CN113008970B - 科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法，其是基于CESI‑MS法对科博肽中主要成分及杂质进行鉴定，并基于CE‑UV法对科博肽含量或纯度进行检测；且CESI‑MS法与CE‑UV法的出峰顺序及峰型一致。该方法分析速度快，分离时间低至3min；分离度高；灵敏度高，可达到2.50ug/mL。利用该方法可以快速、高效地对科博肽的纯度进行分析，从而能够更好地对科博肽的质量一致性进行有效控制。该方法已成功应用于不同批次科博肽样品的一致性分析中，对科博肽纯化工艺具有指导意义，有望进一步应用于其他难分离多肽药物的杂质鉴定及纯度分析研究中。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品质量控制技术领域，具体地说，涉及科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法。
背景技术
科博肽是从中华眼镜蛇的蛇毒中提取获得的一种含有多种组分的多肽类药物，是一种治疗多种慢性疼痛的强效非成瘾性镇痛药。因其具有镇痛持久、成瘾性低而被广泛应用于慢性、顽固性、持续性疼痛的临床治疗中，如晚期肿瘤疼痛、三叉神经痛以及慢性关节痛等。科博肽制备的过程主要通过凝胶色谱分离的方式进行纯化，其产品中可能存在较多的与主成分分子量相近(如脱酰胺化、序列错配等)，结构与色谱性质高度相似的杂质。目前提取多肽药物的纯度分析主要采用HPLC方法，然而采用科博肽现行质量标准中基于HPLC的纯度分析方法，无法实现主成分与杂质之间的有效分离。因此，该方法对其杂质进行准确定性与定量分析难度较大，进而导致制剂的质量一致性与临床用药的安全性难以保证。
为能够实现对难分离多肽类药物的纯度分析与质量控制，亟需开发一种高效准确的多肽药物分析方法。毛细管电泳因其操作简单、样品和缓冲液用量少、分离速度快、分离效率高、分离模式多样等优点，是多肽定性定量分析的常用手段。近年来，毛细管电泳质谱联用技术作为一种新兴的方法，有效结合了毛细管电泳的高分离效率和质谱高灵敏的特点，在多肽、蛋白的表征中逐渐受到关注。无鞘液毛细管电泳质谱联用技术(CESI-MS毛细管电泳电喷雾离子化技术)最早是由Moini等人提出，通过将分离毛细管末端加工成纳升电喷雾喷针，系统通过另一根毛细管将导电液输送到喷针导电部分外侧，完成毛细管电泳和电喷雾的电连接。由于无需使用鞘液辅助导电，从毛细管内分离得到的分析物可以直接进入ESI离子源，没有鞘液的稀释和干扰，从而能够保证分析物的高浓度效果，极大程度提高了质谱的检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高效的科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法。
本发明构思如下：本发明基于CESI-MS和CE-UV方法对科博肽进行了杂质研究，依赖于CE的高效分离能力和MS强大的鉴定能力，利用CESI-MS方法可有效确定科博肽主成分的峰。CE技术具有分离效率高、分离速度快，检测灵敏度高的优势，利用CE-UV方法可以对科博肽的杂质进行快速准确定量。科博肽样品通过CESI-MS与CE-UV方法获得的峰型一致。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法，其特征在于，基于CESI-MS法对科博肽中主要成分及杂质进行鉴定，并基于CE-UV法对科博肽含量或纯度进行检测；且CESI-MS法与CE-UV法的出峰顺序及峰型一致。
前述的方法，将科博肽样品溶于缓冲液中配制成样品溶液，进行CESI-MS检测，得到CESI-MS分析谱图中至少包含1、2、3、4号峰，其中2号峰为主成分峰，1、3和4号峰为杂质峰；3号峰为脱酰胺化产物的降解峰。
