KR20220125170A - 인공 염기 화합물, 이를 포함하는 핵산 및 이의 용도, 및 핵산 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인공 염기 화합물, 이를 포함하는 핵산 및 이의 용도, 및 핵산 제조 방법에 관한 것으로, 자연에 존재하는 DNA 또는 RNA의 유전자 코드를 확장하여 진단 약물로 사용 가능하며, 단백질의 기능을 확장하여 진단 및 치료약물의 개발에 사용될 수 있다. 또한, 확장된 인공 염기쌍은 세포에 도입하여 세포를 이용한 에너지 자원 물질 또는 치료 약물 개발에 효과적으로 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 인공 염기 화합물, 이를 포함하는 핵산 및 이의 용도, 및 핵산 제조 방법에 관한 것이다.
자연에서의 유전자는 20개의 아미노산에 의해 61개의 유전자 코드만 사용하게끔 제한된다. 와슨(Watson)과 크릭(Crick)에 의해 DNA의 염기 결합이 규명된 후 자연의 유전 염기쌍은 아데닌(adenine, A), 티민(thymine, T) , 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C) 4가지의 유전염기를 이용한 A-T, G-C 2가지의 염기쌍을 형성한다.
그러나 최근의 바이오테크놀로지의 발전으로 다양한 필요성에 의해 자연의 A-T, G-C 유전 염기쌍 외에 새로운 인공 염기쌍의 개발이 요구되고 있다.
새로운 유전 염기쌍이 될 수 있는 물질은 자연에 존재하는 바이오 물질 즉 DNA와 RNA의 유전 코드를 확장할 수 있고, 단백질(protein)의 기능을 확장할 수 있으며, 확장된 유전자 코드를 함유한 세포를 이용하여 에너지 자원의 개발 및 치료약물을 개발하는 데 주요한 물질로 사용이 가능하다.
인공 유전자(합성 유전자)에 대한 연구는 수소결합의 패턴을 바꾼 형태의 연구부터 시작되었으며, 이후 수소 결합과 염기 모양의 상보성을 이용한 연구 그리고 최근에는 모양 상보성만을 이용한 연구가 진행되고 있다. 최근, 수소결합 패턴을 이용하고 인공 유전자 염기가 개발된 것으로 보고되었다. 한편, 수소 결합과 모양 상보성 기반의 연구 또는 모양 상보성 기반의 연구에 따른 인공 유전자 개발이 수행되고 있다. 그 외에도, DNA의 벡본(backbone)과 당(sugar) 부분의 변형을 통한 연구가 진행되고 있으며, 이중의 일부는 아주 제한적이나마 유전자 진단 및 치료제의 개발에 이용되고 있다.
이에, 본 발명자들은 새로운 인공 염기 화합물을 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다:
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 중수소가 삼중수소로 치환된 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물 및 화학식 2로 표시되는 화합물; 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물이 상보적인 결합을 형성하고 있는 핵산을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 유전자 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 주형 핵산 서열; 및 상기 화합물과 상보적인 결합을 하는 하나 이상의 화합물을 포함하는 시료로 상기 주형 핵산 서열의 전사, 역전사 및 복제로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나의 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산 제조 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
본 발명의 일 양상은 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
본 발명의 화합물은 자연에 존재하는 DNA 및 RNA의 유전자 코드를 확장할 수 있고, 단백질의 기능을 확장할 수 있으며, 확장된 유전자 코드를 이용하여 다양한 유전자 분자 진단 또는 확장된 압타머 약물의 개발이 가능할 뿐만 아니라, 확장된 유전자 염기쌍을 세포에 도입하여 세포를 이용한 에너지 자원물질의 개발, 및 확장된 유전자 염기쌍을 세포에 도입하여 세포를 이용한 치료약물을 개발하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물인 dDMSTP 및 화학식 3으로 표시되는 화합물인 DMSTP는 티엔아미드(Thienamide)기를 포함하고, 한편, 본 발명의 화학식 2로 표시되는 화합물인 dDMNTP 및 화학식 4로 표시되는 화합물인 DMNTP는 나프틸기(naphthyl)를 포함하므로, 높은 선택성 및 fidelity로 dDMSTP는 dDMNTP와 상보적인 결합에 의해 염기쌍을 형성할 수 있고, DMSTP는 DMNTP와 상보적인 결합에 의해 염기쌍을 형성할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 화합물의 중수소가 삼중수소로 치환된 화합물을 제공한다.
