CN117460840A - 用于空间转录组学分析的生物芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种制备用于分析生物样品的核酸信息的芯片的方法，芯片适合用于分析生物组织样品的空间转录组学信息，还提供了用于分析生物样品的核酸信息的芯片和将芯片用于分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法。能够有效地获得组织样品的细胞中的核酸表达信息，包括空间组学信息。

Description

用于空间转录组学分析的生物芯片及其制备方法和应用
本申请要求2020年12月25日提交的、申请号为202011568787.3、发明名称为“制备用于空间转录组学分析的生物芯片的方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物学与医疗器械领域。具体的，本发明涉及制备用于分析生物样品的细胞的核酸信息的芯片的方法，所述芯片适合用于分析生物组织样品的空间转录组学信息。
背景技术
对生物组织的细胞组织和表达格局的分析，是生物医学研究和诊断学上的里程碑。细胞组织学运用各种染色技术，在一个多世纪前便首先确定了健康器官的基本结构机制和常见病理学变化。该领域的发展，带来了以免疫组织化学和原位杂交的基因表达来研究蛋白质分布的可能性。
新的研究希望可以在保存关于组织的空间信息的情况下对组织中的转录物组和/或基因组变异进行表征。
基因表达分析的最新发展，为利用微阵列或RNA测序评估组织的完整转录组提供了可能，然而，典型的转录组分析以从整块组织(或者甚至完整生物体)提取的mRNA为实施对象，但是要收集较小的组织区域或个体细胞用于转录组分析，却一般非常费力、费钱且精确度低。
发明内容
本发明提供了一种用于制备适于分析生物样品的细胞的核酸信息，特别是适于分析生物组织样品的空间转录组学信息的生物芯片的方法。具体的，本发明提供了一种用于制备具有阵列的生物芯片的方法，包括以下步 骤：
A.通过多条平行设置的微流道将第一组条形码核酸固定在芯片表面，形成第一方向的多条第一条形码带，所述第一组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第一条形码核酸，每条第一条形码带上固定一种第一条形码核酸，且每条第一条形码带上固定的第一条形码核酸具有不同的条形码序列；
B.通过多条平行设置的微流道将第二组条形码核酸沿第二方向施加到芯片表面的具有第一方向的所述多条第一条形码带上，形成多条第二条形码带，所述第二组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第二条形码核酸，每条第二条形码带上具有一种第二条形码核酸，且每条第二条形码带上固定的第二条形码核酸具有不同的条形码序列；
C.在使得第一条形码核酸和第二条形码核酸发生连接反应的条件下，在所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的芯片表面将第二条形码核酸与第一条形码核酸连接，形成探针，所述探针构成阵列的阵点，每个阵点具有一种序列相互不同的探针。
在本发明的其中一个方面，所述方法中采用具有多条平行设置的微流道的微流道装置将所述第一组条形码核酸或第二组条形码核酸输送和固定在芯片表面，其中所述微流道与芯片表面接触的一面可容溶液或溶液中的核酸通过。
在本发明的其中一个方面，所述方法中在所述微流道设备的每一条微流道中加入含有不同条形码序列的第一组条形码核酸或第二组条形码核酸。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的第一条形码核酸包括第一条形码片段；优选的，所述第一条形码核酸在5’端还具有用于扩增反应的引物片段。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的 第一条形码核酸在5’端具有用于与芯片表面连接的基团。
在本发明的其中一个方面，其中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段(例如为识别和结合mRNA或cDNA的片段，例如为poly-T序列)和第二条形码片段。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸还具有唯一分子标识符(UMI)。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第一条形码核酸的3’端具有用于通过一个单链连接核酸与第二条形码核酸连接的第一连接片段，所述第二条形码核酸的5’端具有用于通过所述单链连接核酸与第一条形码核酸连接的第二连接片段，所述第一连接片段和第二连接片段分别与所述单链连接子核酸的两端的序列反向互补。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤C中形成的探针包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段，以及第一条形码片段和第二条形码片段。优选的，所述探针在5’端还具有用于扩增反应的引物片段。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的每一种第一条形码核酸的条形码片段的序列是指定的，和/或所述第二组条形码核酸中的每一种第二条形码核酸的条形码片段的序列是指定的。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述探针的第一条形码片段和第二条形码片段的序列是指定的。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤A中流道内的核酸浓度为约0.1-100uM，例如为约1-20uM。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤B中流道内的核酸浓度为约0.1-100uM，例如为约1-20uM。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤A中，所述第一组条形 码核酸的核酸固定在芯片表面上。