CN110804654A - 一种空间转录组测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种空间转录组测序方法，此方法可以获得组织切片中高分辨率的空间转录组信息，通过对连接在微球上的空间编码序列在半导体测序芯片上进行的原位测序，可以首先确认微球上空间编码序列和测序芯片中微孔位置的对应关系，随后将组织切片贴附于此装载有编码微球的芯片上，原位捕获组织中的信使核糖核酸mRNA，经逆转录合成互补脱氧核糖核酸cDNA，文库构建和测序分析过程即可获得这些核酸链的序列信息；通过软件分析，可以将测序结果定位到其在组织中的原始位置；因此，这种方法有助于研究组织内细胞的基因表达和组织病理学分子机制，为全面理解和研究组织器官功能和疾病演变奠定了重要的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种空间转录组测序方法，特别是涉及一种基于检测PH值变化的半导体芯片的组织切片空间转录组测序方法。
背景技术
组织中细胞的转录组信息是研究细胞基因表达情况的重要依据，并以此来研究细胞表型和功能，揭示组织中的生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。复杂组织的各种功能又与其中的细胞类型紧密相连，因此对组织细胞转录组学的分析是研究组织器官功能和生命体生命活动的重要手段。
现阶段，组织中细胞的转录组分析通常是对活检组织取样后所进行的均质化RNA测序分析，这种方式将会导致最终获取的转录组信息为整个样本组织的平均读数，同时也丢失了细胞转录组在原有组织中的空间位置信息，然而组织中基因表达的空间位置信息对于研究组织功能和病理学变化是非常重要的。原位杂交等现有技术虽然可以在空间上研究组织细胞的基因表达情况，但是其还有很多不足，例如只能研究部分已知基因的表达情况，程序复杂，分辨率过低等等。
因此，开发出一种可以对组织切片进行高分辨率空间转录组学分析的测序方法和技术有利于更好地研究组织内细胞的基因表达和组织病理学分子机制，以至于更全面地理解组织器官功能。
发明内容
针对上述目前存在于组织空间转录组学测序方法和技术的不足，本发明旨在提供一种可以实现组织切片高分辨率空间转录组的测序方法和技术。使用本发明，可以将组织切片中细胞内的mRNA进行原位捕获，从而连接到具有空间位置信息的微球上，随后将捕获了组织中mRNA的微球进行后续的测序步骤，即可获得具有组织空间位置信息的转录组序列信息，该测序方法可实现多细胞，单细胞以及亚细胞分辨率的组织空间转录组测序。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种空间转录组测序方法，主要包括：编码微球的设计，微球位置信息的解码，组织切片处理及信使RNA的捕获，下游测序和分析定位。
进一步地，其所使用微球的尺寸大小可以是粒径0.1微米至100微米的不同材质的微球，微球可以为聚苯乙烯，二氧化硅等不同材质所制备而成的，微球上有事先连接好的寡核苷酸序列，序列信息包括但不仅限于：切割位点序列、扩增和测序接头序列、空间位置编码序列、分子标签序列和mRNA捕获探针序列。一个微球上连接有许多相同的核苷酸序列，其密度为：1条序列每个微球至1000万条序列每个微球，每个微球之间的核苷酸序列是不同的。
进一步地，带有不同编码信息的微球装载到与微球尺寸相匹配的半导体微阵列测序芯片中，使阵列中每个孔只装载上一个微球，随后通过该半导体微阵列测序芯片，可将芯片中微球上所连接的核酸序列进行测序分析，获得其序列信息，而芯片中每个微孔的位置信息是已知的，所以经过测序，可将每个微球上的序列信息与其在芯片中的位置信息一一对应起来，标记为[x1,y1]、[x2,y2]、[x3,y3]…,这样就建立了微球位置信息与微球编码序列信息的对应关系。