各峰对应的分子量如下：
2号峰：6948.24Da；
1号峰：6850.33Da；
3号峰：6949.17Da；
4号峰：7007.36Da。
CESI-MS法中CE方法包括：熔融石英毛细管初次使用时，用甲醇在30psi-500psi压力下冲洗毛细管10-60分钟，然后依次用水、0.01-0.50M NaOH、0.01-0.50M HCl和水在100psi压力下各冲洗10分钟，最后用背景电解质在100psi压力下冲洗10分钟；在每针运行之间依次用0.01-0.5M NaOH、0.01-0.5M HCl和水在30-500psi压力下各冲洗4分钟，最后用背景电解质在30-500psi压力下冲洗1-10分钟；将样品溶解在缓冲液中，在1-5psi压力下进样10-600s；紧接着在1-50psi压力下进样1-250s的背景电解质；分离毛细管温度为20-60℃，样品保存温度为-20～25℃；分离电压为1-50kV，同时施加正向压力1-10.00psi；分离时间为0-90min。
优选地，CESI-MS法中CE方法包括：熔融石英毛细管初次使用时，用甲醇在100psi压力下冲洗毛细管10-60分钟，然后依次用水、0.1M NaOH、0.1M HCl和水在100psi压力下各冲洗10分钟，最后用背景电解质在100psi压力下冲洗10分钟；在每针运行之间依次用0.1MNaOH、0.1M HCl和水在100psi压力下各冲洗4分钟，最后用背景电解质在100psi压力下冲洗5分钟；将样品溶解在缓冲液中，在0.5psi压力下进样60s；紧接着在2.5psi压力下进样25s的背景电解质；分离毛细管温度为25-40℃，样品保存温度为10℃；分离电压为10kV，同时施加正向压力1psi；分离时间为30min。
MS方法包括：采用正离子、IDA模式采集数据，气帘气流速1-50L·h-1，雾化气(Gas1)和辅助气(Gas 2)流速0L·h-1(即未采用雾化气和辅助气)，源温度20-250℃，去簇电压(DP)1-100V，碰撞电压(CE)1-50V，喷雾电压(ISV)为1000-4500V；MS扫描范围为100～2000m/z，一级累计扫描时间为1-500ms。
优选地，MS方法包括：采用正离子、IDA模式采集数据，气帘气(Curtain Gas)流速5L·h-1，雾化气(Gas 1)和辅助气(Gas 2)流速0L·h-1(即未采用雾化气和辅助气)，源温度50℃，去簇电压(DP)100V，碰撞电压(CE)10V，喷雾电压(ISV)为1650V；MS扫描范围为800～2000m/z，一级累计扫描时间为250ms。优选采用
软件1.7进行数据采集控制。
科博肽含量或纯度的检测方法包括：
1)将科博肽标准品溶于缓冲液中配制成不同浓度的标准品溶液，进行CE-UV检测，根据溶液浓度与对应的紫外检测峰面积的关系绘制标准曲线；
2)将待测样品溶于缓冲液中配制成样品溶液，采用与1)相同的方法进行CE-UV检测，根据样品溶液的峰面积和标准曲线，得出待测样品中科博肽的含量。
CE-UV法中CE方法包括：熔融石英毛细管初次使用时，依次用0.01-0.5M NaOH、0.01-0.5M HCl和水在1-50psi压力下各冲洗1-10分钟，最后用背景电解质在1-50psi压力下冲洗1-10分钟，并在1-100kV电压下平衡1-20分钟；在每针运行之间依次用0.01-0.5MNaOH、0.01-0.5M HCl和水在100psi压力下各冲洗1-10分钟，最后用背景电解质在1-50psi压力下冲洗5分钟。
优选地，CE-UV法中CE方法包括：熔融石英毛细管初次使用时，依次用0.1M NaOH、0.1M HCl和水在20psi压力下各冲洗5分钟，最后用背景电解质在20psi压力下冲洗5分钟，并在20kV电压下平衡10分钟；在每针运行之间依次用0.10M NaOH、0.1M HCl和水在100psi压力下各冲洗4分钟，最后用背景电解质在20psi压力下冲洗5分钟。