第一组条形码核酸的核酸优选以化学键连接方式固定在芯片表面上。化学键连接方式例如为选自氨基-醛基反应等的基团连接、共价交联中的任意一种。芯片的表面可以通过表面化学反应用氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷等活性基团等进行包被；所述第一组条形码核酸的核酸与芯片表面连接的一端(通常为5’端)则具有与包被的活性基团形成化学键的基团。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤A和步骤B中所述平行设置的微流道的各条微流道的宽度为约2-200μm，优选为约5-50μm，最优选为约5-25μm，例如为约5μm，10μm或50μm。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤A和步骤B中所述平行设置的微流道的各条相邻微流道之间的间距为约5-400μm，优选为约10-100μm，最优选为约10-50μm，例如为约20μm，50μm或100μm。
本发明的制备得到的芯片可用于对组织样品，特别是组织薄切片进行细胞内含分子的分析，包括对核酸和蛋白的分析，例如通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行分析，获得其表达和空间信息。
在本发明的其中一个方面，所述生物样品为来自受试者的组织样品，例如为手术切除组织样品，优选为通过显微切片术加工得到的组织薄切片。在本发明的其中一个方面，所述组织样品经过固定和包埋(例如包埋在石蜡中)，以及附着在支持物例如玻片上。
在本发明的其中一个方面，可对所述组织薄切片进行形态分析和/或组织学分析，该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、以及FISH染色进行。
在本发明的其中一个方面，对该一种或多种生物分子进行分析是通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行。
在本发明的其中一个方面，受试者选自动物、农场动物、宠物、人类受试者。
在本发明的其中一个方面，分析物进一步包括非人细胞、人细胞、非天然蛋白质、核酸、或小分子、染料、病毒、细菌、寄生虫、原生动物或化学物质中的一种或多种。小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合。
在本发明的其中一个方面，所述芯片可用于分析样品中标记物的定量和/或定性数据。该标记物包括DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。该蛋白质可包括修饰，所述修饰选自下组，该组由以下各项组成：乙酰化、ADP-核糖基化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附接黄素、共价附接血红素、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、精氨酰化、以及泛素化。该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性
(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达。该标记物包括单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5′非翻译区(5′UTR)、或3′非翻译区(3′UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变、或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5′-或3′-UTR、或其组合。其中与正常的健康组织或细胞相比，在癌组织或癌细胞中该标记物包括对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变 化、或甲基化状态变化。其中可通过单细胞测序、单核测序、流式细胞术、免疫组织化学染色、苏木精和伊红染色、全基因组测序、高通量测序、质谱法、DNA微阵列、或其组合对该标记物进行测量。
本发明的芯片可用于分析组织样品。该组织样品包括选自以下项的组的样品：一种或多种恶变前或恶性细胞、来自实体瘤的细胞、软组织肿瘤或转移灶、来自手术边缘的组织或细胞、组织学正常组织、一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)、正常邻近组织(NAT)、来自患肿瘤或处于患肿瘤风险的相同受试者的血液样品、或FFPE样品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的制备芯片的方法步骤的示意图。
图2为本发明的方法中采用具有多条平行设置的微流道的设备的一种示例性实施方式。
图3为本发明提供的制备芯片的方法步骤的示意图。
图4为本发明提供的制备生物芯片的方法的一种示例性实施方式的流程示意图。
图5为本发明提供的制备生物芯片的方法的又一种示例性实施方式的流程示意图。
图6为本发明提供的制备生物芯片的制备过程对其条形码核酸连接反应的观测。
图7为采用本发明提供的制备生物芯片对样品组织进行生物空间组研究中对组织切片进行HE染色后的图像。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。
实施例1
本发明提供了一种制备适于分析生物样品的细胞的核酸信息的生物芯片的方法。更具体的，本发明提供了一种用于制备具有阵列的生物芯片的方法。在本发明的其中一个方面，本发明提供的芯片适于分析生物组织样品的空间转录组学信息。
图1为本发明提供的制备具有阵列的生物芯片的示例性方法的流程示意图。
如图1所示，所述方法主要包括以下步骤：
步骤1.提供芯片基底；
步骤2.通过多条平行设置的微流道将第一组条形码核酸(其包括多种第一条形码核酸，其中每一种第一条形码核酸具有不同的条形码序列(图中的Barcode A))与芯片表面接触和使其固定在芯片表面，在芯片表面形成走向为第一方向的多条第一条形码带，其中每条第一条形码带上固定的第一条形码核酸具有不同的第一条形码序列。