화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물의 중수소(deutrium, D)는 삼중수소(tritium, T)로 치환되더라도, 천연 염기들과의 불완전한 미스매치에 의한 염기쌍간 구별될 수 있는 높은 fidelity를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것이고, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 화학식 4로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것일 수 있다.
따라서, 화학식 1로 표시되는 화합물인 dDMSTP는 화학식 2로 표시되는 화합물인 dDMNTP과 함께 인공 염기쌍을 이루어 DNA 유전자 합성 등에 활용될 수 있으며, 화학식 3으로 표시되는 화합물인 DMSTP는 화학식 4로 표시되는 화합물인 DMNTP과 함께 RNA 합성에 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 1로 표시되는 화합물 및 화학식 2로 표시되는 화합물; 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물이 상보적인 결합을 형성하고 있는 핵산을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하고, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 화학식 4로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하므로, 상보적인 결합을 하는 각 화합물은 서로 다른 2개의 핵산 상에 존재하여 상보적인 결합에 의해 염기쌍을 형성함으로써 이중가닥(double strand)을 형성할 수 있다. 또는 상보적인 결합을 하는 각 화합물은 동일한 단일의 핵산 상에 존재할 수 있고, 이 경우, 단일가닥 내에서 염기쌍이 형성됨으로써 단일가닥 중 일부에 루프구조가 형성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명의 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물 중 하나 이상의 화합물이 도입된 핵산은, DNA 또는 RNA일 수 있고, 예를 들어, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 앱타머일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA란, 어떤 특정한 유전자의 발현을 억제하는 DNA 또는 RNA를 말하며, 표적으로 하는 유전자서열(sense strand)의 전체 길이 또는 부분 서열에 대해서 상보적인 서열로 구성되어, 인위적으로 유전자발현을 조절하는 방법에 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA는 비천연형 염기를 포함하기 때문에 표적에 대한 상보성이 천연형 염기만을 사용했을 경우와 비교하여 상이할 수 있다. 리보자임은 RNA를 구성성분으로 하는 촉매의 총칭을 말하고, 앱타머(aptamer)는 안정된 삼차구조를 유지하면서 특정 분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 핵산을 말한다.
본 발명의 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물 중 하나 이상의 화합물이 도입된 핵산은, 단백질, 펩타이드의 전체 또는 일부를 암호화하는 것일 수 있으며, 유전자 단편이나 프로브 등으로 사용될 수 있다.