前述的方法，紫外检测波长范围为210-220nm。
本发明中，科博肽的线性检测范围为10-1000ug/mL，检出限为2.50ug/mL。
优选地，所述缓冲液为去离子水。
优选地，所述背景电解质为50mM NH4Ac pH 4.0。
第二方面，本发明提供上述方法在科博肽质量控制中的应用。
本发明中涉及的科博肽，其提取及纯化工艺可参见CN105566482A。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次建立了CESI-MS方法对科博肽样品中的主要杂质进行了鉴定。为了对科博肽的主要杂质进行快速准确的定量分析，同时建立了一种快速、高灵敏的科博肽杂质定量的毛细管区带纯度检测方法，用于测定科博肽的纯度及各主要杂质的含量。该方法分析速度快，分离时间低至3min；分离度高；灵敏度高，可达到2.50ug/mL。利用该方法可以快速、高效地对科博肽的纯度进行分析，从而能够更好地对科博肽的质量一致性进行有效控制。该方法已成功应用于不同批次科博肽样品的一致性分析中，对科博肽纯化工艺具有指导意义，有望进一步应用于其他难分离多肽药物的杂质鉴定及纯度分析研究中。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中科博肽及其杂质的CESI-MS分析谱图。其中，A：不同背景电解质pH值对科博肽杂质分离结果的影响，a-pH 3.6，b-pH 4.0，c-pH 5.0；B：不同背景电解质盐离子浓度对科博肽杂质分离结果的影响，a-25mM，b-50mM，c-75mM；C：不同背景电解质有机相浓度对科博肽杂质分离结果的影响，a-0％甲醇，b-10％甲醇，c-20％甲醇，d-30％甲醇；D：不同样品缓冲液对科博肽杂质分离结果的影响，a-去离子水，b-50mM醋酸铵，pH4.0，c-30％甲醇水。实验条件：毛细管，30μm i.d×100cm；背景电解质：50mM醋酸铵，不含有机相(A)；醋酸铵缓冲液，pH 4.0，不含有机相(B)；50mM NH4Ac，pH 4.0(C、D)。峰：2为主成分峰，1、3、4为杂质峰。
图2为本发明较佳实施例中不同方法对科博肽S1分析的分离谱图。其中，A：科博肽样品S1在最优化CESI-MS条件下的分离谱图；B：科博肽样品S1在最优CE-UV条件下的分离谱图。峰：2为主成分峰，1、3、4为杂质峰。
图3为本发明较佳实施例中科博肽S1的线性曲线。以科博肽S1的浓度为横坐标，2号主成分的校正峰面积为纵坐标。
图4为本发明较佳实施例中鉴定的1-4号峰的分子离子峰(去卷积后)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法
1、实验仪器及试剂
CESI 8000Plus高效毛细管电泳电喷雾离子化系统(SCIEX公司)，
III离子源(SCIEX公司)，
5600+LC-MS/MS系统(SCIEX公司，数据采集软件：
软件1.7；数据分析软件：
软件2.2和BioPharmaView TM软件3.0)，OptiMS熔融石英毛细管卡盒(91cm×30μm ID，SCIEX公司)，熔融石英毛细管(30.2cm×50μmID，SCIEX)。
冰醋酸(HAc，质谱纯，Sigma-Aldrich公司)，二次去离子水(Millipore公司)，甲醇(质谱纯，Merck公司)。背景电解质(BGE)和导电液均为：50mM NH4Ac，pH 4.0。
2、实验方法
2.1CESI-MS方法
