CN114276993A - 一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，包括找出下丘脑中弓状核神经元核团的差异表达最显著的若干个标志物；根据标志物在其他细胞群中的表达差异筛选出在弓状核区域中唯一显著高表达的标志物，分别为Gck、S100g、Six6和Sox14；采用流式细胞术分选下丘脑中含有Sox14、S100g、Gck和Six6这四个标志物的阳性细胞，所获得的阳性细胞群中弓状核神经元核团浓度比较高；本发明基于空间转录组技术，通过流式细胞术分选，从而实现弓状核神经元核团分离；本发明提供的下丘脑弓状核神经元核团的分离方法，无需养殖转基因大鼠，操作成本低并且对仪器和平台依赖度较低，适宜在科研单位中推广和普及。

Description

一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法。

背景技术

神经元是构成神经系统结构的基本功能单位。中枢神经系统的神经元具有两种典型的组织结构形式，一种是层状结构，例如大脑皮质；另一种是核团结构，例如下丘脑。下丘脑是动物大脑进化中比较保守又高度异质性的一个区域，其内部神经元核团类型多样化，对内分泌，睡眠与昼夜节律，生殖与性行为以及饮食与能量平衡等都具有关键的调控作用。

下丘脑位于大脑腹面，丘脑下钩的下方，构成第三脑室的下壁，向下延伸与垂体柄相连。从解剖学上从前向后可分为三个区，视上部位于视交叉上方，由视上核和室旁核所组成；结节部位于漏斗后方；乳头部位于乳头体。其中弓状核位于内侧基底部，邻近第三脑室和正中隆起，是许多神经内分泌细胞聚集的区域，包括生长激素释放因子样神经元、β内啡肽样神经元、神经紧张素样神经元、P物质样神经元、神经肽Y样神经元、多巴胺神经元、促肾上腺皮质激素样神经元、γ-氨基丁酸样神经元等。弓状核在神经内分泌调节过程中处于重要地位，参与包括垂体功能、自主神经活动、镇痛和神经免疫等多个方面在内的调控作用。

下丘脑内部各神经元核团缺乏明显的组织学界限。目前对某种特定神经元进行科学研究主要集中在生理和细胞生物学层面，却无法有效地开展更多的分子生物学研究，就是因为缺乏一种能够精确分离下丘脑不同神经元核团的方法。人们利用转基因技术对某些特定标记物制备荧光融合蛋白，通过荧光来示踪神经元核团。但这种方法存在一定的假阳性，而且融合蛋白会影响标记物蛋白连接端的空间结构，存在破坏标记物正常功能的可能性，且转基因动物制备周期长、造价昂贵、后续需要不间断饲养和保种从而增加人力和财力成本，不能为一般科研单位所接受。

总而言之，目前缺乏一种可有效并精准分离下丘脑不同类型神经元核团的方法，且这种方法操作简单、花费不高、对仪器和平台依赖度较低，能在广大科研单位中所普及并接受。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，以解决上述背景技术中提出的问题；

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，所述方法包括如下步骤：

一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一、找出下丘脑中弓状核神经元核团的差异表达最显著的若干个标志物；

步骤二、根据标志物在其他细胞群中的表达差异筛选出在弓状核区域中唯一显著高表达的标志物，分别为Gck、S100g、Six6和Sox14；

标志物Gck如SEQUENCE LISTING ID NO.1所示的核苷酸序列；

标志物S100g如SEQUENCE LISTING ID NO.2所示的核苷酸序列；

标志物Six6如SEQUENCE LISTING ID NO.3所示的核苷酸序列；

标志物Sox14如SEQUENCE LISTING ID NO.4所示的核苷酸序列。

步骤三、采用流式细胞术分别分选下丘脑中Sox14、S100g、Gck和Six6这四个标志物的阳性细胞，即为弓状核神经元核团。

作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一的具体方法如下：

S11、取SD大鼠全脑切片，放置于载玻片的捕获区域上，固定和透化全脑切片，捕获区域捕获细胞释放的RNA；

S12、将载玻片上的细胞群降维聚类为14个细胞群，其中9号群在位置上与脑图谱定位的弓状核一致；找出9号细胞群中差异表达最显著的前9个标志物。

作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一中选出的标志物分别为Fezf1、Kiss1、Ghrh、Sox14、S100g、Ces1d、Gck、Crhr2和Six6。

作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤二的具体方法如下：

S21、计算Fezf1、Kiss1、Ghrh、Sox14、S100g、Ces1d、Gck、Crhr2和Six6标志物在14个细胞群中的表达量；

S22、筛选出在9号细胞群内部唯一高表达的标志物，分别为Sox14、S100g、Gck和Six6。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明基于空间转录组技术，通过下丘脑不同神经元核团中标志物表达的蛋白进行流式细胞术分选，从而实现弓状核神经元核团分离；本发明提供的下丘脑弓状核神经元核团的分离方法，操作简单，无需养殖转基因大鼠，操作成本低并且对仪器和平台依赖度较低，适宜在科研单位中推广和普及。

