KR20220135719A - 2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치 - Google Patents

2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치 Download PDF

Info

Publication number
KR20220135719A
KR20220135719A KR1020210041777A KR20210041777A KR20220135719A KR 20220135719 A KR20220135719 A KR 20220135719A KR 1020210041777 A KR1020210041777 A KR 1020210041777A KR 20210041777 A KR20210041777 A KR 20210041777A KR 20220135719 A KR20220135719 A KR 20220135719A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
substrate
barcode
sample
Prior art date
Application number
KR1020210041777A
Other languages
English (en)
Inventor
허덕회
김범희
박진환
민지현
Original Assignee
주식회사 파이지노믹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 파이지노믹스 filed Critical 주식회사 파이지노믹스
Priority to KR1020210041777A priority Critical patent/KR20220135719A/ko
Publication of KR20220135719A publication Critical patent/KR20220135719A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B45/00—ICT specially adapted for bioinformatics-related data visualisation, e.g. displaying of maps or networks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0663—Stretching or orienting elongated molecules or particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 핵산을 추출하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 시료내에 위치했던 2차원의 위치 정보가 유지되도록 추출하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 본 발명에 따른 핵산 추출 방법 및 장치는 시료에서 핵산의 위치 정보가 유지되도록 추출할 수 있으며, 이를 이용하면 유전체 분석 결과로 도출된 개별 리드의 원 시료 내 위치를 분석할 수 있어 유용하다.

Description

2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치{Method and apparatus for spatial sequencing analysis using nucleic acids maintaining two-dimensional spatial information}
본 발명은 핵산을 추출하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 시료 내에 위치했던 2차원의 위치가 유지되게 추출하는 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 시료 내 위치 정보가 유지되도록 핵산을 추출한 후 위치에 맞게 배치된 바코드를 결합하여 유전자 서열을 분석한 후, 분석된 위치 바코드에 따라 각각의 개별 유전자 서열을 시료 이미지 위에 배치하여 개별 유전자 서열의 시료 내 원위치를 결정하는 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.
사람의 신체는 1014 개 이상의 세포를 포함하며 250개 이상의 상이한 기관과 조직으로 조직화된다. 복잡한 기관, 예컨대 뇌의 발달 및 조직화는 아직도 다 알려지지 않았고, 따라서 그런 조직의 발달 및 기능을 조절하는 유전자를 조사하고 측정하기 위한 정량적 방법을 사용하여 그런 조직에서 발현된 유전자의 발현을 분석할 필요가 있다. 기관은 그 자체가 조직화되고 유지되어야 할 모든 생체 기능, 예컨대 영양분 수송, 방어 등을 가능하게 하는 분화된 세포의 혼합체이다. 따라서 세포 기능은 특별한 조직 구조 내에 있는 세포의 위치 및 직접적이든 간접적이든 그 조직 내에서 다른 세포와 공유하는 상호작용에 좌우된다. 그러므로 이들 상호작용이 조직 내에서 전사 수준에서 각 세포에 영향을 미치는 방법을 구별할 필요가 있으며, 생물학적인 프로세스를 명확하게 확인하기 위해서 유전자가 조직 내 분포되어 있는 형태와 발현 수준을 연계하여 분석할 필요가 있다.
초특급 게놈 서열화를 위해 NGS 기술의 개발은 생명 과학에서 획기적인 사건을 대표한다 (Petterson E et al, Genomics. 2009; 93:105-11). 이런 신기술은 DNA 서열화 비용을 극적으로 감소시켰고, 특이한 개체의 게놈을 포함하여 고등 유기체의 게놈을 유례없는 속도로 측정하는 것을 가능하게 하였다 (Wade CM et al Science. 2009; 326: 865-7; Rubin J et al, Nature 2010; 464:587-91). 고처리율 게놈학의 새로운 진보는 생물학 연구의 풍경을 새롭게 조성하였고, 게놈의 완전한 특성확인 외에 전체 전사체를 디지털 및 정량적 방식으로 연구하는 것도 가능하게 하였다. 이들 포괄적인 데이터 세트를 가시화하고 집약하기 위한 생물정보학 도구들도 또한 최근 수년동안 상당히 개선되었다.