본 발명의 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물 중 하나 이상의 화합물이 도입된 핵산은, RNA간섭(RNA interference, RNAi)에 있어서도 이용되는 것일 수 있다. RNA 간섭은, 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의해서 그 서열 특이적으로 mRNA가 분해되고, 그 결과 유전자의 발현이 억제되는 현상이다. RNA 간섭의 전형적인 예로서는, dsRNA는, RNaseIII 패밀리에 속하는 다이서(Dicer)에 의해, 3'말단측에 2염기 정도의 오버행을 가지는 약 21염기~23염기의 siRNA(short interfering RNA)에 프로세싱된다. siRNA는 RISC로 불리는 siRNA-단백질 복합체에 취입되어, 서열특이적으로 mRNA를 분해한다. RNA 간섭은, 포유동물(인간, 마우스 등), 선충, 식물, 초파리, 균류 등의 광범위한 생물종간에 보존되어 있는 현상인 것으로 나타나고 있다. 본 발명의 핵산은, RNA 간섭에 있어서의 siRNA로서, 또는 분해 대상인 mRNA의 일부로 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 핵산을 포함하는 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
예를 들어, 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이 도입된 본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA 기반의 치료, 진단 및 분자생물학적 기술 분야에 이용되는 프로브에 사용되어 그 기능을 향상시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 핵산은 시료 핵산 내의 표적 뉴클레오타이드 서열 내의 돌연변이 또는 단일염기다형성 및 종(species)을 검출하여 대상 유전자를 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 주형 핵산 서열; 및 상기 화합물과 상보적인 결합을 하는 하나 이상의 화합물을 포함하는 시료로 상기 주형 핵산 서열의 전사, 역전사 및 복제로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나의 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산 제조 방법을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
본 발명의 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 핵산은, 선택된 핵산과 상보적 결합에 의해 염기쌍을 형성할 수 있는 화합물이 포함된 시료의 사용에 따른 복제, 전사 또는 역전사 반응에 의해, DNA 또는 RNA 등의 핵산 내에서 염기쌍을 형성할 수 있다. 예를 들어, 화학식 1로 표시되는 화합물인 dDMSTP를 포함하는 DNA를 주형으로, dNTP와 함께 dDMNTP를 더 포함하는 PCR 시료를 사용하여 증폭 반응을 수행할 경우, 증폭된 DNA 내에서 dDMSTP와 dDMNTP는 염기쌍을 형성한다.
본 발명의 복제, 전사 또는 역전사 반응은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 전사는 T7 RNA 폴리머라제(Takara 등), 복제는 클레노우프레그먼트(KF), 역전사는 AMV Reverse Transcriptase XL(AMV-RT)(Life Science사)와 같은 방법에 따라 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 상보적인 결합을 하는 하나 이상의 화합물은 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것이고, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 화학식 4로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것일 수 있다.
인공 염기 화합물, 이를 포함하는 핵산 및 이의 용도, 및 핵산 제조 방법에 따르면, 자연에 존재하는 DNA 또는 RNA의 유전자 코드를 확장하여 진단 약물로 사용 가능하며, 단백질의 기능을 확장하여 진단 및 치료약물의 개발에 사용될 수 있다. 또한, 확장된 인공 염기쌍은 세포에 도입하여 세포를 이용한 에너지 자원 물질 또는 치료 약물 개발에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 dDMNTP와 dDMSTP의 인공 염기쌍의 유전자 증폭 반응을 나타낸 모식도이다.
도 2는 dNTP만을 사용하거나(a), dNTP와 함께 dDMNTP 및/또는 dDMSTP의 인공 염기쌍을 이용한(b) PCR 증폭 산물을 확인한 전기영동 결과이다.
도 3은 다양한 비율의 natural template에서 PCR과 시퀀싱을 통한 dDMNTP 및 dDMSTP 인공 염기쌍의 유전자 증폭을 확인한 결과이다.
도 4는 natural template에 대한 R/L(인공 염기쌍 이후의 시퀀싱 결과/인공 염기쌍 이전의 시퀀싱 결과) 비율 나타낸 그래프이다.
도 2는 dNTP만을 사용하거나(a), dNTP와 함께 dDMNTP 및/또는 dDMSTP의 인공 염기쌍을 이용한(b) PCR 증폭 산물을 확인한 전기영동 결과이다.
도 3은 다양한 비율의 natural template에서 PCR과 시퀀싱을 통한 dDMNTP 및 dDMSTP 인공 염기쌍의 유전자 증폭을 확인한 결과이다.