附图说明

图1为9个标志物在14个细胞群中的表达量的小提琴图；

图2为本发明中流式分选下丘脑中含有Sox14标志物的神经元细胞过程中游离的单细胞占比图；

图3为本发明中流式分选下丘脑含有Sox14标志物的神经元细胞过程中FSC/SSC结果图；

图4为本发明中流式分选下丘脑含有Sox14标志物的神经元细胞过程中FSC large细胞群进一步分选结果图；

图5为本发明中流式分选下丘脑中含有S100g标志物的神经元细胞过程中游离的单细胞占比图；

图6为本发明中流式分选下丘脑中含有S100g标志物的神经元细胞过程中选取活细胞的结果图；

图7为本发明中流式分选下丘脑中含有S100g标志物的神经元细胞过程中FSC/SSC结果图；

图8为本发明中流式分选下丘脑中含有S100g标志物的神经元细胞过程中FSClarge细胞群进一步分选结果图；

图9为本发明中流式分选下丘脑中含有Gck标志物的神经元细胞过程中游离的单细胞占比图；

图10为本发明中流式分选下丘脑中含有Gck标志物的神经元细胞过程中FSC/SSC结果图；

图11为本发明中流式分选下丘脑中含有Gck标志物的神经元细胞过程中FSClarge细胞群进一步分选结果图；

图12为本发明中流式分选下丘脑中含有Six6标志物的神经元细胞过程中游离的单细胞占比图；

图13为本发明中流式分选下丘脑中含有Six6标志物的神经元细胞过程中FSC/SSC结果图；

图14为本发明中流式分选下丘脑中含有Six6标志物的神经元细胞过程中FSClarge细胞群进一步分选结果图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例；基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动成果前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围；

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，下面将结合实施例来详细说明本申请。

实施例1

本发明提供了一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，具体如下。

步骤1、找出下丘脑中弓状核神经元核团的差异表达最显著的若干个标志物；具体方法如下：

S11、取SD大鼠全脑切片，放置于载玻片的捕获区域上，固定和透化全脑切片，捕获区域上的探针捕获细胞释放的RNA；

S12、将载玻片上的细胞群降维聚类为14个细胞群，其中9号群在位置上与脑图谱定位的弓状核一致；找出9号细胞群中差异表达最显著的前9个标志物，分别为Fezf1、Kiss1、Ghrh、Sox14、S100g、Ces1d、Gck、Crhr2和Six6；图1是9个标志物在14个细胞群中的表达量的小提琴图；

步骤2、根据标志物在其他13个细胞群中的表达差异筛选出在弓状核区域中唯一显著高表达的标志物。

具体方法如下：

S21、计算Fezf1、Kiss1、Ghrh、Sox14、S100g、Ces1d、Gck、Crhr2和Six6标志物在14个细胞群中的表达量；

S22、筛选出在9号细胞群内部唯一高表达的标志物；结果如图1所示，分别为Gck、S100g、Six6和Sox14；

标志物Gck如SEQUENCE LISTING ID NO.1所示的核苷酸序列；

标志物S100g如SEQUENCE LISTING ID NO.2所示的核苷酸序列；

标志物Six6如SEQUENCE LISTING ID NO.3所示的核苷酸序列；

标志物Sox14如SEQUENCE LISTING ID NO.4所示的核苷酸序列。

步骤3、采用流式细胞术分选下丘脑含有Sox14标志物的神经元细胞，即为弓状核神经元核团，Sox14标志物表达的蛋白质位于神经元细胞的内部，Sox14标志物表达的蛋白质如SEQUENCE LISTING ID NO.8所示的核苷酸序列。具体方法如下：

S31、取出生后45天的SD大鼠的下丘脑30份，制备成单细胞悬液；将单细胞悬液放置于含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬至约5x 10⁶细胞/mL；

S32、向每份重悬细胞液中添加30μL Sox14抗体，加入等体积的冰乙醇，在-20℃固定过夜，次日取出，以400g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S33、向每份重悬细胞液中添加15μL抗兔FITC二抗(Abcam制造)，在-20℃固定过夜，次日取出，以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S34、首先采用FSCA/H设门去除步骤S33所得细胞重悬液中的黏连细胞，得到独立的单细胞，此步骤中单细胞收率为30.77％，如图2所示；然后使用FSA/SSA(FSC是指forwardscatter，中文翻译为前向散射光，前向散射光参数和细胞的大小成正比；SSC是指sidescater，中文翻译为侧向散射光，侧向散射光参数反映的是细胞的复杂程度)设门去除碎片，根据FSC参数大小将细胞分为获得FSA large和FSA small两群细胞，FSA large细胞群为神经元细胞群。如图3所示，FSA large细胞占单细胞的比率为83.99％；进一步对FSAlarge细胞群进行分选，获得Sox14阳性大细胞即为目标神经元细胞，如图4所示，Sox14阳性大细胞占FSA large细胞比率为8.21％，所以提取到的目标神经元细胞占总细胞的比率为2.12％。

实施例2

实施例2中步骤1和步骤2与实施例1完全相同，本实施例中不再叙述。

步骤3、采用流式细胞术分选下丘脑中S100g标志物的阳性细胞，即为弓状核神经元核团，S100g标志物表达的蛋白质位于神经元的细胞膜上，S100g标志物表达的蛋白质如SEQUENCE LISTING ID NO.6所示的核苷酸序列。具体方法如下：

S31、取出生后45天的SD大鼠的下丘脑30份，制备成单细胞悬液；将单细胞悬液放置于含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬至约5x 10⁶细胞/mL；