NGS 기술의 발전으로 전장유전체 분석, 전사체 분석 등을 통하여 생물의 유전자 이상 (SNP, Insertion, Deletion, CNV, Gene fusion)과 유전자 발현이상 등 질병과 관련된 마커를 손쉽게 도출하고 평가하는 것이 기능해졌으며, 이로 인하여 Sanger sequencing, Real-time PCR을 사용한 돌연변이 혹은 유전자 발현 분석을 대체할 수 있게 되었고, 심지어 이러한 분석들은 한번의 NGS 분석으로 도출되고 있다. 하지만, 조직의 형태가 유지된 상태에서 분석되는 조직염색 기법을 사용한 발현분석 (Immunohistochemistry, IHC), 특정 유전자의 조직 내 원위치 검사법 (Fluorescence in-situ hybridization, FISH) 등의 위치정보가 포함된 조직 분석 기법의 경우는 NGS 분석으로 완전히 대체하지 못하고 있는 실정이다. 또한, 단일세포 NGS 분석으로 개별 세포의 유전정보를 분석하고 있으나, 세포 간의 관계분석은 이루어지지 못하고 있다.
최근 암 조직 등 조직 내 암세포의 다양성 (Heterogeneity)을 분석하거나, 암 조직 내 암세포와 면역세포의 관계인 암 미세 환경 (Tumor microenvironment) 분석에 관심이 높아짐에 따라 조직의 구획에 따라 나뉘어 추출된 핵산을 NGS 분석하는 방법이 수행된 바 있으나, 구획의 수준이 수 밀리미터 수준으로 해당 구획 내 세포들의 정보가 혼재되어 나타난다는 단점과 각각의 분리된 구획을 독립적으로 분석해야 하는 단점을 가지고 있다. 또한, 최근 mRNA를 위치별로 다른 서열을 가지는 바코드 핵산이 연결된 poly thymine을 글라스에 고정하여 역전사후 NGS 전사체 분석을 수행하는 Spatial transcriptomics 방법이 개발되었으나, 해당 방법은 poly A (adenine)가 손상되지 않은 mRNA 분석에 국한되기 때문에 poly A와 거리가 먼 mRNA의 5' 말단 유전자 서열은 분석이 불가능하고 mRNA의 3' 말단 손상여부에 따라 분석의 효율이 달라지게 된다. 또한, 분석을 위한 시간 소모가 많은 등 사용성이 낮은 한계를 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고자 유전체 분석 결과물의 조직 내 원위치를 밝혀내는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 위치별로 다른 서열을 가지는 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치별로 배치되어 고정된 기판에 핵산을 포함하는 시료를 올리고, 핵산을 추출하고 고정시킨 다음, 추출된 시료 핵산과 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 표적 핵산과 혼성화 한 후, 이를 신장시키고 증폭하여 유전체 분석할 경우, 시료 내 핵산의 위치를 지정할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 핵산 함유 시료에서 추출된 핵산의 시료 내 원위치를 밝혀내는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보가 유지된 채 추출하는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 위치별로 다른 서열을 가지는 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치별로 배치되어 고정된 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보가 유지된 채 추출하는 핵산 추출 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 2차원의 위치정보가 유지된 채 추출된 핵산의 차세대염기서열분석 라이브러리 제작 및 분석을 통하여 얻어지는 리드로부터 공간 분석 데이터를 확보하는 방법 및 그 활용방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치에 배치되어 고정된 기판을 준비하는 단계; (b) 핵산을 함유한 시료를 상기 (a) 단계의 기판에 배치하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 시료에서 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 추출한 핵산을 (a) 단계의 기판에 고정하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 고정된 핵산과 인접한 프라이머를 혼성화 하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 혼성화 된 프라이머를 신장하여 상보핵산을 제작하는 단계; (g) 상기 (f) 단계의 상보핵산을 증폭하여 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 결합된 증폭산물을 수득하는 단계를 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보를 포함하는 증폭산물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 방법으로 증폭산물을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물을 차세대염기서열분석하여 리드를 수득하는 단계; 및 (c) 수득한 리드를 분석하여 핵산을 함유한 시료 내 수득한 개별 리드의 위치를 결정하는 단계를 포함하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 완충용액 패드; 시료 패드; 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 고정된 핵산 포획 기판; 완충용액 패드; 및 가열판을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보가 유지된 채 추출된 핵산과 혼성화 되어 유전자 서열 및 길이로 위치를 할당하는 것을 특징으로 하는 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정위치에 배열되어 고정된 핵산 수득용 기판을 제공한다.