图2为通过多条平行设置的微流道将多种条形码核酸与芯片表面接触并固定在芯片表面的一种示例性实施方式。图2的左图的下方为芯片。图2的左图的中间显示一种具有多条平行设置的微流道(微流道1至微流道n)的微流道装置，其中微流道与芯片表面接触的一面，即图示的微流道的底部，可容溶液或溶液中的核酸通过(透过)。例如，所述微流道与 芯片表面接触的一面不存在微流道壁。将该微流道装置沿第一方向覆盖在芯片表面，然后在微流道内通入指定的溶液，例如含有条形码核酸的溶液。图2的左图的上方为示例性的协助通入溶液的装置，例如为利用负压的真空抽吸装置，其可设置在微流道的出口。图2右图显示在每一条微流道中通过入口加入含有不同条形码序列的条形码核酸(图中的条形码核酸1-n)。在本发明的其中一个方面，所述每一条微流道中通入的条形码核酸的条形码序列具有已知的或指定的核苷酸序列。
步骤3.移走步骤2中的微流道，通过另一组多条平行设置的微流道将第二组条形码核酸(其包括多种第二条形码核酸，其中每一种第二条形码核酸具有不同的条形码序列(图中的Barcode B))沿与第一条形码带的方向不同的第二方向(通常为与第一方向垂直)与芯片表面接触，形成多条第二条形码带，其中每条第二条形码带上固定的第二条形码核酸具有不同的第二条形码序列；
在使得第一条形码核酸和第二条形码核酸能够发生连接反应的条件下，在所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的芯片表面将第二条形码核酸与第一条形码核酸连接，形成探针。
步骤4.移走步骤3中的微流道，获得表面具有探针阵列的生物芯片。所述探针阵列上的每个阵点对应所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的位置。每个阵点具有一种探针分子，其包括第一条形码序列和第二条形码序列。各个阵点具有的探针分子包括的第一条形码序列和第二条形码序列的组合各不相同。在本发明的其中一个方面，所述每一条微流道中通入的条形码核酸的第一条形码序列和第二条形码序列是已知的或指定的，由此各个阵点具有的探针分子包括的第一条形码序列和第二条形码序列及其组合也是已知的。由此可通过各个阵点具有的探针分子的第一条形码序列和第二条形码序列获知其在芯片表面的阵列中的空间位置。
在本发明中，芯片通常是指固体基片，其上可以实施化学，生物，生物物理或生物化学过程等。芯片可具有微观结构或微尺度结构，如通道和孔井，电极元件，电磁元件等利于芯片上发生的化学，生物，生物物理或生物化学过程。芯片表面可以是平的，或不平的。表面不平的芯片可以包括构造在表面的通道或孔。
芯片可以由任何合适的材料制成，芯片材料的示例性类型包括玻璃、改性玻璃、功能化玻璃、无机玻璃、微球(包括惰性和/或磁性颗粒)、塑料、多糖、尼龙、硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、光纤或光纤束、除上文例示的材料以外的多种聚合物和多孔微量滴定板。示例性塑料的具体类型包括丙烯酸树脂(acrylics)、聚苯乙烯、苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯和TeflonTM。示例性的基于二氧化硅的材料的具体类型包括硅和改性硅的各种形式。芯片表面通常需要沉积生物聚合物(包括核酸、多肽和/或其它聚合物)。可通过对于本领域技术人员公知的多种方法，对芯片表面做修饰以适应目标生物聚合物的附着。
在本发明中，制备得到的所述芯片表面的阵列上具有探针(或称为捕捉探针)。探针是指可以基因特异性或靶物特异性地识别和结合目标核酸，例如来自组织样品的核酸的单链核苷酸分子，其具有特异性的核苷酸序列，即能够选择性退火到靶定核酸的核苷酸序列，通常为互补的核苷酸序列。组织样品中的分析物的实例包括基因组DNA、甲基化DNA、特定的甲基化DNA序列、信使RNA(mRNA)、多聚A mRNA、片段化mRNA、片段化的DNA、线粒体DNA、病毒RNA、微小RNA、原位合成的PCR产物、RNA/DNA杂合物、脂质、碳水化合物、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体或病毒壳体蛋白。捕捉探针可以是基因特异性捕捉探针，其例如与样品中特异性靶定的mRNA或cDNA杂交。
在本发明中，所述探针具有条形码序列，用于后续的高通量下一代测序(NGS)或合成测序(SBS)进行分析的应用中，例如在进行大通量的测序分析中。在这些测序中，采用条形码序列来标志和鉴定测序获得的核酸序列的核酸的来源。条形码分子用于将来自生物颗粒(例如，细胞)的核酸分子(例如，RNA分子)条形码化，以生成测序文库，随后对所述测序文库进行测序以产生多个测序读长。多个测序读长中的一些或全部包括条形码序列。在这些测序应用中，通常对细胞核酸进行扩增，直到对象中的条形码化重叠片段构成特定部分或全部细胞基因组的至少1X覆盖率、至少2X、至少3X、至少4X、至少5X、至少10X、至少20X、至少40X或更高覆盖率。一旦产生条形码化片段，就可以将它们直接在合适的测序系统上测序，例如Illumina系统。多个序列上相同条形码的存在可以提供关于该序列的起源的信息。
多核苷酸测序中，可以依赖于独特的条形码序列来鉴定核酸片段的起源，以及，例如，从经测序的片段装配较大的序列。条形码可以允许在测序过程中对单个多核苷酸片段进行鉴别和/或量化。
在本发明中，在制备得到的探针中含有两个条形码序列。两个条形码序列可以帮助确定探针在芯片表面的阵列中的位置(分别确定X维度和Y维度的位置)，因此还还具有位置标签的作用。探针上的条形码序列可与芯片上的阵列中的阵点(feature)对应，也可指示其识别的组织上的细胞，包括单个细胞，在该组织样品中的位置。可以与核酸标签偶联的其它分子的实例包括抗体、抗原结合结构域、蛋白质、肽、受体、半抗原等。
在本发明中，所述探针还包括一个或多个唯一分子标识符(UMI)。唯一分子标识符是连续的核酸片段或两个或多个非连续的核酸片段，它们充当特定分析物或结合特定分析物的捕获探针的标记或标识符。UMI是基本上不与生物样品中的分析物核酸分子杂交的核酸序列。UMI可为捕获探针的序列内包含约6至约20或更多个核苷酸。