进一步地，将待分析的组织进行切片，然后贴于装载有编码微球的芯片上，随后对芯片上的组织进行通透处理，使组织中的mRNA可以渗透出来，在合适的条件下，mRNA上的poly(A)尾巴可以和微球上的mRNA捕获序列进行杂交互补结合，从而将组织中的mRNA结合到微球上。随后，使用逆转录酶及相关试剂将捕获到的mRNA进行原位逆转录，合成出对应的cDNA序列，最后用蛋白酶将芯片上剩余的组织进行消化处理，最后彻底清除掉芯片上的组织，此时芯片中的微球上将携带有其所对应位置上组织中的mRNA序列信息。
进一步地，通过对编码序列中的切割位点进行切割，可将微球上的cDNA序列从微球上释放出来，随后收集到离心管中，再经过文库构建，上机测序流程即可获得cDNA的序列信息，通过每条cDNA序列上所连接的空间位置编码序列信息，最终可将cDNA序列信息与测序芯片中微孔的位置信息进行对应，从而最终定位到其在组织中的原始位置。
本发明中微球位置信息解码是通过半导体测序芯片对微球上的编码序列进行原位测序所实现的。在微球装载到半导体测序芯片上之后，每个微球只会落入到芯片中内的一个微孔内，而每个微孔在芯片上的位置信息是已知的。随后通过上机测序，可以测得芯片上每个微孔内微球上所连接的空间位置编码序列即一段寡核苷酸序列的序列信息，因为每个微球上的空间编码序列是不同的，而每个微球所处的微孔位置信息又是已知的，这样即可实现不同微孔位置与编码序列的一一对应关系。
将组织切片上不同位置的转录组测序信息定位到其在组织切片上的原始位置。在取得微球中编码序列与微孔的对应关系后，微球上的捕获序列原位捕获组织中mRNA，再经逆转录合成cDNA序列，则此时每个微球上的cDNA序列将与微球上的编码序列连接成一条序列，从而使每个微球上的cDNA序列带有了位置编码信息，而每个微球的编码信息又与微球所在微孔的位置相对应，从而就建立了组织切片中转录组的空间位置信息。
在完成捕获mRNA和逆转录合成cDNA过程后，微球上的核酸序列通过酶切释放并收集到离心管内，再经过文库构建和测序步骤后，即可获得微球上每条核苷酸链的序列信息，因为每个微球上捕获的mRNA经逆转录后的cDNA都具有相同的空间编码信息。所以，通过分析测序结果，可以将带有相同空间编码信息cDNA序列的测序结果定位到原来所在的微球上，从而可以定位到微球所在的微孔位置上，从而进一步定位到其在组织中的原始位置信息。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：本方法可以实现组织切片中转录组信息的原位获取，具有多细胞至亚细胞级别的空间分辨率，从而可以准确获取组织切片中特定位点上的基因表达情况，分析细胞之间的异质性和相互关系以及细胞类型的空间分布情况。
附图说明
图1为微球上编码序列结构图；
图2为编码微球在测序芯片上进行微球原位解码测序的流程图；
图3为组织切片经过空间转录组测序分析后，最终可获得转录本测序信息的空间位置图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
将粒径为2微米的编码微球分散在1毫升超纯水中清洗两次，最后再重悬微球，得到终浓度为100000微球/毫升的微球悬浮液，取10微升微球溶液加到测序芯片上，微微晃动，使微球装载到微孔内，随后将芯片进行上机测序，测序完成后，将芯片取出备用。将事先包埋好的小鼠脑组织从-80℃冰箱取出，先放在-20℃冰箱2小时后转移到冷冻切片机内，设置好切片参数后开始切片，将切出的厚度为10微米的组织切片贴在装载有编码微球并完成测序的芯片上，完成组织贴附后，将芯片转移至超净工作台内进行下一步实验。
