CN110249057A

CN110249057A - 用于空间标记和分析生物样本中的核酸的方法

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Publication number: CN110249057A
Application number: CN201780076838.0A
Authority: CN
Inventors: J·弗里森; P·斯托尔; J·伦德贝格; F·萨门; S·维奇科维奇
Original assignee: Spatial Transcriptomics AB
Current assignee: Spatial Transcriptomics AB
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2037-11-17
Also published as: WO2018091676A1; EP3541956B1; EP4148145B1; DK3541956T3; EP3541956A1; GB201619458D0; CN117965695A; DK3916108T3; EP4148145A1; EP3916108B1; EP3916108A1; CN110249057B

Abstract

本发明涉及一种用于空间标记生物样本中的核酸分子的方法，并且具体地涉及一种方法，其包括：(a)提供其上固定有多种捕获探针的固体基质，使得每种捕获所述固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应并且其中每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包含：(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，(ii)对应于捕获探针在固体基质上的位置的定位结构域，和(iii)捕获结构域；(b)使所述固体基质与生物样本接触；和(c)在允许生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从所述固体基质的表面释放所述捕获探针并且同时和/或随后使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸捕获探针以产生延伸探针，从而空间标记生物样本的核酸；其中步骤(c)包括使所述固体基质与含水反应混合物接触，所述含水反应混合物包含：(i)能够使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶；和(ii)用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具。

Description

用于空间标记和分析生物样本中的核酸的方法

技术领域

本发明总体涉及在生物样本中核酸分子的空间标记，例如，生物样本(例如组织样本)中核酸的局部或空间检测(所谓的“空间基因组学”和“空间转录组学”)。特别地，本发明涉及用于增加从每个生物样本中捕获和标记的独特核酸的数量和多样性的所述方法的改进。

背景技术

空间基因组和转录组学方法利用固定在固体基质(例如阵列)上的核酸探针来捕获来自生物样本的核酸(DNA或RNA)随后基于它们在生物样本中的位置标记所述核酸(例如用核酸“条形码”序列)(参见例如WO2012/140224，其通过引用并入本文)。随后将“标记的”核酸从固体基质中释放并分析以产生关于基因的局部化、分布和/或表达的信息，或实际上关于在生物样本(如组织样本)中任何基因组变异(不一定在基因中)的局部化或分布的信息。

举例来说，空间转录组学利用包含独特位置标签(结构域，例如条形码序列)的逆转录(RT)引物，其固定在固体基质(例如玻璃片)上，以生成“阵列”。独特的位置标签对应于阵列上RT引物的位置(阵列的特征)。将生物样本(例如组织切片)置于阵列上，并在阵列上的组织切片中进行逆转录反应。组织样品中的RNA结合与RT引物结合(或杂交)，使用该结合的RNA作为模板进行RT引物的延伸，以获得cDNA，该cDNA因此结合到阵列的表面。由于RT引物中独特的位置标签，每条cDNA链携带有关组织切片中模板RNA位置的信息。然后从阵列表面释放cDNA并进行分析(例如测序)，产生具有精确位置信息的转录组。然后可以将序列数据与组织样品中的位置匹配。例如，组织切片可以是可视化的或成像的，例如，在cDNA合成步骤之前或之后染色和拍照，以促进cDNA分子中的位置标签与组织样品内的位置的相关性，并且序列数据可以覆盖在组织样本的图像上，例如，通过使用计算机，以显示跨组织的任何感兴趣基因的表达模式。然而，可视化步骤不是必需的，因为标记的cDNA分子可以使用其他方法与组织样品中的位置相关联，例如，基于已知的组织样本中的细胞或细胞区域的表达特征，具有相同位置标签(即在阵列上的相同位置(特征))捕获的分子的独特轮廓(profile)，可以使分子与组织样品内的位置相关联。

空间转录组学和基因组学的灵敏度受到各种因素的限制，包括：(i)核酸分子与捕获探针杂交的效率；(ii)后续延伸反应的效率；(iii)阵列上捕获探针的密度，即阵列的分辨率；(iv)未与捕获探针结合的核酸分子的非特异性延伸，例如，由生物样本中的核酸(例如由生物样本的制备(例如固定组织切片)引起的片段化DNA和RNA)引发的延伸反应。这些限制意味着某些转录本可能在随后的分析中代表性不足。例如，一些转录物在低密度阵列上可能不会被捕获，因为表达它们的组织不与阵列的特征接触。对于低丰度转录物，上述限制可能特别成问题。

用于改善阵列上捕获探针密度的方法已在WO 2016/162309(通过引用并入本文)中提出，其利用流动池和珠粒阵列技术来生成具有高密度特征的“随机”阵列，即其中捕获探针的位置未预先确定的阵列。

发明内容

然而，为了克服本领域已知方法的局限性，存在改善空间转录组学和基因组学方法的灵敏度的空间。在这方面，本发明人惊奇地发现，通过将从固体基质(例如阵列)表面释放探针的步骤和使用捕获的核酸作为延伸模板延伸探针的步骤组合，例如释放和扩展步骤同时执行，可以增加由捕获探针捕获的独特核酸分子的数量和多样性。

特别地，本发明人已经发现可以将用于从固体基质表面释放捕获探针的酶(即裂解酶)与在核酸延伸步骤中使用的反应混合物组合，而基本上不损失裂解酶活性。此外，与预期相反，捕获探针的组合(例如同时)释放和延伸不会消除核酸分子的局部捕获，即生物样本中核酸的空间标记保留在本发明的方法中。此外，如下文实施例中详细讨论的，发明人有利地确定捕获探针的同时释放和延伸增加了通过本发明方法捕获的独特核酸分子的数量和多样性，从而提高了空间转录组学和基因组学方法的灵敏度。

虽然不希望受理论束缚，但假设释放和核酸合成步骤的组合可导致一些或所有捕获探针在其延伸之前的局部释放，即探针可被释放到其在阵列上的原始位置附近的局部位置。据认为，这可以通过使捕获探针(未与样品和阵列之间接触的生物样本中的核酸杂交)扩散到样本中来增强方法的灵敏度，从而增加了捕获探针与靶序列杂交的可能性。另外或可替代地，捕获探针同时的释放和延伸可以改善延伸反应，例如DNA合成反应，因为捕获探针不再受物理上的约束，即固定在固体基质上，和/或因为在生物样品和阵列表面之间形成的微反应器环境特别适合模板化核酸延伸反应。因此，一旦捕获探针(当该捕获探针仍固定在固体基质上时，其与靶序列杂交)从阵列表面释放，延伸反应可以更有效地进行。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于空间标记生物样本的核酸的方法，包括：

(a)提供固体基质，其上固定有多种捕获探针使得每种捕获探针占据该固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应，并且其中每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包括：

(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，

(ii)对应于该捕获探针在该固体基质上位置的定位结构域，和

(iii)捕获结构域；

(b)使所述固体基质与生物样品接触；并且

(c)在允许生物样本的核酸与该捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从固体基质表面释放所述捕获探针，并且同时和/或随后使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针，由此空间标记该生物样本的核酸。

本发明的方法代表了对本领域已知的空间转录组学和基因组学的其他方法的显著改进，例如，WO 2012/140224、WO 2014/060483和WO 2016/162309。本文描述的方法使得从生物样本捕获的独特转录物的数量和多样性增加，从而提供空间标记的更能代表生物样本的表达谱的转录组。此外，在本发明方法中，由于捕获探针可以在其延伸之前从阵列表面释放，因此探针不需要通过其5'末端连接至阵列上。在这方面，捕获探针可以通过其3'末端连接至阵列，并且从阵列表面释放捕获探针将暴露探针的3'末端，使得探针能够用作核酸延伸反应的引物。

如下面更详细讨论的，本发明的方法可以包括分析延伸探针的附加步骤。在这方面，显而易见的是，来自生物样本的核酸的空间标记和随后对所标记核酸的分析的组合促进了生物样本(例如组织样本)中核酸的局部检测。因此，在一个实施方案中，本发明的方法可用于确定和/或分析生物样本的所有转录组或基因组，例如，生物样本的全局转录组或基因组。然而，该方法不限于此并且包括确定和/或分析全部或部分转录组或基因组。因此，该方法可以包括确定和/或分析转录组或基因组的一部分或子集，例如，对应于基因子集的转录组，例如一组特定基因，例如与特定疾病或病症、组织类型等有关的基因。

从另一个方面来看，上述方法步骤可以被视为提供获得生物样本(例如组织样本)的空间限定的转录组或基因组，特别是空间限定的全局转录组或基因组的方法。

从另一方面来看，本发明的方法可以被视为用于在生物样本(例如组织样品)中局部或空间检测核酸(无论是DNA还是RNA)的方法，或用于在组织样品中局部或空间检测和/或分析核酸(DNA或RNA)的方法。特别地，该方法可用于组织样品中基因表达或基因组变异的定位或空间检测或确定和/或分析。该局部/空间检测/确定/分析意味着RNA或DNA可以对组织样品中细胞或组织内的其天然位置或位点进行定位。因此，例如，RNA或DNA可以定位于样品中细胞或细胞群或细胞的类型，或组织样品内的区域的特定区域。RNA或DNA的天然位置或位点(或换句话说，RNA或DNA在组织样品中的位置或位点)，例如表达的基因或基因组基因座，可以得到确定。

因此，在一些实施方案中，本发明提供用于局部检测生物样本中的核酸的方法，包括：

(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，

(ii)对应于该捕获探针在该固体基质上位置的定位结构域，和

(iii)捕获结构域；

(b)使所述固体基质与生物样品接触；并且

(c)在允许生物样本的核酸与该捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从固体基质表面释放所述捕获探针，并且同时和/或随后使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针，由此空间标记该生物样本的核酸；并且

(d)分析(c)的延伸探针，即分析该生物样本空间标记的核酸。

如下文更详细描述，可以在分析步骤(步骤(d))中使用任何核酸分析方法。通常，这可能涉及测序，即分析扩展探针的序列，但不必进行实际的序列测定。例如，可以使用序列特异性分析方法。例如，可以使用例如对定位结构域和/或特定靶序列(例如待检测的特定靶DNA(即对应于特定的cDNA/RNA或基因等))特异的引物进行序列特异性扩增反应。示例性分析方法是序列特异性PCR反应。

在步骤(d)中获得的序列分析信息可用于获得关于生物样本(例如组织样品)中的RNA或DNA的空间信息。换句话说，序列分析信息可以提供关于生物样本(例如组织样品)中RNA或DNA的位置的信息。该空间信息可以从确定的序列分析信息的性质导出，例如，它可以揭示特定RNA或DNA的存在，该特定RNA或DNA本身在所用的生物样本(例如组织样品)的背景下就具有空间信息意义和/或可以从固体基质上(如阵列)的生物标本(如组织样品)的位置结合序列信息来得到该空间信息(例如空间定位)。因此，例如借助于位置标签及其与生物样本(例如组织样品)中的位置的相关性，该方法可以包括简单地将序列分析信息与生物样本(例如组织样品)中的位置相关联。然而，在一些实施方案中，可通过将序列分析数据与生物样本(例如组织样品)的图像相关联来方便地获得空间信息。因此，在优选实施例中，该方法还包括以下步骤：

(e)将所述序列分析信息与所述生物样本的图像相关联，其中所述生物样本在步骤(c)之前或之后(即在步骤(b)之后)成像。

因此可以看出，本发明的阵列可用于捕获RNA(例如mRNA)，或生物样本(例如组织样品)的DNA，该生物样本与所述固体基质(例如阵列)接触。因此，本发明的方法可以被认为是量化组织样品中一种或多种基因的空间表达的方法。换句话说，本发明的方法可用于检测生物样本(例如组织样品)中一个或多个基因的空间表达。在另一种方式中，本发明的方法可用于同时确定一个或多个基因在生物样本(例如组织样品)内的一个或多个位置的表达。此外，该方法可以被视为具有二维空间分辨率的用于生物样本(例如组织样品)的部分或全局转录组或基因组分析的方法。

上述方法中从固体基质表面释放所述捕获探针并同时和/或随后延伸所述捕获探针的步骤(c)将被视为与组合释放和延伸反应(即组合实现捕获探针释放和所述捕获探针以靶核酸为模板的延伸的工具)相关。如上所述，该方法灵敏度的提高可能是在步骤(b)中释放未与靶序列结合的捕获探针的结果，这可能促进生物样本中其他靶核酸分子的结合。或者或另外，该方法灵敏度的提高可能是由于捕获探针-靶核酸复合物上的空间位阻的减少或特别有利于核酸延伸反应的微环境的形成，从而提高了延伸反应的效率。

因此，捕获探针的同时释放和延伸并不意味着所有捕获探针将同时释放和延伸，而意味着用于释放和延伸捕获探针的工具同时(即基本上同时)应用于固体基质(例如阵列)。

值得注意的是，如上所述，本发明的捕获探针不限于阵列上的特定取向，不同于WO2012/140224、WO2014/060483和WO2016/162309中的需要捕获探针固定在固体基质上使得它们具有能够用作延伸引物的游离3'末端的方法。在这方面，释放和延伸步骤的组合消除了对固体基质上捕获探针的特定取向的要求。然而，在一些实施方案中，优选捕获探针固定在固体基质上，使得它们具有能够用作延伸引物的游离3'末端。

此外，因为捕获探针可以在固体基质上取向，使得捕获结构域不是游离的或可用于与生物样本中的核酸分子相互作用(即结合或杂交)(即捕获探针可以通过它们的3'末端固定)，在允许(即适合或促进)生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下，不必使生物样本与固体基质接触。然而，在一些实施方案中(例如，其中捕获探针固定在固体基质上使得它们具有能够用作延伸引物的游离3'末端，例如通过其5'末端)步骤(b)可以在允许生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下进行。

因此，在捕获探针固定在固体基质上使得它们具有能够用作延伸引物的游离3'末端(例如通过它们的5'末端)的实施方案中，一些捕获探针可以在延伸前从固体基质释放，即一些捕获探针被释放并随后延伸。此外，一些捕获探针可以在它们从固体基质释放的同时延伸，即一些捕获探针同时延伸并从固体基质释放。因此，在捕获探针固定在固体基质上使得它们具有能够用作延伸引物的游离3'末端(例如通过它们的5'末端)的实施方案中，步骤(c)可以包括同时释放和延伸反应以及顺序释放和延伸反应(即捕获探针的释放和随后延伸)。特别是当在允许生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下进行步骤(b)时，尤其可以发生同时反应，即，使得一些核酸在组合的释放和延伸反应之前(即在步骤(c)之前)可以与捕获探针的捕获结构域杂交。

因此，在捕获探针固定在固体基质上使得它们不具有能够用作延伸引物的游离3'末端(例如通过它们的3'末端)的实施方案中，所有捕获探针可以在其延伸之前从固体基质释放，即释放所有捕获探针并随后延伸。因此，在捕获探针固定在固体基质上使得它们不具有能够用作延伸引物的游离3'末端(例如通过它们的3'末端)的实施方案中，尽管存在用于释放和延伸反应所需的两种组分，步骤(c)可以包括顺序释放和延伸反应，即捕获探针的释放和随后的延伸。

因此，在一些实施方案中，可以看到步骤(c)包括使所述固体基质(如阵列)同时接触：

(i)能够使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶；和

(ii)从固体基质表面释放所述捕获探针的工具。

短语“同时”意味着基本上相同的时间，即一种组分可以在另一种组分之前与固体基质接触，例如，在几秒钟内(例如在15、30、45、60、90、120或180秒内)或数分钟内(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15分钟内)，但是使得反应可以一起进行。如果一种组分在另一种组分之前与固体基质接触，则优选首先接触从固体基质表面释放捕获探针的工具，并在如上定义的数秒或数分钟内接触聚合酶。然而，在一些实施方案中，可能需要首先接触聚合酶并在如上定义的数秒或数分钟内接触用于从固体基质表面释放捕获探针的工具。

鉴于步骤(c)可以包括顺序释放和延伸反应，即捕获探针的释放和随后的延伸，显然可以通过使固体基质接触用于分别从固体基质和聚合酶的表面释放所述捕获探针的工具来实现顺序释放和延伸反应。

因此，在一些实施方案中，可以看到步骤(c)包括使所述固体基质(例如阵列)接触用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具，并随后使所述固体基质(例如阵列)接触能够使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶。

术语“随后”是指在从固体基质表面释放所述捕获探针的工具与固体基质接触后，聚合酶与固体基质接触，使得在捕获探针与其靶分子杂交后不立即发生延伸反应。对于使固体基质与释放捕获探针和聚合酶的工具接触之间可能允许的间隔时间量没有特别限制。然而，优选聚合酶在靶核酸分子(例如RNA)已经显著降解之前与固体基质接触。因此，在一些实施方案中，顺序接触聚合酶意指在使用于释放所述捕获探针的工具与固体基质接触的步骤数分钟或数小时后，使聚合酶与固体基质接触。例如，在用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或60分钟后，例如在120、90或60分钟内，即在用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具后在1-120、5-90、10-60分钟之间，聚合酶可以与固体基质接触。在一些实施方案中，在用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、24、36或48小时后，例如在72、48或24小时内，即在用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具后在1-72、6-48、12-24小时之间，聚合酶可以与固体基质接触。

在一个特别优选的实施方案中，聚合酶和用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具，例如裂解酶，组合于单一反应混合物中，其与阵列接触。因此，在一些实施方案中，步骤(c)包括使所述阵列与反应混合物(即含水反应混合物)接触，所述反应混合物包含：

(i)能够使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶；

(ii)从固体基质表面释放所述捕获探针的工具。

因此，可以看出本发明提供了反应混合物(即含水反应混合物)在用于空间标记生物样本的核酸的方法中(例如本文定义的方法)的用途，包括：

(i)能够使用与捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸捕获探针(如上定义)的聚合酶；和

(ii)从固体基质表面释放所述捕获探针的方法。

从固体基质表面释放捕获探针的步骤可以以多种方式实现。在这方面，如上所述，捕获探针包含裂解结构域以促进捕获探针的释放。因此，“用于从固体基质表面释放捕获探针的工具”包括适用于此目的的任何组分，例如，化学或酶法。如下所述，用于从固体基质表面释放捕获探针的优选方法包括在裂解结构域中酶促裂解捕获探针。在这方面，通过裂解结构域释放探针确保释放的捕获探针(包括任何延伸或部分延伸的捕获探针)包含定位结构域，其包含与阵列上捕获探针的位置有关的信息。

术语“裂解结构域”是指捕获探针内的结构域，其可以被特异性裂解以释放捕获探针(或包含定位结构域和3'到定位结构域(如果存在的话)的序列的捕获探针的一部分，即捕获结构域和延伸产物(如果存在))来自固体基质的表面。

如下所述，捕获探针可以通过任何合适的方法附着到固体基质上，例如通过化学固定，例如通过化学交联剂。因此，在一些实施方案中，捕获探针的裂解结构域是指将捕获探针附着到固体基质表面的可裂解化学交联剂。因此，在一些实施方案中，捕获结构域不形成捕获探针的核苷酸序列的一部分。例如，捕获探针可以包含核酸定位结构域和捕获结构域以及与捕获探针的5'或3'(取决于连接至固体基质上的探针的取向)末端缀合的非核酸裂解结构域(例如可裂解的化学交联剂)。因此，所述结构域的裂解导致整个核酸捕获探针(即包含定位结构域和序列3'至定位结构域)从固体基质表面的释放。如本文所定义的，能够将核酸分子固定到固体基质上的可裂解化学交联剂是本领域已知的。

在优选的实施方案中，捕获探针的裂解结构域是指捕获探针内的核苷酸序列，其可以通过化学方法或优选酶促方式特异性裂解。捕获探针内的裂解结构域的位置将取决于捕获探针是否固定在固体基质上以使得它们具有能够用作延伸引物的游离3'末端(例如通过它们的5'或3'末端)。例如，如果捕获探针通过其5'末端固定，则裂解结构域将位于定位结构域的5'，并且所述结构域的裂解导致包含定位结构域和序列3'至定位结构域的捕获探针的部分，和任选的部分裂解结构域，从固体基质的表面释放。或者，如果捕获探针通过其3'末端固定，则裂解结构域将位于捕获结构域(和定位结构域)的3'处，并且所述结构域的裂解导致包含定位结构域和序列3'至定位结构域的捕获探针的部分从固体基质表面释放。优选地，裂解导致裂解结构域的完全去除，特别是当捕获探针通过其3'末端固定时，因为裂解结构域的一部分的存在可能干扰捕获结构域与靶核酸的杂交和/或其后续的延伸。

“裂解”在本文中广义地定义为包括破坏共价键的任何手段。在一些实施方案中，裂解涉及裂解核苷酸链中的共价键(即链裂解或链断裂)，例如通过裂解磷酸二酯键。

因此，裂解结构域可包含被一种或多种能够裂解核酸分子的酶识别的序列，即能够破坏两个或多个核苷酸之间的磷酸二酯键的序列。例如，裂解结构域可包含限制性内切核酸酶(限制酶)识别序列。限制酶在称为限制性位点的特定识别核苷酸序列上裂解双链或单链DNA，并且合适的酶是本领域熟知的。例如，特别有利的是使用稀有裂解限制酶，即具有长识别位点(长度至少为8个碱基对)的酶，以降低在核酸(例如cDNA分子)中其它地方裂解的可能性。如上所述，可以看出，从固体基质表面释放至少部分捕获探针需要释放包含捕获探针的定位结构域和捕获结构域的部分，并且在一些实施方案中，释放由所述捕获结构域的模板化延伸产生的任何序列。因此，如果捕获探针部分或完全延伸同时仍附着(即固定在)固体基质上，则裂解结构域的裂解将释放延伸的捕获探针，包括定位结构域、捕获结构域和延伸产物。因此，在一些优选的实施方案中，即当捕获探针通过其5'末端固定时，捕获探针的裂解应发生在位置区5'。