CE方法：OptiMS熔融石英毛细管卡盒初次使用时，用甲醇在100psi下冲洗毛细管10分钟，然后分别依次用水、0.10M NaOH、0.10M HCl和水在100psi下各冲洗10分钟，最后用BGE在100psi下冲洗10分钟。在每针运行之间依次用0.1M NaOH、0.1M HCl和水在100psi下各冲洗4分钟，最后用BGE在100psi下冲洗5分钟。样品溶解在适当的缓冲液中，在0.50psi压力下进样60s；紧接着在2.50psi压力下进样25s的BGE。分离毛细管温度为25℃，样品保存温度为10℃；分离电压为10kV，同时施加正向压力1.00psi；分离时间为30min。
MS方法：采用正离子、IDA模式采集数据，气帘气(Curtain Gas)流速5L·h-1，雾化气(Gas 1)和辅助气(Gas 2)流速0L·h-1，源温度50℃，去簇电压(DP)100V，碰撞电压(CE)10V，喷雾电压(ISV)为+1650V。MS扫描范围为800～2000m/z，一级累计扫描时间为250ms；采用
软件1.7进行数据采集控制。
2.2CE-UV方法
熔融石英毛细管初次使用时，依次用0.1M NaOH、0.1M HCl和水在20psi下各冲洗5分钟，最后用BGE在20psi下冲洗5分钟，并在20kV电压下平衡10分钟。在每针运行之间依次用0.10M NaOH、0.10M HCl和水在100psi下各冲洗4分钟，最后用BGE在20psi下冲洗5分钟。
UV检测：设置紫外检测波长范围为210-220nm进行检测。2.3样品处理
科博肽样品(S1～S4)来自不同批次的样品，在-20℃下保存。分别精密称取10mg科博肽粉末置于1.5mL离心管中，加入1mL超纯水，配制成10mg/mL的溶液；进样前，用超纯水(或其他适当样品缓冲液)稀释至1mg/mL。
3、实验结果
3.1CESI-MS方法对科博肽及其杂质的分离和鉴定
3.1.1背景电解质的优化
为了更好地对科博肽及其杂质进行准确鉴定，本发明以科博肽样品S1为例，对影响科博肽及其杂质分离情况的因素进行了探讨。为后续能够与质谱兼容，优先选用挥发性缓冲盐作为背景电解质，进行分离条件的优化。首先，考察了不同pH值对科博肽及其杂质分离情况的影响，背景电解质为50mM NH4Ac，pH从3.6到5.0。如图1A所示，从CESI-MS的总离子流图中可以看出，当pH为3.6时，科博肽与其杂质分离度较低，未能实现有效的基线分离。当pH>3.0时，随着pH逐渐升高，毛细管内壁的硅羟基逐渐解离，电渗流逐渐增大。由于科博肽的等电点为9.0，当背景电解质的pH值小于9.0时，科博肽及其杂质质子化而带有正电荷，导致待测物会向阴极移动，与电渗流方向一致。虽然随着pH值逐渐升高，科博肽及其杂质所带电荷数逐渐降低，其自身的电泳速度逐渐降低，但是电渗流升高更为明显。所以在两种速度的综合作用下，一方面科博肽及其杂质的分离度提高，主成分峰与杂质峰之间可实现较好的基线分离；另一方面科博肽及其杂质出峰时间提前，从而引起质谱信号强度逐渐增强。相较于pH 5.0的背景电解质来说，当采用pH 4.0的缓冲液作为背景电解质时，基线会更加平整，噪音影响较小，并且1号峰和4号峰具有更好的峰型。综合考虑峰型和质谱响应两个方面，选定pH 4.0作为最佳pH值。
其次，研究了不同盐离子浓度的背景电解质对科博肽及其杂质分离情况的影响，pH值为4.0，如图1B所示。当背景电解质盐离子浓度为25mM时，科博肽及其杂质峰型较差。随着背景电解质盐离子浓度升高至50mM时，电渗流降低，科博肽及其杂质的出峰时间延长，峰型改善，分离度提高，并且质谱信号响应值逐渐提高。当背景电解质盐离子浓度进一步升高到75mM时，科博肽及其杂质的分离度并未进一步的改善，并且由于电渗流的作用，迁移时间会进一步延长，故确定50mM为最佳的盐离子浓度。