在本方面的方法的步骤2中，第一组条形码核酸与芯片的固定可采用领域内各种已知的方法进行。核酸的固定指通过共价或非共价键直接或间接附着在芯片上。在本发明的其中一个方面，固定指在需要核酸扩增和/或测序的等反应中，保持静止或附着于芯片上。示例性的非共价连接包括但不限于非特异性相互作用(例如氢键键合、离子键键合、范德华相互作用等)或特异性相互作用(例如亲和相互作用、受体-配体相互作用、抗体-表位相互作用、抗生物素蛋白-生物素相互作用、链霉亲合素-生物素相互作用、凝集素-碳水化合物相互作用等)。
在本方面的方法的步骤3中，第一条形码核酸和第二条形码核酸的连接可通过本领域已知的各种方法进行。例如，通过各自与另一单链核酸片段(连接子核酸)的不同末端的序列互补，在可进行连接反应的条件下形成3个核酸片段(第一条形码核酸、第二条形码核酸和连接子核酸)的组合后达到连接的目的。
在本发明的其中一个方面，所述第一条形码核酸包括第一条形码片段。在本发明的其中一个方面，所述第一条形码核酸在5’端具有用于后续扩增反应的引物片段，例如为用于已知测序方法中通用引物序列。在本发明的其中一个方面，所述第一条形码核酸在5’端具有用于与芯片表面连接的基团或序列。例如，芯片表面为醛基修饰，则在第一条形码核酸在5’端具有氨基基团。在本发明的其中一个方面，所述第一条形码核酸具有可与芯片上修饰的因子形成特异性相互作用的配子，例如所述因子和配子分别为抗体-表位、抗生物素蛋白-生物素、链霉亲合素-生物素、凝集素-碳水化合物。
在本发明的其中一个方面，所述第二条形码核酸包括第二条形码片段。在本发明的其中一个方面，所述第二条形码核酸在3’端具有用于识别和结合生物样品中的目标的捕获片段，例如为识别和结合mRNA或cDNA的片段，例如为识别mRNA的poly-T序列。
在本发明的其中一个方面，所述第一条形码核酸的3’端具有用于与第二条形码核酸连接的第一连接片段(3’连接片段)。在本发明的其中另一个方面，所述第二条形码核酸的5’端具有用于与第一条形码核酸连接的第二连接片段(5’连接片段)。在本发明的其中又一个方面，所述第一连接片段和第二连接片段分别与连接子核酸的一端形成互补，在可连接的条件下(如T4连接酶等的存在下)，第一连接片段和第二连接片段与连接子核酸形成组合，达到第一条形码核酸和第二条形码核酸的连接。
本发明提供的方法制备的芯片可用于对组织样品，特别是组织薄切片进行细胞内含分子的分析，包括对核酸和蛋白的分析，例如通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行分析，获得其表达和空间信息。
“测序”通常是指用于确定一种或多种多核苷酸中的核苷酸碱基序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如核酸分子例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可以通过目前可用的各种系统执行，例如但不限于通过Illumina、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore或Life Technologies的测序系统。可替代地或另外地，可使用核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来执行测序。此类系统可以提供对应于受试者(例如人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如从受试者提供的样品由系统所产生。在一些实例中，此类系统提供测序读长(在本文中也称为“读长”)。读长可以包括一串核酸碱基，其对应于已经测序的核酸分子的序列。在一些情况下，本文提供的系统和方法可与蛋白质组信息一起使用。
本发明制备的芯片适合用于分析生物样品的细胞的核酸信息，特别是生物组织样品的空间转录组学信息。适于本发明的“组织样品”包括从受试者获得，固定，切片并且安装在平面表面的组织。组织样品可以是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品或新鲜组织样品或冷冻组织样品等。本文公开的方法可以在染色组织样品之前或之后进行。例如，在苏木 精和曙红染色之后，组织样品可以按照本文提供的方法进行空间分析。方法可以包括分析样品的组织学(例如使用苏木精和曙红染色)，然后空间分析组织。组织切片用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)通常包括将从受试者获得的组织在甲醛(例如磷酸盐缓冲盐水中的3％-5％甲醛)或Bouin溶液中固定，包埋到蜡中，切成薄切片，然后安装在平面表面，如显微镜载玻片中的生检。
本发明的芯片在使用中，包括将组织切片与阵列接触，阵列上的探针可识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mRNA。后续的分析包括逆转录和扩增等，并且可通过高通量下一代测序(NGS)或合成测序(SB S)进行分析。
在一些实施方案中，将组织切片(例如福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片)中的核酸转移到阵列，并通过与捕捉探针杂交捕捉到阵列上。在一些实施方案中，捕捉探针可以是通用捕捉探针，其例如与核酸测序文库中的衔接子区域，或mRNA的多聚-A尾杂交。在一些实施方案中，捕捉探针可以是基因特异性捕捉探针，其例如与样品中特异性靶定的mRNA或cDNA杂交。
在一些实施方案中，将组织切片(例如FFPE切片)中的核酸转移至阵列，并通过与通用衔接子寡核苷酸的单链连接捕捉到阵列上。在其它实施方案中，可将芯片上的核酸转移到组织切片(例如FFPE切片)中。可通过本领域已知的方法使得结合在芯片上的探针在溶液中脱落后进入与其接触的组织上的细胞。例如，可在核酸探针与芯片的结合处加入可光解的接头等，或者是通过pH敏感型接头将核酸探针与芯片结合，然后通过改变溶液的pH值使得核酸探针与芯片分离。
本发明的芯片和对其的使用，可通过各个阵点具有的探针分子的第一条形码序列和第二条形码序列获知其在芯片表面的阵列中的空间位置，也由此可获得核酸分子所在的细胞在所述组织中的位置信息。
本发明提供的制备具有探针阵列的芯片的方法，可以在同一基底上，实现多个具有相同的编码区域的阵列的芯片的并行合成。如图3所示，可以根据需要，在芯片基底的第一方向和第二方向上形成多组相同的第一条形码带和第二条形码带，由此得到多个在对应阵点上具有相同的第一条形码和第二条形码序列定义的探针的芯片。