S32、向每份重悬细胞液中添加30μLS100g抗体，加入等体积的冰乙醇，在-20℃固定过夜，次日取出，以400g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S33、向每份重悬细胞液中添加15μL抗兔FITC二抗(Abcam制造)，在-20℃固定过夜，次日取出，以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S34、首先采用FSCA/H设门去除步骤S33所得细胞重悬液中的黏连细胞，得到独立的单细胞，此步骤中单细胞收率为64.35％，如图5所示；然后选择活细胞，如图6所示，此步骤中活细胞收率为93.53％，然后使用FSA/SSA(FSC是指forward scatter，中文翻译为前向散射光，前向散射光参数和细胞的大小成正比；SSC是指side scater，中文翻译为侧向散射光，侧向散射光参数反映的是细胞的复杂程度)设门去除碎片，根据FSC参数大小将细胞分为获得FSA large和FSA small两群细胞，FSA large细胞群为神经元细胞群。如图7所示，FSA large细胞占单细胞的比率为19.50％；进一步对FSA large细胞群进行分选，获得Sox14阳性大细胞即为目标神经元细胞，如图8所示，Sox14阳性大细胞占FSA large细胞比率为5.91％，所以提取到的目标神经元细胞占总细胞的比率为0.69％，所取得的目标神经元细胞为活细胞。

实施例3

实施例3中步骤1和步骤2与实施例1完全相同，本实施例中不再叙述。

步骤3、采用流式细胞术分选下丘脑中Gck标志物的阳性细胞，即为弓状核神经元核团，Gck标志物表达的蛋白质位于神经元细胞的内部，Gck标志物表达的蛋白质如SEQUENCE LISTING ID NO.5所示的核苷酸序列。具体方法如下：

S31、取出生后45天的SD大鼠的下丘脑30份，制备成单细胞悬液；将单细胞悬液放置于含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬至约5x 10⁶细胞/mL；

S32、向每份重悬细胞液中添加30μL Gck抗体，加入等体积的冰乙醇，在-20℃固定过夜，次日取出，以400g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S33、向每份重悬细胞液中添加15μL抗兔FITC二抗(Abcam制造)，在-20℃固定过夜，次日取出，以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S34、首先采用FSCA/H设门去除步骤S33所得细胞重悬液中的黏连细胞，得到独立的单细胞，此步骤中单细胞收率为38.47％，如图9所示；然后使用FSA/SSA(FSC是指forwardscatter，中文翻译为前向散射光，前向散射光参数和细胞的大小成正比；SSC是指sidescater，中文翻译为侧向散射光，侧向散射光参数反映的是细胞的复杂程度)设门去除碎片，根据FSC参数大小将细胞分为获得FSA large和FSA small两群细胞，FSA large细胞群为神经元细胞群。如图10所示，FSA large细胞占单细胞的比率为78.28％；进一步对FSAlarge细胞群进行分选，获得Sox14阳性大细胞即为目标神经元细胞，如图11所示，Sox14阳性大细胞占FSA large细胞比率为6.28％，所以提取到的目标神经元细胞占总细胞的比率为1.9％。

实施例4

实施例4中步骤1和步骤2与实施例1完全相同，本实施例中不再叙述。

步骤3、采用流式细胞术分选下丘脑中Six6标志物的阳性细胞，即为弓状核神经元核团，Six6标志物表达的蛋白质位于神经元细胞的内部，Six6标志物表达的蛋白质如SEQUENCE LISTING ID NO.7所示的核苷酸序列。具体方法如下：

S31、取出生后45天的SD大鼠的下丘脑30份，制备成单细胞悬液；将单细胞悬液放置于含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬至约5x 106细胞/mL；

S32、向每份重悬细胞液中添加30μL Six6抗体，加入等体积的冰乙醇，在-20℃固定过夜，次日取出，以400g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S33、向每份重悬细胞液中添加15μL抗兔FITC二抗(Abcam制造)，在-20℃固定过夜，次日取出，以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬；再以500g的速度离心10min，接着在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，如此重复操作3次；

S34、首先采用FSCA/H设门去除步骤S33所得细胞重悬液中的黏连细胞，得到独立的单细胞，此步骤中单细胞收率为44.77％，如图12所示；然后使用FSA/SSA(FSC是指forward scatter，中文翻译为前向散射光，前向散射光参数和细胞的大小成正比；SSC是指side scater，中文翻译为侧向散射光，侧向散射光参数反映的是细胞的复杂程度)设门去除碎片，根据FSC参数大小将细胞分为获得FSA large和FSA small两群细胞，FSA large细胞群为神经元细胞群。如图13所示，FSA large细胞占单细胞的比率为52.70％；进一步对FSA large细胞群进行分选，获得Sox14阳性大细胞即为目标神经元细胞，如图14所示，Sox14阳性大细胞占FSA large细胞比率为7.42％，所以提取到的目标神经元细胞占总细胞的比率为1.8％。