将贴有组织切片的芯片置于超净工作台中，进行组织透化，先用Ⅰ型核酸外切酶缓冲液在37℃条件下处理25分钟，接着再用胃蛋白酶在37℃下处理10分钟。完成透化处理后，紧接着进行逆转录步骤，以捕获的mRNA为模板合成出cDNA链。然后，将组织切片通过蛋白酶K在56℃条件下进行消化处理1个小时，将组织处理干净后，利用剪切酶将cDNA链从微球上剪切下来，收集到离心管内。将收集到的cDNA序列进行文库构建和上机测序流程，最后通过分析所获得的序列信息可以将每条位置空间编码序列所连接的cDNA序列信息定位到芯片上相应的微孔位置，完成所有的信息定位之后，即可以通过软件将不同位点的组织细胞进行分型，再可视化到组织的形貌轮廓上。
图1为微球上编码序列结构图，其中包括：切割位点序列、扩增和测序接头序列、空间编码序列、分子标签序列和信使RNA捕获序列。
图2为编码微球在测序芯片上进行微球原位解码测序过程，在微球装载到半导体测序芯片上之后，每个微球只会落入到芯片中内的一个微孔内，而每个微孔在芯片上的位置信息是已知的。随后通过上机测序，可以测得芯片上每个微孔内微球上所连接的空间位置编码序列即一段寡核苷酸序列的序列信息，因为每个微球上的空间编码序列是不同的，而每个微球所处的微孔位置信息又是已知的，这样即可实现不同微孔位置与编码序列的一一对应关系。
图3为组织切片经过空间转录组测序分析后，最终可获得转录本测序信息的空间位置图谱。在确认了微球上空间编码序列和测序芯片中微孔位置的对应关系后，将组织切片贴附于此装载有编码微球的芯片上，在一定条件下，编码微球上的捕获序列可以原位捕获组织中的mRNA，再经逆转录合成cDNA后，将带有空间编码信息、cDNA序列和分子标签等序列的整条核酸序列从微球上酶切下来，再经过文库构建和测序分析过程即可获得这些核酸链的序列信息。通过软件分析，可以将带有相同空间编码信息的cDNA序列的测序结果定位到原来所在的微球上，从而可以定位到微球所在的微孔位置上，从而进一步定位到其在组织中的原始位置信息并重建转录本的空间位置信息。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种空间转录组测序方法，其特征在于，步骤如下：
（1）编码微球的设计；
（2）微球位置信息的解码；
（3）组织切片处理及信使RNA的捕获；
（4）下游测序和分析定位。
2.根据权利要求1所述的一种空间转录组测序方法，其特征在于：所述步骤（1）的设计步骤如下：将微球上连接核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种空间转录组测序方法，其特征在于：每个微球上连接有1条至1000万条核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的一种空间转录组测序方法，其特征在于，所述核苷酸序列的序列信息包括：切割位点序列、扩增和测序接头序列、空间位置编码序列、分子标签序列和mRNA捕获探针序列。
5.根据权利要求2所述的一种空间转录组测序方法，其特征在于：所述微球由聚苯乙烯、二氧化硅制备而成的。
6.根据权利要求2所述的一种空间转录组测序方法，其特征在于：所述微球的粒径大小为0.1微米至100微米。
7.根据权利要求1所述的一种空间转录组测序方法，其特征在于，所述步骤（2）中微球位置信息的解码的步骤如下：
1）在微球装载到半导体测序芯片上，每个微球分别落入到芯片上的微孔内，并且每个微孔在芯片上的位置信息是已知的，随后通过上机测序，测得芯片上每个微孔内微球上所连接的空间位置编码序列；
2）在取得微球中编码序列与微孔的对应关系后，微球上的捕获序列原位捕获组织中mRNA，再经逆转录合成cDNA序列，建立组织切片中转录组的空间位置信息；
3）在完成捕获mRNA和逆转录合成cDNA过程后，微球上的核酸序列通过酶切释放并收集到离心管内，再经过文库构建和测序步骤后，即可获得微球上每条核苷酸链的序列信息。
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