举例来说，裂解结构域可以包含poly-U序列，其可以被尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和商业上称为USER^TM酶的DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII的混合物裂解。

裂解结构域的另一个实例可用于其中捕获探针间接固定(即通过下面定义的表面探针)到固体基质上的实施方案中。裂解结构域可包含一个或多个错配核苷酸，即当表面探针和捕获探针的互补部分不是100％互补时。例如，通过导致核酸分子在错配位置处的裂解的MutY和T7核酸内切酶I酶，识别出这种不匹配。

可以在捕获探针间接固定(即，通过表面探针)到固体基质上的实施方案中使用的裂解结构域的另一个实例包括切口酶识别位点或序列。在这方面，切口酶仅裂解核酸双链体中的一条链。切口酶是内切核酸酶，其仅裂解DNA双链体的单链。因此，裂解结构域可包含靠近表面探针的5'末端(和/或捕获探针的5'末端)的切口酶识别位点，使得表面探针或捕获探针的裂解使表面探针和捕获探针之间的双链体不稳定，从而从固体基质释放捕获探针。

在将捕获探针直接固定到固体基质上的实施方案中，也可以使用切口酶。例如，固体基质可以与核酸分子接触，所述核酸分子与捕获探针的裂解结构域杂交，以提供或重建切口酶识别位点，即裂解辅助探针。因此，与切口酶接触将导致裂解结构域的裂解，从而从固体基质释放捕获探针。显然，这种裂解辅助探针可用于提供或重建其他裂解酶的裂解识别位点，例如，限制酶，如上所述。

因此，在一些实施方案中，该方法还可以包括使固体基质与裂解辅助探针接触的步骤，即在允许裂解辅助探针与捕获探针的裂解结构域杂交以提供裂解识别位点的条件下，例如切口酶识别位点或限制酶识别位点。

一些切口酶通过结合并识别特定的核苷酸识别序列仅在DNA分子上的特定位点引入单链切口。已经发现了许多天然存在的切口酶，其中目前已经确定了至少四种的序列识别特性。切口酶描述于美国专利6,867,028中，其通过引用整体并入本文，并且任何合适的切口酶可用于本发明的方法中。

在利用切口酶的实施方案中，可以在步骤(d)之前从测定中除去切口酶或使其失活，以防止不需要的延伸探针或其扩增子的裂解。

因此，在优选的实施方案中，“用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具”包括裂解酶，例如如上定义的酶。从以上描述中显而易见的是，裂解酶可以指具有裂解活性的酶的组合或混合物。例如，在优选的实施方案中，裂解酶包含尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化-裂合酶的混合物，例如核酸内切酶VIII。市售的这些酶的混合物，称为USER^TM酶，是特别优选的。因此，在一些实施方案中，裂解结构域包含poly-U序列。

如上所述，裂解酶在聚合酶的同时或之前与阵列接触，优选在单一反应混合物中。因此，在一些实施方案中，裂解酶必须在与聚合酶相同的条件下起作用，例如，在用于聚合酶的相同缓冲液、盐、温度条件下起作用。

“功能性”是指相对于裂解酶在该酶最佳条件下(例如，在制造商推荐的缓冲液、盐和温度条件下)对裂解结构域的活性，裂解酶可在裂解捕获探针的裂解结构域中显示出一些降低的活性。因此，如果裂解酶相对于在该酶的最佳条件下的裂解酶活性具有至少50％的活性，例如至少60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的活性，可以认为该裂解酶是有功能的。

另外或可替代地，在一些实施方案中，聚合酶必须在与裂解酶相同的条件下起作用，例如，在用于裂解酶的相同缓冲液、盐、温度条件下起作用。

“功能性”是指相对于聚合酶在该酶的最佳条件下(例如，在制造商推荐的缓冲液、盐和温度条件下)对相同目标模板化延伸的活性，该聚合酶在捕获探针的目标模板化延伸中显示出一些降低的活性。因此，如果聚合酶相对于在该酶的最佳条件下的聚合酶活性具有至少50％的活性，例如至少60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的活性，可以认为该聚合酶是有功能的。

虽然从本文的讨论中可以明显看出本发明的方法可以用于捕获DNA(例如基因组DNA)和RNA，但是为了简单起见，将在捕获RNA的背景下详细描述本发明，其形成本发明的优选方面。然而，下面给出了与DNA捕获有关的具体实施方案。

RNA可以是可以在细胞中发生的任何RNA分子。因此，它可以是mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、microRNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piwi-interacting RNA，piRNA)、核酶RNA、反义RNA或非编码RNA。然而，优选它是mRNA。

上述方法中的步骤(c)涉及使用与捕获探针杂交的核酸分子(即，被捕获探针“捕获”)作为延伸模板延伸捕获探针以产生延伸的探针，从而在空间上标记生物样本的核酸。因此，在RNA的情况下，步骤(c)的这个方面可以被视为从捕获的RNA产生cDNA(特别是标记的cDNA)，即与cDNA的合成有关。这将涉及捕获的RNA的逆转录(RT)步骤，使用捕获的RNA作为模板延伸捕获探针，其用作RT引物。这样的步骤产生所谓的第一链cDNA，即延伸的探针。如下面将更详细描述的，第二链cDNA合成可以在分析延伸探针的步骤(例如延伸探针的序列)之前在单独的步骤中进行，或者可以作为分析步骤的一部分进行。因此，例如，第二链合成可以在扩增释放的第一链cDNA分子的第一步中发生。在一些实施方案中，第二链合成可以与第一链合成同时发生，或者可以在第一链合成反应后立即进行。例如，当模板转换反应用于第二链合成时，第二链合成可以与第一链合成反应同时发生。模板转换反应在下面详细描述。

因此，在一些实施方案中(即当该方法用于捕获RNA时)，使用逆转录酶进行延伸反应，即聚合酶是逆转录酶。所需的逆转录酶活性可以由一种或多种不同的逆转录酶提供，其中合适的例子是：M-MLV、MuLV、AMV、HIV、ArrayScript^TM、Multi Scribe^TM、ThermoScript^TM和I、II和III酶。如本文所用，术语“逆转录酶”不仅包括天然存在的酶，还包括所有这些修饰的衍生物，包括天然存在的逆转录酶的衍生物。

用于本申请方法的特别优选的逆转录酶包括M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶和衍生物，例如序列修饰的衍生物或其突变体。

M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶的序列修饰的衍生物或突变体包括保留功能性(例如逆转录)的野生型序列的活性的至少一部分的突变体。突变可能影响酶的活性谱，例如在不同的反应条件下(例如温度、模板浓度、引物浓度等)增强或降低聚合速率。突变或序列修饰也可以影响酶的RNase活性和/或热稳定性。逆转录酶可以作为组合物的一部分提供，所述组合物包含其他组分，例如，稳定组分，其增强或改善逆转录酶的活性，所述逆转录酶例如RNase抑制剂、DNA依赖性DNA合成的抑制剂(例如，放线菌素D)。许多序列修饰的逆转录酶的衍生物或突变体，例如，M-MLV和包含未修饰和修饰的酶的组合物是本领域已知的并且可商购获得，例如，ArrayScript^TM、MultiScribe^TM、ThermoScript^TM和Superscript I、II、III和IV酶以及所有这些酶被认为可用于本发明的方法。

因此，在一个实施方案中，本发明的优选逆转录酶由包含SEQ ID NO：1(M-MLV逆转录酶)的核苷酸序列或与其具有至少80、85或90％序列同一性的核苷酸序列编码。或者或另外，本发明的优选逆转录酶包含SEQ ID NO：2的多肽序列或与其具有至少80、85或90％序列同一性的多肽序列。因此，本发明的逆转录酶可以是M-MLV逆转录酶的天然变体或衍生物，例如，来自另一株M-MLV。

优选地，所述核苷酸或多肽序列与其比较的序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同。

核苷酸分子的序列同一性可以通过例如施用GCG软件包的FASTA来确定，其中使用默认值和可变pamfactor，并将缺口产生罚分设置为12.0，将缺口延伸罚分设置为4.0，窗口为6个核苷酸。

优选地，此类序列同一性相关核酸分子在功能上等同于SEQ ID NO：1中所示的核酸分子。这些功能等同的核酸分子可以采取衍生物的形式，并且如果它们根据本领域已知的逆转录酶活性测试编码被认为是功能等同物的多肽，则认为它们在功能上是等同的。优选的功能等同物是编码如上所述的优选多肽的那些。

多肽分子的序列同一性可以通过例如利用具有可变pamfactor的FASTA pep-cmp的SWISS-PROT蛋白质序列数据库的使用确定，并且将缺口产生罚分设定为12.0并将缺口延伸罚分设定为4.0，并且窗口为2个氨基酸。优选地，所述比较是在序列的整个长度上进行的，但是可以在较小的比较窗口上进行，例如，小于600、500、400、300、200、100或50个连续氨基酸。

优选地，此类序列同一性相关多肽在功能上等同于SEQ ID NO：2中所示的多肽。因此，具有SEQ ID NO：2所示序列的多肽可以被修饰而不影响多肽的序列。

不影响多肽序列的修饰包括，例如，化学修饰，包括去糖基化或糖基化。此类多肽可以通过多肽的合成/分离后修饰而不影响功能性来制备，例如，特定残基的某些糖基化、甲基化等。

如本文所提及的，为了实现“功能等同性”，相对于亲代分子(parent molecule，即衍生它的分子，例如通过氨基酸取代)，多肽可以在逆转录酶活性中显示出一些增加或降低的功效，但优选为相同功效或更高功效。在一些实施方案中，可以在功能等同的多肽中减少或抑制部分天然酶活性，例如，RNase活性。因此，功能等同性涉及具有逆转录酶活性的多肽，其能够在RNA模板化延伸反应中延伸捕获探针的捕获结构域。如上所述，这可以通过以定量方式比较衍生多肽相对于衍生其的多肽的逆转录酶活性来测试。衍生物优选具有本发明方法中亲本多肽(parent polypeptide)的至少30、50、70或90％的功效。

与天然存在的蛋白质相关或衍生自天然存在的蛋白质的功能等同的蛋白质，可以通过单个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失(假设他们满足上述序列一致性要求)修饰天然氨基酸序列但不破坏该分子功能来获得。优选地，天然序列具有少于20个取代、添加或缺失，例如，少于10、5、4、3、2或1个这样的修饰。这些蛋白质由“功能等同的核酸分子”编码，其通过适当地取代、添加和/或缺失一个或多个碱基而产生。

如本文所用，术语“多个”意指两个或更多个，或至少两个，例如，3、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、400、500、1000、2000、5000、10,000、100,000、1000,000、10,000,000、15,000,000或更多等。因此，例如，捕获探针的数量可以是任何两个上述数字之间的任何范围内的任何整数。

如上所述，捕获探针固定在固体基质上，因此固体基质可以视为阵列或包含一个或多个阵列，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个阵列。例如，固体基质可包含20、25、30、35、40或更多个阵列。下面讨论和描述用于一般核酸分析，特别是DNA分析的阵列。本文描述的与用于RNA语境的阵列和捕获探针有关的具体细节和实施方案同样(适当时)适用于所有此类阵列，包括与DNA一起使用的阵列。在这方面，应当理解，可以设想包含如本文定义的捕获探针的常规类型阵列可以用于本发明的方法中。

因此，本文概述的方法可利用包含如本文所定义的“捕获探针”的高密度核酸阵列，用于捕获和标记来自生物样本(例如组织样品)中的所有单细胞的转录物，例如薄组织样品切片，或“切片”。可以以高度并行化的方式产生用于分析的组织样品或切片，从而保留切片中的空间信息。将每个细胞的捕获的RNA(优选mRNA)分子或“转录组”转录成cDNA，并分析所得的cDNA分子，例如通过高通量测序。得到的数据可以与生物样本的图像相关联，例如，组织样品通过所谓的定位结构域，例如捕获探针内(例如条形码序列或ID标签)的独特核苷酸序列。

高密度核酸阵列或微阵列是本文所述的空间转录组和基因组标记和标记方法的核心组分。微阵列是分子生物学中使用的多重技术。典型的微阵列由寡核苷酸的一系列微点(特征或位点)组成(数百个点可以掺入单个阵列中，并且几个阵列可以呈现在单个固体基质上)。每个核酸(寡核苷酸)微点的不同(离散)位置(每个种类的寡核苷酸/核酸分子)被称为“特征”或“位点”(因此在上面列出的方法中，每种捕获探针可被视为阵列的特定特征；每个特征在阵列上占据不同的(离散的)位置)，并且通常每个单独的特征在区域中包含在皮摩尔(10^-12摩尔)量级的特定DNA序列(“种类”)的，其被称为“探针”(或“报道子”)。通常，所述探针可以是基因或其他核酸元件的短片段，可以在高严格杂交条件下与cDNA或cRNA样品(或“靶”)杂交。然而，如下所述，本发明的探针与标准微阵列的探针不同。

因此，术语“阵列”是指固体基质上的核酸特征或位点群，其可以根据相对位置彼此区分。根据阵列中位点或特征的位置，可以将位于阵列的不同位点或特征的不同核酸分子彼此区分。阵列的单个位点或特征可包括一种或多种特定类型的分子(例如捕获探针的种类)。例如，位点或特征可以包括具有特定序列的单个核酸分子，或者位点可以包括具有相同序列的几个核酸分子。

捕获探针可以通过任何合适的方式附接在固体基质上，例如本发明的阵列上。如本文所用，术语“附接”是指两个物体彼此连接、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可以通过共价键或非共价键与诸如凝胶或固体支持物的材料连接。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及电子对的共用的化学键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。

在一个优选的实施方案中，通过化学固定(即通过共价键)将探针固定在固体基质(例如阵列)上。这可以是基于化学反应的固体基质和探针之间的相互作用。这种化学反应通常不依赖于通过热或光输入的能量，而是可以通过施加热量(例如化学反应的某个最佳温度)或某一波长的光来增强。例如，化学固定可以发生在基质上的官能团和探针上的相应功能元件之间。探针中的这些相应的功能元件可以是探针的固有化学基团，例如羟基或另外引入。引入捕获探针的官能团的实例是胺基。通常，待固定的探针包含官能胺基团或经化学修饰以包含官能胺基团。如上所述，在一些实施方案中，探针可包含可裂解的化学接头，其将探针附接至固体基质，使得其形成捕获探针的裂解结构域。用于这种化学改性的方法和方法是众所周知的。

可以使用所述官能团在待固定的探针内的定位，以便控制和塑造探针的结合行为和/或取向，例如，官能团可以位于探针的5'或3'末端或探针序列内。其上可以固定探针的典型基质包括能够结合这种探针(例如结合胺官能化核酸)的基元。这种基质的实例是羧基、醛基或环氧基质。这些材料是本领域技术人员已知的。通过引入胺基而在具有化学活性的探针之间产生连接反应的官能团以及阵列基质是本领域技术人员已知的。

其上可以固定探针的可选基质可能必须是化学活化的，例如，通过官能团的活化，可在固体基质上获得。术语“活化的基质”涉及其中通过本领域技术人员已知的化学修饰程序建立或实现相互作用或反应性化学官能团的材料。例如，包含羧基的基质必须在使用前活化。此外，存在可用的含有可与核酸探针中已存在的特定部分反应的官能团的基质。

在一些实施方案中，探针可以直接在固体基质上合成。用于这种方法的合适方法是本领域技术人员已知的。例如，特征(即探针簇)可以通过称为桥式扩增的固相扩增方法制备，如下面更详细地讨论的。其他实例包括由Agilent Inc.、Affymetrix Inc.、RocheNimblegen Inc.或Flexgen BV开发的制造技术。通常，使用激光器和镜组对待添加核苷酸的微点进行特定活化。这种方法可以提供例如约30μm或更大的光斑尺寸(即特征)。

因此，固体基质可以是本领域技术人员已知的任何合适的基质，即适合用作阵列。基质可具有任何合适的形式或样式，例如，它可以是扁平的、弯曲的、例如朝向生物样本(例如组织样品)之间相互作用的区域凸出地或凹入地弯曲和基质发生。特别优选的是基质是平的，即平面的、芯片或载玻片。在一些实施例中，基质可包括各种结构，例如基质中或基质上的孔、珠(或其他颗粒)、来自基质的突起、基质上的脊或基质中的通道。在一些实施方案中，基质的结构(例如孔或珠粒)，每个都可以带有不同的捕获探针。可以根据基质表面中或表面上的结构的位置来识别附接到每个结构的不同捕获探针。位于基质上的其中结构分开的示例性阵列包括但不限于在孔中具有珠粒的那些。

术语“固体基质”通常是指不溶于水性液体的刚性载体，其允许探针在基质上的准确且可追踪的定位。基质的实例是固体材料或包含功能性化学基团(例如胺基或胺官能化基团)的基质。基质可以是无孔的或多孔的。因此，基质可任选地能够吸收液体(例如由于孔隙率)，但通常具有足够的刚性，使得基质在吸收液体时基本上不溶胀，并且当通过干燥除去液体时基本不收缩。无孔固体载体通常对液体或气体是不可渗透的。示例性固体载体包括但不限于玻璃和改性或官能化玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon^TM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或二氧化硅基质料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束、以及聚合物(如聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯)。

本发明设想的优选基质是无孔基质。在一些实施方案中，固体基质位于流动池工具内。

可以使用本领域技术人员已知的任何合适的材料。通常，使用玻璃或聚苯乙烯。聚苯乙烯是一种疏水性材料，适用于结合带负电荷的大分子，因为它通常几乎不含亲水性基团。对于固定在载玻片上的核酸，还已知通过增加玻璃表面的疏水性，可以增强核酸固定。这种增强可以允许相对更密集的阵列。除了用聚L-赖氨酸进行涂层或表面处理之外，该基质(特别是玻璃)还可以通过硅烷化处理，例如用环氧硅烷或氨基硅烷或通过硅烷化或用聚丙烯酰胺处理。

许多标准阵列是商业上可获得的，并且特征的数量和尺寸都可以变化。在本发明中，可以改变特征的排列以对应于存在于不同生物样本(例如组织或有机体)中的细胞的大小和/或密度。例如，动物细胞通常具有1-100μm的区域的横截面，而植物细胞的横截面通常可以在1-10000μm的范围内。因此，阵列具有多达210万个特征，或420万个特征，并且特征尺寸为13微米，对于来自动物或真菌的组织样本可能是优选的，而其他形式，例如，具有8x130k特征的形式，可能足以用于植物组织样本。对于序列分析，尤其是NGS技术，也有现成的商品阵列，或已知可用于此领域的商品阵列。在本发明的上下文中，此类阵列也可以用作阵列表面，例如，Illumina微珠阵列或流动池，使用桥式扩增在其上产生探针。除了可以自定义的商用阵列之外，还可以制作定制或非标准的“内部”阵列，并且可以很好地建立用于生成阵列的方法。本发明的方法可以使用包含如下定义的探针的标准和非标准阵列。

术语“流动池”旨在表示具有可以进行反应的腔室的容器，用于将试剂输送到腔室的入口和用于从腔室中移除试剂的出口。在一些实施方案中，腔室配置用于检测腔室中发生的反应。例如，腔室可包括一个或多个透明表面，允许光学检测腔室中的生物样本、光学标记分子等。示例性流动池包括但不限于核酸测序工具中使用的那些，例如由Illumina,Inc.商业化的Genome或平台的流动池(SanDiego,CA)；或者由Life Technologies(Carlsbad,CA)商业化的SOLiD^TM或Ion Torrent^TM测序平台。示例性的流动池及其制造和使用的方法也描述于例如WO2016/162309、WO2014/142841、美国专利公开号2010/0111768和美国专利号8,951,781，其中的每一个都通过引用并入本文。

术语“珠粒阵列”是指包含珠粒或其他颗粒的集合的固体支持物。颗粒可以悬浮在溶液中，或者它们可以位于固体基质的表面上。具有位于表面上的珠粒的阵列的实例包括珠粒位于孔中的阵列，例如BeadChip阵列(Illumina Inc.，San Diego CA)，来自454LifeSciences(Roche,Basel Switzerland的子公司)的用于测序平台的基质，或来自Ion Torrent(Life Technologies，Carlsbad California的子公司)的用于测序平台的基质。具有位于表面上的珠粒的其他固体支持物描述于美国专利6,266,459、6,355,431、6,770,441、6859570、6,210,891、6258568或6,274,320，美国专利公开2009/0026082A1、2009/0127589A1、2010/0137143A1或2010/0282617A1或PCT公开WO00/63437和WO2016/162309，其各自通过引用并入本文。上述参考文献中的一些描述了在将珠粒加载到固体支持物之中或之上之前将核酸探针连接至珠粒上的方法。因此，珠粒的集合可包括不同的珠粒，每个珠粒具有附接的独特捕获探针。然而，应该理解，可以使珠粒包括通用引物，然后可以将珠粒加载到阵列上，从而能够在阵列上合成捕获探针，例如，使用桥梁扩增方法。如前所述，通常用于珠粒阵列的固体支持物可以在没有珠粒的情况下使用。例如，核酸，例如捕获探针，可以直接连接至孔中或孔中的凝胶材料。因此，以上参考文献说明了可修改用于本文所述方法和组合物的材料、组合物或工具。

因此，用于本发明方法的固体基质可包括珠粒阵列，其中不同的捕获探针附着于阵列中的不同珠粒。在该实施方案中，每个珠粒可以连接至不同的捕获探针上，并且珠粒可以随机分布在固体支持物上，以便有效地将不同的捕获探针固定到固体支持物上。任选地，固体支持物可包括具有容纳不超过一个珠粒的尺寸的孔。在这样的配置中，由于珠粒在孔中的配合所产生的力，珠粒可以附着到孔上。还可以使用附着化学品或粘合剂将珠粒保持在孔中。