以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海昆盟生物科技有限公司

<120> 一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法

<130> 2021

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2442

<212> RNA

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 1

gccuaucuuu ugcaacacuc agccagacag uccucaccug caacaggugg ccucaggagu 60

caggaacauc ucuacuuccc caacgacccc uggguugucc ucucagagau ggcuauggau 120

acuacaaggu guggagccca guuguugacu cugggcacca acaaaugcac gaaugcaugc 180

ucccugcugu gcagagcggg uacucacaac gggcacauga acccucgcug ccgaacagag 240

caggcggccg ccacacagcu gcccaccugc agaguccagc uacucuugaa cuaucaugug 300

gagggucgag cagauccugg cagaguucca gcugcaggag gaagaccuga agaaggugau 360

gagccggaug cagaaggaga uggaccgugg ccugaggcug gagacccacg aggagaaguc 420

ggagacuuuc ucuccuuaga ccugggagga accaacuuca gagugaugcu ggucaaagug 480

ggagaggggg aggcagggca guggagcgug aagacaaaac accagaugua cuccaucccc 540

gaggacgcca ugacgggcac ugccgagaug cucuuugacu acaucucuga augcaucucu 600

gacuuccuug acaagcauca gaugaagcac aagaaacugc cccugggcuu caccuucucc 660

uucccuguga ggcacgaaga ccuagacaag ggcauccucc ucaauuggac caagggcuuc 720

aaggccucug gagcagaagg gaacaacauc guaggacuuc uccgagaugc uaucaagagg 780

agaggggacu uugagaugga ugugguggca auggugaacg acacaguggc cacaaugauc 840

uccugcuacu augaagaccg ccaaugugag gucggcauga uugugggcac uggcugcaau 900

gccugcuaca uggaggaaau gcagaaugug gagcuggugg aaggggauga gggacgcaug 960

ugcgucaaca cggagugggg cgccuucggg gacucgggcg agcuggauga guuccuacug 1020

gaguaugacc ggauggugga ugaaagcuca gcgaaccccg gucagcagcu guacgagaag 1080

aucaucggug ggaaguauau gggcgagcug guacgacuug ugcugcuuaa gcugguggac 1140

gagaaccuuc uguuccacgg agaggccucg gagcagcugc gcacgcgugg ugcuuuugag 1200

acccguuucg ugucacaagu ggagagcgac uccggggacc gaaagcagau ccacaacauc 1260

cuaagcacuc uggggcuucg acccucuguc accgacugcg acauugugcg ccgugccugu 1320

gaaagcgugu ccacucgcgc cgcccauaug ugcuccgcag gacuagcugg ggucauaaau 1380

cgcaugcgcg aaagccgcag ugaggacgug augcgcauca cugugggcgu ggauggcucc 1440

guguacaagc ugcacccgag cuucaaggag cgguuucacg ccagugugcg caggcugaca 1500

cccaacugcg aaaucaccuu caucgaauca gaggagggca gcggcagggg agccgcgcug 1560

gucucugcgg uggccugcaa gaaggcuugc augcuggccc agugaaaucc aggucauaug 1620

gaccgggacc uggguuccac ggggacucca cacaccacaa augcucccag cccaccgggg 1680

caggagaccu auucugcugc uaccccugga aaauggggag aggccccugc aagccgaguc 1740

ggccaguggg acagcccuag ggcucucagc cuggggcagg gggcugggag gaagaagagg 1800

aucagaggcg ccaaggccuu ucuugcuaga aucaacuaca gaaaauggcg gaaaauacuc 1860

aggacuugca cuuucacgau ucuugcuucc caagcguggg ucuggccucc caagggaaug 1920

cuuccuggac cuugcaaugg ccuggcuucc cuggggggga cacaccuuca uggggaggua 1980

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uggcuguuuu cuugucugug gcugaagagg ccggggagcc augagagacu gacuauccgg 2100

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cacccgagug gcuuacaguu cugggaugaa cccucccagg agaugccaga gguuagagcc 2220