在本发明的其中一种实施方式中，发明人出乎意料地发现，在前述方法的步骤2(即本发明提供的一种用于制备具有阵列的生物芯片的方法的步骤A中)，即将所述第一组条形码核酸的核酸固定在芯片表面上时，通过将所述第一组条形码核酸的核酸与已固定在芯片表面(包括整个芯片表面或与第一组条形码位置相同的芯片表面部分)的核酸(本文中称为芯片表面连接子核酸或芯片表面连接子)通过核酸与核酸的连接反应(例如通过核酸连接酶和桥接所述两个核酸的核酸连接子片段)进行相连，能够显著地改进第一组条形码核酸的核酸在芯片上的固定效率，使得在芯片的每个探针构成阵列的阵点上的探针密度显著增加，并且均匀性显著改善。在不受此理论限制的条件下，发明人认为这是由于核酸与核酸的连接反应效率和稳定性比其它核酸与芯片表面固定的方式(如共价键方式等)更强，以及由此可减小探针上每个核酸片段的长度，增加各片段的连接效率等。由此，在本发明的其中一种实施方式中，步骤A之前还包括预步骤，其包括在芯片(例如玻片)表面(例如在芯片的整个表面)预先固定用于与第一组条形码核酸连接的芯片表面连接子核酸。芯片表面连接子核酸可以以化学键连接方式固定在芯片表面上。化学键连接方式例如为选自氨基-醛基反应等的基团连接、共价交联中的任意一种。芯片的表面可以通过表面化学反应用氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷等活性基团等进行包被。所述芯片表面连接子核酸与芯片表面连接的一端(通常为5’端)则具有与包被的活性基团形成化学键的基团。在本发明的其中又一种实施方式中，所述芯片表面连接子核酸的3’端具有用于通过一个单链连接核酸与第一条形码核酸连接的连接片段。在本发明的其中又一种实施方式中，其中所述第一条形码核酸的5’端具有用于通过一个单链连接核酸与 所述芯片表面连接子核酸连接的连接片段，所述芯片表面连接子核酸的3’端具有用于通过所述单链连接核酸与第一条形码核酸连接的连接片段，所述芯片表面连接子核酸的3’端的连接片段和第一条形码核酸的5’端的连接片段分别与所述单链连接核酸的两端的序列反向互补。以及，所述第一条形码核酸的3’端具有用于通过一个单链连接核酸与第二条形码核酸连接的连接片段，所述第二条形码核酸的5’端具有用于通过所述单链连接核酸与第一条形码核酸连接的连接片段，所述第一条形码核酸的3’端的连接片段和第二条形码核酸的5’端的连接片段分别与所述单链连接核酸的两端的序列反向互补。在本发明的其中又一种实施方式中，所述芯片表面连接子核酸在5’端具有用于后续扩增反应的引物片段，例如为用于已知测序方法中通用引物序列。
本发明还提供了用于分析生物样品的核酸信息的芯片。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片通过前述方法制备得到。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片的表面具有形成阵列的探针，所述探针阵列包括正交的行和列，所述阵列中的探针各具有不同的序列，可用于体现所述探针的空间位置。在本发明的其中一个方面，所述探针包括第一条形码和第二条形码。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列的每一行探针具有相同的第一条形码以及每一列的探针具有相同的第二条形码；每一行探针具有的第一条形码各不相同以及每一列探针具有的第二条形码各不相同。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片在其整个表面具有芯片表面连接子核酸。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的5’端为所述芯片表面连接子核酸。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列从5’端到3’端包括所述芯片表面连接子核酸、第一条形码、第二条形码、用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列包括5’端的用于扩增反应的引物片段。在本发明的其中又一个方面， 所述探针阵列中的每个探针的序列还包括唯一分子标识符(UMI)。
本发明还提供了用于分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法，所述方法包括将前述芯片的阵列与组织样品接触。适于本发明的“组织样品”包括从受试者获得，固定，切片并且安装在平面表面的组织。组织样品可以是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品或新鲜组织样品或冷冻组织样品等。本发明的方法可以在染色组织样品之前或之后进行。例如，在苏木精和曙红染色之后，组织样品可以按照本文提供的方法进行空间分析。方法可以包括分析样品的组织学(例如使用苏木精和曙红染色)，然后空间分析组织。组织切片用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)通常包括将从受试者获得的组织在甲醛(例如磷酸盐缓冲盐水中的3％-5％甲醛)或Bouin溶液中固定，包埋到蜡中，切成薄切片，然后安装在平面表面，如显微镜载玻片中的生检。本发明的方法在将组织切片与芯片上的探针阵列接触，阵列上的探针可识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mRNA。后续的分析包括逆转录和扩增等，并且可通过高通量下一代测序(NGS)或合成测序(SBS)进行分析。
实施例2芯片(表面局部修饰)的制备
图4为本发明提供的制备生物芯片的方法的示例性实施方式的流程示意图。
其中，以玻璃片为芯片基底。
通过软光刻工艺制备由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成如图2所示的包括多条平行设置的微流道的装置，微流道的底部开口。
微流道的装置包括约50-500条平行设置的微流道。所述平行设置的微流道的各条微流道的宽度为约2-200μm，优选为约5-50μm，最优选为约5-25μm，例如为约5μm，10μm或50μm。各条相邻微流道之间的间距为约5-400μm，优选为约10-100μm，最优选为约10-50μm，例如为约20μm，50μm或100μm。