도 4는 natural template에 대한 R/L(인공 염기쌍 이후의 시퀀싱 결과/인공 염기쌍 이전의 시퀀싱 결과) 비율 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. DNA 인공 염기쌍 물질의 제조
DNA의 인공 염기쌍으로 사용될 수 있는 염기 물질인 dDMSTP 및 dDMNTP를 합성하였다. dDMSTP 및 dDMNTP의 화학구조식은 표 1과 같고, 각 화합물의 합성 방법은 각각 <1-1> 및 <1-2>에 나타낸 바와 같다.
| 명칭 | 화학구조식 | 화학식 |
| dDMSTP |
 |
화학식 1 |
| dDMNTP |
 |
화학식 2 |
<1-1> dDMSTP의 합성 방법
DNA의 인공 염기쌍으로 사용될 수 있는 염기 물질 중 하나인 dDMSTP의 제조 방법은 아래와 같다.
나프틸기(naphthyl)를 포함하는 dDMNTP와 염기쌍을 형성할 수 있도록, 우선 반응식 1에 따라 티엔아미드(Thienamide)기를 포함하는 화학식 1a로 표시되는 중간화합물을 제조하였다. 한편, DNA 중합효소에 의해 인식되는 완벽한 변형염기쌍과 다른 자연의 염기들과의 불완전한 미스 매치에 의한 염기쌍간 구별될 수 있도록 fidelity를 조절하기 위해 티엔아미드기를 포함하는 방향족 화합물이 붙은 염기에 CD3를 도입하였으며, 중수소(deutrium) 외에도 삼중수소(tritium)가 사용 가능하다.
[반응식 1]
그 후, 반응식 2에 따라 화학식 1a를 베타(b) 위치에서 글리코시드(glycoside)결합을 통하여 2-디옥시리보오스(deoxyribos)와 결합시켜 화학식 1b로 표시되는 중간 화합물을 제조한 다음, DNA 중합효소에 의해 DNA에 도입될 수 있도록 트리포스페이트(Triphosphate) 작용기를 도입하여, 최종적으로 화학식 1로 표시되는 dDMSTP를 합성하였다.
[반응식 2]
<1-2> dDMNTP의 합성 방법
DNA의 인공 염기쌍으로 사용될 수 있는 염기 물질 중 하나인 dDMNTP의 제조 방법은 아래와 같다.
티엔아미드(Thienamide)기를 포함하는 dDMSTP와 염기쌍을 형성할 수 있도록, 우선 반응식 3에 따라 나프틸기(naphthyl)기를 포함하는 화학식 2a로 표시되는 중간화합물을 제조하였다. 한편, DNA 중합효소에 의해 인식되는 완벽한 변형염기쌍과 다른 자연의 염기들과의 불완전한 미스 매치에 의한 염기쌍간 구별될 수 있도록 fidelity를 조절하기 위해 티엔아미드기를 포함하는 방향족 화합물이 붙은 염기에 CD3를 도입하였으며, 중수소(deutrium) 외에도 삼중수소(tritium)가 사용 가능하다.
[반응식 3]
그 후, 반응식 4에 따라 화학식 2a를 베타(b) 위치에서 글리코시드(glycoside)결합을 통하여 2-디옥시리보오스(deoxyribos)와 결합시켜 화학식 2b로 표시되는 중간 화합물을 제조한 다음, 반응식 5에 따라 DNA 중합효소에 의해 DNA에 도입될 수 있도록 트리포스페이트(Triphosphate) 작용기를 도입하여, 최종적으로 화학식 2로 표시되는 dDMNTP를 합성하였다.
[반응식 4]
[반응식 5]
실시예 2. RNA 인공 염기쌍 물질의 제조
RNA의 인공 염기쌍으로 사용될 수 있는 염기 물질인 DMSTP 및 DMNTP를 합성하였다. DMSTP 및 DMNTP의 화학구조식은 표 2와 같고, 각 화합물의 합성 방법은 각각 <2-1> 및 <2-2>에 나타낸 바와 같다.
| 명칭 | 화학구조식 | 화학식 |
| DMSTP |
 |
화학식 3 |
| DMNTP |
 |
화학식 4 |
<2-1> DMSTP의 합성 방법
RNA의 인공 염기쌍으로 사용될 수 있는 염기 물질 중 하나인 DMSTP의 제조 방법은 아래와 같다.