ccagaguccu ugcucuaagg ggaccagaaa ggggaggccu cacucugcac uauucaagca 2280

ggaaucaucu ccaacacuca ggucccugac ccaggaggaa gaagccaccc ucaguguccc 2340

uccaagagac cacccagguc cuucucuccc ucguucccaa augccagccu cucuaccugg 2400

gacugugggg gaguuuuuaa uuaaauauuu aaaacuacuu ca 2442

<210> 2

<211> 405

<212> RNA

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 2

agaccucacc uguuccuguc ugacucuggc agcacucacu gacagcaagc agcacagaaa 60

aaugagcgcu aagaaaucuc ccgaagaaau gaagagcauu uuucaaaaau augcagccaa 120

agaaggcgau ccaaaccagc uguccaagga ggagcugaag cugcugauuc agucagaguu 180

ccccagccuc cugaaggcuu caaguacucu agacaaucuc uuuaaagagc uggauaagaa 240

cggugaugga gaaguuagcu augaagaauu cgaaguuuuc uucaaaaagu uaucacaaug 300

aagccagaag aaggagcucc gacaccaccu acugauugaa uccuauccaa ucccaaagau 360

cuagcuguga gagcaagaua cuguuaauaa agcaaauucu gagac 405

<210> 3

<211> 3999

<212> RNA

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 3

aucuagcugg cuggcguguc cuagcugagc aagcgcagcc gaacccaacc cacaucucuu 60

ccaggcggga aggcuccccc ccgacuuugu aacccccagc cgcaccccgc ucggccggcg 120

ggcaucugcu gccugucccg cccggggcgc ccgcgcagcc ucgauguucc agcugcccau 180

uuugaauuuc agcccccagc aaguagccgg gguaugcgag acccuggagg aaagcggcga 240

cguggagcgc cucggucgcu uccugugguc gcugcccgug gccccggcag ccugugaggc 300

ccucaacaaa aaugagucgg ugcugcgcgc gagagccauc guggccuucc acgguggcaa 360

cuaccgcgag cucuaccaca uucuggaaaa ucauaaguuu acuaaggaau cgcacgccaa 420

gcugcaggca cuguggcucg aagcucauua ccaggaggca gagaagcugc guggacgacc 480

ccuggggcca guagacaagu accggguaag gaagaaguuc ccgcugccgc ggaccauuug 540

ggauggcgaa cagaagacuc acugcuucaa ggagcgcaca cggcaccugc uucgagagug 600

guaccuucag gacccauauc ccaaccccag caaaaagcga gagcucgccc aagcaaccgg 660

acugaccccc acgcaggugg gcaacugguu caaaaaccgc agacaaagag accgggcagc 720

ugcagccaag aacagacucc agcaacaggu ucugucgcag ggccccgggc gggugcuacg 780

cucggagggu gagggcacgc cagaggugcu gggcgucgcc uccaguccug cugccagucu 840

guccagcaag gcggccacuu cggccaucuc caucacaucc agcgacagcg agugcgacau 900

cugaccuguu cacucaucac acuuagaaac agaauccagu guaaaaauca gaugcacaaa 960

auaagagagg accggaccag caaauacgac gcuggccccg uggccaggga ccggcgggcc 1020

uaaacugcuc uuguagggag uuucuaucgc aacucugggg cgugcgguga ggccugaccc 1080

aaugccauuu cucuucacgu ugcuuuuccu ggaggaucug gcugcaaaga cucauuugga 1140

acagaacugc acgcugagcg ccugcccuug agucuccugu ggguauuuca uuugucgaaa 1200

ggacgguguu auauauauau auguauguau aacuuuuccu uugaagguuu cuuuuuaaaa 1260

aaaacaaaac aaaacauaua uaugcuguuu auuuacuuau uuaaaagacu uccaugauag 1320

guuucucugu agcuugggga acuugcuguu cuaaaugagc gagcucaugc auucugugug 1380

aagaagccaa auaauaaaac accuugguga guaaccuuuc uuaaugaagg gagcugcuau 1440

cucagauuuu aaaaaaucac ucguauuccc uuuaccgggc augcaggaug gaauccuguc 1500

caaauagucu cucugacuuc ucuauuuccu uugauaucuc aguaucuauu uuuaaacaac 1560

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uuuauuaagu guuagugauu uucaagaaca auucgagaag acaaauucua gacucaggca 1800