合成PLL-PEG-生物素，用PBS配置成1mg/ml的PLL-PEG-生物素溶液。
合成100条5’端生物素修饰的具有以下序列的第一组条形码核酸：
5’生物素-CTACACGACGCTCTTCCGATCT 12345678 CTCTTTCCCTACACGACGCTCTT-3′
其中，“12345678”表示具有8个核苷酸的条形码片段，其中所述8个核苷酸的序列是已知(指定的)，所述100条第一组条形码核酸的第一条形码的序列各不相同。该条形码片段的5’侧的CTACACGACGCTCTTCCGATCT为后续测序程序中用于扩增反应的引物片段。该条形码片段的3’侧的CTCTTTCCCTACACGACGCTCTT为用于与第二条形码片段形成连接的连接片段。
合成100条具有以下序列的第二组条形码核酸：
5’磷酸化-GAGTGATTGCTTGTGACGCCTT 87654321 NNNNNNNNNN TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′
其中，“87654321”表示具有8个核苷酸的条形码片段，其中所述8个核苷酸的序列是已知(指定的)，所述100条第二组条形码核酸的第一条形码的序列各不相同。在本发明的其中一个方面。第二组条形码核酸中的各条条形码核酸的条形码片段与第一组条形码核酸中的各条条形码核酸的条形码片段相同。该条形码片段的5’侧的
GAGTGATTGCTTGTGACGCCTT为用于与第一条形码片段形成连接的连接片段。该条形码片段的3’侧具有polyT VN序列，可用于结合mRNA。
合成用于连接第一条形码核酸和第二条形码核酸的连接子核酸，其序列如下：
5′-AAGGCGTCACAAGCAATCACTCAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG-3′
将PDMS微流道装置与玻片贴合，实现流道封闭。根据界面特性可以用夹持工具对流道顶部与基底玻片进行压合以提高密封性。微流道的一端为溶液入口，另一端通过接口与真空抽吸装置相连接。
将第一个PDMS微流道装置与玻片贴合，通入乙醇排除气泡，再换PBS缓冲液冲洗一次，然后在流道内加入1mg/ml的PLL-PEG-生物素溶液， 反应约30分钟，室温。保持低负压以维持流体低速流动，使得消耗的反应物得以补充。
反应完成后，通入PBS缓冲液清洗流道，接着通入链霉亲和素，充满流道后静置10分钟，室温。反应完成后，实现在流道覆盖处的芯片的局部修饰。
通入PBS缓冲液进行清洗。清洗之后在微流道内通入生物素化的第一组条形码核酸：在每一个流道通入15uM的一种第一条形码核酸(每个流道的第一条形码核酸具有与其它流道的第一条形码核酸不同的条形码序列)。充满流道后静置10分钟，室温。反应完成后，实现第一组条形码核酸在流道覆盖处的芯片的固定，形成第一组条形码带。
用PBS缓冲液和超纯水对流道进行冲洗，冲洗之后，移走微流道装置，对芯片进行室温晾干。
晾干之后，将另一个PDMS微流道装置与玻片沿与第一个PDMS微流道装置的流道形成正交的方向进行贴合。流道内通入缓冲液排出流道内的气体之后，通入15uM的第二组条形码核酸：在每一个流道通入一种第二条形码核酸(每个流道的第二条形码核酸具有与其它流道的第二条形码核酸不同的条形码序列)和连接子核酸以及T4连接酶。充满流道后静置30分钟，室温。
完成连接反应之后，通入缓冲液，超纯水对流道进行清洗。之后取下流道，对基底进行晾干。即完成芯片制备。
实施例3芯片(表面完全修饰)的制备
图5为本发明提供的制备生物芯片的方法的另一示例性实施方式的流程示意图。
其中，先以玻璃片为芯片基底，通过表面化学反应用氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷等活性基团等芯片表面进行修饰。
在本实施例中，以商购的光学环氧基修饰的玻璃片( Slide E)为芯片基底。
合成100条5’端氨基修饰的具有以下序列的第一组条形码核酸：
5’氨基-CTACACGACGC TCTTCCGATCT 12345678 CTCTTTCCCTACACGACGCTCTT-3′
其中，“12345678”表示具有8个核苷酸的条形码片段，其中所述8个核苷酸的序列是已知(指定的)。所述100条第一组条形码核酸的所述条形码片段(称为第一条形码)的序列各不相同，且各条第一组条形码核酸的第一条形码的序列是已知(指定的)。其中带下划线的T碱基为FITC修饰。在本实施例中，采用对条形码片段进行荧光修饰和检测产生的荧光信号来对芯片合成中每个加入条形码片段的步骤进行观察或生产质控。在其它实施方式中，可以不对条形码片段进行荧光修饰。
合成100条具有以下序列的第二组条形码核酸：
5’磷酸化-GAGTGATTGCT TGTGACGCCTT 87654321 NNNNNNNNNN TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′
其中，“87654321”表示具有8个核苷酸的条形码片段，其中所述8个核苷酸的序列是已知(指定的)，所述100条第二组条形码核酸的条形码片段(称为第二条形码)的序列各不相同，且各条第二组条形码核酸的第二条形码的序列是已知(指定的)。其中带下划线的T碱基为Cy3修饰。
合成1条具有以下序列的连接子核酸：
5’-CAAGCAATCACTCGAAGAGCGTCGTGT-3’
将实施例2所描述的PDMS微流道装置与玻片贴合，实现流道封闭。用夹持工具对流道顶部与基底玻片进行压合以提高密封性。微流道的一端为溶液入口，另一端通过接口与真空抽吸装置相连接。
将第一个PDMS微流道装置与玻片贴合，通入乙醇排除气泡，再换PBS缓冲液冲洗一次，然后在流道内加入15uM的第一组条形码核酸(溶解于300mM磷酸钠缓冲液中，pH8.5)：在每一个流道通入一种第一条形码核酸(每个流道的第一条形码核酸具有与其它流道的第一条形码核酸不同的条形码序列)。充满流道后，将玻片置于35℃饱和氯化钠湿盒，静置三小时，室温。反应完成后，使用1×PBS缓冲液冲洗流道1分钟。然后拆下PDMS微流道装置，修饰的玻片依次使用0.1％Triton X-100、1mM HCl、100mM KCl清洗，然后使用0.1M Tris pH 9.0、50mM乙醇胺、0.1％ 的SDS于50℃进行封闭。封闭结束后使用去离子水冲洗基片1分钟，然后用氮气吹干基片。采用荧光显微镜观察第一条形码核酸的FITC荧光信号，确定反应完成和实现第一组条形码核酸在流道覆盖处的芯片的固定，形成第一组条形码带。