固体基质(例如阵列)上的探针可以固定，即优选地通过5'或3'末端(取决于阵列的化学基质)附接或结合到阵列。通常，对于商业上可获得的阵列，探针通过3'键连接，从而留下游离的5'末端。然而，包含通过5'键连接至基质上的探针从而留下游离的3'末端的阵列，可以使用本领域熟知的标准技术合成，并在本文别处描述。

用于将核酸探针与固体基质(例如阵列)偶联的共价连接，可以被视为直接和间接连接，因为尽管探针通过“直接”共价键连接，但是可以存在将核酸探针的“第一”核苷酸与例如玻璃或硅的基质分开的化学部分或连接物，即间接连接。出于本发明的目的，通常看到通过共价键和/或化学接头固定到基质上的探针被固定或直接附着到基质上。如上所述，在一些实施方案中，化学接头是可裂解的，例如酶促和/或化学裂解，使其形成捕获探针的裂解结构域。

如下面将更详细描述的，本发明的捕获探针可以直接或间接固定在固体基质(例如阵列)上或与固体基质(例如阵列)相互作用。因此，捕获探针不需要直接与阵列结合，而是可以间接地相互作用，例如通过与分子或实体(例如珠粒)结合，所述分子或实体本身直接或间接地与固体基质(例如阵列)结合(例如，捕获探针可以与捕获探针的结合配偶体(即表面探针)相互作用(例如结合或杂交)，所述表面探针本身直接或间接地与阵列结合)。然而，一般而言，捕获探针将直接或间接(通过一个或多个中间体)结合于或固定在固体基质(例如阵列)上。

本发明的方法可包括通过其5'或3'末端固定的探针固定的探针。然而，当捕获探针直接固定在固体基质上时，例如，可能优选将其固定，使得捕获探针的3'末端可自由延伸，例如，通过被5'端固定。在一些实施方案中，捕获探针可以间接固定，使得其具有游离的(即可延伸的)3'末端。

延伸的或可延伸的3'末端，意指可以将另外的核苷酸添加到核酸分子(例如捕获探针)的最3'端核苷酸，以延长核酸分子的长度，即用于延伸核酸分子的标准聚合反应，例如，通过聚合酶(例如逆转录酶)催化的模板聚合。

因此，在一个实施方案中，阵列包含通过其3'末端直接固定的探针，即下文中定义的所谓表面探针。每种表面探针包含与每种捕获探针互补的区域，使得捕获探针可以与表面探针杂交，导致捕获探针包含可自由延伸的3'末端。然而，显而易见的是，在一些实施方案中，表面探针可以通过它们的5'末端直接固定，使得裂解结构域的裂解需要释放捕获探针的3'末端，即暴露捕获以延伸。在本发明的一个优选方面，当固体基质(例如阵列)包含表面探针，捕获探针在阵列上原位合成。

探针可以由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与Watson-Crick型或类似碱基对相互作用的合成核苷酸残基组成。因此，核酸结构域可以是DNA或RNA或其任何修饰，例如PNA或含有非核苷酸骨架的其他衍生物。然而，在转录组分析的背景下，捕获探针的捕获结构域必须能够引发逆转录反应产生与捕获的RNA分子互补的cDNA。如下文更详细地描述，在基因组分析的背景下，捕获探针的捕获结构域必须能够结合DNA片段，其可以包括与已经添加到片段化DNA的结合结构域结合。在一些实施方案中，捕获探针的捕获结构域可引发DNA延伸(聚合酶)反应以产生与捕获的DNA分子互补的DNA。

在本发明的一个优选实施方案中，捕获探针的捕获结构域至少包含脱氧核糖核苷酸(dNTP)或由脱氧核糖核苷酸(dNTP)组成。在特别优选的实施方案中，整个捕获探针包含脱氧核糖核苷酸或由脱氧核糖核苷酸组成。

在本发明的一个优选实施方案中，捕获探针直接固定在阵列的基质上，即通过它们的5'末端，产生可自由延伸的3'末端。

本发明的捕获探针包含至少三个结构域，捕获结构域和定位结构域(或特征识别标签或结构域；定位结构域可替代地定义为标识(ID)结构域或标签，或作为位置标签)和裂解结构域，如上所定义。捕获探针可以进一步包含如下进一步定义的扩增结构域。当捕获探针通过与表面探针杂交间接连接至阵列表面时，表面探针需要与捕获探针互补的序列(例如部分或结构域)。例如，当表面探针通过其3'末端固定在固体基质上时，这种互补序列可以与捕获探针上的位置/识别结构域和/或扩增结构域和/或裂解结构域互补。换句话说，定位结构域和/或扩增结构域和/或裂解结构域可以构成捕获探针的与表面探针互补的区域或部分。然而，捕获探针还可以包含另外的与表面探针互补的结构域(或区域、部分或序列)。

或者，当表面探针通过其5'末端固定在固体基质上时，这种互补序列可以与捕获探针的裂解结构域和/或捕获结构域和/或位置/鉴定结构域和/或扩增结构域互补，优选裂解结构域。换句话说，裂解结构域和/或捕获结构域和/或位置/识别结构域和/或扩增结构域可以构成捕获探针的与表面探针互补的区域或部分。然而，捕获探针还可以包含与表面探针互补的另外的结构域(或区域，部分或序列)。

捕获结构域通常位于捕获探针的3'末端，并包含可通过模板依赖性聚合延伸的游离3'末端。然而，显而易见的是，在一些实施例中，例如，当捕获探针通过其3'末端直接或间接固定时，裂解结构域可位于3'末端，捕获结构域直接或间接位于裂解结构域的上游(即5'末端)。捕获结构域包含能够与核酸杂交的核苷酸序列，例如RNA(优选mRNA)存在于生物样本(例如组织样品)的细胞中，与固体基质(例如阵列)接触。

有利地，可以选择或设计捕获结构域以选择性地或特异性地结合(或更通常地能够结合)特定的核酸(例如RNA)，需要检测或分析。例如，可以选择或设计捕获结构域用于选择性捕获mRNA。如本领域众所周知的，这可以基于与mRNA的poly-A尾杂交。因此，在优选的实施方案中，捕获结构域包含poly-T寡核苷酸，即通过磷酸二酯键连接的一系列连续的脱氧胸苷残基，其能够与mRNA的poly-A尾杂交。或者，捕获结构域可包含在功能上或结构上类似于poly-T的核苷酸，即能够选择性结合poly-A的核苷酸，例如poly-U寡核苷酸或由脱氧胸苷类似物或其组合组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸保留与poly-A结合的功能特性。在特别优选的实施方案中，捕获结构域，或更特别是捕获结构域的poly-T和/或-U元件，包含至少10个核苷酸，优选至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在进一步的实施方案中，捕获结构域，或更具体地，捕获结构域的poly-T和/或-U元件包含至少25、30或35个核苷酸。

随机序列也可以用于核酸的捕获，如本领域已知的，例如，随机六聚体或类似序列，因此这种随机序列可用于形成捕获结构域的全部或部分。例如，随机序列可以与poly-T(或poly-T类似物等)序列结合使用。因此，当捕获结构域包含poly-T(或“poly-T样”)寡核苷酸时，它也可包含随机寡核苷酸序列。例如，这可以位于poly-T序列的5'或3'，例如在捕获探针的3'末端，但这种随机序列的定位并不重要。这种构建体可以促进捕获mRNA的poly-A的初始部分。或者，捕获结构域可以是完全随机的序列。根据本领域已知的原理，也可以使用简并捕获结构域。

捕获结构域可能能够选择性地结合所需的核酸(例如RNA)亚型或子集，例如如上所列的特定类型的RNA，例如mRNA或rRNA等，或者给定类型的RNA的特定子集，例如特定的mRNA种类，例如对应于特定基因或基因组。可以基于期望捕获的RNA的序列来选择或设计这种捕获探针。因此，它可以是序列特异性捕获探针，特异于特定RNA靶标或靶组(目标组等)。因此，根据本领域熟知的原理，它可以基于特定基因序列或特定基序序列或共同/保守序列等。

在捕获结构域包含对特定靶基因或基因组特异的序列的实施方案中，可能需要直接在固体基质上合成捕获探针，例如，使用连接反应。特别地，直接在固体基质上合成捕获探针的捕获结构域可能是有用的。

例如，可以提供固体基质，其包含通过其5'末端固定的捕获探针，其中捕获结构域被固体基质上的所有探针共有的通用结构域替换(这种探针可以被视为定位结构域寡核苷酸)。使基质与一个或多个包含5'至3'的连接辅助探针在允许连接辅助探针与固定在固体基质上的探针杂交的条件下接触：

(i)与捕获结构域5'的序列互补的结构域；和

(ii)与固定在固体基质上的探针中的通用结构域互补的结构域。还使基质与一种或多种含有捕获结构域的探针接触(这种探针可以被视为捕获结构域寡核苷酸)，其中在允许包含捕获结构域的探针与辅助探针杂交的条件下，探针包含5'至3'的：

(i)与辅助探针5'的序列互补的结构域；和

(ii)包含对特定靶基因特异的序列的捕获结构域。

最后，使基质与组分(例如连接酶和适当的缓冲液、盐等)接触，所述组分使用连接辅助探针作为连接模板，促进含有捕获结构域的探针与固定在固体基质上的探针的连接以形成捕获探针。因此，如果含有捕获结构域的一种探针与固定在固体基质上的探针连接，则该阵列的每个特征将能够从生物样本中捕获单个靶核酸，例如，以分析单个基因的表达。然而，如果将多于一种含有捕获结构域的探针与固定在固体基质上的探针连接(即每种探针含有包含对不同靶基因特异的序列的捕获结构域)，则该阵列的每个特征将是能够从生物样本中捕获多种靶核酸，例如以分析基因子集的表达。显然，连接辅助探针、含有捕获结构域的探针和促进探针连接的组分可以分别(例如顺序地)或同时与固体基质接触。

虽然可以通过任何合适的方法产生包含对单个基因或基因组特异的捕获探针的固体基质，但显然上述方法提供了基于单个阵列平台产生多个基因特异性基质的便利方法。在这方面，可以制造包含捕获探针的共同或通用基质，其中捕获结构域被固体基质上的所有探针共有的通用结构域替换，并且可以用于产生每种特定于特定靶标基因或靶标基因组的多种基质。这种基质可以在诊断测定中发现特别的用途，例用于分析与一种或多种疾病(例如癌症)相关的基因或基因组的表达。

因此，上述方法的步骤(a)可以包括：

(1)提供固体基质，其上固定有多种探针，使得每种探针在固体基质上占据不同的位置并且定向为具有游离的3'末端，其中所述探针用于模板化的连接反应，其中每种所述探针均包含具有5'至3'的核酸分子：

(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，

(ii)定位结构域，其对应于捕获探针在固体基质上的位置，并且任选地

(iii)通用结构域；

(2)使所述固体基质接触：

(i)如上定义的连接辅助探针；

(ii)含有如上定义的捕获结构域的一种或多种探针；和

(iii)使用(2)(i)中的辅助探针作为连接模板促进(ii)中的探针与(1)中的探针连接的组分。

上述步骤发生在合适的条件下，例如适于形成探针互补结构域杂交和(ii)中探针与(1)中探针连接形成捕获探针的条件，所述捕获探针用于引物延伸反应。

用于进行连接反应的合适的酶和条件在下面详细讨论，并且可以应用于上述方法。

捕获探针的定位结构域(特征识别结构域或标签)直接或间接位于捕获结构域的上游，即更靠近捕获探针核酸分子的5'末端。优选地，定位结构域直接与捕获结构域相邻，即在捕获结构域和定位结构域之间不存在中间序列。在一些实施方案中，定位结构域形成捕获探针的5'末端。例如，当裂解结构域是将捕获探针连接至固体基质的可裂解交联剂时，定位结构域可以形成捕获探针的5'末端。另外或可替代地，当捕获探针经由其3'末端固定到基质时，定位结构域可以形成捕获探针的5'末端。

如上所述，固体基质(例如阵列)的每个特征(不同的位置)包含核酸探针种类的微点，其中每个特征(或相邻特征组)的定位结构域是独特的。因此，捕获探针的“种类”参照其定位结构域定义；同种类的捕获探针将具有相同的定位结构域。然而，并不要求捕获探针种类的每个成员整体具有相同的序列。特别地，由于捕获结构域可以是或可以包含随机或简并序列，同一种类内各个探针的捕获结构域可以变化。因此，在捕获探针的捕获结构域相同的一些实施方案中，每个特征都包含单一的探针序列。然而，在捕获探针变化的其他实施方案中，一个探针种类下的成员将不具有完全相同的序列，尽管该种类中每个成员的定位结构域的序列将是相同的。所需要的是固体基质(例如阵列)的每个特征或位点(或相邻特征或位点的组)携带单个种类的捕获探针(具体地，每个特征或位置携带具有相同位置标记的捕获探针，即在每个特征或位置或相邻特征或位置的组处存在单一定位结构域)。每个种类的探针都有不同的定位结构域，可以区分其种类。然而，在一些情况下，如本文更详细描述的，每个种类的探针的每个成员可具有不同的捕获结构域，因为捕获结构域可以是随机的或简并的或可具有随机或简并组件，或如上所述，捕获可以在每个特征处产生对基因子集特异的结构域。这意味着在给定的特征或位置内，探针的捕获结构域可能不同。

因此，在一些但不一定在所有实施方案中，固定在特定特征的任何一种探针分子的核苷酸序列与固定在相同特征的其他探针分子的核苷酸序列相同，但是每个特征(或相邻特征的组)处的探针的核苷酸序列与每个其他特征固定的探针各不相同、差别迥异或可以区别。优选地，每个特征包括不同种类的探针。然而，在一些实施例中，一组相邻特征包括相同种类的探针可能是有利的，即有效地产生覆盖阵列的区域的大于单个特征的特征，例如降低阵列的分辨率。在其他实施方案中，固定在特定特征的任何一种探针分子的定位结构域的核苷酸序列可以与固定在相同特征的其他探针分子相同，但捕获结构域可以变化。尽管如此，捕获结构域可以设计为捕获相同类型的分子，例如，一般来说为mRNA。因此，例如，在特征包括含有多个捕获结构域的捕获探针的情况下，例如，每个捕获结构域特定于特定基因，每个特征能够捕获相同的靶核酸。

捕获探针的定位结构域(或标签)包括对于每个特征(或相邻特征组)唯一的序列，并且用作位置或空间标记(识别标签)。以这种方式，生物样本(例如组织样品(例如组织中的每个细胞))的每个区域或结构域将通过固体基质(例如阵列)上的空间分辨率来识别，连接核酸(例如从特定细胞到捕获探针中的独特定位结构域序列的RNA(例如转录物))。凭借定位结构域，阵列中的捕获探针可以与组织样品中的位置相关，例如与样品中的细胞相关。因此，捕获结构域的定位结构域可以被视为核酸标签(识别标签)。

可以使用任何合适的序列作为本发明的捕获探针中的定位结构域。合适的序列是指定位结构域不应干扰(即抑制或扭曲)核酸(例如生物样本(例如组织样品)的RNA)和捕获探针的捕获结构域之间的相互作用。例如，应该设计定位结构域，使得组织样品中的核酸分子不与定位结构域特异性杂交。优选地，捕获探针的定位结构域的核酸序列与生物样本(例如组织样品)中的核酸序列具有小于80％的序列同一性。优选地，捕获探针的定位结构域在生物样本(例如组织样品)中的大部分核酸分子上具有小于70％、60％、50％或小于40％的序列同一性。序列同一性可以通过本领域已知的任何适当方法确定，例如，使用BLAST比对算法。

在优选的实施方案中，每种捕获探针的定位结构域含有条形码序列。可以使用随机序列生成来生成条形码序列。随机生成的序列之后可以通过映射到所有常见参考物种的基因组并使用预设的Tm间隔，GC含量和与其他条形码序列的限定的差异距离进行严格过滤，以确保条形码序列不会干扰与来自组织样品的核酸(如RNA)的捕获，并且可以毫无困难地彼此区分。

在本发明的一些实施方案中，如本文其他地方所述，扩增探针可能是有利的，例如标记的cDNA分子，通过本发明的方法产生。因此，在一些实施方案中，捕获探针包含扩增结构域，即所有捕获探针共有的结构域，并促进单一反应中所有延伸探针的扩增。捕获探针的扩增结构域直接或间接位于定位结构域的上游，即更靠近捕获探针核酸分子的5'末端。在一些实施例中，例如当捕获探针通过其5'末端固定在阵列上时，扩增结构域可以直接或间接位于裂解结构域的下游，即更靠近捕获探针核酸分子的3'末端，即扩增结构域可以位于裂解结构域和定位结构域之间。因此，在一些实施方案中，扩增结构域与定位结构域直接相邻，即在定位结构域和扩增结构域之间没有中间序列。

然而，在一些实施例中，例如，当捕获探针通过其3'末端固定在阵列上，扩增结构域可以间接位于裂解结构域的上游，即更接近捕获探针核酸分子的5'末端。因此，在捕获探针包含扩增结构域的一些实施方案中，结构域可以形成捕获探针的5'末端。例如，当裂解结构域是可裂解的交联剂，将捕获探针连接至固体基质(例如阵列)上时，扩增结构域可以形成捕获探针的5'末端。或者，当捕获探针通过其5'末端固定时，例如当裂解结构域位于捕获探针的3'末端时，扩增结构域可以形成捕获探针的5'末端。

应当理解，延伸探针的扩增可以在固体基质(例如阵列)上发生，即延伸的探针不需要从基质上移除或收集(例如合并)，例如在进行扩增步骤之前将其转移到单独的器皿或容器中。然而，在一些实施方案中，在扩增(或第二链合成，如下所述)之前移除或收集(例如汇集)延伸的探针可能是方便的。在这方面，该方法可包括汇集来自步骤(c)的延伸探针的步骤(例如，以形成延伸探针的混合物)。汇集延伸探针的步骤可以被视为从固体基质(例如阵列)中移除、收集和/或转移包含延伸探针的溶液到一个单独的器皿或容器，例如PCR管。

扩增结构域包含扩增引物可以与之杂交的不同序列。对于每种捕获探针，捕获探针的扩增结构域优选是相同的。因此，单个扩增反应足以扩增所有延伸探针，例如标记的cDNA分子。

任何合适的序列可用作本发明的捕获探针中的扩增结构域。合适的序列是指扩增结构域不应干扰(即抑制或扭曲)核酸(例如生物样本(例如组织样品)的RNA)和捕获探针的捕获结构域之间的相互作用。此外，扩增结构域应包含与核酸(例如生物样本(例如组织样品)的RNA)中的任何序列不相同或基本相同的序列，使得扩增反应中使用的引物可以在反应的扩增条件下仅与扩增结构域杂交。

例如，扩增结构域应设计成使得生物样本(例如组织样品)中的核酸分子不与扩增结构域或扩增结构域的互补序列特异性杂交。优选地，捕获探针的扩增结构域的核酸序列及其互补序列与组织样品中的核酸序列具有小于80％的序列同一性。优选地，捕获探针的定位结构域在组织样品中的大部分核酸分子上具有小于70％、60％、50％或小于40％的序列同一性。序列同一性可以通过本领域已知的任何适当方法确定，例如，使用BLAST比对算法。

在本发明的一个代表性实施方案中，仅每种捕获探针的定位结构域是独特的。因此，捕获结构域、裂解结构域和扩增结构域(如果存在)在一个实施方案中对于任何特定阵列的每种捕获探针都是相同的，以确保核酸(例如来自生物样本(例如组织样品)的RNA)的捕获，捕获探针的释放和延伸探针的扩增在整个阵列上是均匀的。然而，如上所述，在一些实施方案中，捕获结构域可以通过包括对特定基因的亚群特异的随机或简并序列或捕获结构域而不同。

在捕获探针间接固定在阵列基质上的实施方案中，例如，通过与表面探针杂交，可以如下所述在阵列上合成捕获探针。

例如，表面探针可以直接通过或例如在其3'末端固定在阵列的基质上。每种类型的表面探针对于阵列的每个特征(或相邻特征组)(独特位置)是唯一的，并且与上面定义的捕获探针部分互补。

因此，在一些实施方案中，表面探针在其5'末端包含与不与核酸(例如生物样本(例如组织样品)的RNA)结合的捕获结构域的一部分互补的结构域(互补捕获结构域)。换句话说，它包含可以与捕获结构域寡核苷酸的至少一部分杂交的结构域。表面探针还包含与捕获探针的定位结构域互补的结构域(互补定位结构域或互补特征识别结构域)和与捕获探针的裂解结构域互补的结构域(互补裂解结构域)。互补定位结构域直接或间接位于互补捕获结构域的下游(即3'末端)，即可存在分离互补定位结构域和互补捕获结构域的中间或接头序列。互补裂解结构域直接或间接位于互补定位结构域的下游(即3'末端)，即可存在分隔互补裂解结构域和互补定位结构域的中间体或接头序列。当捕获探针包含扩增结构域时，表面探针还可以含有与扩增结构域互补并且位于互补定位结构域的直接或间接下游(即3'末端)的结构域(互补扩增结构域)，即可以存在将互补扩增结构域和互补定位结构域分开的中间体或接头序列。然而，互补扩增结构域将位于互补裂解结构域的上游(即5'末端)，即确保延伸的捕获探针含有扩增结构域、定位结构域和延伸序列(即捕获结构域的3'端)。

在捕获探针在固体基质(例如阵列)表面上合成的实施方案中，基质(例如阵列)的表面探针可以包括在表面探针的3'末端的结构域(例如互补扩增结构域)，即在互补裂解结构域的直接或间接下游，其与捕获探针的结构域(例如扩增结构域)互补。