augaauccua uuuuacaaaa aaaaugcaaa gacgugcgug agaauuuuau gauaaaaaag 1860

uguuuccauu uuguuugagg cccucgccca cucagaagaa gugugugcgc acucaugauc 1920

guagggcgag cauauagagc auguagaauu uuacuaaugc augcaguuuu uaucaagacc 1980

auuaaaaaag aucggagagc uugucaguaa cuagacuagc aucuuccugc uucagacaug 2040

gguuuuaguc aaguaaauua uuuuuaccaa gagaaaucag uauacagguu auauauugac 2100

cagaaagcaa gcuacagaga aaugacaggc auuuucuaaa ucaaugcucu cuacauuuaa 2160

caugcaaaca auucaucagg aacuucauug ccuugggagu aaccuuaguu aaaauauaaa 2220

auauuguuag cauguaacug uucuuuuuac auacacaggu auauaccaca ugcacgugca 2280

ggcguacaca cacacacaca cacacacaca cacacuacca uuuuugcacu aagaaaguaa 2340

auaauauuca gauaaucuaa gauuuugcuu ucucuaguaa aauggauugc acauuacaaa 2400

auuugacauu gaucuuuaaa ucacuugagc uggacuucuc acccaguuag aguucuuuua 2460

auucaccucu cuguccuaaa agguauucca caggucaaac aaacaccugc uaauguuucu 2520

gaaggcaaaa aagguuaaag uaccaaacaa augaaaaaug aaguuacaaa agacaauaga 2580

uagucaagug acuauuggaa gccagggaug ugagaaaagg cuaauguaug uacgcaugua 2640

uguuuaugua uguauguuug uauguaugug uguuuguaug aauguaugca uacaugcaug 2700

cauguuugua ugucacuuaa gcagagcugg cuucuguggg cuuuaaaauu aucaucacug 2760

uccaaauguu ccuuaucuag aaaaucuuug caaauugaaa cugucauagc aaaagagcag 2820

uagauggaca aguuuaggga gcauuuguga uugaauaggu aauucucaaa uugaaccaac 2880

gcacuacagu gguccaugcu accucugcug auuucuaaag ucccugguag uacuuugauu 2940

gccaaggagc agucuggggc accagaggag agugcaaaug cuaagaaaau auuccuuuuc 3000

cugguccuga gagugacaac ccauagcgac cugaaacuga guagcuccuu aauuuuguac 3060

ccuugguuag uggugguauu gugacucuaa cuggcagacc ucgggagguu uaggaucagu 3120

cuggccuaca aggugagcuc caggcuagcc augucuacac ggugagguuu uuguuuuuaa 3180

cacagagugu uucagaaaac accaacauau uucacccgag guucucucac cucacccuag 3240

ucuagaauca gccuagcagg auugcgcuuc aaugggaaau uccuggcucu caaucuuaca 3300

guccagcucu gucuccucuc auuucaguua uagaugaucc agaaccagua auuggagagg 3360

cucacuggca aauuucauuu cuuauuuuuu gugaucccag gucaaguaga aaagaaggaa 3420

agaacuaauu aguaaacuga uguacaagaa uuugagauua uaaaaauccu aaccuacucg 3480

ccauauucga augacugaaa cagaaggaaa caucuacucu cuccggaaau agagcaagcc 3540

ucagaaacua agcuuucucu guauggaaca acguuuaaug gcccuuacgg aaaauguuuc 3600

ccuaucugca uuggugaagg cuuuuaaaua uauuauuuac cuaaauuaac aagcugccca 3660

agaauuacau uuaaaguagu uauaaugcuu caaaaacaug cagauuuauu aaucugauuu 3720

cauguugaaa ucuuggggca ccaacauugu ucgaaagaua uuuuugaaug uguaccggaa 3780

aucugguguc acguaauugc ucugugauua auucuuggaa ugaccccagg uuggaaauua 3840

ggccagaccu ucaaacaucu acuuaucuaa ucaccugaau cagcccauaa acacguauua 3900

ugaaaauuuu cuuuuuuaaa aaaaaucaau uuuauccuag ccuaagcugc guuaaaaauc 3960

gaggcaguag aaaggcucca auaaagguuc ugaaucgag 3999

<210> 4

<211> 1937

<212> RNA

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 4

gagaaggcga aggugaagag ggagcgaagg aggagccucc ugcccucgcc agaaaauuac 60

cuagccacuu aaucccaaga cucugguacu ugggccccaa ucucuggugc ccacagacuc 120

caggccgaga guccucuccu ccccgcugcc cuuccuacuc uucggccccc ugggggcugc 180

cugggggcug ggacuggcau gaucaguuga aaacuuugca gggucagcuc uucucucuga 240

uuuuuccucu gcggcuccga gacgagggga cuucagaguc ccgggcucag gacggacaga 300

aagacagacg gccaaccgcg cccaggcacg cccgcagagc cccugcauuc cccgcccccg 360

cccgccucgc cgggaccaug uccaaaccuu cagaccacau caagaggccc augaaugccu 420

ucaugguaug gucccggggc cagcggcgca agauggccca ggaaaauccc aagaugcaca 480

acucggagau cagcaaacgc cuaggcgccg aauggaagcu ccuguccgag gcagagaagc 540

ggccuuacau cgacgaagcc aaaaggcugc gcgcccagca caugaaggag caccccgacu 600

acaaguaccg gccucggcgc aagccgaaga accugcucaa gaaagacagg uaugucuucc 660

cccugcccua ccugggcgac acggacccgc ucaaggcggc cggccugccc gugggggcuu 720

ccgacggccu ccugagcgcg cccgagaaag cccgggccuu cuugccgccg gccucggcgc 780

cuuacucccu gcuggacccu gcgcaauuua guuccagugc cauccagaag augggugaag 840

ugccccacac guuggccacc agcgcgcugc ccuacgcguc cacccugggc uaucagaacg 900

gcgccuucgg cagucucagc ugccccagcc agcauacgca cacgcacccg ucccccacca 960

acccgggcua cguggugccc uguaacugua ccgccugguc ugccuccacc cugcagcccc 1020

cugucgccua cauccucuuc ccaggcauga ccaagacugg cauagacccu uauucgucag 1080

cccacgcuac ggccauguaa cccccagcuu ggccgggacc ugaagggugg uguggaagca 1140

gagaucugau uccuuuccuu ugcaccuagu cuggcccaca gaugccucug ggucaggccu 1200

acugcugccc ccugcccacc ccagacucug ccucucucuu ccaggggaaa agggaggggc 1260

cgccauccug gacccaaggc acagacucgu gcuggaaauu uccaaacguu uagaaagcua 1320

cacauguucc ccucucccga cucucccaaa gcaaaccucc gacuguaccc ccuuuggaca 1380

aaaaaaaaag uaggcaauuu gcuuuauuua cgucccccuc acuguccgcg gauaggcuuu 1440

ggacucggaa cucccagauc cugguauuau aucuagaaca ugcguauaua uauuuuuccu 1500

uucccacuga agaaaagagc ugagucuugc ugcugugcca ucagacccag cuaggcacca 1560

uuugcucuuc ccgugugggg gugagaggcu uaaaaguuua aaacuucagg aagggaaacc 1620

uuucuguuuc aaaccauacu guggucgugu uugcuucgau aaagagaaaa aaaaaaaaag 1680

gaaccaugug gcuuuucacu uuguguaccg caguacuccu agacaccuaa guuuacuuuu 1740

agacagaaug ucagguaaug aaaucaggaa guagaaagug gacaaaaacc uuaaaauaau 1800

aauaaaaaaa aacauccuac auggucauaa auguuuugac aaugucuugg aaauguaccu 1860

agaaggauuu uuuuuucuca uuccucuguu cauuuuguug aacaaagacg uuuuaaauaa 1920

agacaaucug ucacugc 1937

<210> 5

<211> 498

<212> PRT

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 5

Met Ala Met Asp Thr Thr Arg Cys Gly Ala Gln Leu Leu Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Asn Lys Cys Thr Asn Ala Cys Ser Leu Leu Cys Arg Ala Gly Thr