반응식 6에 따라 화학식 1a를 베타(b) 위치에서 글리코시드(glycoside)결합을 통하여 2-리보오스(deoxyribos)와 결합시켜 화학식 3a로 표시되는 중간 화합물을 제조한 다음, 트리포스페이트(Triphosphate) 작용기를 도입하여, 최종적으로 화학식 3으로 표시되는 DMSTP를 합성하였다.
[반응식 6]
<2-2> DMNTP의 합성 방법
RNA의 인공 염기쌍으로 사용될 수 있는 염기 물질 중 하나인 DMNTP의 제조 방법은 아래와 같다.
반응식 7에 따라 화학식 2a를 베타(b) 위치에서 글리코시드(glycoside)결합을 통하여 2-리보오스(deoxyribos)와 결합시켜 화학식 4a로 표시되는 중간 화합물을 제조한 다음, 반응식 8에 따라 트리포스페이트(Triphosphate) 작용기를 도입하여, 최종적으로 화학식 4로 표시되는 DMNTP를 합성하였다.
[반응식 7]
[반응식 8]
실험예 1. dDMNTP와 dDMSTP의 선택적 염기쌍 형성 효과 확인
dDMNTP와 dDMSTP가 선택적으로 염기쌍을 이루는지 여부를 PCR(polymerase chain reaction)을 통하여 확인하였다(도 1).
구체적으로, PCR 증폭 반응을 위한 시료 22㎕를 다음과 같이 준비하였다. 즉, 상보적인 위치에 인공염기가 도입된 두 개의 주형 서열 D2(A)(인공염기 dDMN이 도입된 주형) 및 D2(B)(인공 염기 dDMS 가 도입된 주형)(2㎕, 1pmole/㎕), 프라이머 P1 및 P2(2㎕, 10pmole/㎕)를 사용하였고(표 3), PCR 마스터 믹스(Taq DNA 중합효소(0.05U/㎕), 반응 완충액, 4mM MgCl2, dNTP 각 0.4mM) 10㎕를 사용하였으며, dDMNTP와 dDMSTP를 각각 2㎕, 0.4 mM/㎕를 사용하였고, 나머지는 dH2O를 첨가하여 반응을 진행하였다. PCR은 94℃에서 30초 denaturation, 48℃에서 30초 anneling, 65℃에서 8분 extension의 사이클을 14회 반복하여 수행하였다.
| 프라이머명 | 핵산서열(5'→3') | 서열번호 |
| Primer 1 | CACACAGGAAACAGCTATGAC | 서열번호 1 |
| Primer 2 | GAAATTAATACGACTCACTATAGG | 서열번호 2 |
| D2(A) | GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCTCCAAGAAGCCGGTCCCCATCAC(dDMN)AGTGCAACCGC | 서열번호 3 |
| D2(B) | TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCCGGGTTATTACATGCGCTGGCACTTGCCCGTACGGCGGTTGCACT(dDMS)GTGATGGGG | 서열번호 4 |
PCR 반응이 완료된 후 5㎕의 반응용액을 분취하여 2% 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동을 수행하여 DNA 증폭여부를 확인하였다. 반응 혼합물(5㎕)을 10x 로딩 완충액(5㎕)과 혼합하고 각 웰에 로딩한 후 진행하였다. 1x TBE 완충액(89mM Tris, 89mM 붕산염, 2mM EDTA, pH8.3)에서 90 내지 180분 동안 95/80V의 일정한 전위와 3mA의 전류에서 전기영동을 수행한 후, 젤 이미지 시스템 (ChemiDoc MP 이미징 시스템(Bio-Rad))을 이용하여 분석하였다.