본 발명은 또한, 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease 및 Lysozyme으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소; Tween-20, Triton X-100 및 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 계면활성제; Urea, β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제; DNA 또는 RNA 분해효소 및 전류이동완충액을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 시약을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 지정된 위치에 배열되어 부분 고정된 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 배치되어 고정된 기판에 핵산이 함유된 시료를 올린 후 2차원의 위치가 보존되게 핵산을 추출하고, 인접한 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머와 위치가 보존되게 추출된 핵산을 혼성화 시켜 위치정보가 포함된 상보핵산을 제작하고 증폭하면 위치정보가 포함된 염기서열분석을 가능하게 하여, 세포간-, 조직간-, 미생물간-, 무기물-미생물 간의 유전자 발현, 변이 등에 기반한 관계분석이 가능하고, 원 위치 정보가 보존된 다수의 유전자를 단일 가닥 핵산과 이중 가닥 핵산을 대상으로 분석하는 것이 가능하다는 면에서 유용하다.
도 1은 본 발명의 간접 원위치 유전체분석 (indirect in-situ sequencing)의 개념을 나타낸 간략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 위치 바코드 서열 포함하는 프라이머가 고정화 된 기판의 세척 과정을 수행하기 위한 적층 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산을 포함하는 시료로부터 2차원의 위치정보를 유지한 채 핵산을 추출하고 기판에 전달하는 장치를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산을 포함하는 시료로부터 2차원의 위치정보를 유지한 채 핵산을 추출 및 변성하고 기판에 전달하는 장치를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 사용된 위치 바코드 서열을 포함하는 고정형 프라이머의 구조를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 사용된 단일분자 지정을 위한 서열 및 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머의 구조를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에 사용된 액상형 프라이머의 구조를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 사용된 위치 바코드 서열이 결합된 상보핵산을 생성하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명에 사용된 이중가닥 핵산으로부터 위치 바코드 서열이 결합된 상보핵산을 생성하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 결합된 상보핵산을 증폭하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 간접 원위치 유전체분석 (indirect in-situ sequencing)의 분석 결과물 리드 (read)의 구조를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 간접 원위치 단일분자 유전체분석 (indirect in-situ single molecule sequencing)의 분석 결과물 리드의 구조를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 배치된 핵산수득 기판을 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 기판 상의 핵산의 위치를 지정하기 위해 어레이 별로 할당된 어레이 바코드 서열을 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 기판 상의 핵산의 위치를 지정하기 위해 어레이 내의 위치에 따라 할당된 위치 바코드 서열의 배치를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터의 전처리 절차를 나타낸 도면이다.