20 25 30

His Asn Gly His Met Asn Pro Arg Cys Arg Thr Glu Gln Ala Ala Ala

35 40 45

Thr Gln Leu Pro Thr Cys Arg Val Gln Leu Leu Leu Asn Tyr His Val

50 55 60

Glu Gly Arg Ala Asp Pro Gly Arg Val Pro Ala Ala Gly Gly Arg Pro

65 70 75 80

Glu Glu Gly Asp Glu Pro Asp Ala Glu Gly Asp Gly Pro Trp Pro Glu

85 90 95

Ala Gly Asp Pro Arg Gly Glu Val Gly Asp Phe Leu Ser Leu Asp Leu

100 105 110

Gly Gly Thr Asn Phe Arg Val Met Leu Val Lys Val Gly Glu Gly Glu

115 120 125

Ala Gly Gln Trp Ser Val Lys Thr Lys His Gln Met Tyr Ser Ile Pro

130 135 140

Glu Asp Ala Met Thr Gly Thr Ala Glu Met Leu Phe Asp Tyr Ile Ser

145 150 155 160

Glu Cys Ile Ser Asp Phe Leu Asp Lys His Gln Met Lys His Lys Lys

165 170 175

Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro Val Arg His Glu Asp Leu

180 185 190

Asp Lys Gly Ile Leu Leu Asn Trp Thr Lys Gly Phe Lys Ala Ser Gly

195 200 205

Ala Glu Gly Asn Asn Ile Val Gly Leu Leu Arg Asp Ala Ile Lys Arg

210 215 220

Arg Gly Asp Phe Glu Met Asp Val Val Ala Met Val Asn Asp Thr Val

225 230 235 240

Ala Thr Met Ile Ser Cys Tyr Tyr Glu Asp Arg Gln Cys Glu Val Gly

245 250 255

Met Ile Val Gly Thr Gly Cys Asn Ala Cys Tyr Met Glu Glu Met Gln

260 265 270

Asn Val Glu Leu Val Glu Gly Asp Glu Gly Arg Met Cys Val Asn Thr

275 280 285

Glu Trp Gly Ala Phe Gly Asp Ser Gly Glu Leu Asp Glu Phe Leu Leu

290 295 300

Glu Tyr Asp Arg Met Val Asp Glu Ser Ser Ala Asn Pro Gly Gln Gln

305 310 315 320

Leu Tyr Glu Lys Ile Ile Gly Gly Lys Tyr Met Gly Glu Leu Val Arg

325 330 335

Leu Val Leu Leu Lys Leu Val Asp Glu Asn Leu Leu Phe His Gly Glu

340 345 350

Ala Ser Glu Gln Leu Arg Thr Arg Gly Ala Phe Glu Thr Arg Phe Val

355 360 365

Ser Gln Val Glu Ser Asp Ser Gly Asp Arg Lys Gln Ile His Asn Ile

370 375 380

Leu Ser Thr Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Thr Asp Cys Asp Ile Val

385 390 395 400

Arg Arg Ala Cys Glu Ser Val Ser Thr Arg Ala Ala His Met Cys Ser

405 410 415

Ala Gly Leu Ala Gly Val Ile Asn Arg Met Arg Glu Ser Arg Ser Glu

420 425 430

Asp Val Met Arg Ile Thr Val Gly Val Asp Gly Ser Val Tyr Lys Leu

435 440 445

His Pro Ser Phe Lys Glu Arg Phe His Ala Ser Val Arg Arg Leu Thr

450 455 460

Pro Asn Cys Glu Ile Thr Phe Ile Glu Ser Glu Glu Gly Ser Gly Arg

465 470 475 480

Gly Ala Ala Leu Val Ser Ala Val Ala Cys Lys Lys Ala Cys Met Leu

485 490 495

Ala Gln

<210> 6

<211> 79

<212> PRT

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 6

Met Ser Ala Lys Lys Ser Pro Glu Glu Met Lys Ser Ile Phe Gln Lys

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Lys Glu Gly Asp Pro Asn Gln Leu Ser Lys Glu Glu Leu

20 25 30

Lys Leu Leu Ile Gln Ser Glu Phe Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ser Ser

35 40 45

Thr Leu Asp Asn Leu Phe Lys Glu Leu Asp Lys Asn Gly Asp Gly Glu

50 55 60

Val Ser Tyr Glu Glu Phe Glu Val Phe Phe Lys Lys Leu Ser Gln

65 70 75

<210> 7

<211> 246

<212> PRT

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 7

Met Phe Gln Leu Pro Ile Leu Asn Phe Ser Pro Gln Gln Val Ala Gly

1 5 10 15

Val Cys Glu Thr Leu Glu Glu Ser Gly Asp Val Glu Arg Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Leu Trp Ser Leu Pro Val Ala Pro Ala Ala Cys Glu Ala Leu Asn