将另一个PDMS微流道装置与玻片沿与第一个PDMS微流道装置的流道形成正交的方向进行贴合。流道内通入缓冲液排出流道内的气体之后，通入15uM的第二组条形码核酸：在每一个流道通入一种第二条形码核酸(每个流道的第二条形码核酸具有与其它流道的第二条形码核酸不同的条形码序列)和连接子核酸以及T4连接酶。充满流道后37℃静置30分钟。
完成连接反应之后，通入1×PBS缓冲液，超纯水对流道进行清洗。之后取下流道，用去离子水冲洗基片1分钟，然后用氮气吹干基片。采用荧光显微镜观察第二条形码核酸的Cy3荧光信号，确定反应完成和实现第二条形码核酸与第一组条形码核酸在流道交叉点的连接反应，形成条形码阵列，由此完成芯片制备。
通过对制备得到的芯片上荧光信号的观测来评估各条形码核酸连接反应的效率以及制备得到的芯片的探针的强度(密度)和均匀性。图6显示在显微镜(奥林巴斯bx53)下对各条形码核酸连接反应的观测的图。如图6所示，在芯片横向的阵列上显示第一组条形码核酸的携带的FITC修饰的荧光信号；在芯片竖向的阵列上显示第二组条形码核酸的携带的Cy3修饰的荧光信号。
实施例4组织样品制备和染色
(一)组织OCT包埋
取新鲜小鼠脑组织样本，迅速用预冷的PBS溶液或者生理盐水冲洗组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体。将组织置于包埋槽，添加OCT包埋剂至完全覆盖组织。确认组织周围没有气泡，将包埋槽置于干冰上，直至OCT完全冻结。
(二)冷冻切片
冷冻切片机温度设定为箱体温度：-20℃，样本头温度：-10℃。切片之前将冷冻组织和基片先放入-20℃冷冻切片机箱体中平衡30分钟以上，然后在冷冻切片机箱体中进行冷冻切片，厚度为10μm。
(三)组织固定、HE染色
将切好的组织切片贴附于实施例3制备得到的条形码阵列修饰的基片上，然后置于37℃孵育1分钟。将贴附组织的基片完全浸入预冷的甲醇中，-20℃固定30分钟。固定结束后，取出基片，擦干背面液体，在组织切片上滴加500μl异丙醇，室温孵育1分钟。1分钟后，除去异丙醇，然后室温晾干5-10分钟。
加入1ml苏木精，均匀覆盖基片上的组织切片，室温孵育7分钟。去除苏木精试剂，将基片浸入RNase-free Water中清洗，晾干。加入1ml返蓝液，室温孵育2分钟。去除返蓝液，将基片浸入RNase-free Water清洗后，擦干基片背面液体。加入1ml伊红混合物，室温孵育1分钟。
去除伊红，将基片浸入RNase-free Water清洗，晾干直至组织不透明。在37℃下孵育玻片5分钟后，进行明场成像。
图7为HE染色后的组织图像。
(四)组织透化
将夹具腔室组装至制备得到的组织芯片上，确保组织切片位于对应的腔室内部。向腔室中加入70ul透化酶(0.1N HCl稀释的0.1％胃蛋白酶)37℃透化组织，移除透化酶后用0.1×SSC清洗。
实施例5组织样品切片通过芯片进行逆转录反应、建库和测序
向实施例4中清洗后的腔室中加入70μl反转录混合液。其中，反转录混合液包括：1x第一链缓冲液，5mM DTT，500μM dNTP，0.19μg/μl BSA，1％DMSO，2.5μM Template Switch Oligo，20U/μl Superscript III以及2U/μl RNase inhibitor。
其中Template Switch Oligo序列为：
5’Biotin-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG-3’
Template Switch Oligo中，倒数第1、2、3位碱基进行核糖鸟嘌呤核 苷修饰。
使用胶带将腔室密封之后，置于温控板上，调控至约50℃进行反转录，反应16小时。
反转录结束后，吸弃腔室中的反转录混合液。向腔室中加入70μl 0.08M KOH，室温孵育5分钟，然后加入100ul RNase-free Water清洗一次。
向清洗后的腔室中加入cDNA二链合成反应液。其中二链合成反应液包括：1×Kapa HiFi Hotstart ReadyMix，0.8uM Second Strand Primer。使用胶带将腔室密封之后，置于温控板上，调控至约37℃进行cDNA二链合成，反应30分钟。
其中Second Strand Primer序列为：
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT-3’
反应结束后，吸弃腔室内二链合成反应液，然后加入100ul RNase-free Water清洗一次。接着向腔室中加入70μl 0.08M KOH，室温孵育10分钟。准备几个新的1.5ml离心管，向其中加入10μl Tris(1M，pH 7.0)。将腔室中的70μl样品转移至相应的含有Tris的离心管内，混匀，即完成cDNA的二链制备。
cDNA扩增
取新的1.5ml离心管置于冰上，配制PCR扩增反应液。其中PCR反应液包括：1×Kapa HiFi Hotstart ReadyMix，0.8μM cDNA Forward Primer，0.8μM cDNA Reverse Primer，35μl cDNA template，总体积100μl。通过以下方案进行cDNA扩增：
其中cDNA Forward Primer序列为：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATC-3’
cDNA ReversePrimer序列为：
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG-3’
结果显示CT值为约10.6。
扩增结束后，使用AMpure SPRIselect Beads纯化扩增产物。
将扩增后产物选行建库/测序。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

  1. 制备具有阵列的生物芯片的方法，包括以下步骤：