在本发明的一些实施方案中，表面探针的序列与位置、裂解和扩增(如果存在)结构域和与不结合核酸(例如生物样本(例如组织样品)的RNA)的捕获结构域部分显示出100％的互补性或序列同一性。在其他实施方案中，表面探针的序列可以显示与捕获探针的结构域小于100％的序列同一性，例如，小于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％。在本发明特别优选的实施方案中，互补裂解结构域与捕获探针的裂解结构域共享小于100％的序列同一性。

如上所述，在本发明的一些实施方案中，捕获探针可以在阵列的基质上合成或产生。

在代表性实施方案中，阵列包含如上定义的表面探针。对应于捕获结构域和至少捕获探针的裂解结构域(任选还包括扩增结构域)的寡核苷酸与固体基质(例如阵列)接触，并允许与表面探针的互补结构域杂交。在标准杂交条件下，可以通过洗涤固体基质(例如阵列)可以除去过量的寡核苷酸。得到的基质(例如阵列)，例如，阵列包含部分单链探针，其中表面探针的5'和3'末端都是双链的，互补定位结构域(和任选的互补扩增结构域)是单链的。固体基质(例如阵列)可以用聚合酶处理以通过模板依赖性方式延伸裂解结构域寡核苷酸的3'末端，从而合成捕获探针的定位结构域(和任选的扩增结构域)。然后连接合成的定位结构域的3'末端，例如使用连接酶，在捕获结构域寡核苷酸的5'末端产生捕获探针。在这方面应理解，捕获结构域寡核苷酸的5'末端被磷酸化以使得能够发生连接。由于每种表面探针包含独特的互补定位结构域，每种捕获探针将包含独特的定位结构域。

本文所用的术语“杂交”是指在核苷酸序列之间形成双链体，所述核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对充分互补以形成双链体。当这些分子共享碱基对组织同源性时，两个核苷酸序列彼此“互补”。“互补”核苷酸序列将与特异性组合以在适当的杂交条件下形成稳定的双链体。例如，当第一序列的一部分可以以反平行意义结合第二序列的一部分时，两个序列是互补的，其中每个序列的3'末端与另一个序列的5'末端结合并且然后，将一个序列的每个A、T(U)、G和C分别与另一个序列的T(U)、A、C和G比对。RNA序列还可以包括互补的G＝U或U＝G碱基对。因此，本发明的“互补”不需要两个序列具有完美的同源性。当至少约90％(优选至少约95％)的核苷酸在限定的分子长度上共享碱基对组织时，通常两个序列是充分互补的。因此，捕获和表面探针的结构域包含互补区域。此外，捕获探针的捕获结构域含有核酸(例如生物样本(例如组织样品)的RNA)的互补区域。

在另一个代表性实施方案中，捕获探针可以在固体基质(例如阵列)上合成，使用聚合酶延伸(类似于如上所述)和末端转移酶以添加可构成捕获结构域的“尾部”。使用末端转移酶将核苷酸序列添加到寡核苷酸末端是本领域已知的，例如，引入同聚物尾部，例如poly-T尾巴。因此，在这种合成中，可以使对应于捕获探针的裂解结构域的寡核苷酸(裂解结构域寡核苷酸)与阵列接触，并使其与表面探针的互补结构域杂交。可以通过在标准杂交条件下洗涤阵列来除去过量寡核苷酸。所得阵列包含部分单链探针，其中表面探针的3'末端是双链的，互补定位结构域是单链的。可以用模板依赖性方式用聚合酶处理阵列以延伸裂解结构域寡核苷酸的3'末端，从而合成捕获探针的定位结构域(和任选的扩增结构域)。然后可以使用末端转移酶引入捕获结构域(例如包含poly-T序列)以添加poly-T尾以产生捕获探针。

在另一个代表性实例中，捕获探针可以使用扩增技术(如桥式扩增)在固体基质(例如阵列)上合成。例如，第一多个核酸引物与固体支持物连接，其中核酸引物包括所述第一核酸引物共有的第一通用引物序列，并且第二多个核酸引物与固体支持物连接，其中核酸引物包含所述第二核酸引物共有的第二通用引物序列。将包含所述第一和第二核酸引物的固体支持物与多个不同探针接触，所述探针包含与捕获结构域、定位结构域、裂解结构域和扩增结构域(如果存在)互补的序列，其与第一通用引物结合序列杂交于固体支持物上的第一个通用引物和与第二个通用引物序列相同的序列。探针与第一通用引物杂交，其使用核酸探针作为模板延伸，从而产生第一多个延伸的核酸分子。

第一多个延伸的核酸分子包含第二通用引物结合序列，其与固体支持物上的第二通用引物杂交，其使用第一多个延伸的核酸分子作为模板延伸，从而产生和接触固体基质的探针相同第二多个延伸的核酸分子。第二多个延伸的核酸分子包含第一通用引物结合序列，其与固体支持物上的第一通用引物杂交，因此能够模板化所述第一通用引物的延伸。引物的持续延伸导致在包含核酸分子的固体基质表面上形成簇，所述核酸分子具有和接触固体支持物的多种不同探针相同或互补的序列。

与固体基质接触的核酸探针包含与第二通用引物序列相同的序列和与捕获结构域互补的序列之间的裂解位点或结构域。裂解该裂解位点或结构域导致包含第二通用引物序列的结构域的释放。显而易见的是，在一些实施方案中，包含第二通用引物序列的结构域的释放可以揭示捕获探针的捕获结构域，并从阵列的表面释放第二多个延伸的核酸分子。在一些实施方案中，包含第二通用引物序列的结构域的释放可以揭示捕获探针的定位结构域或扩增结构域，并从阵列的表面释放第二多个延伸的核酸分子。

因此，上述方法产生附着于固体支持物的随机簇捕获探针，其可用于使用本文先前所述的方法从生物样本中捕获核酸。有利地，可以去除释放的第二多个延伸的核酸分子，例如，在进行本发明的方法之前，通过洗涤固体基质。

在这方面，显而易见的是，可以修改上述方法以使用包含捕获结构域、定位结构域和裂解结构域的多个探针，而不是它们的互补序列，例如，通过在第一通用引物结合序列和捕获结构域之间包括裂解位点或结构域。实际上，与固体基质接触的探针结构域的顺序将取决于捕获探针是否通过其3'末端或5'末端固定，并且技术人员可以容易地按顺序修改探针结构域的顺序以产生固体基质(例如阵列)，包含适用于本发明方法的捕获探针。值得注意的是，如上所述，使用桥式扩增在阵列上合成捕获探针的方法可特别用于产生流动池形式的固体基质。

如本文所用，术语“随机”可用于指捕获探针在固体基质(例如阵列)上的空间排列。在这方面，存在至少两个与固体基质(例如阵列)上的捕获探针(即特征)的空间排列有关的参数，如本文所述。第一参数涉及特征的间隔和相对位置，第二参数涉及存在于特定特征的特定分子种类的同一性或预定知识。因此，在一些实施例中，阵列的特征可以是随机间隔的，使得相邻特征在彼此之间具有可变间距。或者，在一些实施例中，可以对特征之间的间隔进行排序，例如，形成规则图案，例如直线网格或六边形网格。在另一方面，阵列的特征相对于占据每个特征的捕获探针种类的身份或预定知识可以是随机的，而与间隔是否产生随机图案或有序图案无关。例如，在本文所述的一些实施方案中，固体基质可以在核酸附着于相对于它们的相对位置排序的位点的条件下与核酸群接触，但是相对于其相关知识“随机定位”。存在于任何特定位点的核酸种类的序列。在表面上的位置处提及“随机分布”核酸意指缺乏知识或缺乏关于在哪个位置捕获哪种核酸的预先确定(无论位置是否以有序模式排列)。

显而易见的是，可以使用任何方便的手段产生随机阵列。然而，在一些实施方案中，通过使用附着于固体基质表面的引物扩增固体基质表面上的捕获探针来产生随机阵列，使得捕获探针的位置不是预定的。在一些实施方案中，使用所谓的珠阵列产生随机阵列，其中不同的捕获探针附着于阵列中的不同珠粒，其随机分布在阵列的表面上，使得每个珠粒仅在固体基质上表示一次，并且因此每种捕获探针也仅在固体基质上表示一次。在这方面，显而易见的是，珠粒可以以有序的空间布置排列，例如，其中固体基质包括有序空间排列的孔，其具有容纳不超过单个珠粒的尺寸。然而，这样的珠粒阵列可以被视为随机阵列，只要不知道或没有预先确定每个捕获探针将位于固体基质上的位置。

由于本发明的方法依赖于将包含定位结构域的扩展探针的序列与固体基质上的特定位置相关联的能力，显然必须在用于本发明方法之前分析随机阵列。确定每种捕获探针的位置(即每个定位结构域的位置)在固体基质上的位置。这可以通过本领域已知的任何合适的方法实现，例如测序或使用杂交探针。

因此，在一些实施方案中，本发明的方法可包括在固体基质上进行核酸检测反应以确定固体基质上随机定位的探针的定位结构域序列的步骤。例如，核酸检测反应可以是测序反应，以确定随机定位在固体基质上的捕获探针的定位结构域序列。在一些实施方案中，核酸检测反应可以是固体基质上的解码(decoder)探针杂交反应，以确定随机定位在固体基质上的捕获探针的定位结构域序列。这些步骤可以在本发明方法的步骤(b)之前进行。

举例来说，组合杂交方法，例如用于解码多重珠阵列的方法(参见例如，美国专利号8,460,865(其通过引用并入本文)可用于解码“随机”阵列。此类方法利用与定位结构域序列的至少一部分互补的标记的核酸解码探针(例如条形码序列)。可以使用具有已知标记的解码探针进行杂交反应，使得标记最终在固体基质上的位置根据核酸互补规则鉴定核酸探针。在一些情况下，使用具有可区分标签的许多不同探针的池，从而允许多路解码操作。在解码操作中确定的不同条形码的数量可以超过用于解码操作的标签的数量。例如，解码可以在几个阶段中进行，其中每个阶段构成与不同解码探针池的杂交。相同的解码探针可以存在于不同的池中，但是每个解码探针上存在的标签可以在池与池之间不同(即，当处于不同的池中时，每个解码器探针处于不同的“状态”)。这些状态和阶段的各种组合可用于扩展可被解码的定位结构域(例如条形码)的数量，其远远超出可用于解码的不同标签的数量。

测序技术，例如合成测序(SBS)技术，是用于确定随机阵列上的定位结构域(例如条形码)序列的特别有用的方法。举例来说，SBS可以如下进行。为了启动第一个SBS循环，可以使一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶、SBS引物等与固体基质上的一个或多个特征接触(例如，捕获探针附着于固体支持物的特征)。可以检测SBS引物延伸导致标记的核苷酸掺入的那些特征。任选地，核苷酸可包括可逆终止部分，一旦核苷酸已添加到SBS引物中，该终止部分终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物中，使得在递送去封闭剂以除去该部分之前不会发生随后的延伸。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将解封闭试剂递送至固体基质(在检测发生之前或之后)。可以在各种递送步骤之间进行洗涤。然后可以将该循环重复n次以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。例如，在WO 91/06678、WO 04/018497、WO07/123744；美国专利号7,057,026、7,329,492、7,211,414、7,315,019或7,405,281；和美国公开号2008/0108082(其各自通过引用并入本文)中描述了可以容易地适用于本发明方法的示例性SBS程序、流体系统和检测平台。

因此，在一些实施方案中，捕获探针还可以包含含有测序引物结合位点的结构域。特别地，测序引物结合位点可位于捕获探针的捕获结构域和定位结构域之间。包含位于捕获结构域和捕获探针的定位结构域之间的测序引物结合位点的结构域可特别用于如上所述对随机阵列上的捕获探针进行测序。

因此，从上面的讨论中显而易见的是，捕获探针可以包含一个或多个通用结构域，即每种捕获探针共有的结构域。特别地，通用结构域可以是引物结合位点，其可用于合成固体基质(例如阵列)上的捕获探针，和/或对随机阵列上的捕获探针进行排序。

显而易见的是，本发明的捕获探针可包含两个不同的裂解位点或结构域。例如，第一裂解结构域可位于定位结构域的上游(即5'末端)，例如当捕获探针被其5'末端固定时。然而，在一些实施方案中，第一裂解结构域可位于捕获结构域的下游(即3'末端)，例如，当捕获探针被其3'末端固定时。第二个裂解结构域可位于用于合成固体基质(例如阵列)上的捕获探针的第一通用引物结合位点之间，以及捕获结构域或其互补。裂解位点或结构域必须对不同的裂解反应具有反应性(例如含有不同的裂解酶识别位点)，使得每个裂解位点或结构域可以被选择性地裂解而不必裂解另一个。例如，可以在步骤(c)之前(即在释放和延伸捕获探针之前)裂解第二裂解位点或结构域，从而从保留附着在固体基质上捕获探针的其他结构域分离或去除第一通用引物结合位点。在使固体基质与生物样品接触后，即与延伸反应同时，裂解第一个裂解位点或结构域。

典型的用于本发明方法固体基质(例如阵列)可包含多个微点或“特征”。特征可以定义为阵列基质上固定有单种捕获探针的区域或不同位置。因此，每个特征将包含相同物种的多种探针分子。在该背景中将理解，虽然涵盖相同物种的每个捕获探针可具有相同序列，但不一定是这种情况。每种捕获探针将具有相同的定位结构域(即每种的每个成员，因此特征中的每个探针将被相同地“标记”)，但是特征(种类)的每个成员的序列可能不同，因为捕获结构域的序列可能不同。如上所述，可以使用随机或简并捕获结构域，或者可以使用对基因子集特异的捕获结构域。因此，特征内的捕获探针可包含不同的随机或简并序列或不同的基因特异性序列。固体基质(例如阵列)上的特征的数量和密度将确定阵列的分辨率，即可以分析组织样品的转录组或基因组的细节水平。因此，更高密度的特征通常会增加阵列的分辨率。

如上所述，本发明阵列上的特征的大小和数量将取决于组织样本的性质和所需的分辨率。因此，如果需要仅针对生物样本(例如组织样品(或包含大细胞的样品))中的细胞区域确定转录组或基因组，然后可以减少阵列上的特征的数量和/或密度(即，低于可能的最大特征数量)和/或可以增加特征的大小(即每个特征的面积可以大于最小可能特征)，例如一个包含很少大特征的数组。如上所述，在一些实施例中，相邻特征可包括相同的捕获探针，即包含相同定位结构域的捕获探针，以便有效地增加特征的大小，即降低阵列的分辨率。或者，如果需要确定样品中单个细胞的转录组或基因组，则可能需要使用可能的最大数量的特征，这将需要使用最小可能的特征尺寸，例如，包含许多小功能的阵列。

虽然单细胞分辨率可能是本发明的优选和有利特征，但实现这一点并不是必需的，并且细胞群水平的分辨率也是有意义的，例如检测或区分特定细胞类型或组织区域，例如正常与肿瘤细胞。

在本发明的代表性实施例中，阵列可包含至少2、5、10、50、100、500、750、1000、1500、3000、5000、10000、20000、40000、500、000、75000、100000、150000、200000，300000、400000、500000、750000、800000、1000000、1220000、1500000、1750000、2000000、2100000、3000000、3500000、4000000、4500000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、12000000或15000000特征。如上所述，特征尺寸和/或特征之间的平均距离(即，特征的间距)可以减小，并且这可以允许更多数量的特征被容纳在相同或相似的区域内。举例来说，这些特征可以包括在小于约20cm²、10cm²、5cm²、1cm²、1mm²或者100μm²的面积中。

本领域公认的是，固体基质可包含一个以上的“阵列”，从而能够在单个基质上多重分析生物样本。因此，在一些实施方案中，固体基质包含2个或更多个阵列，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个阵列，例如12、15、20、25或更多阵列。

因此，在本发明的一些实施例中，每个特征的面积可以是约0.1μm²、0.5μm²、1μm²、2μm²、3μm²、4μm²、5μm²、10μm²、12μm²、15μm²、20μm²、50μm²、75μm²、100μm²、150μm²、200μm²、250μm²、300μm²、400μm²或500μm²。

如本文所用，术语“间距”在用于指代阵列的特征时，旨在表示相邻特征的中心间距。特征图案可以用平均间距来表征。可以对图案进行排序，使得围绕平均间距的变化系数小或者图案可以是随机的，在这种情况下，变化系数可以相对较大。在任一种情况下，平均间距可以是，例如，至少约10nm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、100μm或更大。可选地或另外地，平均间距可以是例如至多约100μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.1μm或更小。当然，特定特征图案的平均间距可以在较低值之一和从上述范围中选择的较高值之一之间。

术语“生物样本”旨在表示一种或多种细胞、组织、生物或其部分。显而易见的是，来自任何生物(例如植物、动物或真菌)的生物样本可以用于本发明的方法。本发明的方法允许捕获任何核酸，例如mRNA、分子，其存在于能够转录和/或翻译的细胞中。本发明的方法特别适用于分离和分析生物样本(例如组织样品)中细胞的转录组或基因组，其中转录组或基因组的空间分辨率是合乎需要的，例如，细胞相互连接或直接与相邻细胞接触的情况下。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的方法也可用于分析样品内不同细胞或细胞类型的转录组或基因组，即使所述细胞不直接相互作用，例如血液样本。换句话说，细胞不需要存在于组织的环境中，并且可以作为单个细胞(例如，从非固定组织分离的细胞，例如血液样品)应用于阵列。尽管如此，单个细胞虽然不一定固定在组织中的某个位置，但仍然可以应用于阵列上的某个位置并且可以单独识别。因此，在对无直接相互作用的细胞或非组织细胞进行分析的时候，所述方法的空间性质可以用于获取或检索个体细胞的独有或独立的转录组或基因组信息。

因此，生物样本可以是收获的或活检的组织样本，或可能是培养的样本。代表性样品包括临床样品，例如全血或血液衍生品、血细胞、组织、活组织检查或培养的组织或细胞等，包括细胞悬浮液。例如人造组织可以由细胞悬浮液(包括例如血细胞)制备。细胞可以在基质中捕获(例如凝胶基质，例如琼脂、琼脂糖等)，然后可以以常规方式切片。在免疫组织化学的背景下，这些方法是本领域已知的(参见例如Andersson等,2006,J.Histochem.Cytochem.54(12):1413-23.2006年9月6日电子公开)。

制备生物样本(例如组织样品)的方式以及如何处理所得样品可能影响本发明方法的转录组学或基因组学分析。此外，各种生物样本(例如组织样品)将具有不同的物理特性，并且在本领域技术人员的技能范围内进行必要的操作以产生用于本发明的方法的生物样本(例如组织样品)。然而，从本文的公开内容显而易见的是，任何样品制备方法都可用于获得适用于本发明的方法的生物样本(例如组织样品)。例如，厚度约为1细胞或更少的任何细胞层可用于本发明的方法中。在一个实施方案中，生物样本(例如组织样品)的厚度可以小于细胞横截面的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1。然而，由于如上所述，本发明不限于单细胞分辨率，因此不要求生物样本(例如组织样品)的厚度为一个细胞直径或更小；但如果需要，也可以使用组织样品较厚的生物样本(例如组织样品)。例如，可以采用冷冻切片，其厚度可能是例如10-20μm。

生物样本(例如组织样品)可以以任何方便或期望的方式制备，并且本发明不限于任何特定类型的组织制备。可以使用新鲜的、冷冻的、固定的或未固定的组织。任何所需的方便程序可用于固定或包埋生物样本(例如组织样品)，如本领域所述和已知的。因此，可以使用任何已知的固定剂或包埋材料。

作为生物样本的第一代表性实例，例如，在用于本发明的组织样品中，组织可以通过在适于维持或保持组织结构的完整性(即物理特性)的温度下深度冷冻来制备，例如低于-20℃，优选低于-25、-30、-40、-50、-60、-70或-80℃。可以将冷冻的组织样品切片，即薄切片，通过任何合适的方式置于固体基质(例如阵列)表面。例如，组织样品可以使用冷冻切片机、低温恒温器制备，设置在适于维持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学性质的温度，例如低于-15℃，优选低于-20或-25℃。因此，应对样品进行处理，以使组织中的核酸(例如RNA)的变性或降解最小化，在组织中。这些条件在本领域中是公认的，并且可以通过核酸提取(例如总RNA提取)监测任何降解的程度，以及随后的组织样品制备的各个阶段的质量分析。

在第二代表性实例中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的标准方法制备组织，所述方法在本领域中是公知的。在固定组织样品并包埋在石蜡或树脂块中之后，可以将组织样品切片，即切成薄片置于固体基质(例如阵列)上。如上所述，可以使用其他固定剂和/或包埋材料。

很明显，生物样本(例如组织样品切片)需要进行处理以除去包埋材料，例如在进行本发明的方法之前从样品中去石蜡(即去除石蜡或树脂)。从组织样品中除去石蜡或树脂或其他材料可以通过任何合适的方法实现，并且这些方法在本领域中已经很好地建立，例如，通过将样品(在固体基质的表面上，例如阵列)在合适的溶剂(例如二甲苯)中温育例如两次10分钟，然后用乙醇冲洗，例如用99.5％的乙醇冲洗2分钟，用96％乙醇冲洗2分钟，并用70％乙醇冲洗2分钟。

对于本领域技术人员显而易见的是，使用FFPE方法或其他固定和包埋方法制备的组织切片中的RNA比冷冻组织的情况更可能部分降解。然而，不希望受任何特定理论的束缚，据信这在本发明的方法中可能是有利的。例如，如果样品中的RNA部分降解，则RNA聚核苷酸的平均长度更短，且或多或少得到了随机化。因此假定部分降解的RNA将导致各种处理步骤中的较少偏差，如本文其他地方所述，例如，衔接子的连接(扩增结构域)，cDNA分子的扩增及其测序。