그 결과, D2A와 D2B 주형을 이용한 DNA증폭에서 0.4mM dNTP만 도입하거나 또는 각 하나의 변형 뉴클레오티드(dDMNTP 및 dDMSTP)만 도입한 경우 DNA 증폭 산물은 전혀 검출되지 않거나 매우 소량만이 검출된 반면, dNTP와 함께 dDMNTP 및 dDMSTP를 모두 사용한 시료에서는 많은 양의 증폭 산물이 확인되었다(도 2).
이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 dDMNTP 및 dDMSTP는 상보적인 결합에 의하여 선택적으로 염기쌍을 형성할 수 있음이 확인되었다.
실험예 2. DNA 시퀀싱에 따른 dDMNTP와 dDMSTP의 높은 선택성 및 fidelity 확인
DNA 시퀀싱 실험을 통하여 dDMNTP 및 dDMSTP 염기쌍간의 높은 선택성 및 fidelity(DNA 합성의 정확도)를 확인하였다.
구체적으로, 사이클 시퀀싱 반응(20㎕)은 9800 Fast Thermal Cycler(Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였으며, 10fmol(1ng) 템플릿(D2(A) 및 D2(B), 표 3)와 6pmol 프라이머(primer long 1 및 primer long 2)(표 4)를 넣고 BigDye Terminator v3.1 사이클 시퀀싱 키트의 사이클 시퀀싱 믹스(0.5㎕)를 함께 넣어 진행하였다. 그 후, 98℃에서 10초 denaturation, 50℃에서 50초 anneling, 60℃에서 2.5분 extension의 사이클을 25회 반복하여 PCR을 수행한 다음, 잔류 염료 종결자를 제거하였다.
| 프라이머명 | 핵산서열(5'→3') | 서열번호 |
| Primer long 1 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACACAGGAAACAGCTATGAC | 서열번호 5 |
| Primer long 2 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATTAATACGACTCACTATAGG | 서열번호 6 |
| D1(A, Nat) | GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCTCCAAGAAGCCGGTCCCCATCACAAGTGCAACCGC | 서열번호 7 |
| D1(B, Nat) | TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCCGGGTTATTACATGCGCTGGCACTTGCCCGT ACGGCGGTTGCACTTGTGATGGGG | 서열번호 8 |
3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems)를 이용하여 시퀀싱하였고, Applied Biosystems Data Collection 소프트웨어 v3.0을 사용하여 시퀀싱 데이터를 분석하였다. 주형 서열(D2(A) 및 D2(B)), 및 6pmol 프라이머 primer long 1 과 primer long 2를 각각 따로 넣고 여기에 dNTP를 넣어 시퀀싱 하였다. 또한, 템플릿D2(A)와 D2(B)에 천연 주형 서열(natural template)인 D1(A) 및 D1(B)(표 4)의 첨가량을 증가 시켜가면서 시퀀싱을 시도하였다.
그 결과, 주형 서열 D2(A) 및 D2(B)에 대해 primer long 1과 primer long 2 각각 사용하여 시퀀싱한 경우, 인공염기 dDMN 및 dDMS이 있는 부분에서 시퀀싱이 멈춘 것으로 확인되었으며(도 3 화살표), 이는 dNTP가 dDMN 및 dDMS를 인지하지 못하기 때문인 것으로 확인되었다. 반면, 천연 주형 서열 D1(A) 및 D1(B)의 양을 늘려가면서 시퀀싱을 한 경우, dDMN 및 dDMS가 도입된 다음의 서열에서도 점차적으로 시퀀싱이 수행되었으며, 천연 주형 서열 100%에서는 완벽한 시퀀싱 결과가 확인되었다.
또한, dDMNTP 및 dDMSTP가 도입된 서열에 대해 dNTP만 사용하였을 때 dDMN 및 dDMS가 있는 부분까지의 시퀀싱의 결과(Left, L)와, dDMN 및 dDMS 이후의 시퀀싱의 결과(Right, R)의 비율로 인공유전문자의 fidelity를 측정하였다.