最后，将不同浓度的甲醇添加到背景电解质中，用于研究不同浓度的有机相添加剂对科博肽及其杂质分离情况的影响，以及对质谱响应的影响，背景电解质为50mM NH4AcpH 4.0。如图1C所示，随着有机相浓度的升高，电渗流降低，科博肽及其杂质的迁移时间延长，但其分离度并未改善，并且科博肽及其杂质的峰型变差，质谱信号强度降低。虽然随着有机相浓度升高，科博肽及其杂质的质谱响应强度会有所升高，但仍然不及未添加有机相的背景电解质获得的分析结果。实验结果显示，有机相的加入并未对科博肽及其杂质的分离和质谱响应产生促进作用。故最优背景电解质为50mM NH4Ac pH 4.0，无需添加有机相。
3.1.2样品缓冲液的优化
为了得到更好的峰型和质谱信号强度，分别考察了不同样品缓冲液对分离结果的影响，包括去离子水、50mM NH4Ac pH 4.0、30％的甲醇水溶液。如图1D所示，相比于50mMNH4Ac pH 4.0的样品缓冲液，当样品溶解在去离子水中时，在电泳分离过程中存在场放大样品堆积效应，质谱响应强度有所增加，并且1号峰和4号峰的峰型会更加尖锐。当采用30％的甲醇水作为样品缓冲液时，科博肽及其杂质的质谱响应值与去离子水相近，故本发明中选择去离子水作为样品缓冲液。
科博肽样品S1在最优CESI-MS条件下的分离谱图见图2A，各峰对应的分子量如下：
2号峰：6948.24Da；
1号峰：6850.33Da；
3号峰：6949.17Da；
4号峰：7007.36Da。
鉴定的1-4号峰的分子离子峰(去卷积后)见图4。
3.2CE-UV方法对科博肽纯度分析
3.2.1CE-UV方法对科博肽及其杂质的分离和定量分析
基于光学检测器(如紫外检测器、二极管阵列检测器等)对药物杂质的定量分析是常用的方法之一。本发明基于CESI-MS分析的最佳背景电解质条件，利用50um内径、30.20cm总长的毛细管，借助于紫外检测器对科博肽进行纯度分析。在最优条件下，科博肽样品S1的CE-UV分离谱图如图2B所示，从峰型上来看，CE-UV方法的测定结果与CESI-MS方法一致，CE-UV方法所得结果分离度更高，3min以内即可实现快速分离。由于两种方法都是依据相同的毛细管电泳分离模式，并使用相同的背景电解液，出峰顺序完全一致，所以在CE-UV谱图中可准确确认科博肽样品中的主成分及杂质。表1所示为科博肽及其杂质的校正峰面积，通过CE-UV方法的分析可得科博肽样品S1的纯度为53.63％。
表1科博肽样品S1的CE-UV方法纯度分析结果
| 峰序号 | 迁移时间(min) | 校正峰面积 | 校正峰面积百分比 |
| 1 | 2.11 | 333.75 | 1.31％ |
| 2 | 2.30 | 13664.78 | 53.63％ |
| 3 | 2.52 | 10922.51 | 42.86％ |
| 4 | 2.80 | 560.48 | 2.20％ |
3.2.2CE-UV方法对科博肽纯度分析的线性和灵敏度
以科博肽S1主成分峰(即2号峰)为例，对CE-UV方法的线性和灵敏度进行了考察。以科博肽样品S1的浓度为横坐标，以主成分峰的校正峰面积为纵坐标制作线性关系，回归方程为y＝105.28x-618.89，其R2＝0.999，标准曲线如图3所示。结果表明科博肽主成分在10-1000ug/mL之间具有良好线性。当进样浓度为10ug/mL时，信噪比为12，故该CE-UV方法的检出限为2.50ug/mL。实验结果证明，该方法检测灵敏度高。
3.2.3CE-UV方法对科博肽纯度分析的重复性考察
本发明通过计算科博肽及其杂质的相对迁移时间和校正峰面积的RSD，评估了CE-UV方法对科博肽纯度分析的稳定性和重复性，如表2所示，分别探讨了日内、日间的迁移时间和校正峰面积的重复性。对于科博肽及其杂质，迁移时间的日内和日间RSD均小于1％，校正峰面积百分比均小于5％。这一结果充分证明CE-UV方法对于科博肽纯度分析的适用性。
表2CE-UV方法对科博肽S1纯度分析的迁移时间和校正峰面积重复性
本发明建立了基于CESI-MS技术对科博肽中主要杂质进行鉴定的方法，并在此基础上，通过方法优化建立了一种快速、高效的毛细管电泳纯度分析方法(CE-UV)，实现了对科博肽杂质的定性表征与定量分析，有助于更好地对该多肽类药物进行质量控制。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (4)
1.科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法，其特征在于，基于CESI-MS法对科博肽中主要成分及杂质进行鉴定，并基于CE-UV法对科博肽含量或纯度进行检测；且CESI-MS法与CE-UV法的出峰顺序及峰型一致；
将科博肽样品溶于缓冲液中配制成样品溶液，进行CESI-MS检测，得到CESI-MS分析谱图中至少包含1、2、3、4号峰，其中2号峰为主成分峰，1、3和4号峰为杂质峰；各峰对应的分子量如下：
2号峰：6948.24Da；
1号峰：6850.33Da；
3号峰：6949.17Da；
4号峰：7007.36Da；
CESI-MS法中CE方法包括：熔融石英毛细管初次使用时，用甲醇在30psi-500psi压力下冲洗毛细管10-60分钟，然后依次用水、0.01-0.50M NaOH、0.01-0.50M HCl和水在100psi压力下各冲洗10分钟，最后用背景电解质在100psi压力下冲洗10分钟；在每针运行之间依次用0.01-0.5M NaOH、0.01-0.5M HCl和水在30-500psi压力下各冲洗4分钟，最后用背景电解质在30-500psi压力下冲洗1-10分钟；将样品溶解在缓冲液中，在1-5psi压力下进样10-600s；紧接着在1-50psi压力下进样1-250s的背景电解质；分离毛细管温度为20-60℃，样品保存温度为-20～25℃；分离电压为1-50kV，同时施加正向压力1-10.00psi；分离时间为1-90min；
MS方法包括：采用正离子、IDA模式采集数据，气帘气流速1-50L·h-1，源温度20-250℃，去簇电压20-100V，碰撞电压1-50V，喷雾电压为1000-4500V；MS扫描范围为100～2000m/z，一级累计扫描时间为1-500ms；
科博肽含量或纯度的检测方法包括：
1)将科博肽标准品溶于缓冲液中配制成不同浓度的标准品溶液，进行CE-UV检测，根据溶液浓度与对应的紫外检测峰面积的关系绘制标准曲线；
2)将待测样品溶于缓冲液中配制成样品溶液，采用与1)相同的方法进行CE-UV检测，根据样品溶液的峰面积和标准曲线，得出待测样品中科博肽的含量；
CE-UV法中CE方法包括：熔融石英毛细管初次使用时，依次用0.01-0.5M NaOH、0.01-0.5M HCl和水在1-50psi压力下各冲洗1-10分钟，最后用背景电解质在1-50psi压力下冲洗1-10分钟，并在20-100kV电压下平衡1-20分钟；在每针运行之间依次用0.01-0.5M NaOH、0.01-0.5M HCl和水在100psi压力下各冲洗1-10分钟，最后用背景电解质在1-50psi压力下冲洗5分钟；
紫外检测波长范围为210-220nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，科博肽的线性检测范围为10-1000ug/mL，检出限为2.50ug/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为去离子水。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述背景电解质为1-50mM NH4AcpH 4.0。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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