因此，在本发明的一个实施方案中，生物样本(例如组织样品)，即与固体基质(例如阵列)接触的组织样品的部分，使用FFPE或其他固定和包埋方法制备。换句话说，样品可以是已固定的，例如经固定和包埋的。在本发明的另一个实施方案中，通过深度冷冻制备组织样品。在另一个实施例中，根据本领域已知的程序，可以使用组织切片。在其他实施方案中，可以使用未固定的样品。

虽然可以使用任何合适的技术或制备方法制备用于本发明方法的生物样品，但在一些特别优选的实施方案中，样品的核酸分子(特别是RNA分子)在与固体基质(例如阵列)接触之前不进行修饰。例如，在一些优选的实施方案中，在与固体基质接触之前，生物样本的核酸分子(例如RNA)不进行处理以增强或促进其与捕获探针的相互作用。特别地，在一些实施方案中，在将生物样本与固体基质接触之前，生物样本的核酸分子(例如RNA)不与促进生物样本的核酸分子和捕获探针之间的相互作用的核酸(例如适体、寡核苷酸或核酸标签)接触或杂交。例如，在一些实施方案中，在将生物样本与基质(例如阵列)接触之前，生物样本不与作为生物样本的靶核酸和捕获探针之间的中间体(即起到将生物样本靶核酸间接附接或连接至捕获探针的功能)的核酸接触或杂交。

用于本发明方法的生物样本(例如组织样品切片)的厚度可取决于用于制备样品的方法和组织的物理特性。因此，任何合适的截面厚度都可用于本发明的方法中。在本发明的代表性实施方案中，组织样品切片的厚度为至少0.1μm，进一步优选至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm。在其他实施方案中，组织样品切片的厚度为至少10、12、13、14、15、20、30、40或50μm。然而，厚度并不重要，这些仅是代表值。如果需要或方便，可以使用较厚的样品，例如70或100μm或更多。通常，组织样本部分的厚度在1-100μm、1-50μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-15μm、1-10μm、2-8μm之间。如上所述，可以使用更厚的样品，例如，3-7μm或4-6μm。

在使生物样本(例如组织样品切片)接触固体基质时，例如在移除包埋材料(例如去石蜡)之后，生物样本(例如组织样品)中的核酸(例如RNA)分子将与阵列上固定的捕获探针结合。在一些实施方案中，促进核酸(例如RNA)分子与捕获探针的杂交可能是有利的。通常，促进杂交包括改变发生杂交的条件。可以修改的主要条件是在逆转录步骤之前的阵列上生物样本(例如组织样品切片)温育的时间和温度，其在本文别处描述。

很明显，来自不同来源的生物样本(例如组织样品)可能需要不同的处理以允许核酸与捕获探针相互作用，即与捕获探针杂交。例如，透化生物样本(例如组织样品)可能是有用的以促进核酸和捕获探针之间的相互作用。如果组织样品没有充分透化，则捕获探针捕获的核酸量可能太低而不能进行进一步分析。相反，如果是生物样本(例如组织样品)渗透过强，核酸可能从生物样本(例如组织样品)中的源头扩散开来，即可被捕获探针捕获的核酸可能与其在生物样本(例如组织样品)中的原始空间分布不能精确地相关。因此，在透化生物样本之间必须保持平衡，例如，组织样品(例如组织样品)足以获得核酸和捕获探针之间的有效相互作用，同时保持生物样本中核酸分布的空间分辨率。用于固定生物样本(例如组织样品)的方法，也可能影响生物样本(例如组织样品)的核酸和捕获探针之间的相互作用。

因此，在一些实施方案中，该方法还包括使生物样本透化的步骤。该步骤可在使样品与固体基质接触的步骤之后进行。在一些实施方案中，使生物样本透化的步骤可以在释放和延伸捕获探针的步骤之前或同时进行。

用于透化和/或固定生物样本(例如细胞和组织)的合适方法和试剂是本领域熟知的，可以选择任何合适的方法用于本发明的方法。一些蛋白酶特别适用于透化生物样本(例如胃蛋白酶)中的细胞。特别有用的固定剂包括例如甲醇。

作为来自固体基质上的生物样本(例如组织样品)的核酸分子的空间标记(例如局部或空间检测)的条件根据生物样本(例如组织样品)而变化，在此讨论典型的参数范围。例如，在生物样本(例如组织样品切片)接触固体基质(例如阵列)时，可以将基质温育至少1小时以使核酸(例如RNA)与捕获探针杂交。优选固体基质(例如阵列)可以温育至少2、3、5、10、12、15、20、22或24小时或直到组织样品部分已经干燥。基质温育时间并不重要，可以使用任何方便或期望的时间。典型的基质(例如阵列)温育可能长达72小时。因此，温育可以在任何合适的温度下进行，例如在室温下进行，尽管在一个优选的实施方案中，生物样品(例如组织样品切片)在至少25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃的温度下在固体基质(例如阵列)温育。温育温度高达55℃在本领域中是常见的。在特别优选的实施方案中，使组织样品切片在37℃下在阵列上干燥24小时。一旦生物样本(例如组织样品切片)已干燥基质(例如阵列)在进行组合裂解和延伸(例如逆转录步骤)之前，可以在室温下储存阵列。应该理解，如果允许生物样本(例如组织样品切片)在基质(例如阵列)表面上干燥，在进一步操作捕获的核酸(例如，从固体基质裂解捕获探针并同时或随后逆转录捕获的RNA的步骤)之前需要将其重新水合。

因此，本发明的方法可以包括在将样品与固体基质(例如阵列)接触之后再水合生物样本(例如组织样品)的步骤。

在一些实施方案中，在使生物样本(例如组织样品)接触基质(例如阵列)之前阻断(例如掩蔽或修饰)捕获探针可能是有利的，特别是当生物样本(例如组织样品)中的核酸在其在阵列上捕获之前经历修饰过程。具体地，阻断或修饰捕获探针的游离3'末端可能是有利的。在一个具体实施方案中，生物样本(例如组织样品)中的核酸(例如片段化的基因组DNA)可以修饰，使其可以被捕获探针捕获。例如，并且如下面更详细描述的，可以将衔接子序列(包含能够结合捕获探针的捕获结构域的结合结构域)添加到核酸(例如片段化的基因组DNA)的末端。这可以通过例如连接衔接子或延伸核酸的方式实现，例如使用酶在序列末端掺入额外的核苷酸，例如poly-A尾。在生物样本(例如组织样品)接触阵列以表面捕获探针的修饰(例如以避免捕获探针的游离3'末端添加poly-A尾)之前，必须阻断或修饰捕获探针，特别是捕获探针的游离3'末端。优选地，阻断结构域的掺入可以在合成时掺入捕获探针中。然而，阻断结构域可以在其合成后掺入捕获探针。

在一些实施方案中，捕获探针可以被任何合适的和可逆的手段阻断，这些手段可以防止在修饰生物样本(例如组织样品)的核酸的过程中修饰捕获结构域，其发生在生物样本(例如组织样品)与阵列接触之后。换句话说，捕获探针可以被可逆地掩蔽或修饰，使得捕获探针的捕获结构域不包含游离的3'末端，即3'末端被去除或修饰，或者使其不可接近以便捕获探针不易受用于修饰(例如连接或延伸)生物样本的核酸的过程的影响，或者除去额外的核苷酸以显示和/或恢复捕获探针的捕获结构域的3'末端。

例如，阻断探针可以与捕获探针杂交以掩蔽捕获结构域的游离3'末端，例如发夹探针或部分双链探针，其合适的实例是本领域已知的。捕获结构域的游离3'末端可以通过化学修饰来阻断，例如，添加叠氮基甲基作为化学可逆封端部分，使得捕获探针不包含游离的3'末端。合适的替代性封端部分是本领域熟知的，例如，捕获结构域的末端核苷酸可以是可逆的终止子核苷酸，其可以在探针合成期间或之后包含在捕获探针中。

可替代地或另外地，可以修饰捕获探针的捕获结构域，以便允许去除捕获探针的任何修饰(例如另外的核苷酸)，其发生在生物样本(例如组织样品)的核酸分子被修饰时。例如，捕获探针可以包含捕获结构域下游的另外的序列，即3'至捕获结构域，即阻断结构域。这可以是如上定义的裂解结构域的形式，例如限制性内切核酸酶识别序列或可被特定酶活性裂解的核苷酸(例如尿嘧啶)序列。在修饰生物样本(例如组织样品)的核酸之后，捕获探针可以进行酶促裂解，这将允许去除阻断结构域和在修饰过程中在捕获探针的3'末端添加的任何其他核苷酸。去除阻断结构域将揭示和/或恢复捕获探针的捕获结构域的游离3'末端。阻断结构域可以作为捕获探针的一部分合成(例如，如上所述，关于使用桥式扩增在固体基质上合成探针)或者可以原位添加到捕获探针中(即作为现有阵列的修饰)，例如通过连接阻断结构域。

可以使用上述阻断机制的任何组合来阻断捕获探针。在这方面，显而易见的是，捕获结构域可以通过其3'末端固定捕获探针而“阻断”。

一旦生物样本例如组织样品)的核酸(例如片段化的基因组DNA)已被修饰以使其能够与捕获探针的捕获结构域杂交，捕获探针必须是未被阻断的，例如，通过解离阻断寡核苷酸，去除封端部分和/或阻断结构域。

为了将从阵列的每个特征获得的序列分析或转录组或基因组信息与生物样本(例如组织样品)的区域(即区域或细胞)相关联，生物样本相对于阵列上的特征定向。换句话说，将组织样品放置在阵列上，使得阵列上的捕获探针的位置可以与生物样本(例如组织样品)中的位置相关。因此，可以识别生物样本(例如组织样品)中的位置，每种捕获探针的位置(或阵列的每个特征)对应。换句话说，可以识别每种捕获探针的位置对应于生物样本(例如组织样品)中的哪个位置。例如，这可以通过固体基质(例如阵列)上存在的位置标记来完成，如下文所述。

方便地，但不是必须地，生物样本(例如组织样品)可以在与阵列接触后成像。这可以在生物样本(例如组织样品)的核酸在组合的释放和延伸步骤之前或之后进行。在一些实施方案中，生物样本(例如组织样品)在捕获探针与固体基质(例如阵列)的组合释放和延伸之前成像。在特别优选的实施方案中，生物样本(例如组织样品)在捕获探针与固体基质(例如阵列)的组合释放和延伸后成像。由于延伸的探针能够扩散通过残余组织，在汇集(即收集)从基质释放的分子(延伸探针)之前，没有必要从固体基质(例如阵列)上除去任何残留的组织。此外，例如当通过深度冷冻使用组织制备时，处理捕获的核酸的步骤(例如捕获探针的组合释放和延伸)可以用于从阵列表面移除一些组织。在这种情况下，如果在分析延伸探针的步骤之前进行的话，在汇集来自于固体基质的延伸的探针时可能需要分离收集的残留组织。这可以通过任何合适的方法(例如离心)实现。

因此，在一些实施方案中，该方法可包括从组合的延伸探针分离组织的步骤。

当处理捕获核酸的步骤用于从阵列表面移除一些组织时，生物样本(例如组织样品)的成像可以在处理步骤(例如组合的释放和延伸步骤)之前进行。一般而言，成像可以在生物样本(例如组织样品)接触固体基质后的任何时间发生，但在任何降解或除去生物样本(例如组织样品)的步骤之前。如上所述，这可能取决于生物样本(例如组织样品)。

有利地，固体基质(例如阵列)可包括标记以促进生物样本(例如组织样品)的定向或相对于固体基质(例如阵列)的特征的成像。用于标记固体基质(例如阵列)的任何合适的方法可以使用，使得当生物样本(例如组织样品)成像时可以被检测到。例如，产生信号(优选可见信号)的分子(例如荧光分子)可以直接或间接地固定在基质(例如阵列)表面上。优选地，基质(例如阵列)包括阵列表面上不同位置的至少两个标记，进一步优选至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个标记。方便地，可以使用几百甚至几千个标记。标记可以以图案形式提供，例如构成阵列的外边缘，如阵列特征的整个外边缘。可以使用其他信息模式，例如，分割阵列的线条。这可以有助于对准生物样本(例如组织样品)与阵列的图像，或实际上通常将阵列的特征与生物样本(例如组织样品)相关联。因此，标记物可以是固定化分子，信号给予分子可以与之相互作用以产生信号。

在代表性实例中，固体基质(例如阵列)可包括标记特征，例如固定在基质(例如阵列)上且标记的核酸可以与之杂交的核酸探针。例如，标记的核酸分子或标记核酸可以连接或偶联当经受特定波长(或波长范围)的光(即被激发)时能够发出荧光的化学部分。在对生物样本(例如组织样品)染色以使生物样本(例如组织样品)可视化或成像之前、同时或之后，这种标记核酸分子可以与基质(例如阵列)接触。然而，当生物样本(例如组织样品)成像时，标记物必须是可检测的。因此，在优选的实施方案中，可以使用用于使生物样本(例如组织样品)可视化的相同成像条件来检测标记。

在本发明特别优选的实施方案中，基质(例如阵列)包括与标记的(优选荧光标记的)标记核酸分子(例如寡核苷酸)杂交的标记特征。

然而，显而易见的是，位置标记的使用对于将从阵列的每个特征获得的序列分析或转录组或基因组信息与生物样本的区域(即区域或细胞)相关联(即比对生物样本和阵列特征)是不必要的。在这方面，可以将生物样本的拓扑结构与分析扩展探针产生的数据比对。例如，组织样本切片中的裂隙将对应于缺乏来自阵列上的特定特征的延伸探针，并且这可能足以比对生物样本与阵列上的特征。此外，在一些实施方案中，固体基质表面上的特征是可见的，特别是在使用高分辨率成像染色生物样本之后，从而使生物样本能够与阵列上的特征对齐。因此，在一些实施例中，阵列的特征可以被视为位置标记。

对生物样本(例如组织样品)进行成像的步骤可以使用本领域已知的任何方便的组织学方法，例如，光、明场、暗场、相衬(phase contrast)、荧光、反射、干涉、共聚焦显微镜或其组合。通常，生物样本(例如组织样品)在可视化之前被染色以提供不同区域(例如生物样本(例如组织样品)的细胞)之间的对比。使用的染色类型取决于生物样本(例如组织)的类型和待染色细胞的区域。这种染色方案是本领域已知的。在一些实施方案中，可以使用一种以上的染色来可视化(成像)生物样本(例如组织样品)的不同方面，例如组织样品的不同区域，特定细胞结构(例如细胞器)或不同细胞类型。在其他实施方案中，生物样本(例如组织样品)可以在没有染色样品的情况下被可视化或成像，例如，如果组织样品中含有提供足够对比度的颜料，或者如果使用特定形式的显微镜检查。

在优选的实施方案中，使用荧光显微镜观察组织样品或使组织样品成像。

在一些实施方案中，延伸捕获探针包括从捕获的(杂交的)RNA产生cDNA。应理解，这是指杂交核酸的互补链的合成，例如，基于捕获的RNA模板(该RNA与捕获探针的捕获结构域杂交)产生cDNA。因此，在延伸捕获探针的初始步骤中，例如cDNA的产生，捕获的(杂交的)核酸(例如RNA)作为延伸(例如逆转录)步骤的模板。

逆转录涉及通过逆转录酶从RNA(优选mRNA(信使RNA))合成cDNA(互补或拷贝DNA)的步骤。因此，可以认为cDNA是取出生物样本(例如组织样品)时细胞中存在的RNA的拷贝。即它代表在分离时在所述细胞中表达的所有或部分基因。

捕获探针(特别是捕获探针的捕获结构域)充当引物，用于产生与捕获探针杂交的核酸的互补链，例如用于逆转录的引物。因此，由延伸反应(例如逆转录反应)产生的核酸(例如cDNA)分子结合捕获探针的序列(即延伸反应，例如逆转录反应)，可以被视为间接标明或标记核酸的方法，例如，生物样本(例如组织样品)的转录物，其与阵列的每个特征接触或在特征附近，使得释放的捕获探针能够以局部方式结合转录物。如上所述，每种捕获探针包括定位结构域(特征识别标签)，其表示阵列的每个特征(或相邻特征组)的唯一序列。因此，所有在特定特征(或特定特征附近)合成的核酸(例如cDNA)分子将包含相同的核酸“标签”。

核酸(例如cDNA)在阵列的每个特征(或特定特征附近)处合成的分子可以代表与该特征接触(或在该特征附近)的生物样本(例如组织样品)的区或区域的基因组或表达的基因，例如组织或细胞类型或其组或亚组，并且可以进一步代表在特定条件下表达的基因，例如，在特定时间，在特定环境中，处于发展阶段或响应刺激等。因此，任何单一特征的cDNA(即由特定种类的捕获探针捕获)可以代表在单个细胞中表达的基因，或者如果该特征在细胞连接处与样品接触(或在其附近)，cDNA可以代表在一个以上细胞中表达的基因。类似地，如果单个细胞与多个特征接触(或在其附近)，则每个特征(即特定种类的延伸捕获探针)可代表在所述细胞中表达的基因的一部分。类似地，在其中捕获的核酸是DNA的实施方案中，任何单一特征(即特定种类的延伸捕获探针)可以代表单个细胞或多于一个细胞的基因组。或者，单个细胞的基因组可以由多个特征(即多种延伸的捕获探针)表示。

捕获探针的延伸，例如逆转录反应，可以使用本领域中存在的任何合适的酶和方案进行。然而，显而易见的是，没有必要提供用于合成第一核酸的引物(例如cDNA)链，因为捕获探针的捕获结构域充当引物(例如逆转录引物)。

优选地，在本发明的背景下，处理延伸的探针(例如cDNA)以包含双链DNA。处理延伸探针以产生双链DNA可以在单一反应中实现，以仅产生第二种DNA(例如cDNA)链，即产生双链DNA分子而不增加双链DNA分子的数量，或在扩增反应中产生多拷贝的第二链，其可以是单链DNA的形式(例如线性扩增)或双链DNA(例如cDNA)(例如指数扩增)。

第二链DNA(例如cDNA)的合成步骤可以在固体基质(例如阵列)上进行(即，在汇集延伸的分子之前)，既可以作为第二链合成的单独步骤，例如使用如下文更详细描述的随机引物，也可以作为扩增反应的初始步骤。或者，第一链DNA(即延伸探针)，例如，可以合并cDNA(包含即掺入捕获探针的链)和第二链合成，无论是作为不连续步骤还是在扩增反应中可以随后进行，例如，在一个单独的器皿或容器(例如PCR管)中进行的反应。

当第二链合成发生在固体基质(例如阵列)上时，该方法可包括在第二链合成之前去除捕获的核酸(例如RNA)的任选步骤，例如使用RNA消化酶(RNase)，例如RNase H。对此的程序是本领域公知和描述的。然而，这通常不是必需的，并且在大多数情况下RNA自然降解。如果需要，可以使用RNase H来增加RNA去除的稳健性。

例如，在生物样本中，例如在包含大量RNA的组织样品中，产生双链cDNA的步骤可以产生足够量的cDNA，使其可以直接测序(在汇集延伸的探针的步骤之后)。在这种情况下，第二链cDNA合成可以通过本领域已知的任何方法实现，如下文所述。第二链合成反应可以在固体基质上进行，即在汇集延伸的探针之前(例如将延伸的探针转移到单独的器皿或容器，例如PCR管)或汇集延伸探针(例如cDNA)后。

在其他实施方案中，可能需要增强(即扩增)延伸的探针(例如合成的cDNA)，以产生足以用于分析(例如DNA测序)的量。在该实施方案中，延伸探针的第一链(例如cDNA分子)，其也包含阵列特征的捕获探针，作为扩增反应(例如聚合酶链式反应)的模板。扩增的第一反应产物是第二条DNA链(例如cDNA)，其本身将作为扩增反应的进一步循环的模板。

在上述任一实施方案中，第二条DNA链(例如cDNA)将包含捕获探针的互补序列。如果捕获探针包含扩增结构域，那么这可以用于DNA(例如cDNA)的后续扩增和序列分析，例如扩增反应可包括与扩增结构域具有相同序列的引物，即与扩增结构域的互补序列互补(即杂交)的引物。鉴于扩增结构域位于捕获探针的定位结构域的上游(在延伸的探针中，例如第一条cDNA链)，定位结构域的互补序列将被掺入DNA(例如cDNA分子)的第二条链中。

在第二条DNA(例如cDNA)链在单一反应中产生的实施方案中，第二链合成可通过任何合适的方法实现。例如，第一链cDNA(即延伸探针)可以与随机引物(例如六聚体引物)和DNA聚合酶(优选链置换聚合酶，例如klenow(exo))一起温育，在足以进行模板化DNA合成的条件下进行。该过程将产生不同长度的双链cDNA分子，并且不可能产生全长cDNA分子，即对应于合成其所来源的整个mRNA的cDNA分子。随机引物将在随机位置(即在序列内而不是在序列末端)与第一链cDNA分子(即延伸探针)杂交。

如果需要产生全长DNA(例如cDNA)分子，即对应于整个捕获的核酸(例如RNA)分子(如果是核酸(例如RNA)在组织样品中部分降解，然后捕获的核酸(例如RNA)分子不是“全长”转录物或与基因组DNA的初始片段长度相同的长度，然后可以修饰延伸探针(例如第一链cDNA)分子的3'末端。例如，可以将接头或连接器连接至cDNA分子的3'末端。这可以使用单链连接酶如T4 RNA连接酶或Circligase^TM(Epicenter Biotechnologies)来实现。