천연 주형 서열의 첨가량을 늘려가면서 R/L의 비율의 변화를 측정하고, 선형회귀선을 사용하여 확인한 결과, dDMNTP와 dDMSTP의 높은 fidelity(도 4)가 확인되었다.
이와 같은 결과를 통하여, dDMNTP와 dDMSTP는 높은 선택성과 높은 fidelity를 갖는 새로운 인공 염기쌍으로써 적용될 수 있음이 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION JEONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Artificial Base Compound, Nucleic Acid containing the same and
Uses thereof, and Method for Preparing Nucleic Acid
<130> DHP22-133
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 1
<400> 1
cacacaggaa acagctatga c 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 2
<400> 2
gaaattaata cgactcacta tagg 24
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D2(A)
<220>
<221> unsure
<222> (79)
<223> dDMN
<400> 3
gaaattaata cgactcacta tagggttaac tttaagaagg agatatacca tgggctccaa 60
gaagccggtc cccatcacna gtgcaaccgc 90
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D2(B)
<220>
<221> unsure
<222> (71)
<223> dDMS
<400> 4
tttcacacag gaaacagcta tgacccgggt tattacatgc gctggcactt gcccgtacgg 60
cggttgcact ngtgatgggg 80
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer long 1
<400> 5
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttc 60
acacaggaaa cagctatgac 80
<210> 6
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer long 2
<400> 6
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tgaaattaat acgactcact atagg 85
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D1(A, Nat)
<400> 7
gaaattaata cgactcacta tagggttaac tttaagaagg agatatacca tgggctccaa 60
gaagccggtc cccatcacaa gtgcaaccgc 90
<210> 8
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D1(B, Nat)
<400> 8
tttcacacag gaaacagcta tgacccgggt tattacatgc gctggcactt gcccgtacgg 60
cggttgcact tgtgatgggg 80
Claims (8)
- 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
- 제 1 항에 있어서, 상기 화합물의 중수소가 삼중수소로 치환된 것인 화합물.
- 제 1 항에 있어서,
화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것이고, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 화학식 4로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것인 화합물.
- 화학식 1로 표시되는 화합물 및 화학식 2로 표시되는 화합물; 또는
화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물
이 상보적인 결합을 형성하고 있는 핵산:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
- 제 4 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것인 핵산.
- 제 4 항의 핵산을 포함하는 유전자 검출용 조성물.
- 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 주형 핵산 서열; 및
상기 화합물과 상보적인 결합을 하는 하나 이상의 화합물을 포함하는 시료로 상기 주형 핵산 서열의 전사, 역전사 및 복제로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나의 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산 제조 방법:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
(상기 화학식에서 D는 중수소이다).
- 제 7 항에 있어서,
상기 상보적인 결합을 하는 하나 이상의 화합물은 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고,
화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것이고, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 화학식 4로 표시되는 화합물과 상보적인 결합을 하는 것인
핵산 제조 방법.
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| KR1020220025933A KR20220125170A (ko) | 2021-03-04 | 2022-02-28 | 인공 염기 화합물, 이를 포함하는 핵산 및 이의 용도, 및 핵산 제조 방법 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101404374B1 (ko) | 2005-12-09 | 2014-06-09 | 도꾸리쯔교세이호징 리가가쿠 겐큐소 | 핵산의 복제방법 및 신규한 인공 염기쌍 |
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2022
- 2022-02-28 KR KR1020220025933A patent/KR20220125170A/ko not_active Application Discontinuation
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| KR101404374B1 (ko) | 2005-12-09 | 2014-06-09 | 도꾸리쯔교세이호징 리가가쿠 겐큐소 | 핵산의 복제방법 및 신규한 인공 염기쌍 |
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