도 17는 본 발명의 일 실시예에 따른 전처리된 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터의 분석 절차 및 위치정보를 포함하는 공간 분석 데이터의 생성 절차를 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터 분석 절차에 따른 결과물을 나타낸 도면이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 전사체분석 (indirect in-situ sequencing)의 분석 결과물 리드와 냉동 조직 절편 사진을 결합한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 전사체분석의 분석 결과물 리드에 대하여 각 스팟에서 산출된 정렬 리드 수의 어레이 별 편차를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 전사체분석의 분석 결과물 리드에 대하여 상보핵산 증폭 과정에서의 반복실험에서 산출된 정렬 리드 수 사이의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 레퍼토리 분석을 위해 제작된 알파사슬 표적 정방향 프라이머의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 레퍼토리 분석을 위해 제작된 베타사슬 표적 정방향 프라이머의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 레퍼토리 분석을 위해 제작된 알파사슬 및 베타사슬 표적 역방향 프라이머의 서열을 나타낸 도면이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 레퍼토리 분석의 결과물을 나타낸 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
제1, 제2, A, B 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않으며, 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 이하 설명하는 기술의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 해석되지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함한다" 등의 용어는 설시된 특징, 개수, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 의미하는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 개수, 단계 동작 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에 대한 상세한 설명을 하기에 앞서, 본 명세서에서의 구성부들에 대한 구분은 각 구성부가 담당하는 주기능 별로 구분한 것에 불과함을 명확히 하고자 한다. 즉, 이하에서 설명할 2 개 이상의 구성부가 하나의 구성부로 합쳐지거나 또는 하나의 구성부가 보다 세분화된 기능별로 2 개 이상으로 분화되어 구비될 수도 있다. 그리고 이하에서 설명할 구성부 각각은 자신이 담당하는 주기능 이외에도 다른 구성부가 담당하는 기능 중 일부 또는 전부의 기능을 추가적으로 수행할 수도 있으며, 구성부 각각이 담당하는 주기능 중 일부 기능이 다른 구성부에 의해 전담되어 수행될 수도 있음은 물론이다.
또, 방법 또는 동작 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명에서는, 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 공간적으로 지정 위치에 배치된 후, 고정된 기판을 사용하여 핵산이 포함된 시료의 핵산을 2차원의 위치가 유지된 채 추출하고 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 결합된 상보핵산을 생산하고 증폭하여 유전체분석을 할 경우, 유전체분석의 결과인 개별 리드 (read)에 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열에 따라 좌표를 지정하여 조직의 원위치에 배치할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 기판의 지정위치에 배치한 후 고정한 다음, 시료의 핵산을 기판 위에서 2차원의 위치 유지되도록 추출하고, 기판 위에서 프라이머를 표적핵산에 결합하는 과정을 거친 후 증폭하여 NGS 기법을 통해 유전자 서열을 분석하여 그 위치 정보를 결정할 경우 (도 1), 분석된 염기서열 결과물 리드 각각을 조직사진 내 원위치에 배치하여 그 위치를 간접적으로 확인할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 19).
따라서, 본 발명은 일관점에서,
(a) 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치에 배치되어 고정된 기판을 준비하는 단계;
(b) 핵산을 함유한 시료를 상기 (a) 단계의 기판에 배치하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 시료에서 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 추출한 핵산을 (a) 단계의 기판에 고정하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 고정된 핵산과 인접한 프라이머를 혼성화 하는 단계;
(f) 상기 (e) 단계의 혼성화 된 프라이머를 신장하여 상보핵산을 제작하는 단계
(g) 상기 (f) 단계의 상보핵산을 증폭하여 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 결합된 증폭산물을 수득하는 단계를 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보를 포함하는 증폭산물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "뉴클레오시드"는 핵산 염기가 당 모이어티에 연결된 글리코실아민 화합물을 의미한다. "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 포스페이트를 의미한다. 뉴클레오티드는 표 1에 기재된 것과 같이, 그의 뉴클레오시드에 상응하는 알파벳 문자 (문자 명칭)를 사용하여 표시될 수 있다. 예컨대, A는 아데노신 (아데닌 핵염기를 함유하는 뉴클레오시드)을 지칭하고, C는 시티딘을 지칭하고, G는 구아노신을 지칭하고, U는 우리딘을 지칭하고, T는 티미딘 (5-메틸 우리딘)을 지칭한다. W는 A 또는 T/U를 지칭하고, S는 G 또는 C를 지칭한다. N은 랜덤한 뉴클레오시드를 표시하고, dNTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 의미한다. N은 A, C, G, 또는 T/U 중 어떤 것도 될 수 있다.
Figure pat00001
본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 명세서를 통틀어, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 문자의 서열에 의해 표시될 때마다, 뉴클레오티드는 좌에서 우로 5'→순서이다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체 (예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격 (예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스핵산, 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “핵산”은 뉴클레오티드 폴리머를 지칭하며, 달리 한정되지 않는다면 자연적으로 발생한 뉴클레오티드와 유사한 방식 (예컨대, 혼성화)으로 작용할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체(analog)를 포함한다.