或者，使用双链连接酶如T4DNA连接酶，第二链合成辅助探针(能够与第一链cDNA分子的3'末端杂交的部分双链DNA分子)可以连接至延伸探针(例如第一链cDNA)分子的3'末端。适用于连接步骤的其他酶是本领域已知的，包括例如Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Thermococcus sp.(菌株9°N)DNA连接酶(9°N^TMDNA连接酶，New England Biolabs)和Ampligase^TM(Epicentre Biotechnologies)。第二链合成辅助探针还包含特定序列，第二链DNA(例如cDNA)从该特定序列合成，可以使用与辅助探针的部分互补的引物引发，所述辅助探针与延伸探针(例如第一链cDNA)连接。另一种替代方案包括使用末端转移酶活性酶掺入多核苷酸尾部，例如在延伸探针(例如第一链cDNA)分子的3'末端的poly-A尾。可以使用poly-T引物引发第二链合成，所述poly-T引物还可以包含用于进一步扩增的特定扩增结构域。产生“全长”双链DNA(例如cDNA)分子(或最大长度的第二链合成)的其他方法，在本领域中是公知的。

在一些实施方案中，第二链合成可以使用模板转换的方法，例如，使用的SMART^TM技术。SMART(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template，RNA模板5'末端的转换机制)技术在本领域中已经很好地建立，并且基于逆转录酶(例如Superscript II(Invitrogen))的发现能够在延伸的cDNA分子的3'末端添加几个核苷酸，即产生在3'末端具有单链DNA突出端的DNA RNA杂合体。DNA突出端可以提供寡核苷酸探针可以与之杂交的靶序列，以提供用于进一步延伸cDNA分子的额外模板。有利地，与cDNA突出端杂交的寡核苷酸探针含有扩增结构域序列，其互补序列掺入合成的第一链cDNA产物中。含有扩增结构域序列的引物可以加入到反应混合物中，该扩增结构域序列将与掺入cDNA第一链的互补扩增结构域序列杂交，以使用合适的聚合酶和cDNA第一链作为模板引发第二链合成。该方法避免了将衔接子连接至cDNA第一链的3'末端的需要。虽然模板转换最初是针对具有5'封端结构的全长mRNA开发的，但是已经证明它与没有封端结构的截短mRNA同样良好地起作用。因此，模板转换可用于本发明的方法中以产生全长和/或部分或截短的cDNA分子。因此，在本发明的一个优选实施方案中，第二链合成可以利用模板转换或通过模板转换实现。在一个特别优选的实施方案中，在固体基质上(即在汇集延伸的探针之前)进行模板转换反应，即cDNA第一链的进一步延伸以掺入互补的扩增结构域。优选地，第二链合成反应也在固体基质上的溶液中进行。

在一些实施方案中，在扩增和/或分析(例如序列分析)之前处理双链延伸探针以除去任何未延伸的捕获探针可能是有利的。这可以通过本领域已知的任何合适的方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，例如外切核酸酶或纯化柱。因此，在一些实施方案中，该方法还包括处理延伸的探针以去除未延伸的捕获探针的步骤。例如，这可以在汇集扩展探针的步骤之后。

在可能需要或有利于增强、富集或扩增DNA(例如cDNA)分子的实施方案中，扩增结构域可以掺入DNA(例如cDNA)分子中。如上所述，当捕获探针包含扩增结构域时，第一扩增结构域可以掺入延伸的探针(例如cDNA分子的第一链)中。在这些实施方案中，第二链合成可以包含第二扩增结构域。例如，用于产生第二链cDNA的引物(例如随机六聚体引物)，poly-T引物，与第二链合成辅助探针互补的引物，在其5'末端可以包含扩增结构域，即扩增引物可以与之杂交的核苷酸序列。因此，得到的双链DNA可以包含在双链DNA(例如cDNA分子)的每个5'末端或朝向每个5'末端的扩增结构域。这些扩增结构域可以用作扩增反应(例如PCR)中使用的引物的靶标。或者，接头或连接器连接至延伸探针(例如第一链cDNA分子)的3'末端可包含第二扩增结构域。类似地，可以通过模板转换将第二扩增结构域掺入第一链cDNA分子中。

在捕获探针不包含扩增结构域的实施方案中，cDNA分子的第二链可以是根据以上描述合成。可以修饰得到的双链DNA分子，以在第一DNA(例如cDNA链(第一扩增结构域))的5'末端掺入扩增结构域，如果在第二链DNA(例如cDNA)合成步骤中没有掺入，则在第二DNA(例如cDNA链(第二扩增结构域))的5'末端。可以掺入这样的扩增结构域，例如，通过将双链衔接子连接至DNA(例如cDNA)分子的末端。适用于连接步骤的酶是本领域已知的，包括例如Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Thermococcus sp.(菌株9°N)DNA连接酶(9°N^TMDNA连接酶，New England Biolabs)和Ampligase^TM(Epicentre Biotechnologies)和T4DNA连接酶。在优选的实施方案中，第一和第二扩增结构域包含不同的序列。

由上可知，通过本领域已知的各种方法和技术以及这些技术的组合，例如通过使用包括扩增结构域的引物、衔接子的连接、末端转移酶的使用和/或通过模板转换方法，可以将该扩增结构域添加到扩展探针(即DNA分子(例如cDNA分子))或它们的互补物(例如第二链)中。从本文的讨论中可以清楚地看出，这些结构域可以在汇集(即转移到单独的器皿或容器中，例如PCR管)延伸的探针之前或之后加入。

从上面的描述中可以明显看出，通过本发明的方法合成的单一固体基质(例如阵列)的所有的DNA(例如cDNA分子)可以全部包含相同的第一和第二扩增结构域。因此，单一的扩增反应(例如PCR)可能足以扩增所有DNA(例如cDNA)分子。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法可以包括扩增DNA(例如cDNA分子)的步骤。在一个实施方案中，扩增步骤在延伸的探针(例如cDNA分子)被汇集之后进行。在其他实施方案中，扩增可以在汇集延伸的探针之前(即在固体基质(例如阵列)上)进行。本领域已知，通过在基质表面上形成孔以包含溶液或通过将基质浸入溶液中，可以在固体基质(例如阵列)上进行扩增反应。实际上，存在用于进行这种反应的片上热循环仪。因此，在一个实施方案中，本领域已知为测序平台或用于任何形式的序列分析(例如在下一代测序技术中或通过下一代测序技术)的阵列可用作本发明阵列的基础(例如Illumina珠阵列、流动池等，如上所述)。

对于第二DNA(例如cDNA)链的合成，如果延伸的探针包含部分双链核酸分子，则优选使用链置换聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Bst(exo^-)DNA聚合酶、klenow(exo^-)DNA聚合酶。例如，在其中捕获探针通过表面探针间接固定在阵列的基质上的实施方案中，延伸的探针可以是至少部分双链的(例如DNA:DNA，DNA:RNA或DNA:DNA/RNA杂交体)。链置换聚合酶是必要的，以确保第二个cDNA链合成将定位结构域(特征识别结构域)的互补序列整合到第二DNA(例如cDNA)链中。

如上所述，可以看出本发明的方法包括汇集(收集或回收)扩展探针(例如cDNA分子)(包括双链cDNA分子)和/或它们的扩增子的步骤。如上所述，在固体基质上扩增的情况下，延伸的探针可以包括延伸探针(例如cDNA)的扩增子。

已经汇集的扩展探针(即DNA(例如cDNA分子)或扩增子(可以如上所述进行修饰)进行分析以进行研究(例如确定它们的序列，尽管如上所述不需要实际序列测定而可以使用任何分析序列的方法)。因此，可以使用任何核酸分析方法。序列分析的步骤可以识别定位结构域，并因此允许分析的分子定位于生物样本(例如组织样品)中的位置。类似地，可以确定分析的分子的性质或身份。以这种方式，核酸(例如RNA)在阵列中的给定位置并因此在生物样本(例如组织样品)中可以确定。因此，分析步骤可包括或使用识别分析的分子(并因此识别“靶”分子)及其定位结构域的任何方法。通常，这种方法是序列特异性方法。例如，该方法可以使用序列特异性引物或探针，特别是对定位结构域特异的引物或探针和/或待检测或分析的特定核酸分子(例如对应于核酸(例如待检测的RNA或cDNA分子)的DNA分子)。通常在这种方法中，可以使用序列特异性扩增引物(例如PCR引物)。

在一些实施方案中，可能需要分析靶标相关分子的子集或家族，例如，共享序列相似性和/或保守结构域的编码特定蛋白质组(例如，一个受体家族)的所有序列。因此，本文所述的扩增和/或分析方法可以使用简并或基因家族特异性引物或探针，其与延伸探针的子集或由其衍生的核酸(例如扩增子)杂交。在特别优选的实施方案中，扩增和/或分析方法可以利用通用引物(即所有捕获序列共有的引物)与对靶分子子集特异的简并或基因家族特异性引物组合。

因此，在一个实施方案中，使用基于扩增(尤其是基于PCR)的序列分析方法。

然而，修饰和/或扩增延伸探针(例如cDNA分子)的步骤可以将额外的组分引入样品中，例如，酶、引物、核苷酸等。因此，在序列分析之前，本发明的方法可以进一步包括纯化包含延伸探针(例如cDNA分子)或其扩增子的样品的步骤，例如，去除可能干扰测序反应的寡核苷酸引物、核苷酸、盐等。任何合适的纯化扩展探针(例如cDNA分子)的方法可以使用。

释放的DNA分子的序列分析可以是直接的或间接的。因此，序列分析基质(可以被视为经历序列分析步骤或过程的分子)可以是直接延伸的探针，或者可以是由其衍生的分子。因此，例如在涉及测序反应的序列分析步骤的背景下，测序模板可以是延伸的探针，或者可以是由其衍生的分子。例如，第一和/或第二链DNA(例如cDNA分子)可以直接进行序列分析(例如测序)，即可以直接参与序列分析反应或过程(例如测序反应或测序过程，或者是测序或以其他方式鉴定的分子)。或者，延伸的探针可以在序列分析(例如测序或通过其他方法鉴定)之前进行第二链合成或扩增的步骤。因此，序列分析基质(例如模板)可以是延伸探针的扩增子或第二链。

可以对双链分子的两条链进行序列分析(例如测序)，但本发明不限于此，可以分析(例如测序)单链分子(例如cDNA)。例如，各种测序技术，例如Helicos或Pacbio技术或正在开发的纳米孔测序技术，可用于单分子测序。因此，在一个实施方案中，延伸的探针(即第一条DNA链(例如cDNA))可以进行测序。第一链DNA(例如cDNA)可能需要在3'末端修饰cDNA以进行单分子测序。这可以通过类似于处理第二DNA(例如cDNA)链的方法完成。这些方法在本领域中是已知的。

在本发明的一个优选方面，序列分析将鉴定或揭示延伸探针的至少一部分，包括至少部分捕获的核酸(例如RNA)序列和定位结构域的序列。定位结构域(或标签)的序列将识别捕获探针从其释放的特征(或相邻特征组)，并因此识别固体基质上核酸(例如mRNA)分子被捕获的位置或其附近。捕获的核酸(例如RNA)分子的序列与生物样本(例如组织样品)来源的生物体的序列数据库进行比较，确定它所对应的基因。通过确定生物样本(例如组织样品)的哪个区域(例如细胞)与特征接触，可以确定生物样本(例如组织样品)的哪个区域表达所述基因(或含有基因，例如在空间基因组学的情况下)。可以对通过本发明的方法产生的所有DNA(例如cDNA)分子实现该分析，产生生物样本(例如组织样品)的空间转录组或基因组。

作为代表性实例，可以分析测序数据以将序列分类成特定种类的捕获探针，即根据定位结构域的序列。这可以通过例如以下方式实现。使用FastX工具包FASTQ条形码分离器工具将序列分类为各个捕获探针定位结构域(标记)序列的单个文件。可以分析每一种类的序列，即来自每个特征(或相邻特征的组)的序列，以确定转录物的身份。例如，可以使用例如Blastn软件鉴定序列，用于将序列与一个或多个基因组数据库进行比较，优选用于获得的生物样本(例如组织样品)的生物样本的数据库。将与本发明方法产生的序列具有最大相似性的数据库序列的同一性分配给所述序列。通常，仅认为具有至少1e^-6，优选1e^-7、1e^-8或1e^-9的确定性的匹配会被看作是成功识别。

显然，任何核酸测序方法都可用于本发明的方法中。然而，所谓的“下一代测序”技术将在本发明中尤为适用。高通量测序在本发明的方法中特别有用，因为它使得大量核酸能够在非常短的时间内部分测序。鉴于最近完全或部分测序的基因组数量的激增，对延伸探针(例如cDNA分子)的全长进行测序以确定每个分子对应的基因并不是必需的。例如，DNA(例如cDNA)分子的每个末端的前100个核苷酸应该足以鉴定捕获探针被释放的特征，并因此识别固体基质上核酸(例如mRNA)分子被捕获的位置或附近(即其在固体基质(例如阵列)上的位置)并表达基因。来自DNA(例如cDNA)分子的“捕获探针末端”的序列反应产生定位结构域的序列和至少约20个碱基，优选30或40个碱基的转录物或基因特异性序列数据。来自“非捕获探针末端”的序列反应可产生至少约70个碱基，优选80、90或100个碱基的转录物或基因特异性序列数据。

在一些实施方案中，可能需要对通过本发明方法产生的全长扩展探针进行测序。如上所述，模板转换对于产生全长双链cDNA分子特别有用，并且在一些实施方案中，对这些分子的全长进行测序可能是理想的或有利的。可以使用任何合适的测序技术对全长DNA分子进行测序，代表性实例如下所示。

作为代表性实例，测序反应可以基于可逆染料-终止剂，例如在Illumina^TM技术中使用的。例如，首先将DNA分子连接至例如玻璃或硅载玻片上的引物并扩增以形成局部克隆集落(桥式扩增)，如上所述的。添加四种类型的ddNTP，并且洗去未掺入的核苷酸。与焦磷酸测序不同，DNA一次只能扩增一个核苷酸。相机拍摄荧光标记的核苷酸的图像，然后染料以及末端3'阻断剂从DNA中化学除去，允许下一个循环。可以重复该步骤直到获得所需的序列数据。使用该技术，可以在单个载玻片上同时测序数千种核酸。

其他高通量测序技术可同样适用于本发明的方法，例如，焦磷酸测序。在该方法中，DNA在油溶液中的水滴内扩增(乳液PCR)，每个液滴含有连接至单个引物包被的珠粒上的单个DNA模板，然后形成克隆群落。测序仪器包含许多皮升体积的孔，每个孔含有单个珠粒和测序酶。焦磷酸测序使用荧光素酶产生光以检测添加到新生DNA中的各个核苷酸，并且组合的数据用于产生序列读数。

开发中的技术的一个例子是基于在DNA聚合过程中释放的氢离子的检测。含有待测序的模板DNA链的微孔充满单一类型的核苷酸。如果引入的核苷酸与前导模板核苷酸互补，则将其掺入生长的互补链中。这导致氢离子的释放，其触发超敏感离子传感器，这表明发生了反应。如果模板序列中存在均聚物重复，则将在单个循环中掺入多个核苷酸。这导致相应数量的释放的氢离子和比例更高的电子信号。

因此，显然可以获得新的测序格式，并且这些平台的主要特征之一的较短的运行时间，显然其他测序技术将可用在本发明的方法中。

如上所述，本发明的基本特征是延伸捕获探针以产生“捕获的”核酸分子(即与捕获探针的捕获结构域杂交的分子)的互补链的步骤，例如对捕获的RNA分子进行逆转录。逆转录反应是本领域熟知的，并且在代表性的逆转录反应中，反应混合物包括逆转录酶、dNTP和合适的缓冲液。如上所述，在优选的实施方案中，逆转录反应混合物还包括用于从固体基质表面释放所述捕获探针的工具，例如裂解酶(如USER酶)。反应混合物可以包含其他组分，例如RNase抑制剂、DNA依赖性DNA合成的抑制剂(例如放线菌素D)。引物和模板是捕获探针的捕获结构域和如上所述的捕获的RNA分子。在主题方法中，每种dNTP通常以约10至5000μM，通常约20至1000μM的量存在。可以在适于延伸捕获探针和从固体基质上裂解所述探针的条件下，将反应混合物在固体基质上温育。通常，反应混合物可以在固体基质上温育至少1小时，例如1-2小时或2、3、4或更多小时。然而，较短的温育时间可能是足够的，例如大约30分钟，如10-30分钟、15-30分钟等。显而易见的是，可以使用具有DNA聚合酶活性的酶进行等同反应以产生捕获的DNA分子的互补链。这种类型的反应在本领域中是公知的，并在下面更详细地描述。

在一些实施方案中，在延伸反应(例如逆转录反应)中使用标记的dNTP可能是有用的或有利的。标记的dNTP将掺入合成的DNA分子(例如cDNA分子)中，从而标记延伸的探针。在代表性实施方案中，标记的dNTP是荧光标记的dNTP，例如Cy3-dCTP。

因此，在一些实施方案中，该方法还包括标记步骤(c)中产生的延伸探针的步骤。在一些实施方案中，标记步骤可以与所述延伸步骤同时进行，即通过将标记的核苷酸掺入延伸的探针中。在一些实施方案中，标记步骤可以在延伸步骤之后，例如，通过在第二链合成和/或扩增步骤中使用标记的核苷酸，从而将标记的核苷酸掺入第二链(即，扩展探针的互补链)和/或其扩增子。或者，标记物(可检测分子)可以掺入到标记物中通过结合分子(例如通过插入)来合成cDNA。

在包括荧光核酸染色剂的实施方案中，代表性可检测分子或许是可用的。荧光核酸染色剂例如菲啶鎓染料，包括其单体或其同源二聚体或异二聚体，当与核酸复合时产生增强的荧光。菲啶鎓染料的实例包括乙锭同型二聚体、溴化乙锭、碘化丙锭和其他烷基取代的菲啶鎓染料。在本发明的另一个实施方案中，核酸染色剂是或包含吖啶染料或其同源或异源二聚体，例如吖啶橙、吖啶同二聚体、乙锭-吖啶异二聚体或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本发明的另一个实施方案中，核酸染色剂是吲哚或咪唑染料，例如Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580(BIOPROBES 34,Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.,(2000年5月)DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其他允许的核酸染色剂包括但不限于7-氨基放线菌素D、羟基芪嘧啶、LDS 751、选择的补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金属络合物如钌络合物和过渡金属络合物(例如掺入Tb³⁺和Eu³⁺)。在本发明的某些实施方案中，核酸染色剂是花青染料或花青染料的同二聚体或异二聚体，当与核酸结合时产生增强的荧光。可以使用Lee(1989)的美国专利4,522,587、Yue等(1996)的美国专利5,582,977、Yue等(1994)的美国专利5,321,130、Yue等(1995)的美国专利5,410,030(所有该四篇专利通过引用并入本文)中描述的任何染料，包括可从Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg商购的商标为TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、PO-PRO和YO-PRO的核酸染色剂。可以使用Haugland等(1995)的美国专利5,436,134、Yue等(1997)的美国专利5,658,751以及Haugland等(1999)的美国专利5,863,753(所有该三篇专利通过引用并入本文)中描述的任何染料，包括可从Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg商购的商标为SYBR Green、SYBR Gold、EvaGreen、SYTO、SYTOX、PICOGREEN、OLIGREEN和RIBOGREEN的核酸染色剂。在本发明的其他实施方案中，核酸染色剂是单体、同型二聚体或异二聚体花青染料，其掺入氮杂或聚氮杂苯并唑杂环，例如氮杂苯并噁唑、氮杂苯并咪唑或氮杂苯并噻唑，当与核酸结合时产生增强的荧光，包括从Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.商购的商标为SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、LO-PRO的核酸染色剂。可以基于其结合单链或双链核酸的能力来选择核酸染色的类型。在标记第一cDNA链的实施方案中，优选使用能够标记单链核酸分子的核酸染色剂作为在基质上捕获并用于模板cDNA合成的RNA转录物可以部分或完全降解。

在空间转录组学和基因组学方法的背景下标记和检测标记的DNA分子的其他实施方案描述于WO2014/060483，其通过引用并入本文。

逆转录酶反应可以在任何合适的温度下进行，这取决于酶的性质。通常，逆转录酶反应在37-55℃之间进行，尽管该范围之外的温度也可能是合适的。反应时间可短至1、2、3、4或5分钟或多达48小时。通常，根据选择，反应进行5-120分钟，优选5-60、5-45或5-30分钟或1-10或1-5分钟。反应时间并不重要，可以使用任何所需的反应时间。

如上所述，该方法的某些实施方案包括扩增步骤，其中产生的DNA(例如cDNA)分子的拷贝数，例如为了富集样品以获得更好地表现从生物样本(例如组织样品)中捕获的核酸(例如转录物)。根据需要，扩增可以是线性的或指数的，其中感兴趣的代表性扩增方案包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)；等温扩增等。

聚合酶链式反应(PCR)在本领域中是公知的，描述于美国专利4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,512,462中，其公开内容在此引入并入本文。在代表性的PCR扩增反应中，反应混合物包括可以合并的上述延伸探针(例如cDNA分子)，其与引物延伸反应(例如与第一和/或第二扩增结构域(例如在几何(或指数)扩增中使用的引物或在线性扩增中使用的单一引物)杂交的PCR引物)中使用的一种或多种引物组合。延伸探针(例如cDNA分子)接触的寡核苷酸引物(下文中为方便起见称为模板DNA)将具有足够的长度以在退火条件下提供与互补模板DNA的杂交(下面更详细地描述)。引物的长度取决于扩增结构域的长度，但通常长度至少为10bp，通常至少15bp，更通常至少16bp，可长达30bp的长度或更长，其中引物的长度通常为18-50bp，通常长度为约20-35bp。模板DNA可以与单一引物或一对引物(正向和反向引物)接触，这取决于是否需要模板DNA的引物延伸、线性或指数扩增。

