由其制备的聚合物囊泡及其应用
CN108948152A (zh) 一种两亲性穿膜肽键合物、其制备方法及用途
Gao et al. Irinotecan delivery by unimolecular micelles composed of reduction-responsive star-like polymeric prodrug with high drug loading for enhanced cancer therapy
CN108126210A (zh) 一种单靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
CN105860057A (zh) 基于疏水功能性小分子-亲水聚氨基酸的生物可降解聚合物及其制备方法和应用
Tian et al. Dextran-doxorubicin prodrug nanoparticles conjugated with CD147 monoclonal antibody for targeted drug delivery in hepatoma therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant