JP2021522815A - 超並列シーケンシングを用いるlnaオリゴヌクレオチド治療法の品質管理法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は治療用オリゴヌクレオチド分析の分野に関し、そして、本発明のクロマトグラフィ又は質量分析法と組み合わせて又はこれらの代わりに使用することができ、並びに例えばオリゴヌクレオチド治療法の探索、製造、品質保証、治療法開発、及び患者モニタリングにおいて使用することができる配列に基づく品質情報を提供する、治療用オリゴヌクレオチドのプライマーベースの並列シーケンシングの方法を提供する。
治療用オリゴヌクレオチドを製造するための品質を決定する分析ツールは、典型的には、クロマトグラフ分離法及び質量分析法(mass spectroscopy:MS)に基づく分析ツールを使用する。複雑な質量スペクトルはある程度の解釈を必要とするので、オリゴヌクレオチドの集団内のシーケンス分布の決定的な判定をもたらすことはできない。このように、MSツールは、例えばインプットエラー、不完全なカップリング、二重カップリング、又はホスホラミダイト不純物によって導入され得る、オリゴヌクレオチド調製物中の配列ベースのエラーを同定及び/又は定量化するそれらの能力に制限される。
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、該修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた該第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のPCR増幅を行って、該PCR増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと、のいずれかとを含む。
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの該集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の該相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた該第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のPCR増幅を行って、該PCR増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと、のいずれかとを含む。
(i)該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと;
(ii)本発明に係る該修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングのための該方法を行うことと;
(iii)工程(ii)で得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの集団の配列非均一性を同定することと;を含む。
(i)該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと;
(ii)本発明に係る該修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングのための該方法を行うことと;
(iii)該修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証するために得られた該配列データを分析することと;を含む。
(i)該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと;
(ii)本発明に係る該修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングのための該方法を行うことと;
(iii)該修飾オリゴヌクレオチドの純度を決定するために得られた該配列データを分析することと;を含む。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、それが当業者により、2つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製とによって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。本発明に関して、オリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、そして精製又は単離することができる。
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、1つ以上の糖−修飾ヌクレオシド及び/若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド、並びに/又は複合部分の存在を説明する。
骨格修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル以外の少なくとも1つのヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドである。修飾オリゴヌクレオチドは、有利には、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの骨格修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。ここで、該修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間におけるヌクレオシド間結合の少なくとも70%がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、ヌクレオシド間結合の例えば少なくとも80%、例えば少なくとも90%、例えば全てが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
糖修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、リボース糖は、デオキシリボース(DNAヌクレオシド)又はリボース(RNAヌクレオシド)以外の部分で置換される。糖修飾オリゴヌクレオチドには、2’炭素が、水素又はヒドロキシル以外の置換基で置換されているヌクレオシドと、二環式ヌクレオシド(LNA)と、が含まれる。いくつかの実施形態では、糖修飾は、2’フルオロRNA以外である。
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位にH若しくは−OH以外の置換基を有し(2’置換ヌクレオシド)、又は2’炭素とリボース環の第2の炭素との間に架橋を形成できる2’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばLNA(2’−4’バイラジカル架橋)である。
「LNAヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’とを結合するバイラジカル(「2’−4’架橋」とも称される)を含む2’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸(bicyclic nucleic acid:BNA)とも称されている。リボースの立体配座の固定は、LNAが相補的RNA又はDNA分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上(デュプレックス安定化)に関連している。これはオリゴヌクレオチド/相補的デュプレックスの融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの3’末端2’置換ヌクレオシドなどの少なくとも1つの2’置換ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、2’置換オリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド、ミクスマーオリゴヌクレオチド、又はトータルマー(totalmer)オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、2’置換は、2’メトキシエチル(2’−O−MOE)又は2’O−メチルからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの3’ヌクレオチドは、2’−O−MOE又は2’−O−メチルなどの2’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、4つより多くの連続したヌクレオシド修飾ヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、3つより多くの連続したヌクレオシド修飾ヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、3’末端において、2つの2’−O−MOE修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオシド間結合の少なくとも75%はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の全ては、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドは、治療法としての使用を含め、哺乳動物におけるインビボ適用のために広く使用される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの3’末端LNAヌクレオシドなどの少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド、ミクスマーオリゴヌクレオチド、又はトータルマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドは、4つより多くの連続したLNAヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドは、3つより多くの連続したLNAヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドは、3’末端において、2つのLNAヌクレオチドを含む。
ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、ギャップマーオリゴヌクレオチドであり得る。
LNAギャップマーという用語は、フランクにおける親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも1つがLNAヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドはLNAギャップマーであり、ここで、オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの2つの3’側最末端ヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、LNAギャップマーの5’及び3’フランクの両方がLNAヌクレオシドを含み、いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、LNAオリゴヌクレオチド、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドである。ここで、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオシドは、LNA又はDNAヌクレオシドのいずれかである。
混合ウィングギャップマー又は混合フランクギャップマーという用語は、少なくとも1つのLNAヌクレオシドと、フランク領域の少なくとも1つが、例えば、2’−O−アルキル−RNA、2’−O−メチル−RNA、2’−アルコキシ−RNA、2’−O−メトキシエチル−RNA(MOE)、2’−アミノ−DNA、2’−フルオロ−RNA、及び2’−F−ANAヌクレオシドなどの少なくとも1つの2’置換修飾ヌクレオシドなどの、少なくとも1つの非LNA修飾ヌクレオシドと、を含む、LNAギャップマーを指す。いくつかの実施形態では、混合ウィングギャップマーは、LNAヌクレオシド(例えば、5’又は3’)のみを含む1つのフランクを有し、他のフランク(それぞれ、3’又は5’)は2’置換修飾ヌクレオシド及び任意にLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、混合ウィングギャップマーは、フランクにLNA及び2’−O−MOEヌクレオシドを含む。
ミクスマーは、ヌクレオシド修飾ヌクレオシド及びDNAヌクレオシドの両方を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、4つより多くの連続したDNAヌクレオシドを含まない。ミクスマーオリゴヌクレオチドは、核酸標的の非RNAseH媒介調節のため、例えば、マイクロRNAの阻害のため、又はプレmRNAのスプライススイッチング調節のために、しばしば使用される。
トータルマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する全ヌクレオシドがヌクレオシド修飾されている、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドである。トータルマーは、1つのタイプのヌクレオシド修飾のみを含んでもよく、例えば、完全2’−O−MOE若しくは完全2’−O−メチル修飾オリゴヌクレオチド、又は完全LNA修飾オリゴヌクレオチドであってもよく、又は異なるヌクレオシド修飾の混合物、例えばLNAと2’−O−MOEヌクレオシドとの混合物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、トータルマーは、1つ又は2つの3’末端LNAヌクレオシドを含み得る。
微小オリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチド内の各ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、7〜10ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。微小オリゴヌクレオチドは、マイクロRNAを標的とするため特に効果的な設計であることが知られている。
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、立体定義オリゴヌクレオチドである。立体定義オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも1つが立体定義ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、siRNA若しくはsiRNAセンス、及び/又はアンチセンス鎖などのRNAi分子であり得る。本明細書では、用語「RNA干渉(RNAi)分子」とは、RNA還元サイレンシング複合体(RNA reducing silencing complex:RISC)によってRNA発現又は翻訳を阻害する任意の分子を指す。小型干渉RNA(siRNA)は、典型的には、センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む二本鎖RNA複合体であり、これは細胞に投与されると、RISC複合体(siRISC)へのアンチセンス鎖の組み込みがもたらされ、RISC関連の細胞内の相補的なRNA標的核酸の翻訳阻害又は分解がもたらされる。センス鎖はパッセンジャ鎖とも称され、アンチセンス鎖はガイド鎖とも称される。小型ヘアピンRNA(shRNA)は、RISCを介してmRNAを分解することができるヘアピン構造を形成する単一の核酸分子である。RNAi核酸分子は、化学的に(siRNA複合体に典型的)若しくはインビトロ転写により合成され、又はベクタから発現され得る。
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、DNA及びRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び1つ以上のリン酸基(ヌクレオシドに存在しない)を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」とは、等価なDNA又はRNAヌクレオシドと比較して、糖部分又は(核酸)塩基部分の1つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語、修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」若しくは修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。非修飾DNA又はRNA糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でDNA又はRNAヌクレオシドと称される。DNA又はRNAヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがWatson Crick塩基対合が可能であれば、依然として一般にDNA又はRNAと称される。
用語「修飾ヌクレオシド間結合」とは、2つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル(PO)結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのDNA又はRNAヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに領域F及びF’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニン及びグアニン)及びピリミジン(例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン)部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンと、天然に存在しない変異体との両方を指す。そのような変異体は、例えば、Hiraoら(2012年)「Accounts of Chemical Research」第45巻、第2055頁、及びBergstrom(2009年)「Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.」第37巻、第1.4.1頁に記載されている。
核酸塩基配列とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド中に存在する核酸塩基の配列を指す。オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、通常、A、T、C、及びG核酸塩基の配列を指す。したがって、オリゴヌクレオチド内の5−メチルシトシン塩基の存在は、シーケンシング法によって同定される核酸塩基配列中のシトシン残基として同定することができる。同様に、ウラシル核酸塩基は、シーケンシング法においてチロシン塩基として同定され得る。
用語「核酸配列」とは、ヌクレオチドの連続配列を含み、修飾オリゴヌクレオチド又はその逆相補体に存在するヌクレオチドの配列を含み得る、核酸分子を指す。
用語「相補性」とは、ヌクレオシド/ヌクレオチドのWatson−Crickの塩基対合の能力を説明する。Watson−Crick塩基対は、グアニン(G)−シトシン(C)及びアデニン(A)−チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば5−メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のWatson Crick塩基対合を包含することが理解されるであろう(例えばHiraoら(2012年)「Accounts of Chemical Research」第45巻、第2055頁、及びBergstrom(2009年)「Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.」第37巻、第1.4.1頁を参照されたい)。
本明細書で使用される用語「同一性」とは、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば、配列モチーフ)に同一である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合(パーセントで表される)を指す。したがって、同一性の百分率は、2つの配列(本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における)の間で同一の(一致する)整列された塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率=(一致×100)/整列領域(例えば、連続ヌクレオチド配列)の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がWatson Crick塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう(例えば、5−メチルシトシンは、%同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる)。
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」は、2つの核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸)が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することによりデュプレックスを形成するとして理解するべきである。
同一性:2つのアミノ酸の関連性は「同一性」というパラメータで表される。本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、EMBOSSパッケージ(「EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite」、Riceら(2000年)「Trends in Genetics」第16巻、第276〜277頁;http://emboss.org)のNeedleプログラム、好ましくはバージョン3.0.0以降に実装される、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman及びWunsch(1970年)「J.Mo/.Biol.」第5巻、第48号、第443〜453頁)を用いて決定される。使用されるオプションのパラメータは、ギャップ開放ペナルティ10、ギャップ拡張ペナルティ0.5、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリクスである。Needle標識した「最長同一性(longest identity)」の出力(10−no briefオプションを使用して得られる)はパーセント同一性として使用され、次のように計算される:(同一残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数)。
連結とは、オリゴヌクレオチドなどの2つの核酸断片の共有結合連結を指す。連結は、典型的には、1つの核酸断片上の3’−OH基と別の核酸断片上の5’ホスホリル基との間のリン酸結合の形成を含み、T4−DNAリガーゼなどのリガーゼ酵素によって触媒され得る。
本明細書に記載されるように、捕捉プローブオリゴヌクレオチドとも呼ばれる3’捕捉プローブオリゴヌクレオチドは、第1プライマー結合部位を含み、そして本発明の方法において、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結され、それによって、修飾オリゴヌクレオチドを鋳型として用いるポリメラーゼベースの鎖伸長を可能にする、オリゴヌクレオチドである。第1プライマー結合部位はまた、固相結合プライマーなどの、プライマーをシーケンシングするための結合部位としても使用され得る。
A.所定の配列の少なくとも3つの連続したヌクレオチドを含む5’領域であって、5’側最末端ヌクレオチドが、末端5’リン酸基を有するヌクレオチドである、領域と;
B.任意に、所定のヌクレオチド配列の領域を含む並列シーケンシング反応バーコード領域と;
C.任意に、領域Bの3’又は領域Bの5’に位置する縮重ヌクレオチド又は所定ヌクレオチドの領域と;
D.固相シーケンシングプライマー結合部位と;
E.任意に、第1プライマー結合部位と;
F.任意に、リンカー領域(ヌクレオチドの配列であり得る)と;
G.第1のセグメント(第1のデュプレックス領域)の所定の配列Aに相補的な、ヌクレオチドの連続配列と;
H.少なくとも2ヌクレオチドの領域であって、3’側最末端ヌクレオチドが、ブロックされた3’末端基を有する末端ヌクレオチドである、領域と;を含む。
A.所定の配列の少なくとも3つの連続したヌクレオチドを含む5’領域であって、5’側最末端ヌクレオチドが、末端5’リン酸基を有するヌクレオチドである、領域と;
B.任意に、所定のヌクレオチド配列の領域を含む並列シーケンシング反応バーコード領域と;
C.任意に、領域Bの3’又は領域Bの5’に位置する縮重ヌクレオチド又は所定ヌクレオチドの領域と;
D.固相シーケンシングプライマー結合部位と;
E.任意に、第1プライマー結合部位と;
F.任意に、リンカー領域(ヌクレオチドの配列であり得る)と;
F’ 第1プライマー結合部位及び/又は固相シーケンシングプライマー結合部位とデュプレックスを形成する領域であり、ここで、デュプレックスは切断可能なリンカーを含む、領域と;
G.第1のセグメント(第1のデュプレックス領域)の所定の配列Aに相補的な、ヌクレオチドの連続配列と;
H.少なくとも2ヌクレオチドの領域であって、3’側最末端ヌクレオチドが、ブロックされた3’末端基を有する末端ヌクレオチドである、領域と;を含む。
いくつかの実施形態では、領域Aは、所定の配列の少なくとも3つの連続したヌクレオチドを含むか、又はそれらからなり、ここで、5’末端ヌクレオチドは、5’リン酸基を含むDNAヌクレオチドである。少なくとも3つの連続するヌクレオチドは、領域G(第1のデュプレックス領域)に相補的であり、かつ領域Gにハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、領域Aの少なくとも3つの連続するヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。
領域Bは、DNAヌクレオチドなどの3〜20ヌクレオチドの領域など、所定のヌクレオチド配列の領域を含む並列シーケンシング「反応バーコード」領域として使用され得るか、又は該並列シーケンシング領域である。捕捉プローブが領域Bを含むことは、別個の捕捉プローブ連結からの試料のプールが、共通の並列シーケンシング操作におけるシーケンシングの前にプールされることを可能にするので、有利である。異なる領域B配列を有する異なる捕捉プローブの使用によって、別個の捕捉プローブ連結からの配列データのシーケンシング後分離が可能となる。
領域Cは、領域Aの3’に位置するヌクレオチドの任意の配列であり、これは、所定の配列若しくは縮重配列を含んでもよいか、又はいくつかの実施形態では、所定の配列部分及び縮重配列部分の両方を含んでもよい。領域Cの長さは、存在する場合、用途に応じて調節され得る。縮重配列が使用される場合、その後のシーケンシング工程における増幅生成物の「分子バーコーディング」を可能にすることで、特定の増幅生成物が特有であるかどうかを決定させる。これは、オリゴヌクレオチドの異種混合物中に存在する、異なるオリゴヌクレオチドの比較定量化を可能にする。いくつかの実施形態では、領域Cは、3〜30縮重連続ヌクレオチド、例えば3〜30縮重連続DNAヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、領域Cは、イノシンヌクレオチドなどのユニバーサルヌクレオチドを含む。
領域Dは固相プライマー結合部位であり、また、シーケンシングプライマー結合部位とも呼ばれ、任意のクローン増幅及び続く並列シーケンシングの前に、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドに、アダプターライゲーション産物か、又は任意にはアダプターライゲーション産物から調製されたPCR産物かを捕捉するために使用される。領域Dはまた、第1ストランド合成を開始するための第1プライマー結合部位として使用され得る。
領域Eは、第1ストランド合成を開始するために使用される、第1プライマー結合部位である。領域Dが第1プライマー結合部位として使用される場合、領域Eを含める必要はない。したがって、機能的には、第1プライマー結合部位領域Eは、固相プライマー結合部位(D)と同一であってもよく、又は領域Dと部分的に重複していてもよい。
領域Gは、領域Aとデュプレックスを形成する領域Aに相補的なヌクレオチドの領域である。領域Gが領域Aに相補的なRNAヌクレオシドを含まない場合は有益であり、また、捕捉プローブの5’末端ヌクレオシドに相補的かつハイブリダイズする領域Gに存在するヌクレオシド(領域Aの5’ヌクレオシド)が、DNAヌクレオシドであることも有益である。この結果、領域Aと領域Gとがハイブリダイズすると、DNA/DNAデュプレックスが形成される。いくつかの実施形態では、領域Gの2つ又は3つの3’側最末端は、DNAヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Gのヌクレオシドの全ては、DNAヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Gは、領域Aに相補的であり、かつハイブリダイズし得る、少なくとも3つの連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、領域Gの少なくとも3つの連続するヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。
領域Hは、検出され、捕捉され、配列決定され、及び/又は定量化されるヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドに、捕捉プローブオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる目的に役立つ。
領域F
領域Fは任意の領域であり、図7の領域Eと領域Gとを結ぶ細い線によって図示される。領域Eが存在しない場合、領域D及び領域G、又は領域D若しくは領域Eを、領域F’に連結することができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオシドリンカーを含まない。
3’捕捉プローブは、いくつかの実施形態では、直線的捕捉プローブであってもよい。直線的捕捉プローブでは、直線的捕捉プローブと共にスプリント連結プライマーを使用することが有利であり得る。スプリント連結プライマーは、捕捉プローブの5’領域及び修飾オリゴヌクレオチドの3’領域にハイブリダイズし、それにより、連結される末端を整列させる。
DNAポリメラーゼをブロックする修飾又はリンカー部分は、リンカー部分又は修飾を横切るポリメラーゼのリードスルーを妨げ、結果として鎖伸長の終結をもたらす。
特異的プライマーは、プライマー結合部位に相補的な配列を含むプライマーである。プライマー及びプライマー結合部位に関する用語「特異的」とは、使用される鋳型分子を考慮する必要があり得ること、すなわち捕捉プローブ又はアダプターにおけるプライマー結合部位が、いくつかの実施形態において、捕捉プローブ又はアダプターを含む核酸分子から調製された相補的核酸分子においてプライマー結合部位を提示するように操作され得るこということが理解されるであろう。
本明細書中で使用される場合、第1プライマーとは、捕捉プローブオリゴヌクレオチド/修飾オリゴヌクレオチドライゲーション産物にハイブリダイズした場合、本明細書中に記載される領域D又はEなどの、ポリメラーゼ媒介鎖伸長(第1ストランド合成)を開始するために使用される、捕捉プローブの領域に特異的なプライマーを指す。したがって、第1プライマーは、捕捉プローブオリゴヌクレオチド上の領域に相補的な配列を含み、更に、シーケンシングプライマー結合部位などの更なる領域を含み得る。第1プライマーは、フローセル結合部位などの、超並列シーケンシングにおいて使用される固体支持体に結合するための結合部位を更に含み得る。第1プライマーは、本発明の方法に含まれる増幅工程(PCT工程)で使用するためのPCRプライマー結合部位を更に含み得る。第1プライマーは、例えば15〜30ヌクレオチド長であり得、そして、例えばDNAオリゴヌクレオチドプライマーであり得る。
本明細書中で使用される場合、ポリメラーゼ媒介5’−3’鎖伸長とは、捕捉プローブオリゴヌクレオチド/修飾オリゴヌクレオチドライゲーション産物にハイブリダイズした場合の、第1プライマーからの捕捉プローブオリゴヌクレオチド/修飾オリゴヌクレオチドライゲーション産物の相補ストランドのポリメラーゼ媒介伸長を指し、このプロセスは、DNAポリメラーゼ又は逆転写酵素などの核酸ポリメラーゼによって媒介され得る。本明細書に例示されているように、実施例は、修飾オリゴヌクレオチドを読み取る(すなわち、逆転写する)ことができる好適なポリメラーゼ酵素及び実験条件を同定するために使用することができる、アッセイを提供する。したがって、ポリメラーゼは、修飾オリゴヌクレオチド配列にわたって逆転写して、修飾オリゴヌクレオチド全体の相補的配列を含む伸長生成物を提供することができる酵素である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、LNA修飾オリゴヌクレオチド配列、例えばLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列にわたって逆転写することができる酵素である。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合により連結された、少なくとも2つの連続LNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合により連結された、少なくとも2つの連続する糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結された少なくとも2つの連続する糖修飾ヌクレオシドを含み、ここで、該糖修飾ヌクレオシドの少なくとも1つは、LNAヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合により連結された、少なくとも2つの連続する2’−O−メトキシエチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結された少なくとも2つの連続する糖修飾ヌクレオシドを含み、ここで、該糖修飾ヌクレオシドの少なくとも一方はLNAヌクレオシドであり、他方は2’−O−メトキシエチルヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、DNA及びLNAヌクレオシドを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「アダプタープローブ」とは、第1プライマーからのポリメラーゼ媒介5’−3’鎖伸長からの伸長生成物の3’末端に連結される、オリゴヌクレオチドプローブを指す。アダプタープローブは、プライマーベースのシーケンシングに直接使用することができる、及び/又は本発明の方法を含む増幅工程(PCT工程)で使用することができる、プライマー結合部位を提供する。アダプタープローブは、シーケンシングプライマー結合部位などの更なる領域を更に含み得る。アダプタープローブは、フローセル結合部位などの、超並列シーケンシングにおいて使用される固体支持体に結合するための結合部位を更に含み得る。アダプタープローブは、本発明の方法に含まれる増幅工程(PCR工程)で使用するためのPCRプライマー結合部位を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、アダプタープローブを伸長生成物の3’末端に連結した後、PCR増幅工程を行う。PCR増幅は1対のPCRプライマーを使用し、ここで、該プライマーの一方は、捕捉プローブ上の領域(第1プライマー結合配列、又は第1のプライマー結合配列の上流の捕捉プローブの領域であり得る)に特異的であり、他方のPCRプライマーは、アダプタープローブの領域に特異的である。
バーコードは、例えば、同じ捕捉プローブ連結事象(分子バーコード)由来又は共通の捕捉プローブ連結反応(反応バーコード)由来である複数の配列の同定に関して、本発明の方法で得られた配列のオリジナルを同定するために使用される、捕捉プローブ又はプライマー内の配列である。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴヌクレオチド及び/又はアダプタープローブは、ランダムヌクレオシド配列(縮重配列)の配列を含む。捕捉プローブ又はアダプタープローブ内の縮重配列の使用は、PCR増幅工程後の同じ連結された伸長生成物分子の重複から生じるシーケンシング結果の同定を可能にするために、使用することができる。
超並列シーケンシングの能力は、シーケンシング鋳型を単一のシーケンシング実験にプールすることを可能にし、それによって、各シーケンシング操作の費用効果を高める。したがって、シーケンシングデータを分離して、別のシーケンシング鋳型反応から生じる配列を同定することができることが望ましい。これは、各鋳型に特有である共通の配列同定を組み込んだ捕捉プローブ又はPCRプライマーを使用することによって達成することができる。反応バーコードの長さは、各並列シーケンシング操作にプールされた異なるシーケンシング鋳型の複雑さを反映するように修飾することができ、(例えば、DNAヌクレオチドの長さが)2〜20ヌクレオチド、例えば、長さが4〜5ヌクレオチドであってもよい。
縮重ヌクレオチドとは、特定の位置に複数の代替塩基(核酸のIUPAC表記法で使用される通り)を有することができる、核酸配列上の位置を指す。個々の分子について、規定された位置に特異的ヌクレオチドが存在するが、オリゴヌクレオチド試料中の分子の集団内では、規定された位置のヌクレオチドは縮重するということが認識されるべきである。事実上、縮重配列の組込みは、オリゴヌクレオチドの集団の各メンバ間で規定された位置における、ヌクレオチド配列のランダム化をもたらす。いくつかの配列はPCR中に優先的に増幅され得ることが知られており、これにより、縮重配列に由来する遺伝的「バーコード配列」の発生を計数することで、増幅前の相対量を決定することができる(例えば、Kielpinski及びVinter、「NAR」(2014年)第42巻、第8号、第e70頁参照)。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、縮重ヌクレオチドの代わりに使用され得るユニバーサル塩基(例えば、イノシンヌクレオチド)の領域を含む。
シーケンシングとは、核酸分子内の核酸塩基の順序(配列)の決定を指す。本発明の文脈において、シーケンシングとは、修飾オリゴヌクレオチド内の核酸塩基の配列の決定を指す。従来の配列決定方法は、インビトロDNA複製中にDNAポリメラーゼによる連鎖停止ジデオキシヌクレオチドの組込みを選択すること、続いて連鎖停止生成物を電気泳動分離することを用いる、連鎖停止法(サンガーシーケンシングとして知られる)に基づく。異なる連鎖停止塩基(A、T、C、又はG)を各々が有する4つの別々の反応を用いて、ゲル電気泳動における4つの連鎖停止反応生成物の相対運動性を比較することによって、配列を決定する。
プライマーベースのシーケンシングとは、核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーからの5’−3’ポリメラーゼに基づく鎖伸長の使用を指す。プライマーベースのシーケンシングは、連鎖停止法(例えば、サンガー法)に基づくか、又は合成によるシーケンシングを有利に使用することができる。
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドの集団をシーケンシングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、修飾オリゴヌクレオチドに捕捉プローブを連結する工程、次いで、その後ポリメラーゼに基づく鎖伸長のために使用されて伸長生成物を生成する、捕捉プローブに相補的である第1プライマーのハイブリダイゼーションの工程を含む。次に、アダプターを伸長生成物の3’末端に連結することで、既知のプローブ配列によって5’及び3’に隣接した修飾オリゴヌクレオチドの相補的配列を含む核酸分子を得る。ここで、該核酸分子は、プライマー結合部位として使用することができ、例えば、プライマーベースのシーケンシング(単一分子鋳型シーケンシング)において直接使用することができるか、又はシーケンシングの前に、例えばPCR又は縮小サイクル増幅(クローン増幅シーケンシング)を介して増幅することができる。
従来のサンガー法に基づくシーケンシングが連鎖停止法に基づくのに対して、合成によるシーケンシングは、連鎖停止を開始することなく、鎖伸長中の色素標識ヌクレオチドの添加に基づく。特有の色素シグナル(A、T、C、及びGの4つの塩基それぞれに1つずつ)の実時間モニタリングにより、鎖伸長中に配列が捕捉される。合成法による合成によるシーケンシングの顕著な利点は、核酸配列の複雑な混合物の超並列シーケンシングを可能にすることである。いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるシーケンシング方法は、循環可逆的終結方法又は単一ヌクレオチド付加方法である。
従来のサンガーシーケンシングでは、各シーケンシング操作は単一の核酸鋳型の配列を決定するために使用されるが、次世代シーケンシング方法の使用は、核酸配列の異種混合物の並列シーケンシングを可能にする。本明細書に記載されるように、並列シーケンシングは、クローン増幅工程を用いることができ、増幅プライマー内に配列ベースの識別子を組み込むことによって、各本来の鋳型分子に由来する反復クローン配列を同定することができる。
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程:
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、該修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた該第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のPCR増幅を行って、該PCR増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと、のいずれかとを含む。
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの該集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の該相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた該第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のPCR増幅を行って、該PCR増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと、のいずれかとを含む。
(i)捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
(ii)該捕捉プローブオリゴヌクレオチドの領域に相補的な第1プライマーを加えることと;
(iii)該第1プライマーのポリメラーゼ媒介5’−3’鎖伸長を行うことと;
(iv)工程ivで得られた伸長生成物の3’末端にアダプタープローブを連結することと;
(v)工程(iv)で得られた該ライゲーション産物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと;を含む。
(i)捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
(ii)該捕捉プローブオリゴヌクレオチドの領域に相補的な第1プライマーを加えることと;
(iii)該第1プライマーのポリメラーゼ媒介5’−3’鎖伸長を行うことと;
(iv)工程iiiで得られた伸長生成物の3’末端にアダプタープローブを連結することと;
(v)一対のPCRプライマーを用いる、工程(iv)の該ライゲーション産物のPCR増幅を行うことであって、該PCRプライマーの一方は該捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該アダプタープローブに特異的である、PCR増幅を行うことと;
(vi)工程(v)で得られた該PCR生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと;を含む。
(i)捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
(ii)該捕捉プローブオリゴヌクレオチドの領域に相補的な第1プライマーを加えることと;
(iii)該プライマーのポリメラーゼ媒介5’−3’鎖伸長を行うことと;
(iv)工程iiiで得られた伸長生成物の3’末端にアダプタープローブを連結することと;
(v)任意に、一対のPCRプライマーを用いる、工程(iv)の該ライゲーション産物のPCR増幅を行うことであって、該PCRプライマーの一方は該捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該アダプタープローブに特異的である、PCR増幅を行うことと;
(vi)工程(iv)で得られた該ライゲーション産物又は工程(v)で得られた該PCR生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと;を含む。
(i)修飾オリゴヌクレオチドの3’末端へ自己プライミング捕捉プローブオリゴヌクレオチドを連結することであって、ここで、該自己プライミング捕捉プローブは、切断された場合、5’−3’ポリメラーゼ媒介鎖伸長のための基質を提供する切断可能な連結を含む、工程と;
(ii)該自己プライミング捕捉プローブを切断することと;
(iii)該切断された自己プライミング捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’鎖伸長を行うことと;
(iv)工程iiiで得られた伸長生成物の3’末端にアダプタープローブを連結することと;
(v)任意に、一対のPCRプライマーを用いる、工程(iv)の該ライゲーション産物のPCR増幅を行うことであって、該PCRプライマーの一方は該捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該アダプタープローブに特異的である、PCR増幅を行うことと;
(vi)工程(iv)で得られた該ライゲーション産物又は工程(v)で得られた該PCR生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと;を含む。
(i)修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端へ自己プライミング捕捉プローブオリゴヌクレオチドを連結することであって、ここで、該自己プライミング捕捉プローブは、切断された場合、5’−3’ポリメラーゼ媒介鎖伸長のための基質を提供する切断可能な連結を含む、工程と;
(ii)該自己プライミング捕捉プローブを切断することと;
(iii)該切断された自己プライミング捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’鎖伸長を行うことと;
(iv)工程iiiで得られた伸長生成物の3’末端にアダプタープローブを連結することと;
(v)任意に、一対のPCRプライマーを用いる、工程(iv)の該ライゲーション産物のPCR増幅を行うことであって、該PCRプライマーの一方は該捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該アダプタープローブに特異的である、PCR増幅を行うことと;
(vi)工程(v)で得られた該ライゲーション産物又は工程(e)で得られた該PCR生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと;を含む。
修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり得る。修飾オリゴヌクレオチドは、LNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は2’−O−メトキシエチル(MOE)ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどのホスホロチオエート2’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエート糖修飾オリゴヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態では、複合部分は、酵素、抗体若しくは抗体断片、又はペプチドなどのタンパク質;脂質、リン脂質、ステロールなどの親油性部分;ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリマー;受容体リガンド;小分子;レポータ分子;及び、非ヌクレオシド炭水化物からなる群より選択される。
リンケージ又はリンカーは、1つ以上の共有結合を介して、対象の1つの化学基又はセグメントを別の化学基又はセグメントに連結する2つの原子間の接続である。複合部分は、直接又は連結部分(例えば、リンカー又はテザー)を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、第3の領域、例えば複合部分をオリゴヌクレオチド(例えば、領域A又はCの末端)に共有結合させるのに役立つ。
本発明は、同一の修飾オリゴヌクレオチド合成操作のプールからの修飾オリゴヌクレオチドの集団における配列非均一性を決定するための方法を提供し、該方法は、次の工程:
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと;
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと;
得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの集団の配列非均一性を同定することと;を含む。
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと;
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと;
該修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証するために得られた該配列データを分析することと;を含む。
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと;
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと;
該修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証するために得られた該配列データを分析することと;を含む。
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと;
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと;
該修飾オリゴヌクレオチドの純度を決定するために得られた該配列データを分析することと;を含む。
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、該修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた該第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
続いて、以下のいずれか:
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のPCR増幅を行って、該PCR増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと
を含む、方法。
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの該集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の該相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた該第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
続いて、以下のいずれか:
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた該ライゲーション産物のPCR増幅を行って、該PCR増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと
を含む、方法。
a.固相ブリッジ増幅などの固相増幅、又は
b.液滴PCRなどのエマルション相増幅、のいずれかを含む、実施形態1〜11のいずれか一項に記載の方法。
LNAオリゴヌクレオチドを横断して読む種々のポリメラーゼ能力を試験できるようにするために、ホスホロチオエート骨格(12塩基対)を有するLNAオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格(図1A参照)を有する正常DNA塩基の20bp超である5’及び3’側の両方のフランクである、「LNA試験鋳型1」(LNA Test Template 1:LTT1)と命名した、一本鎖試験鋳型分子を作製した。この鋳型分子を種々の後の実験に用いた。このLNAオリゴ試験分子と並行して、12塩基対が同じ配列からなるが、DNA及び骨格がホスホジエステルであった全塩基からなる、同じ試験鋳型も作製した。この鋳型は「DNA試験鋳型1」(DNA Test Template 1:DTT1)と呼ばれ、対照オリゴとして機能した。これらの鋳型は、これらの分子の5’末端及び3’部分に置かれたプライマーを用いた後の実験で使用された。PCR反応が起こるためには、ポリメラーゼは、ホスホジエステル骨格を含む鋳型の部分及び5’正常DNA部分全体にわたって、プライマーを伸長できなければならない。したがって、このLTT1分子は、LNAオリゴをコピーするポリメラーゼの能力を試験するのに役立つ。
(全ヌクレオシドはホスホジエステル結合DNAヌクレオシドである;「/5Phos/」は5’リン酸基を示す;/iSp18/は、18原子のヘキサエチレングリコールスペーサーを示す;/3AmMO/は3’アミノ修飾子を示す。)配列表において、本明細書に開示されているプローブの塩基配列は、特定された修飾なしで提供され、場合によっては、RNA塩基がDNA塩基として示されていることに留意されたい。相違する場合、実施例における配列及び配列の修飾は、配列表における開示よりも優先される。
以下の連結反応をPCRチューブ中にセットアップした:
a:2uL H2O+2uL DCP1(100uM)
b:2uL LNA O1(10uM)+2uL DCP1(100uM)
c:2uL LNA O1(10uM)+2uL DCP1(100uM)
混合物を55℃で3分間加熱し、次いで4℃まで冷却した。
2uL T4 DNA Ligase Buffer(Thermo Scientific)
6uL PEG(50%)
6uL H2O
2uL T4 DNA Ligase(Thermo Scientific)
上記の反応の各々に、等量の2倍Novex(登録商標)TBE−Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を加え、試料を95℃で2分間熱変性させ、氷上に置いた。このようにして調製した15μlの試料を、Novex(登録商標)TBE−Urea Gels、15%、15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAを、SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)で可視化した(図1B参照)。
LTT1、DTT1、及び捕捉プローブ(DCP1)を、QX200(商標)ddPCR(商標)EvaGreen Supermixで実施される標準エマルションPCR反応における鋳型分子として使用した。EvaGreen用の自動化液滴生成油を用いて、AutoDG(BioRad)上に液滴を生成した。PCRサイクリング後、液滴をQX200液滴リーダ(BioRad)で読み取った。
と、LTT1及びDTT1の5’末端に結合する順方向プライマー
と、を用いてセットアップした。第2の反応も行い、追加の標準Taqポリメラーゼ(New England Biolabs)を加えた。これは、標準Taqを追加することでLTT1のリードスルーが改善されるかどうかを確認するために行った。
図2のパネルAは、6つの異なるPCR反応での液滴の蛍光強度の1Dプロットを示す。多数の陽性液滴が出現するので、DTT1鋳型のPCR増幅が実行可能であることが明らかになり得る。しかしながら、LTT1又はDCP1を用いたPCR反応では、陽性液滴は見られなかったか、又はほとんど見られなかった。標準Taqポリメラーゼの更なる添加にかかわらず、同じ結果が見られた。このことは、Taqポリメラーゼが、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴを含有するLNAを横切って完全に読み取ることがほとんど不可能であることを示している。
Taqポリメラーゼは正常条件下でLTT1鋳型を横断して読むことができないので、逆転写酵素(Reverse Transcriptase:RT)がLNAオリゴ伸長を横断して読むことができるかどうかを見るために、多くの市販のRT酵素ポリメラーゼを試験した。これは、第1ストランドのコピー反応をセットアップすることによって行われ、異なるポリメラーゼは、DCP1_プライマー1をプライマーとして使用してLTT1をコピーしようと試みた。第2に、生成されたインタクトなLTT1第1ストランドのコピーの量を、実施例2に記載したように、DCP1_プライマー1及びTT1_プライマー1を用いたddPCR反応で試験した。図3は、以下の6種類のポリメラーゼを試験した結果を示している:Agilent製AccuScript Hi−Fi Reverse Transcriptase、Thermo Scientific製SuperScript IV Reverse Transcriptase 200U/uL、MyPols製Volcano2G DNAポリメラーゼ 5U/uL、Thermo Scientific製RevertAid Reverse Transcriptase 200U/uL、New England BioLabs製AMV Reverse Transcriptase 10単位/uL、タカラバイオ製PrimeScript Reverse Transcriptase(PrimeScript RT Reagent Kit)。
全ての反応が含まれ(1uL LTT1(31pM)、0.5uL DCP1_プライマー1(10uM)、水10uLを加えた。異なる酵素は、販売業者から提供された緩衝液を用いて実行した。
b)0.5uL SuperScript IV、0.5uL 0.1M DTT、2uL第1ストランド緩衝液、1uL dNTP(10mM)
c)0.2uL Vulcano2G、2uL Vulcano緩衝液、1uL dNTP(10mM)
d)0.5uL RevertAid、2uL反応緩衝液、1uL dNTP(10mM)
e)0.5uL AMV、0.5uL 0.1M DTT、2uL cDNA 合成緩衝液、1uL dNTP(10mM)
f)0.5uL PrimeScript、2uL PrimeScript緩衝液、1uL dNTP(10mM)
図3は、異なるPCR反応における液滴の蛍光強度を示す。図には42℃の逆転写反応の結果のみが示されている。他の温度の結果は、AMVで見られる非常に小さい活性が52.5℃以上で失われることを除いて、各条件で同じであった。一般的な逆転写酵素では、LTT1鋳型全体を読み取る能力がないか、又は極めて非常に低い効率であることが分かる。しかしながら、Vulcano2Gは鋳型を読むのにかなりの効率があるように見えることが分かった。等数のインプット分子を有するDTT1鋳型上におけるddPCRと比較した液滴数の定量化は、Vulcano2G酵素の読取効率がおよそ10%であることを示し、これは10個のLLT1分子のうちの1つがVulcano2G酵素によって丸ごと転写されることを意味した。AMV及びPrime Script酵素でおよそ0.1%の効率が見られた。
ポリメラーゼでLNAオリゴを横断して転写する際の困難を克服するために、PCR反応における添加物が、LTT1におけるLNAオリゴを横断して読み取る際にポリメラーゼを助けることができるかどうかの試験に着手した。LNAオリゴ、すなわち塩化テトラメチルアンモニウム(TMA)、ポリエチレングリコール(PEG)、塩化アンモニウム、及び1,2−プロパンジオールの読取りに有益な効果があるかどうかを調べるために、4種類の既知のPCR添加物を試験した。修飾Taqポリメラーゼを含有するAccuStart II PCR ToughMix(QuantiBio)を用いて、エマルションPCR反応における添加物を試験した。EvaGreen用の自動化液滴生成油を用いて、AutoDG(BioRad)上に液滴を生成した。PCRサイクリング後、液滴をQX200液滴リーダ(BioRad)で読み取った。別々のEvaGreen色素(Biotiumカタログ番号31000)をPCR反応に加えた。
11uL AccuStart II PCR ToughMix
0.2uL TT1_プライマー1(10uM)
0.2uL DCP1_プライマー1(10uM)
0.5uL EvaGreen色素(40倍)
XuL PCR添加物
2uL LTT1(100fM)
H2O添加22uL
図4は、添加物を用いたddPCRの結果を示す。結果は、全液滴の蛍光強度を示す、1Dプロットとして表示する。その結果、塩化TMA及び塩化アンモニウムを添加しても、LNAリードスルーは改善されなかった(図4パネルA及びパネルC)。しかしながら、PEGの濃度の増加は、陽性液滴の量の増加をもたらすことが分かる。正の効果は3%PEGで始まり、4%及び5%の両方で増加した(図4パネルB)。また、1,2−プロオアンジオールの添加による正の効果を観察し、およそ0.8Mの1,2−プロパンジオール付近から始まる陽性液滴の量の増加を見出した(図4パネルD)。1.2M超の1,2−プロパンジオール濃度の増加は、若干の陽性液滴をもたらしたが、陽性液滴の蛍光強度の減少もまたもたらした。まとめると、PEG又は1,2−プロパンジオールの添加は、Taqポリメラーゼがホスホロチオエート骨格を有するLNAオリゴを横切るその読取能力を劇的に増加させることを可能にすると結論する。図4パネルEは、検出されたLTT1分子の濃度を示し、PEGがLTT1検出を明らかに増加させることと、PEGが、LTT1鋳型を読み取る能力もまたいくらか増加させた1,2−プロパンジオールと比較して、より良好な添加物であることと、を示す。
実施例4では、PEG及び1,2−プロパンジオールの添加が、開示されていない修飾Taqポリメラーゼを含有する混合物(QuantaBio)を介してAccustart II PCRを用いた場合に、LTT1鋳型分子の成功した増幅に有益であったことが示された。PCR添加物が他のポリメラーゼに対するLNAオリゴ「リードスルー」も可能にするかどうかを調べるために、複数回のLTT1鋳型の第1ストランド合成を行うことによって、正常なTaqポリメラーゼ及び高忠実度ポリメラーゼ(Phusion polymerase、Thermo Scientific)を試験した。生成されたインタクトな第1ストランドのコピーの数は、実験2、3、4で実施したものと同様に、Evagreen ddPCR検出によって検出された。以下の20uL反応を設定し、0、1、3、5、及び10回の第1ストランド増幅を用いて実施した。
b)0.1uL Taqポリメラーゼ、2uL Taq緩衝液、0.4uL DCP1_プライマー1(10uM)、0.4uL LTT1(10pM)、0.5uL 1,2−プロパンジオール、4uL PEG(50%)
c)2uL Taq緩衝液、0.4uL DCP1_プライマー1(10uM)、0.4uL LTT1(10pM)、0.5uL 1,2−プロパンジオール、4uL PEG(50%)
d)0.2uL Phusionポリメラーゼ、5倍HF緩衝液、0.4uL DCP1_プライマー1(10uM)、0.4uL LTT1(10pM)
e)0.2uL Phusionポリメラーゼ、5倍HF緩衝液、0.4uL DCP1_プライマー1(10uM)、0.4uL LTT1(10pM)、0.5uL 1,2−プロパンジオール、4uL PEG(50%)
f)0.2uL Phusionポリメラーゼ、5倍GF緩衝液、0.4uL DCP1_プライマー1(10uM)、0.4uL LTT1(10pM)
g)0.2uL Phusionポリメラーゼ、5倍GF緩衝液、0.4uL DCP1_プライマー1(10uM)、0.4uL LTT1(10pM)、0.5uL 1,2−プロパンジオール、4uL PEG(50%)
第1ストランド再現(reaktion)。(95℃で5分;52.5 3分、95℃で30秒をXサイクル;その後、氷上)
図5は、第1ストランド合成に関するddPCR反応の結果を示す。図5パネルAは、PCR添加物を含まない第1ストランドTaqポリメラーゼ合成におけるddPCR反応を示す。このように、第1ストランド合成サイクルの結果として陽性液滴の数増加することはほとんどなく、通常の条件下でTaqポリメラーゼがホスホロチオエート骨格及びLNA塩基を含有するオリゴを横切って読むことができないことが再び示される。図5パネルCは、同じ反応を示すが、Taqポリメラーゼの存在は示さない。Taqポリメーゼ(polymerse)を用いない第1ストランド反応における陽性液滴数は、添加物を用いない反応とほぼ同じであった。これは、陽性液滴の大部分が、第1ストランド合成の間ではなく、Evagreen ddPCR反応の間に生じたLNA鋳型のコピーから生じたことを示した。図5パネルBは、10%PEG及び0.31Mが第1の合成中に存在した場合の、ddPCR反応の結果を示す。ストランド合成反応.このように、陽性液滴の数は、第1ストランド合成サイクルの数と共に増加し、添加物が、標準TaqポリメラーゼがLTT1のLNAオリゴ部分を横切って読むことを可能にすることを実証する。図5パネルE及びFは、10%PEG及び0.31Mの1.3−プロパンジオール添加物を伴う又は伴わないHF緩衝液中における、Phusion DNAポリメラーゼによる第1ストランド合成反応に関するddPCRを示す。これは、PEG及び1,2−プロパンジオールの添加並びに緩衝液HF又はGF緩衝液の使用にかかわらず、Phusionポリメラーゼが、LTT1のLNAオリゴヌクレオチド部分を横切って読み取ることができないことを示す。図5パネルDは、試験された7つの条件について検出されたLTT1コピーの数の定量化を示す。Taqポリメラーゼ及び添加物との反応においてのみ見られるように、LTT1鋳型分子の効果的な第1ストランド複製が見られる。これらの試験したPCR添加物(PEG及び1,2−プロパンジオール)の存在は、いくつかのDNAポリメラーゼがLNAオリゴを横断して読むことを可能にすると結論される。
完全なホスホロチオエート骨格を有するLNAオリゴヌクレオチドのシーケンシングが可能であることを示すために、以下の方法を用いて、5つのLNAオリゴヌクレオチドの混合物を配列決定した。シーケンシングは、正常Taq DNAポリメラーゼ及びVulcano2Gポリメラーゼ(myPOLS)の両方を用いて、第1ストランド合成中にPEGの添加の有無により行った。
2uL LNA混合物を、2uL捕捉プローブインデックス1(10uM)と混合した。
2uL LNA混合物を、2uL捕捉プローブインデックス2(10uM)と混合した。
2uL LNA混合物を、2uL捕捉プローブインデックス3(10uM)と混合した。
2uL LNA混合物を、2uL捕捉プローブインデックス4(10uM)と混合した。
16uLの連結混合物を各チューブに添加した:
20uL毎の反応:(2uL T4連結緩衝液、6uL PEG、6uL H2O、2uL T4リガーゼ)
上記の反応の各々に、等量の2倍Novex(登録商標)TBE−Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を加え、試料を95℃で2分間熱変性させ、氷上に置いた。このようにして調製した15μlの試料を、Novex(登録商標)TBE−Urea Gels、15%、15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAを、SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)で可視化した(図6A参照)。
4つの異なるプロトコルを用いて、連結されたLNAオリゴの第1ストランドのコピーを作製した。
95℃;3分、10回(55℃;5分、72℃;1分)、その後4℃で保持。
16uLの連結混合物を各チューブに添加した:
20uL毎の反応:(2uL T4連結緩衝液、6uL PEG、6uL H2O、2uL T4リガーゼ)。連結:2回(4℃;2分、16℃;2時間、22℃5分)、75℃;10分、その後4℃で保持。
連結された第1ストランド合成のPCR増幅を、NGS_PCR_プライマー1及び2を用いてPhusion DNAポリメラーゼで行った。これらのプライマーは、イルミナTruSeq NGSプロトコルと互換性のある5’オーバーハングを含む。
4つの反応を同じ濃度に標準化し、一緒にプールして、10nMのNGSライブラリを作製した。phiX対照混合物をこの試料にスパイクし、全分子の20%の最終濃度にして、続くイルミン(illumine)シーケンシングのための配列変動を得た。NGSライブラリは、イルミナのMiniSeq System用のDenature and Dilute Library Guideに従って調製した。ライブラリを、MID出力カセットを用いてIllumina miniSeqシステム上で配列決定した。シーケンシングは、151サイクルを実行するインデックスなしで、読取1のみを使用するfastqファイルを生成するように設定した。
生成されたfastqファイルは、CLC Genomics Workbench 10 software(Qiagen)にインポートした。読取りは、異なる捕捉プローブ1に組み込まれたバーコードに従って分離され、捕捉プローブ1からの残りの読取りは、読取りの5’末端からトリミングされた。その後、捕捉プローブ2に由来する配列は、捕捉プローブ1と2との間に挿入された配列のみを残して、3’末端からトリミングされた。次に、awkコマンドラインを使用して、18未満の全読取りをトリミングし、最後に、18bp又は32bpより長いal読取りを、シーケンシング読取りの3末端から塩基を除去することによって、18bp又は32bpにトリミングした。特有の読取りの数を定量化した。最多読取りの上位10を図6のパネルBに示す。図6において、読取りは、元のLNAオリゴを5’−>3’の様式で読み取るために、逆相補されている。
ここでは、QCのための完全ホスホロチオエート化(phosphorotioated)LNAオリゴのシーケンシングが可能であることが示される。
2uLオリゴ1を、2uL捕捉プローブ1インデックス3(10uM)と混合した。
2uLオリゴ2を、2uL捕捉プローブ1インデックス2(10uM)と混合した。
2uLオリゴ3を、2uL捕捉プローブ1インデックス4(10uM)と混合した。
2uLオリゴ4を、2uL捕捉プローブ1インデックス1(10uM)と混合した。
16uLの連結混合物を各チューブに添加した:
20uL毎の反応:(2uL T4連結緩衝液、6uL PEG、6uL H2O、2uL T4リガーゼ)。連結:2回(4℃;2分、16℃;20分、22℃5分、30℃1分)、75℃;10分、その後4℃で保持。
上記の反応の各々に、等量の2倍Novex(登録商標)TBE−Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を加え、試料を95℃で2分間熱変性させ、氷上に置いた。調製した15μlの試料を、Novex(登録商標)TBE−Urea Gels、15%、15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAを、SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)で可視化した(図8A参照)。
第1ストランド合成は、Vulcano2G DNAポリメラーゼを用いて20uL反応で行った:
4uL:5倍Vulcano2G緩衝液
0.4uL:Vulcano2Gポリメラーゼ
0.5uL:dNTP(10uM)
0.4uL:捕捉RTプライマー(10uM)
4uL:連結鋳型
H20添加20uL
サーモサイクラで以下のプログラムを用いる:
95℃;3分、10回(55℃;5分、72℃;1分)、その後4℃で保持。
16uLの連結混合物を各チューブに添加した:
20uL毎の反応:(2uL T4連結緩衝液、6uL PEG、6uL H2O、2uL T4リガーゼ)。連結:2回(4℃;2分、16℃;2時間、22℃5分)、75℃;10分、その後4℃で保持。
連結された第1ストランド合成のPCR増幅を、NGS_PCR_プライマー1及び2を用いてPhusion DNAポリメラーゼで行った。これらのプライマーは、イルミナTruSeq NGSプロトコルと互換性のある5’オーバーハングを含む。
4つの反応を同じ濃度に標準化し、一緒にプールして、10nMのNGSライブラリを作製した。phiX対照混合物をこの試料にスパイクし、全分子の20%の最終濃度にして、続くイルミン(illumine)シーケンシングのための配列変動を得た。NGSライブラリは、イルミナのMiniSeq System用のDenature and Dilute Library Guideに従って調製した。ライブラリを、MID出力カセットを用いてIllumina miniSeqシステム上で配列決定した。シーケンシングは、151サイクルを実行するインデックスなしで、読取1のみを使用するfastqファイルを生成するように設定した。
生成されたfastqファイルは、CLC Genomics Workbench 10 software(Qiagen)にインポートした。読取りは、4つの捕捉プローブ1などに組み込まれたバーコードに従って分離され、捕捉プローブ1からの残りの読取りは、読取りの5’末端からトリミングされた。その後、捕捉プローブ2に由来する配列は、捕捉プローブ1と2との間に挿入された配列のみを残して、3’末端からトリミングされた。次に、awkコマンドラインを使用して、18未満の全読取りをトリミングし、最後に、18bpより長いal読取りを、シーケンシング読取りの3末端から塩基を除去することによって、18bpにトリミングした。特有の読取りの数を定量化した。最多読取りの上位10を図8のパネルB〜パネルEに示す。図8において、読取りは、元のLNAオリゴを5’−>3’の様式で読み取るために、逆相補されている。
ここでは、QCのため5’末端でGalNAcと複合した完全ホスホロチオエート化LNAオリゴのシーケンシングが可能であることが示される。
2uLオリゴ1を、2uL捕捉プローブ1インデックス3(10uM)と混合した。
16uLの連結混合物をチューブに添加した:
20uL毎の反応:(2uL T4連結緩衝液、6uL PEG、6uL H2O、2uL T4リガーゼ)。連結:2回(4℃;2分、16℃;20分、22℃5分、30℃1分)、75℃;10分、その後4℃で保持。
上記の反応に、等量の2倍Novex(登録商標)TBE−Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を加え、試料を95℃で2分間熱変性させ、氷上に置いた。調製した15μlの試料を、Novex(登録商標)TBE−Urea Gels、15%、15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAを、SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)で可視化した。
第1ストランド合成は、Vulcano2G DNAポリメラーゼを用いて20uL反応で行った:
4uL:5倍Vulcano2G緩衝液
0.4uL:Vulcano2Gポリメラーゼ
0.5uL:dNTP(10uM)
0.4uL:捕捉RTプライマー(10uM)
4uL:連結鋳型
H20添加20uL
サーモサイクラで以下のプログラムを用いる:
95℃;3分、10回(55℃;5分、72℃;1分)、その後4℃で保持。
16uLの連結混合物を各チューブに添加した:
20uL毎の反応:(2uL T4連結緩衝液、6uL PEG、6uL H2O、2uL T4リガーゼ)。連結:2回(4℃;2分、16℃;2時間、22℃5分)、75℃;10分、その後4℃で保持。
PCRサイクル:98℃;30秒、15回(98℃;15秒、60℃;20秒、72℃;20秒)、72 5分、その後4℃で保持。
反応を10nMに標準化し、異なるバーコード化システムを含む別のNGSライブラリでプールして、10nM NGSライブラリを作成した。この単一反応は、全NGSライブラリのおよそ10%を構成した。NGSライブラリは、イルミナのMiniSeq System用のDenature and Dilute Library Guideに従って調製した。ライブラリを、MID出力カセットを用いてIllumina miniSeqシステム上で配列決定した。シーケンシングは、151サイクルを実行するインデックスなしで、読取1のみを使用するfastqファイルを生成するように設定した。
生成されたfastqファイルは、CLC Genomics Workbench 10 software(Qiagen)にインポートした。捕捉プローブ1インデックス1に由来する読取りを単離して、捕捉プローブ1由来の残りの読取りは、読取りの5’末端からトリミングした。その後、捕捉プローブ2に由来する配列は、捕捉プローブ1と2との間に挿入された配列のみを残して、3’末端からトリミングされた。次に、awkコマンドラインを使用して、15未満の全読取りをトリミングし、最後に、15bpより長いal読取りを、シーケンシング読取りの3末端から塩基を除去することによって、15bpにトリミングした。特有の読取りの数を定量化した。最多読取りの上位5を図9に示す。図9において、読取りは、元のLNAオリゴを5’−>3’の様式で読み取るために、逆相補されている。
Crouzierらは、Superscript III逆転写酵素(RT)(Thermos Scientific)は、RNAストランドを逆転写する際に、LNAヌクレオチド(LNA−T及びLNA−A)を読み取る能力を有することを記載している。著者らは、SuperScript III RTが、RNA鋳型を読み取る際、非連続的なLNA−T及びLNA−Aを組み込むことができることを示している。著者らはまた、Superscript III RTが、2つのLNA A及び2つのLNA T(非連続)を含むRNA鋳型を、正常なdNTPのみを用いて逆転写できることも示している(Crouzierら(2012年)、図3パネルCレーン2)。
全ての反応が含まれ(1uL LTT1(31pM)、0.5uL DCP1_プライマー1(1uM)、水10uLを加えた。酵素は、販売業者から提供された緩衝液を用いて実行した。
b)2uL 5倍第1ストランド緩衝液、1uL MgCL2(50mM)、0.75uL DTT(100mM)、0.75uL dNTP(10mM)、0.5 SuperScript III逆転写酵素
c)2uL 5倍Vulcano2G緩衝液、1uL dNTP(10mM)
d)2uL 5倍Vulcano2G緩衝液、1uL dNTP(10mM)、0.2uL Vulcano2G
b)5分50℃、4℃で保持。
c)サイクル(5分50℃、30秒98℃)を3回、その後4℃で保持。
d)サイクル(5分50℃、30秒98℃)を5回、その後4℃で保持。
図10のパネルAは、1×45分の第1ストランド合成反応で実施される、EvaGreen ddPCR反応における液滴の蛍光強度を示す。LTT1の第1ストランドのコピーを作成するSuperScript III RT能力の徴候は見られず、酵素を用いない反応でも同じ数の陽性液滴が見られた。検出されたコピーの定量化は図10パネルBに示されており、これは、LTT1鋳型の第1ストランドのコピーを作製するVulcano2Gのはるかに優れた能力を示している。図10パネルCは、第1ストランド合成の1、3、又は5回で行われた反応で実施されたEvaGreen ddPCR反応における、液滴の蛍光強度を示す。ストランド合成反応.検出されたコピーの定量化は図10パネルDに示されており、これは、Vulcano2Gが、その熱安定性のために数回の第1ストランド合成反応を実施することができ、LNA含有分子の検出を増加させるために使用することができることを示す。ここでもまた、Superscript III RTがLTT1鋳型を逆転写できるという兆候は見られなかった。
Crouzierら(2012年)、「Efficient Reverse Transcription Using Locked Nucleic Acid Nucleotides towards the Evolution of Nuclease Resistant RNA Aptamers.」 PLoS ONE(2012年4月)、第7巻、第4号、第e35990頁
バーコードを含むDNA/PSオリゴヌクレオチドに複合された種々の化学的部分のライブラリが、シーケンシングを用いて単一動物でのそれらの肝濃縮について調べることができるという原理の証明を示すデータ。データは、GalNAc複合オリゴヌクレオチド(配列番号22)が裸のオリゴ(配列番号35)と比較して、皮下注射から4時間後に肝臓で濃縮されることを、原理の証明として示している。データはまた、配列番号26が、裸のオリゴである配列番号37と比較して、皮下注射から4時間後に肝臓で濃縮されることも同定する。各オリゴ(下の表)の5μM溶液を、0.25mL/マウスの用量でC57BL/6Jマウス(n=3)に皮下注射し、注射の4時間後に肝臓を採取した。
バーコードを含むDNA/PSオリゴヌクレオチドに複合された種々の化学的部分のライブラリが、シーケンシングを用いて単一動物でのそれらの血漿保持について調べることができるという原理の証明を示すデータ。オリゴヌクレオチドに複合されたパルミチン酸アルブミン結合C16が皮下注射の4時間後に血漿中に濃縮されることを原理の証明として示す、データ。データはまた、GalNAc複合オリゴヌクレオチドが、裸のオリゴヌクレオチドと比較して循環から除去されることを同定する。
バーコードを含むオリゴヌクレオチドを含有するLNA/DNA/PSに複合した種々の化学部分のライブラリが、シーケンシングを用いて単一動物での複数の組織における組織送達特性について調べられることを示す、データ。データはまた、コレステロール複合(配列番号49及び50)及びトコフェロール複合オリゴヌクレオチド(配列番号60及び61)が肝臓に豊富であり、静脈注射から3日後に腎臓で還元されることも、同定する。データはまた、胆汁アミン複合体(配列番号51及び52)が膵臓中のオリゴヌクレオチド含量を増加させることも同定している。
Claims (44)
- 2’糖修飾ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングするための方法であって、次の工程:
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、前記修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた前記第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
続いて、以下のいずれか:
−工程(c)で得られた前記ライゲーション産物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた前記ライゲーション産物のPCR増幅を行って、前記PCR増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと
を含む、方法。 - 2’糖修飾ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングするための方法であって、次の工程:
a.捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団に存在する前記修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結することと;
b.前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介5’−3’第1ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた前記第1ストランド合成生成物の3’末端に連結することと;
続いて、以下のいずれか:
−工程(c)で得られた前記ライゲーション産物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと;又は、
−工程(c)で得られた前記ライゲーション産物のPCR増幅を行って、前記PCR増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと
を含む、方法。 - 前記捕捉プローブが第1プライマー結合部位を含み、第1ストランド合成の前に、第1プライマーが第1ストランド合成の開始のため前記捕捉プローブにハイブリダイズされる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記捕捉プローブが、自己プライミング捕捉プローブである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記捕捉プローブ及び前記アダプタープローブが、クローン増幅プライマー結合部位を含み、前記シーケンシング工程が、工程cで得られた前記ライゲーション産物又は前記PCR増幅生成物のクローン増幅を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR増幅工程が、一対のPCRプライマーを用いて実施され、一方は前記捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は前記アダプタープローブに特異的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR増幅プライマーがクローン増幅プライマー結合部位を含み、前記プライマーベースのシーケンシング工程が前記PCR増幅生成物のクローン増幅を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記クローン増幅プライマーが前記第1及び第2PCRプライマーに特異的である;又は、
前記クローン増幅プライマーが前記3’捕捉プローブ及びアダプタープローブに特異的である;又は、
一方の前記クローン増幅プライマーが前記PCRプライマーの一方に特異的であり、他方のクローン増幅プライマーが3’捕捉プローブ若しくはアダプタープローブのいずれかにそれぞれ特異的である、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プライマーベースのシーケンシング工程が、合成法によるシーケンシングを用いて実施される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーベースのシーケンシング方法が、循環可逆的終結法(cyclic reversible termination method:CRT)である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シーケンシング工程がクローン増幅を含み、前記クローン増幅プライマーが、固体支持体、例えばフローセルに結合されるか、又はエマルション滴内に区画化される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーベースのシーケンシング工程の前記PCR工程が、
a. 固相ブリッジ増幅などの固相増幅、又は
b. 液滴PCRなどのエマルション相増幅
のいずれかを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プライマーベースのシーケンシングが、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシングを用いて行われる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1ストランド合成が、ポリメラーゼ及びポリエチレングリコール又はプロピレングリコールの存在下において行われる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 第1ストランド合成に使用される前記ポリメラーゼが、Taqポリメラーゼ若しくはVolcano2Gポリメラーゼ若しくはPrimeScript逆転写酵素、又はTaqポリメラーゼと少なくとも70%の同一性を有する有効なポリメラーゼである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、LNAホスホロチオエート又は2’−O−MOEホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2つの近接する2’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの2’−O−メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2つの近接する2’−O−メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に位置する少なくとも2つ又は少なくとも3つの近接する2’−O−メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドなどの、前記修飾オリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも1つの2’−O−メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2つの近接するLNAヌクレオチド又は少なくとも3つの近接するLNAヌクレオチドを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記LNAオリゴヌクレオチドの3’末端に位置する少なくとも2つのLNAヌクレオチドなどの、少なくとも1つのLNAヌクレオチドを含む、請求項1〜22に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、LNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、LNAギャップマー(gapmer)又はLNAミクスマー(mixmer)などのLNAヌクレオシド及びDNAヌクレオシドの両方を含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、LNA−Tヌクレオシドなどの少なくとも1つの2’糖修飾Tヌクレオシド、又はLNA−Cヌクレオシドなどの少なくとも1つの2’糖修飾Cヌクレオシドを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、1つ以上のLNAヌクレオシド、及び1つ以上の2’−O−メトキシエチルヌクレオシドなどの1つ以上の2’置換ヌクレオシドを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、2’−O−メトキシエチルギャップマー、混合ウィング(mixed wing)ギャップマー、交互フランク(alternating flank)ギャップマー、又はLNAギャップマーからなる群より選択される、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、ミクスマー又はトータルマー(totalmer)である、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、GalNAc複合体などの複合基(conjugate group)を含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば単一のオリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールにおいて、純度又は非均一性の程度を決定するための方法である、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば修飾オリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールに存在する、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記配列又は優勢な配列を決定するための方法である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば同じオリゴヌクレオチド合成操作(若しくはバッチ)又はオリゴヌクレオチド合成操作(若しくはバッチ)のプールからの、修飾オリゴヌクレオチドの集団である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列をシーケンシングするための、プライマーベースのシーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の非均一性を決定するための、プライマーベースのシーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の質を決定するための、プライマーベースのシーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列をシーケンシングするための、並列シーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の質を決定するための、並列シーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の非均一性を決定するための、並列シーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列をシーケンシングするための、合成シーケンシングによるシーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の非均一性を決定するための、合成によるシーケンシングの使用。
- 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の質を決定するための、合成によるシーケンシングの使用。
- 前記2’糖修飾オリゴヌクレオチドが、請求項1〜33のいずれか一項に記載のものである、請求項34〜42のいずれか一項に記載の使用。
- LNA修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む鋳型からの第1ストランド合成のための、配列番号1と少なくとも70%の同一性を有するTaqポリメラーゼ又はポリメラーゼ酵素の使用。
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