    A.通过多条平行设置的微流道将第一组条形码核酸固定在芯片表面，形成第一方向的多条第一条形码带，所述第一组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第一条形码核酸，每条第一条形码带上固定一种第一条形码核酸，且每条第一条形码带上固定的第一条形码核酸具有不同的条形码序列；
    B.通过多条平行设置的微流道将第二组条形码核酸沿第二方向施加到芯片表面的具有第一方向的所述多条第一条形码带上，形成多条第二条形码带，所述第二组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第二条形码核酸，每条第二条形码带上具有一种第二条形码核酸，且每条第二条形码带上的第二条形码核酸具有不同的条形码序列；
    C.在使得第一条形码核酸和第二条形码核酸发生连接反应的条件下，在所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的芯片表面将第二条形码核酸与第一条形码核酸连接，形成探针，所述探针构成阵列的阵点，每个阵点具有一种序列相互不同的探针。
  2. 权利要求1的方法，其中采用具有多条平行设置的微流道的微流道装置将所述第一组条形码核酸或第二组条形码核酸输送和固定在芯片表面，其中所述微流道与芯片表面接触的一面可容溶液或溶液中的核酸通过，其中在所述微流道设备的每一条微流道中加入含有不同条形码序列的第一组条形码核酸或第二组条形码核酸。
  3. 权利要求1的方法，其中所述第一组条形码核酸中的第一条形码核酸包括第一条形码片段，以及在5’端具有用于扩增反应的引物片段。
  4. 权利要求3的方法，其中所述第一组条形码核酸中的第一条形码核酸在5’端具有用于与芯片表面连接的基团。
  5. 权利要求1的方法，其中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的探针片段(例如为识别和结合mRNA或cDNA的片段，例如为poly-T序列)和第二条形码片段。
  6. 权利要求5的方法，其中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸还具有唯一分子标识符(UMI)。
  7. 权利要求1的方法，其中所述第一条形码核酸的3’端具有用于通过一个单链连接核酸与第二条形码核酸连接的第一连接片段，所述第二条形码核酸的5’端具有用于通过所述单链连接核酸与第一条形码核酸连接的第二连接片段，所述第一连接片段和第二连接片段分别与所述单链连接核酸的两端的序列反向互补。
  8. 权利要求1的方法，其中步骤C中形成的探针包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段，以及第一条形码片段和第二条形码片段，优选的，所述探针在5’端还具有用于扩增反应的引物片段。
  9. 权利要求1的方法，其中所述第一组条形码核酸中的每一种第一条形码核酸的条形码片段的序列和所述第二组条形码核酸中的每一种第二条形码核酸的条形码片段的序列是指定的。
  10. 权利要求1的方法，其中步骤A或B中流道内的核酸浓度为约0.1-100uM，例如为约1-20uM。
  11. 权利要求1的方法，其中步骤A中，所述第一组条形码核酸的核酸以化学键连接方式固定在芯片表面上，所述化学键连接方式例如为选自氨基-醛基反应、静电吸附、共价交联中的任意一种。
  12. 权利要求1的方法，其中步骤A和步骤B中所述平行设置的微流道的各条微流道的宽度为约2-200μm，优选为约5-50μm，最优选为约5-25μm，例如为约5μm，10μm或50μm，
    以及，
    所述平行设置的微流道的各条相邻微流道之间的间距为约5-400μm，优选为约10-100μm，最优选为约10-50μm，例如为约20μm，50μm或100μm。
  13. 根据权利要求1-12中任一项所述的方法制备的具有阵列的生物芯片用于分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法，所述方法包括将前述芯片的阵列与组织样品接触，阵列上的探针识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mRNA，然后进行逆转录和扩增等反应，任选的，可通过高通量下一代测序(NGS)或合成测序(SBS)进一步对获得的核酸进行分析。
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KR101829182B1 (ko) * 2009-04-02 2018-03-29 플루이다임 코포레이션 표적 핵산의 바코딩을 위한 멀티 프라이머 증폭 방법
KR102650753B1 (ko) * 2016-10-01 2024-03-26 버클리 라잇츠, 인크. 미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 dna 바코드 조성물 및 방법
US10752946B2 (en) * 2017-01-31 2020-08-25 Myriad Women's Health, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
EP3580354A4 (en) * 2017-02-13 2021-03-31 Yale University HIGH FLOW SINGLE-CELL POLYOMIC
US20200362397A1 (en) * 2017-05-31 2020-11-19 Centrillion Technology Holdings Corporation Oligonucleotide probe array with electronic detection system
JP7084470B2 (ja) * 2017-08-23 2022-06-14 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 酵素のスクリーニング法

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