除上述组分外，本发明方法中产生的反应混合物通常包括聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。可以通过一种或多种不同的聚合酶提供所需的聚合酶活性。在许多实施方案中，反应混合物包括至少A族聚合酶，其中感兴趣的代表性A族聚合酶包括但不限于：栖热水生菌(Thermus aquaticus)聚合酶，包括天然聚合酶(Taq)及其衍生物和同系物，例如Klentaq(如Barnes等,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1994)91:2216-2220)所述。嗜热细菌(Thermus thermophilus)聚合酶，包括天然聚合酶(Tth)及其衍生物和同系物，以及类似物。在某些实施方案中，进行的扩增反应是高保真反应，反应混合物可以进一步包括具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶，例如，可以由B族聚合酶提供，其中感兴趣的B族聚合酶包括但不限于：Perler等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:5577-5581中所述的海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)；热球菌属菌种GB-D(Pyrococcusspecies GB-D)(Deep Vent)；Lundberg等在Gene(1991)108:1-6中所述的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)，乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)以及类似物。当反应混合物包括A族和B族聚合酶时，A族聚合酶可以以大于B族聚合酶的量存在于反应混合物中，其中活性差异通常至少为10倍，并且更通常至少约100倍。通常，反应混合物包括对应于存在的四种天然存在的碱的四种不同类型的dNTP，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在主题方法中，每种dNTP通常以约10至5000μM，通常约20至1000μM的量存在。

在本发明方法的逆转录酶和/或扩增步骤中制备的反应混合物可以进一步包括含水性缓冲介质，其包括一价离子源、二价阳离子源和缓冲剂。可以使用任何方便的单价离子源，例如KCl、醋酸钾、醋酸铵、谷氨酸钾、NH₄Cl、硫酸铵等。二价阳离子可以是镁、锰、锌等，其中阳离子通常是镁。可以使用任何方便的镁阳离子源，包括MgCl₂、醋酸镁等。存在于缓冲液中的Mg²⁺的量可以为0.5-10mM，但优选为约3-6mM，并且理想值为约5mM。可存在于缓冲液中的代表性缓冲剂或盐包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三甲基甘氨酸(Tricine)、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、丙磺酸(MOPS)等，其中缓冲剂的量通常为约5-150mM，通常为约10-100mM，更通常约20-50mM，其中在某些优选的实施方案中，缓冲剂的存在量足以提供约6.0-9.5的pH，其中最优选的是在72℃的pH为7.3。可存在于缓冲介质中的其他试剂包括螯合剂，例如EDTA，EGTA等。

在本主题方法的制备逆转录酶、DNA延伸或扩增反应混合物的步骤中，各种组成成分可以以任何方便的顺序组合。例如，在扩增反应中，可以先向缓冲液中加入引物、聚合酶，然后是模版DNA，或者同时混合所有的各种成分来制备反应混合物。

如上所述，本发明的一个优选实施例中，延伸的探针(例如cDNA分子)可以通过向核酸分子末端添加扩增结构域来修饰，这可能涉及连接反应。

如本领域所知，连接酶催化在两个紧邻的核酸的并置的3'-羟基和5'-磷酸末端之间形成磷酸二酯键。可以使用任何方便的连接酶，其中感兴趣的代表性连接酶包括但不限于：热敏性和热稳定性连接酶。热敏性连接酶包括但不限于：噬菌体T4DNA连接酶、噬菌体T7连接酶和大肠杆菌连接酶。热稳定性连接酶包括但不限于：Taq连接酶、Tth连接酶和Pfu连接酶。热稳定性连接酶可以从嗜热或者超嗜热的生物中获得，包括但不限于：原核生物、真核生物或古细菌生物。某些RNA连接酶也可用于本发明的方法中。

在该连接步骤中，将合适的连接酶和任何必需和/或需要的试剂与反应混合物合并，并保持在足以发生连接相关寡核苷酸的条件下。连接反应条件是本领域技术人员熟知的。在连接期间，在某些实施方案中，反应混合物可以保持在约4℃至约50℃，例如约20℃至约37℃的温度下持续约5秒至约16小时的时间，例如约1分钟至约1小时。在其他实施方案中，反应混合物可以保持在约35℃至约45℃的温度，例如约37℃至约42℃，例如，在或约38℃、39℃、40℃或41℃，持续时间范围为约5秒至约16小时，例如约1分钟至约1小时，包括约2分钟至约8小时。在代表性实施方案中，连接反应混合物包含50mM Tris pH7.5、10mMMgCl₂、10mM DTT、1mM ATP、25mg/ml BSA、0.25单位/ml RNase抑制剂和0.125单位/mlT4DNA连接酶。在另一个代表性的实施方案中，使用包含2.125mM镁离子、0.2单位/ml RNase抑制剂以及0.125单位/ml的DNA连接酶。反应中的衔接子的量将取决于样品中DNA(例如cDNA)的浓度，并且通常在DNA(例如cDNA)的摩尔含量的10-100倍之间。

作为代表性示例，本发明的方法可包括以下步骤：

(a)提供其上固定有多种捕获探针的固体基质，使得每种捕获探针占据固体基质上的不同位置，其中所述探针用于逆转录引物延伸反应(优选地，所述探针在所述固体基质上定向以具有游离的3'末端)并且每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包含：

(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，

(ii)对应于捕获探针在固体基质上的位置的定位结构域，和

(iii)捕获结构域；

(b)使所述固体基质与生物样本接触；

(c)将生物样本在固体基质上成像；

(d)在允许生物样本的RNA与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从固体基质的表面释放所述捕获探针，并且同时和/或随后使用与捕获探针杂交的RNA作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针(cDNA分子)，从而在空间上标记生物样本的RNA；

(e)在延伸探针上进行第二链cDNA合成；

以及

(f)分析所述延伸探针，例如，所述延伸探针(cDNA分子)的序列。

作为替代的代表性示例，本发明的方法可以包括以下步骤：

(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，

(ii)对应于捕获探针在固体基质上的位置的定位结构域，和

(iii)捕获结构域；

(b)使所述固体基质与生物样本接触；

(c)任选地使组织样品再水合；

(e)将生物样本在固体基质上成像；

(f)扩增延伸探针；以及

(g)分析扩增的延伸探针，例如扩增的延伸探针(cDNA分子)的序列。

作为又一代表性示例，本发明的方法可包括以下步骤：

(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，

(ii)对应于捕获探针在固体基质上的位置的定位结构域，和

(iii)捕获结构域；

(b)使所述固体基质与生物样本接触；

(c)任选地使组织样品再水合；

(e)任选地将生物样本在固体基质上成像；

(f)在延伸探针上进行第二链cDNA合成；

(g)任选地汇集来自(f)的双链延伸探针；

(h)扩增来自(f)或(g)的双链延伸探针；以及

(i)分析扩增的延伸探针，例如扩增的延伸探针(cDNA分子)的序列。

本发明包括上述方法中的步骤的任何合适组合。应该理解，本发明也包括这些方法的变体，例如在固体基质上进行扩增的情况。还包括省略成像步骤的方法以及包括将通过分析扩展探针(包括双链延伸探针和/或其扩增子)获得的序列分析信息与所述生物样本的图像相关联的步骤的方法。

如上所述，尽管主要参考RNA的检测或分析以及转录组分析或检测来描述本发明，但是应当理解，所描述的原理可以类似地应用于细胞中DNA的检测或分析以及基因组研究。因此，更广泛地看，本发明可以被视为通常适用于核酸的检测，并且在更具体的方面，提供用于分析或检测DNA的方法。空间信息在基因组学背景中也可能是有价值的，即具有空间分辨率的DNA分子的检测和/或分析。这可以通过根据本发明的基因组标记来实现。这种空间标记(例如局部或空间检测)方法可用于例如研究组织的不同细胞或区域中的基因组变异，例如比较正常和患病细胞或组织(例如正常与肿瘤细胞或组织)或在疾病进展中研究基因组的变化等。例如，肿瘤组织可包括异质细胞群，该细胞群在其包含的基因组变体(例如突变和/或其他遗传畸变，例如染色体重排、染色体扩增/缺失/插入等)方面有差异。在这样的背景下，以局部方式检测不同细胞中的基因组变异或不同基因组基因座可能是有用的，例如，可用于研究基因组变异的空间分布。这种方法的主要用途是在肿瘤分析中。在本发明的环境中，可以制备被设计为例如用于在捕获探针上从一个特征捕获整个细胞的基因组的固体基质(例如阵列)。因此可以比较生物样本(例如组织样品)中的不同细胞。当然，本发明不限于这样的设计，并且其他变化也是可能的，其中以局部方式检测DNA，并且从固体基质(例如阵列)释放的捕获探针捕获的DNA的位置与生物样本(例如组织样品)中的位置或位点相关。

在分析延伸探针(包括双链延伸探针和/或其扩增子)的步骤中获得的序列分析(例如测序)信息可用于获得关于样品中核酸的空间信息。换句话说，序列分析信息可以提供关于样品中核酸位置的信息。该空间信息可以从获得的序列分析信息(例如从确定或鉴定的序列)的性质中导出，例如，它可以揭示特定核酸分子的存在，所述特定核酸分子本身可以在所使用的组织样品的环境下具有空间信息，和/或该空间信息(例如空间定位)可以源自组织样本在阵列上的位置，与序列分析信息相结合。然而，如上所述，可以通过将序列分析数据与生物样本(例如组织样品)的图像相关联来方便地获得空间信息，这代表了本发明的一个优选实施方案。

步骤(c)中提到的延伸反应可以定义为聚合酶催化的延伸反应，并且用于获得“捕获的核酸分子”的互补链，即与捕获探针的捕获结构域杂交的核酸分子，即通过利用捕获探针作为引物和捕获的核酸作为模板合成互补链。换句话说，它可以是由任何聚合酶进行的任何引物延伸反应。因此，当捕获的核酸分子核酸是DNA(例如基因组DNA)时，聚合酶将是DNA聚合酶。

因此，在一些实施方案中，本发明提供的方法包括：

(a)提供其上固定有多种捕获探针的固体基质，使得每种捕获探针占据固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应(优选地，所述探针在所述固体基质上定向以具有游离的3'末端)并且所述捕获探针的每种包含核酸分子，所述核酸分子包含：

(i)用于从固体基质表面释放捕获探针的裂解结构域，

(ii)对应于捕获探针在固体基质上的位置的定位结构域，和

(iii)捕获结构域；

(b)使所述固体基质与生物样本接触；和

(c)在所述生物样本组织样品中片段化DNA，其中所述片段化在步骤(b)中使固体基质与生物样本接触之前、期间或之后进行；

(d)在允许生物样本的DNA与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从固体基质表面释放所述捕获探针，并同时和/或随后使用与捕获探针杂交的DNA作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针，从而在空间上标记生物样本的DNA；

(e)任选地产生所述标记DNA的互补链和/或任选地扩增所述标记的DNA；

(f)任选地汇集来自(d)的延伸探针(标记的DNA)或汇集来自步骤(e)的双链延伸探针(标记的DNA)和/或扩增子；以及

(g)分析来自(d)或(f)的扩展探针(标记的DNA)和/或来自步骤(e)或(f)的双链延伸探针(标记的DNA)和/或扩增子，例如延伸探针(标记DNA)和/或双链延伸探针(标记DNA)和/或扩增子的序列。

该方法还可以包括以下步骤：

(h)将所述序列分析信息与所述生物样本的图像相关联，其中生物样本在步骤(d)之前或之后成像，优选在步骤(d)之前成像。

在空间基因组学的背景下，其中靶核酸是DNA，在某些情况下可能优选包括成像和图像相关步骤。

在捕获DNA的实施方案中，DNA可以是可以在细胞中发生的任何DNA分子。因此，它可以是基因组的，即核、DNA、线粒体DNA或质粒DNA(例如叶绿体DNA)。在一个优选的实施方案中，DNA是基因组DNA。

应当理解，在步骤(b)中在接触之后(即在将生物样品置于固体基质(例如阵列)上之后)进行片段化时，片段化发生在DNA与捕获结构域杂交之前。换句话说，DNA片段与所述捕获探针中的捕获结构域杂交(或更具体地，允许杂交)。

如上所述，在一些实施方案中，优选生物样品中的(靶)核酸分子(特别是RNA)在生物样品与固体基质接触之前不被处理或修饰以增强或促进它们与捕获探针的相互作用，例如与作为生物样本的靶核酸和捕获探针之间的中间物的核酸接触或杂交，即所述核酸起到间接地将生物样本的靶核酸附接或连接至捕获探针的作用。然而，有利地，但不是必须地，在本发明该方面的一个特定实施方案中，生物样本(例如组织样品)的DNA片段可以具有结合结构域以使捕获探针能够捕获或促进它们的捕获。因此，结合结构域能够与捕获探针的捕获结构域杂交。因此，这样的结合结构域可以被认为是捕获结构域的互补(即，它可以被视为互补捕获结构域)，尽管不需要捕获和结合结构域之间绝对的互补性，仅仅是结合结构域具有足够的互补性以允许发生有效的杂交，即生物样本(例如组织样品)中的DNA片段能够与捕获探针的捕获结构域杂交。提供这样的结合结构域可以确保样品中的DNA直到片段化步骤之后才结合捕获探针。可以通过本领域熟知的方法将结合结构域提供给DNA片段，例如通过连接可能含有结合结构域的衔接子或接头序列。例如，可以使用具有突出末端的接头序列。结合结构域可以存在于这种接头的单链部分中，使得在接头与DNA片段连接后，含有结合结构域的单链部分可用于与捕获探针的捕获结构域杂交。或者，在一个优选的实施方案中，可以通过使用末端转移酶引入结合结构域以引入多核苷酸尾部，例如均聚物尾部，如poly-A结构域。这可以使用类似于上述用于在RNA方法的背景下引入第二扩增结构域的程序来进行。因此，在有利实施方案中，可以引入共同的结合结构域。换句话说，结合结构域是所有DNA片段共有的，并且可用于实现固体基质(例如阵列)上片段的捕获。如下所述，在一些实施方案中，可以在使DNA片段化的步骤期间(例如同时)将共同结合结构域引入DNA，例如其中使用转座酶(例如Tn5)将DNA片段化，共同结合结构域同时连接至DNA片段上。

当进行拖尾反应以引入(共同的)结合结构域时，捕获探针在固体基质(例如阵列)上，可以保护阵列不受拖尾反应的影响，即可以如上所述阻塞或掩蔽捕获探针。这可以通过例如将阻断寡核苷酸与捕获探针杂交来实现，例如与捕获探针的突出端(例如单链部分)杂交。例如，当捕获结构域包含poly-T序列时，这种阻断寡核苷酸可以是poly-A寡核苷酸。阻断寡核苷酸可具有封闭的3'末端(即不能延伸的末端，或尾部)。捕获探针也可以通过化学和/或酶修饰来保护(即被阻断)，如上文详细描述的。

因此，在本发明的一些实施方案中，该方法可包括向DNA片段提供能够与捕获结构域杂交的结合结构域的步骤。该步骤可以在片段化DNA的步骤之后(或同时)在释放和延伸捕获探针的步骤之前进行。在优选的实施方案中，如果与基质(例如阵列)接触，则在生物样品之后进行向DNA片段提供能够与捕获结构域杂交的结合结构域的步骤，即该步骤在基质上原位进行。

在上述DNA检测方法中，显然延伸捕获探针的步骤和产生标记DNA的互补拷贝或扩增标记DNA的任选步骤可能涉及或需要使用链置换聚合酶。例如，与捕获探针杂交的片段化DNA可以是部分双链DNA，因此捕获探针的延伸可能需要移除一条DNA链。上文讨论了合适的链置换聚合酶。在产生扩展探针的扩增探针的互补链和/或扩展探针的扩增子的背景下，链置换聚合酶的使用是确保将定位结构域复制到互补拷贝或扩增子中。特别是通过与表面探针杂交，捕获探针固定在固体基质(例如阵列)上的情况。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法可用于确定和/或分析组织样品的所有基因组，例如，组织样本的全局基因组。然而，该方法不限于此并且包括确定和/或分析全部或部分基因组。因此，该方法可以涉及确定和/或分析基因组的一部分或子集，例如，部分基因组对应于一子集或一组基因或染色体，例如，一组特定基因或染色体或特定区域或基因组的一部分，例如与特定疾病或病症、组织类型等有关。因此，与正常组织相比，或甚至在组织样品中的不同类型的细胞内，该方法可用于检测或分析来自肿瘤组织的基因组序列或基因组基因座。可以检查不同基因组变体或基因座在不同细胞、细胞群、组织或组织部分或类型中的存在或不存在，或分布或位置。

从另一个方面来看，上面提出的方法步骤可以被视为提供获得关于核酸(例如生物样本(例如组织样品)的基因组序列、变体或基因座)的空间信息的方法。换句话说，本发明的方法可用于标记(或标示)基因组，特别是个体或空间分布的基因组。

或者从另一个方面来看，可以将本发明的方法视为用于空间检测生物样本(例如组织样品)中的DNA的方法，或用于检测具有空间分辨率的DNA的方法，或用于生物样本(例如组织样品)中DNA的局部或空间测定和/或分析的方法。特别地，该方法可以用于生物样本(例如组织样品)中的基因或基因组序列或基因组变体或基因座(例如基因组变体或基因座的分布)的局部或空间检测或确定和/或分析。局部/空间检测/确定/分析意味着DNA可以定位于其天然位置或生物样本(例如组织样品)中的细胞或组织内的位置。因此，例如，DNA可以定位于细胞或细胞群，或样品中的细胞类型，或生物样本(例如组织样品)中特定区域的区域。可以确定DNA的天然位置或位点(或换句话说，DNA在生物样本(例如组织样品)中的位置或位点)，例如基因组变体或基因座。

在组织样品中片段化DNA的步骤可以使用本领域已知的任何所需方法进行。因此，可以使用物理破碎方法，例如，超声或超音处理。化学方法也是已知的。也可以使用酶促的片段化方法，例如，使用内切核酸酶(例如限制酶、或转座酶(例如Tn5)。用于此的方法和酶也是本领域熟知的。值得注意的是，转座酶，例如Tn5，可以有利地导致DNA的同时片段化和衔接子的连接(例如包含共同的结合结构域)到两条DNA片段的5'末端，这可以通过捕获探针促进片段化DNA的捕获，即连接至DNA的5'末端的衔接子可含有能够与捕获探针的捕获结构域相互作用(即杂交)的结构域。可以在制备生物样本(例如组织样品)期间或之后进行破碎用于放置在固体基质(例如阵列)上，例如制备组织切片。方便地，可以在固定组织的步骤中实现破碎。因此，例如，福尔马林固定将导致DNA的片段化。其他固定剂可能会产生类似的结果。

就制备和使用固体基质(例如阵列)的细节而言，在本发明的这些方面中，应理解在RNA方法的背景中以上给出的描述和细节类似地适用于更多本文所述的DNA检测方法。因此，上面讨论的所有方面和细节都类似地适用。例如，逆转录酶引物和反应等的讨论可以类似地应用于上文提到的延伸引物，DNA聚合酶反应等的任何方面。同样地，可以类似地将参考和第一和第二链cDNA合成应用于标记的DNA分子及其互补序列。可以使用如上所述的序列分析方法。

举例来说，捕获结构域可以如上文针对捕获探针所述。例如，可以使用poly-T或含poly-T的捕获结构域，其中DNA片段具有包含poly-A序列的结合结构域。

捕获探针/标记的DNA分子(即包含捕获的DNA分子的互补物的延伸探针)可以具有如上所述的扩增结构域。

附图说明

结合以下附图，参考以下非限制性实施例进一步描述本发明，其中：

图1显示了实施例2中描述的实验设计的示意图。

图2显示了根据实施例2中描述的方法在其上合成cDNA(掺入用Cy3标记的核苷酸)的阵列的荧光显微图像。(A)显示cDNA合成(C)和(D)后的图像或组合的cDNA合成和捕获探针(E)的释放。(B)显示延长的捕获探针(C)和(D)释放后或进一步的温育期(E)后的图像。

图3显示了条形图，其显示：(A)在单独的延伸和释放步骤(ST1.0)之后以及在组合的延伸和释放步骤(ST2.0)之后识别的唯一转录物的总数；(B)在单独的延伸和释放步骤(ST1.0)之后以及在组合的延伸和释放步骤(ST2.0)之后鉴定的独特基因的总数。

图4显示了热力图，其显示了使用以下方法从小鼠脑组织切片在每个特征处捕获的转录物数量：(A)单独的延伸和释放步骤(ST1.0)；(B)组合的延伸和释放步骤(ST2.0)。

图5显示了小鼠脑组织和Penk转录物的图像的叠加图，其中使用：(A)单独的延伸和释放步骤(ST1.0)；(B)组合的延伸和释放步骤(ST2.0)，在与所述组织接触的阵列上的特征处捕获所述Penk转录物。

具体实施方式

实施例1

下面描述的方案代表“标准”空间转录组学方法，其中cDNA合成步骤和延伸探针的释放分开进行，称为“ST1.0”。

用5'至3'定向探针制备内部印刷微阵列

将RNA捕获寡核苷酸(表1)印刷在载玻片上以充当捕获探针。用具有C6间隔区的5'-末端氨基接头合成探针。根据制造商(Surmodics)说明，将具有18聚体独特条形码的1007捕获寡核苷酸、9聚体半随机化UMI和聚-20TVN捕获区域排列在Codelink ActivatedSlides的表面上。将寡核苷酸固定在100μm特征中，微点之间具有200μm的中心距(间距)。根据载玻片制造商，在每个微点中固定了大约2亿个寡核苷酸。为了定向，阵列左上角的区域留空。每个载玻片制备六个6200×6600μm阵列。印刷后，根据制造商的说明进行表面粘连。

表1

探针1

收集和准备嗅球

使成年C57BL/6小鼠(>2个月大)安乐死并立即分离嗅球并在异戊烷中快速冷冻。在切片之前将组织包埋在冷OCT中。将嗅球在低温恒温器上切成厚度为10μm。将切片安装在空间条形码阵列上。