35 40 45

Lys Asn Glu Ser Val Leu Arg Ala Arg Ala Ile Val Ala Phe His Gly

50 55 60

Gly Asn Tyr Arg Glu Leu Tyr His Ile Leu Glu Asn His Lys Phe Thr

65 70 75 80

Lys Glu Ser His Ala Lys Leu Gln Ala Leu Trp Leu Glu Ala His Tyr

85 90 95

Gln Glu Ala Glu Lys Leu Arg Gly Arg Pro Leu Gly Pro Val Asp Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Lys Lys Phe Pro Leu Pro Arg Thr Ile Trp Asp Gly

115 120 125

Glu Gln Lys Thr His Cys Phe Lys Glu Arg Thr Arg His Leu Leu Arg

130 135 140

Glu Trp Tyr Leu Gln Asp Pro Tyr Pro Asn Pro Ser Lys Lys Arg Glu

145 150 155 160

Leu Ala Gln Ala Thr Gly Leu Thr Pro Thr Gln Val Gly Asn Trp Phe

165 170 175

Lys Asn Arg Arg Gln Arg Asp Arg Ala Ala Ala Ala Lys Asn Arg Leu

180 185 190

Gln Gln Gln Val Leu Ser Gln Gly Pro Gly Arg Val Leu Arg Ser Glu

195 200 205

Gly Glu Gly Thr Pro Glu Val Leu Gly Val Ala Ser Ser Pro Ala Ala

210 215 220

Ser Leu Ser Ser Lys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Ser Ile Thr Ser Ser

225 230 235 240

Asp Ser Glu Cys Asp Ile

245

<210> 8

<211> 240

<212> PRT

<213> 大鼠属(Rattus norvegicus)

<400> 8

Met Ser Lys Pro Ser Asp His Ile Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe Met

1 5 10 15

Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu Asn Pro Lys

20 25 30

Met His Asn Ser Glu Ile Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu Trp Lys Leu

35 40 45

Leu Ser Glu Ala Glu Lys Arg Pro Tyr Ile Asp Glu Ala Lys Arg Leu

50 55 60

Arg Ala Gln His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro Arg

65 70 75 80

Arg Lys Pro Lys Asn Leu Leu Lys Lys Asp Arg Tyr Val Phe Pro Leu

85 90 95

Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Asp Pro Leu Lys Ala Ala Gly Leu Pro Val

100 105 110

Gly Ala Ser Asp Gly Leu Leu Ser Ala Pro Glu Lys Ala Arg Ala Phe

115 120 125

Leu Pro Pro Ala Ser Ala Pro Tyr Ser Leu Leu Asp Pro Ala Gln Phe

130 135 140

Ser Ser Ser Ala Ile Gln Lys Met Gly Glu Val Pro His Thr Leu Ala

145 150 155 160

Thr Ser Ala Leu Pro Tyr Ala Ser Thr Leu Gly Tyr Gln Asn Gly Ala

165 170 175

Phe Gly Ser Leu Ser Cys Pro Ser Gln His Thr His Thr His Pro Ser

180 185 190

Pro Thr Asn Pro Gly Tyr Val Val Pro Cys Asn Cys Thr Ala Trp Ser

195 200 205

Ala Ser Thr Leu Gln Pro Pro Val Ala Tyr Ile Leu Phe Pro Gly Met

210 215 220

Thr Lys Thr Gly Ile Asp Pro Tyr Ser Ser Ala His Ala Thr Ala Met

225 230 235 240

Claims (4)

1.一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一、找出下丘脑中弓状核神经元核团的差异表达最显著的若干个标志物；

步骤二、根据标志物在其他细胞群中的表达差异筛选出在弓状核区域中唯一显著高表达的标志物，分别为Gck、S100g、Six6和Sox14；

标志物Gck如SEQUENCE LISTING ID NO.1所示的核苷酸序列；

标志物S100g如SEQUENCE LISTING ID NO.2所示的核苷酸序列；

标志物Six6如SEQUENCE LISTING ID NO.3所示的核苷酸序列；

标志物Sox14如SEQUENCE LISTING ID NO.4所示的核苷酸序列；

步骤三、采用流式细胞术分别分选下丘脑中Sox14、S100g、Gck和Six6这四个标志物的阳性细胞，即为弓状核神经元核团。

2.根据权利要求1所述的一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，其特征在于，所述步骤一的具体方法如下：

S11、取SD大鼠全脑切片，放置于载玻片的捕获区域上，固定和透化全脑切片，捕获区域捕获细胞释放的RNA；

S12、将载玻片上的细胞群降维聚类为14个细胞群，其中9号群在位置上与脑图谱定位的弓状核一致；找出9号细胞群中差异表达最显著的前9个标志物。

3.根据权利要求2所述的一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，其特征在于，所述步骤一中选出的标志物分别为Fezf1、Kiss1、Ghrh、Sox14、S100g、Ces1d、Gck、Crhr2和Six6。

4.根据权利要求3所述的一种用于分离大鼠下丘脑弓状核神经元的方法，其特征在于，所述步骤二的具体方法如下：

S21、计算Fezf1、Kiss1、Ghrh、Sox14、S100g、Ces1d、Gck、Crhr2和Six6标志物在14个细胞群中的表达量；

S22、筛选出在9号细胞群内部唯一高表达的标志物，分别为Gck、S100g、Six6和Sox14。

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