용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA (cDNA) (이는 보통 전령 RNA (mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는RNA를 포함한다.
용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연 (coextensive)일 필요는 없다 (즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일 필요는 없다).
용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극율, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5' 위치 피리미딘 개질, 8' 위치 퓨린 개질, 시토신 환외 (exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.
핵산(들)은 고상 매개 화학적 합성 (solid phase-mediated chemical synthesis)과 같은 완전한 화학적 합성 과정으로부터, 핵산을 생성하는 임의의 종으로부터 분리를 통해서와 같은 생물학적 공급원으로부터, 또는 DNA 복제, PCR 증폭, 역전사와 같은 분자 생물학 도구에 의한 핵산의 취급과 관련된 과정으로부터, 또는 이들 과정의 결합으로부터 유도될 수 있다.
본 발명에서 용어 “상보”는 2 개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2 개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드의 일부만이 결합하여 2 개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위한 표적 핵산 서열 (예컨대, 증폭될 DNA 주형)에 혼성화 되는 짧은 선형 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 키메라 서열일 수 있다. 프라이머는 천연, 합성, 또는 개질된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 프라이머 길이의 상한 및 하한 둘 모두는 실험적으로 결정된다. 프라이머 길이의 하한은 핵산 증폭 반응 조건에서 표적 핵산과의 혼성화 후 안정한 듀플렉스를 형성하는데 필요한 최소 길이이다. 매우 짧은 프라이머 (흔히 3 개 뉴클레오티드 미만 길이)는 이러한 혼성화 조건 하에서 표적 핵산과의 열열학적으로 안정한 듀플렉스를 형성하지 않는다. 상한은 표적 핵산에서 미리 결정된 핵산 서열 이외의 영역에서 듀플렉스 형성을 가질 수 있는 가능성에 의해 보통 결정된다. 일반적으로, 적합한 프라이머 길이는 약 3 개 뉴클레오티드 길이 내지 약 50 개 뉴클레오티드 길이의 범위에 있다.
본 발명에서 용어 “혼성화”는 상보적 염기서열을 가진 단일 가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중 가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링 (annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일 가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우 (perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우 (mismatch)까지 포함한다.
가장 광범위한 측면으로 본 발명의 방법은 시료 중의 핵산의 국지화 된 검출에 사용될 수 있다. 그러므로 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 시료의 모든 전사체 또는 게놈, 예를 들어 시료의 전역적 전사체를 측정 및/또는 분석하는 데 사용될 수 있다. 그러나 본 발명의 방법은 이것에만 한정되는 것은 아니며 모든 또는 부분적인 전사체 또는 게놈을 측정 및/또는 분석하는 것을 포함한다. 그러므로 본 발명의 방법은 전사체 또는 게놈의 부분 또는 하위세트, 예컨대 하위세트의 유전자에 상응하는 유전자, 예를 들면 예컨대 특정 질병 또는 상태, 조직 유형 등에 관련된 특별한 유전자의 세트를 측정 및/또는 분석하는 것을 포함할 수 있다.
다른 측면으로 보자면, 상기에서 정리된 방법의 단계들은 시료의 공간적으로 규정된 전사체 또는 게놈, 및 특히 공간적으로 얻어진 전역적 전사체 또는 게놈을 얻기 위한 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다.
또는 달리 본 발명의 방법은 핵산, 그것이 시료 중의 DNA이거나 RNA이거나 그것의 국지화 된 또는 공간적인 검출을 위한 방법, 또는 시료 중의 핵산 (DNA 또는 RNA)의 국지화 된 또는 공간적인 측정 및/또는 분석을 위한 방법이라 할 수 있다. 특히 본 방법은 시료 중의 유전자 발현 또는 게놈 변화의 국지화 된 또는 공간적인 검출 또는 측정 및/또는 분석을 위해 사용될 수 있다. 국지화 된/공간적인 검출/측정/분석이란 RNA 또는 DNA가 시료 중의 세포 또는 조직 내에서 그것의 원래 위치 또는 국지화에 위치할 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로 예를 들어 RNA 또는 DNA는 시료 중의 세포 또는 세포 그룹, 또는 세포 유형에, 또는 시료 내의 특별한 영역에 위치할 수 있다. RNA 또는 DNA의 원래의 국지화 또는 위치 (또는 달리 표현하면 시료 중의 RNA 또는 DNA의 국지화 또는 위치), 예컨대 발현된 유전자 또는 게놈 유전자좌는 측정될 수 있다.