透化和逆转录

对于每个孔，对应于具有切片的每个亚阵列，加入70μl含有0.19μg/μl BSA(#B9000S，NEB)的1x外切核酸酶I反应缓冲液(#B0293S，NEB)并在37℃下温育30分钟。每个孔用100μl 0.1×SSC洗涤，在去离子水中从储备溶液(#S6639，Sigma-Aldrich)稀释。接下来，将70μl溶于0.1M HCl(#318965-1000ML，Sigma-Aldrich)的0.1％胃蛋白酶(#P7000-25G，Sigma-Aldrich)加入各孔中，并在37℃下温育10分钟。如前所述洗涤每个孔，并向每个孔中加入70μl逆转录混合物并温育过夜(ON)。

逆转录混合物含有1x第一链缓冲液(#18080-044，Invitrogen)，5mM DTT(#18080-044，Invitrogen)，500μM dATP/dGTP/dTTP，12.5μM dCTP，25μM Cananine3-dCTP(#NEL576001EA，PerkinElmer)，0.19μg/μl BSA，50ng/μl放线菌素D(#A1410-2MG，Sigma-Aldrich)，1％DMSO(#472301-500ML，Sigma-Aldrich)，20U/μl Superscript III(#18080-04，Invitrogen)和2U/μl RNaseOUT(#10777-019，Invitrogen)。透化进行2、10或30分钟。cDNA合成进行1小时、3小时、6小时或过夜。

为了降解和去除小鼠组织，将70μl蛋白酶K(#19131，Qiagen)和PKD缓冲液(pH7.5，根据制造商，#1034963，Qiagen)以1：7的比例加入到每个孔中并在56℃温育1小时。温育后，载玻片用含有0.1％SDS的2×SSC在50℃(#71736-100ML，Sigma-Aldrich)洗涤，然后在室温(RT)下用0.2×SSC和0.1×SSC洗涤，最后旋转干燥。

成像

使用Agilent微阵列扫描仪在100％曝光和5μm分辨率下在532nm处对阵列成像。

从阵列中释放cDNA

将阵列连接至ArrayIt载玻片架和16孔掩模(ArrayIt Corporation)。向每个孔中加入含有1x Exo I缓冲液(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)，1x BSA，RNase/DNase游离水，5U USER酶混合物(New England Biolabs)的裂解混合物(50μl)。用塑料密封剂覆盖反应，并在37℃下温育1小时，间隔以300rpm混合3秒并静置6秒。温育后，从每个使用的孔中收集45μl裂解混合物并置于0.2ml PCR管中。

实施例2

设计实验以确定同时执行延伸和释放步骤的效果。实验设计的示意图显示在图1中，其描绘了六种不同的处理：C1，C2，D1，D2，E1和E2。

C1和C2涉及上文实施例1中描述的“标准”方案，使用下面列出的cDNA合成混合物：

组织透化步骤包括用外切核酸酶缓冲液(C1)或包含外切核酸酶I的外切核酸酶缓冲液处理。

D1和D2仅在裂解步骤方面不同于C1和C2，其中裂解混合物包含在cDNA缓冲液混合物中的USER酶。裂解混合物如下：

E1和E2与C1和C2不同，因为cDNA合成混合物包括裂解酶，即USER酶。用于组合的(即同时的)cDNA合成和探针释放的反应混合物如下：

方案E1和E2不包括组织去除步骤。E方案在本文中也称为ST2.0。

对于每个孔，加入释放混合物并在37℃下温育1-2小时。

图2显示了在cDNA合成(A)后和裂解反应后约3小时，来自阵列表面的Cy3信号，即掺入延伸探针中的荧光标记。图2表明，如预期的，方案C导致阵列表面上的cDNA合成(A)和随后从阵列表面(B)释放延伸的探针。

方案D显示裂解酶(USER)能够在逆转录酶缓冲液中有效地起作用，因为延伸的探针从阵列表面释放，具有与方案C中的裂解反应类似的功效。

方案E显示捕获探针与cDNA合成同时成功裂解。在这方面，合并来自方案C和E的扩展探针并进行序列分析以证实cDNA在方案E中成功合成。

扩展探针混合物的收集

65μl的延伸探针混合物从每个使用的孔中收集并置于0.2ml PCR管中。

cDNA第二链合成用于制备用于测序的cDNA文库

加入5μl含有2.7x第一链缓冲液、3.71U/μlDNA聚合酶I(#18010-017，Invitrogen)和0.18U/μl RNaseH(#18021-014，Invitrogen)的第二链混合物，并将样品在16℃温育。在2小时内，加入5μl T4DNA聚合酶(#M0203S，NEB)并将样品在16℃下再温育20分钟。加入25μl去离子水或80mM EDTA(#15575-038，Invitrogen)并根据制造商的方案使用AgencourtRNACIean XP珠粒纯化(#A63987，Beckman Coulter)并洗脱到去离子水中。将5.6μl样品与10.4μl体外转录混合物混合，最终含量为1x T7反应缓冲液(#AM1333，Ambion)，7.5mM各NTP(#AM1333，Ambion)，1x T7酶混合物(#AM1333，Ambion)和1U/μl SUPERaseIN(#AM2694，Ambion)。将样品在37℃下温育14小时。

根据制造商的方案使用Agencourt RNACIean XP珠粒纯化样品，并洗脱到10μl去离子水中。根据制造商的方案，通过使用RNA 6000 Pico试剂盒(#5067-1513，Agilent)和2100生物分析仪(Agilent)测定扩增的RNA(aRNA)的量和平均片段长度。加入剩余样品和2.5μl连接接头，使终浓度为0.71μM。将样品在70℃加热2分钟，然后置于冰上，然后加入4.5μl连接混合物至最终含量为1×T4 RNA连接酶反应缓冲液(#B0216L，NEB)，20U/μl T4 RNA连接酶2，截短型(#M0242L，NEB)，4U/μl RNase抑制剂，鼠(#M0314L，NEB)和0.5μM连接衔接子。将样品在25℃下温育1小时。根据先前描述的方案使用Agencourt RNACIean XP珠粒纯化样品，并与1μl RT引物(IDT)混合至终浓度1.7μM和1μl dNTP，最终浓度0.83mM的每种dNTP。将样品在65℃加热5分钟，然后置于冰上，加入8μl逆转录混合物至最终含量为1x第一链缓冲液，0.05M DTT，500μM每种dNTP，1mM RT-引物，10U/μl Superscript III和2U/μlRNaseOUT。将样品在50℃温育1小时，然后置于冰上，随后根据前述方案使用AgencourtRNACIean XP珠粒纯化样品。总反应体积为10μl，含有1xKAPA HiFi HotStart ReadyMix(#KK2601，KAPA Biosystems)，1×EVA绿(#31000，Biotium)，0.5μM PCR InPE1.0(Eurofins)，0.01μM PCR InPE2.0(Eurofins)，0.5μM PCR Index(Eurofins)和2μl纯化的cDNA通过qPCR以下列方案扩增：98℃下3分钟，然后在98℃下循环20秒，在60℃下循环30秒和在72℃下循环30秒。在基于qPCR确定所需的循环量之后，在25μl的总反应体积中扩增样品。纯化文库并将样品在20μl洗脱缓冲液(#19086，Qiagen)中洗脱，并使用DNA 1000试剂盒(#5067-1504，Agilent)和2100生物分析仪根据制造商的方案测定成品文库的平均片段长度。根据制造商的方案，用Qubit dsDNA HS测定试剂盒(#Q32854，Life Technologies)测定最终文库的浓度。将完成的文库稀释至4nM，并根据制造商的方案使用配对末端测序在Illumina NextSeq平台上测序。通常，31或51个碱基在读数1上测序，121或101个碱基在读数2上测序。文库制备过程中使用的寡核苷酸是：

连接衔接子：

rApp]AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[ddC](SEQ ID NO:4)

第二逆转录引物：

TGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA(SEQ ID NO:5)

PCR引物InPE1.0：

ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:6)

PCR引物InPE2.0：

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:7)

PCR索引引物(Index primer)：

AAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTC(SEQ ID NO:8)

图3中的结果令人惊讶地证明了捕获探针的同时裂解和延伸(方案E，即ST2.0)导致产生的转录物(即扩展探针)总数增加(图3A)，并且检测到的独特基因数量增加，即捕获探针的同时裂解和延伸增强了从组织样品中捕获的核酸的多样性。

实施例3

使用含有定位结构域的捕获探针的阵列在小鼠脑组织上进行标准ST1.0方案(即单独的延伸和裂解反应)和ST2.0方案(即捕获探针的同时裂解和延伸)。图4显示了使用ST1.0(A)和ST2.0(B)对阵列上的每个特征获得的测序数据的热力图。图5显示了使用ST1.0(A)和ST2.0(B)获得的小鼠脑组织图像上的脑啡肽原(Penk)基因的表达数据的叠加图。

从图4中的数据可以明显看出，大多数延伸探针直接与阵列与组织样品接触的部分相关。因此，图4中的结果表明ST2.0方案中的释放引物能够与组织下的转录物相遇并杂交。此外，图4中的数据表明，相对于ST1.0方案，使用ST2.0方案延伸了更多数量的探针。

图5表明可以使用ST1.0和ST2.0方案在空间上检测来自Penk基因的独特转录物。两种方案均显示Penk转录物位于组织的中央梨形结构中，证明两种方案均促进来自生物样本的核酸分子的空间标记。

序列表

<110> 空间转录公司 AB

<120> 用于空间标记和分析生物样本中的核酸的方法

<130> FSP1V190843ZX

<150> 1619458.1

<151> 2016-11-17

<160> 8

<170> PatentIn 版本号 3.5

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> 小鼠白血病病毒(Murine leukemia virus)

<400> 1

gcttttcccc tcgagcgccc agactgggat tacaccaccc aggcaggtag gaaccaccta 60

gtccactatc gccagttgct cctagcgggt ctccaaaacg cgggcagaag ccccaccaat 120

ttggccaagg taaaagggat aacacaggga cctaatgagt ctccctcagc ctttttagag 180

agactcaagg aggcctatcg caggtacact ccttatgacc ctgaggaccc agggcaagaa 240

accaatgtgt ctatgtcatt catctggcag tctgccccgg atatcgggcg aaagttaggg 300

cggttagaag atttaaagag caagacctta ggagacttag ttagggaggc tgaaaagatc 360

tttaataaac gtgaaacccc ggaagaaaga gaggaacgta tcaggagaga aacagaggaa 420

aaagaagaac gccgtaggac agtggatgag cagaaagaga aagaaaggga ccgcagaaga 480

catagagaga tgagcaagct cttggccact gtagttattg gtcaggaaca ggatagacag 540

gagggagagc ggaagaggcc ccaacttgat aaggatcaat gcgcctactg caaagaaaag 600

gggcactggg ctaaagactg tcccaagaag ccacgagggc cccgaggacc caggccccag 660

acctccctcc tgaccttagg tgactaggga ggtcagggtc aggacccccc ccctgaaccc 720

aggataaccc tcaaagtcgg ggggcaaccc gtcaccttcc tggtagatac tggggcccaa 780

cactccgtgc tgacccaaaa tcctggaccc ctaagtgaca agtctgcctg ggtccaaggg 840

gctactggag gaaagcggta tcgctggacc acggatcgca aagtgcatct agctaccggt 900

aaggtcaccc actctttcct ccatgtacca gactgcccct atcctctgct aggaagagat 960

ttgctgacta aactaaaagc ccaaatccac tttgagggat caggagctca ggttgtggga 1020

ccaatgggac agcccctgca agtgctgacc ctaaacatag aagatgagta tcggctacat 1080

gagacctcaa aagagccgga tgtttctcta gggttcacat ggctttctga ttttcctcag 1140

gcctgggcgg aatccggggg catgggactg gcagttcgcc aagctcctct gatcatacct 1200

ctgaaggcaa cctctacccc cgtgtccata aaacaatacc ccatgtcaca agaagccaga 1260

ctggggatca agccccacat acagagactg ttggaccagg gaatactggt accctgccag 1320

tccccctgga acacgcccct gctacccgtt aagaaaccag ggactaatga ttacaggcct 1380

gtccaagatc tgagagaagt caacaagcgg gtggaagaca tccaccccac cgtgcccaac 1440

ccttacaacc tcttgagcgg gctcccaccg tcccaccagt ggtacactgt gcttgactta 1500

aaggatgcct ttttctgcct gagactccac cccaccagtc agcctctctt cgcctttgag 1560

tggagagacc cagagatggg aatctcagga caattaacct ggaccagact cccacagggt 1620

ttcaaaaaca gtcccaccct gtttgatgag gcactgcaca gagacctagc agacttccgg 1680

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 小鼠白血病病毒(Murine leukemia virus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (229)..(229)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 2

Ala Phe Pro Leu Glu Arg Pro Asp Trp Asp Tyr Thr Thr Gln Ala Gly

1 5 10 15

Arg Asn His Leu Val His Tyr Arg Gln Leu Leu Leu Ala Gly Leu Gln

20 25 30

Asn Ala Gly Arg Ser Pro Thr Asn Leu Ala Lys Val Lys Gly Ile Thr

35 40 45

Gln Gly Pro Asn Glu Ser Pro Ser Ala Phe Leu Glu Arg Leu Lys Glu

50 55 60

Ala Tyr Arg Arg Tyr Thr Pro Tyr Asp Pro Glu Asp Pro Gly Gln Glu

65 70 75 80

Thr Asn Val Ser Met Ser Phe Ile Trp Gln Ser Ala Pro Asp Ile Gly

85 90 95

Arg Lys Leu Gly Arg Leu Glu Asp Leu Lys Ser Lys Thr Leu Gly Asp

100 105 110

Leu Val Arg Glu Ala Glu Lys Ile Phe Asn Lys Arg Glu Thr Pro Glu

115 120 125

Glu Arg Glu Glu Arg Ile Arg Arg Glu Thr Glu Glu Lys Glu Glu Arg

130 135 140

Arg Arg Thr Val Asp Glu Gln Lys Glu Lys Glu Arg Asp Arg Arg Arg

145 150 155 160

His Arg Glu Met Ser Lys Leu Leu Ala Thr Val Val Ile Gly Gln Glu

165 170 175

Gln Asp Arg Gln Glu Gly Glu Arg Lys Arg Pro Gln Leu Asp Lys Asp

180 185 190

Gln Cys Ala Tyr Cys Lys Glu Lys Gly His Trp Ala Lys Asp Cys Pro

195 200 205

Lys Lys Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Arg Pro Gln Thr Ser Leu Leu

210 215 220

Thr Leu Gly Asp Xaa Gly Gly Gln Gly Gln Asp Pro Pro Pro Glu Pro

225 230 235 240

Arg Ile Thr Leu Lys Val Gly Gly Gln Pro Val Thr Phe Leu Val Asp

245 250 255

Thr Gly Ala Gln His Ser Val Leu Thr Gln Asn Pro Gly Pro Leu Ser

260 265 270

Asp Lys Ser Ala Trp Val Gln Gly Ala Thr Gly Gly Lys Arg Tyr Arg

275 280 285

Trp Thr Thr Asp Arg Lys Val His Leu Ala Thr Gly Lys Val Thr His

290 295 300

Ser Phe Leu His Val Pro Asp Cys Pro Tyr Pro Leu Leu Gly Arg Asp

305 310 315 320

Leu Leu Thr Lys Leu Lys Ala Gln Ile His Phe Glu Gly Ser Gly Ala

325 330 335

Gln Val Val Gly Pro Met Gly Gln Pro Leu Gln Val Leu Thr Leu Asn

340 345 350

Ile Glu Asp Glu Tyr Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu Pro Asp Val

355 360 365

Ser Leu Gly Phe Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala Trp Ala Glu

370 375 380

Ser Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu Ile Ile Pro

385 390 395 400

Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr Pro Met Ser

405 410 415

Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg Leu Leu Asp

420 425 430

Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr Pro Leu Leu

435 440 445

Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val Gln Asp Leu

450 455 460

Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr Val Pro Asn

465 470 475 480

Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln Trp Tyr Thr

485 490 495

Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu His Pro Thr

500 505 510

Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu Met Gly Ile

515 520 525

Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe Lys Asn Ser

530 535 540

Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala Asp Phe Arg

545 550 555 560

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 探针1

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..(73)

<223> n是a, c, g, t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(77)

<223> n是a, c, g, t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> n是a, c, g, t或u

<400> 3

uuuuugactc gtaatacgac tcactatagg gacacgacgc tcttccgatc tgtccgatat 60

gattgccgcw snnwsnnvtt tttttttttt ttttttttvn 100

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 连接衔接子

<400> 4

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcacc 35

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 第二逆转录引物

<400> 5

tgactggagt tcagacgtgt gctcttccga 30

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> PCR 引物 InPE1.0

<400> 6

atgatacggc gaccaccgag atctacactc tttccctaca cgacgctctt ccgatct 57

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> PCR 引物 InPE2.0

<400> 7

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> PCR索引引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(29)

<223> n是a, c, g或t

<400> 8

aagcagaaga cggcatacga gatnnnnnng tgactggagt tc 42

Claims

1.一种用于空间标记生物样本的核酸的方法，包括：

(a)提供其上固定有多种捕获探针的固体基质，使得每种捕获探针占据所述固体基质上的不同位置，其中所述探针用于引物延伸反应并且其中每种所述捕获探针包含核酸分子，所述核酸分子包含：

(i)用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的裂解结构域，

(ii)对应于所述捕获探针在所述固体基质上的位置的定位结构域，和

(iii)捕获结构域；

(b)使所述固体基质与生物样本接触；

(c)在允许所述生物样本的核酸与所述捕获探针中的捕获结构域杂交的条件下从所述固体基质的表面释放所述捕获探针并且同时和/或随后使用与所述捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针以产生延伸探针，从而空间标记所述生物样本的核酸；

其中步骤(c)包括使所述固体基质与含水反应混合物接触，所述含水反应混合物包含：

(i)能够使用与所述捕获探针杂交的核酸分子作为延伸模板延伸所述捕获探针的聚合酶；和

(ii)用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的工具。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述用于从所述固体基质表面释放所述捕获探针的工具包括能够特异地使裂解结构域内的捕获探针裂解的裂解酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述裂解结构域包含poly-U序列，并且所述裂解酶包含尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和能够识别dsDNA的脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点的内切核酸酶的混合物，其中所述内切核酸酶优选DNA糖基化酶-裂解酶，例如内切核酸酶VIII。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述裂解结构域包含限制性内切核酸酶识别序列，并且所述裂解酶是限制性内切核酸酶。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是逆转录酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述逆转录酶选自M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶及其衍生物或突变体，优选其中所述衍生物是序列修饰的衍生物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述逆转录酶包含SEQ ID NO：2所示的多肽序列或与其具有至少80％序列同一性的多肽序列。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶由包含SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括合成所述延伸探针的互补链以产生双链延伸探针的步骤。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括扩增所述延伸探针和/或双链延伸探针的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中扩增所述延伸探针和/或双链延伸探针的步骤包括PCR。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析所述延伸探针和/或双链延伸探针和/或其扩增子的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述分析所述延伸探针和/或双链延伸探针和/或其扩增子的步骤包括分析所述延伸探针和/或双链延伸探针和/或其扩增子的序列。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述方法还包括将所述分析信息与所述生物样本的图像相关联的步骤，所述分析信息例如为序列分析信息，其中所述生物样本在步骤(c)之前或之后成像。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括标记步骤(c)中产生的所述延伸探针和/或其互补链和/或扩增子的步骤，其中所述标记步骤可以与所述延伸步骤同时或在其后进行。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述捕获探针直接固定在所述阵列的所述基质上，产生可自由延伸的3'末端。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述捕获探针是DNA分子。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含扩增结构域。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中每种捕获探针的定位结构域包括条形码序列。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中一种捕获探针包含具有不同序列的捕获结构域。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述捕获结构域包含poly-T DNA寡核苷酸，所述poly-T DNA寡核苷酸包含至少10个脱氧胸苷残基和/或随机或简并寡核苷酸序列。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述捕获结构域包含对特定靶基因或基因组特异的序列。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述固体基质位于流动池装置内。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述固体基质包括阵列。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述阵列是珠粒阵列。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述捕获探针以有序排列固定在所述固体基质上。

27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述捕获探针以随机排列固定在所述固体基质上。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法还包括在所述固体基质上进行核酸检测反应以确定所述固体基质上随机定位的探针的所述定位结构域序列的步骤。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中使用桥式扩增在所述固体基质上合成所述捕获探针。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述生物样本是组织切片。

31.根据权利要求30所述的方法，其中使用固定组织制备所述组织切片，所述固定组织为例如福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织，或深度冷冻组织。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，还包括在使所述样本与所述固体基质接触之后并且在步骤(c)之前使所述生物样本再水合的步骤。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，还包括在使所述样本与所述固体基质接触之后并且在步骤(c)之前透化和/或固定所述生物样本的步骤。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述固体基质包括至少一个位置标记物，以使所述生物样本能够在所述固体基质上定向。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，进一步包括收集延伸探针和/或双链延伸探针和/或其扩增子的步骤，其中所述延伸探针来自步骤(c)。

36.根据权利要求14-35中任一项所述的方法，其中使用光、亮场、暗场、相衬、荧光、反射、干涉或共聚焦显微镜或其组合对所述生物样本成像。

37.根据权利要求36所述的方法，其中使用光学显微镜或荧光显微镜对所述生物样本成像。

38.根据权利要求13-37中任一项所述的方法，其中所述序列分析步骤包括测序步骤，优选地，其中所述测序步骤包括基于可逆染料-终止子的测序反应。

39.含水反应混合物在用于空间标记生物样本的核酸的方法中的用途，所述含水反应混合物包括：

(i)聚合酶，优选逆转录酶；和

(ii)裂解酶，优选根据权利要求3或4中所述的裂解酶。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述用于空间标记生物样本的核酸的方法根据权利要求1-38中任一项所定义。