본 발명에서 분석에 사용되는 핵산은 시료 내 DNA 또는 RNA이면 제한 없이 사용할 수 있으며, RNA는 세포에서 발생할 수 있는 모든 RNA 분자일 수 있다. 그러므로 그것은 mRNA, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA, 작은 핵 RNA (snRNA), 작은 인 (nucleolar) RNA (snoRNA), 마이크로RNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 피위 (piwi) 단백질과 상호작용하는 RNA (piRNA), 리보솜성 RNA, 안티센스 RNA 또는 비코딩 RNA일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머는 3'->5' 순서로 표적 특이적 서열, 위치 바코드 서열 및 어댑터 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기의 표적 특이적 서열은 표적 유전자 서열과 상보적인 서열이며, 예컨대, mRNA의 poly A (adenine)에 상보적인 poly T (thymine) 서열, 유전자의 발현, 변이 등의 평가를 위한 핵산에 상보적인 서열 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 3'->5' 순서로 표적 특이적 서열, 위치 바코드 서열, 3 내지 12 개 무작위 염기서열 및 어댑터 서열을 포함하여 단일 분자를 지정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 위치 바코드 서열은 기판 상의 각 어레이마다 위치별로 다른 서열 혹은 길이로 구성된 이미 알고 있는 서열로서, 기판의 지정된 위치에 배치시키고 고정시킨 위치 바코드를 포함하는 프라이머 각각의 기판 상 위치를 대변하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 위치 바코드 서열은 이미 알고 있는 서열로서 기판의 지정된 위치에 고정시켜 기판의 특정 위치를 나타내는 3 내지 8 개로 구성된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 표적 특이적 서열과 위치 바코드 서열 사이의 2 내지 4 개 염기서열을 포함하는 링커 서열을 포함하여 표적 핵산과 프라이머의 혼성화 과정에서 위치 바코드 서열에 의한 혼성화 온도의 변화를 최소화하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는
(i) 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 기판의 지정된 위치에 배치하는 단계;
(ii) UV 및 열로 기판에 고정하는 단계; 및
(iii) 프라이머가 고정된 기판을 세척하는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는
(a) 시료를 기판 위에 위치시키는 단계; 및
(b) 시료 위에 기질분해 시약이 포함된 버퍼가 함유된 패드를 올리는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 30 ℃ 내지 65 ℃의 온도로 핵산이 포함된 샘플의 기질을 분해하여 핵산을 추출하고, 추출된 핵산을 인접한 기판의 표면에 전달시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 (c) 단계는 (a) 단계의 기판에 핵산이 포함된 시료를 올리고, 핵산을 둘러싸고 있는 단백질 등의 기질을 분해할 수 있는 효소, 예컨대 Proteinase K, Protease, Lysozyme; 계면활성제, 예컨대 Tween-20, Triton X-100, 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS); 첨가제, 예컨대 Urea, β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol); 등이 포함된 완충용액을 머금은 흡수지로 덮은 후 일정 시간 동안 반응시켜 핵산이 핵산을 둘러싸고 있는 기질에서 유출되어 맞닿아 있는 (a) 단계의 기판의 표면에 위치할 수 있도록 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계는 핵산을 기판 표면에 전달할 수 있는 방법이면 제한없이 이용 가능하나, 바람직하게는 전기영동 (electrophoresis) 또는 유체의 이동을 사용한 능동적인 전달일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 시료는 수득 되거나 생검된 시료이거나 또는 가능하게는 배양된 시료다. 대표적인 시료로는 임상적 시료, 예컨대 전혈 또는 전혈-유도된 생성물, 혈구, 조직, 생검 시편, 또는 배양된 조직 또는 세포 등이며, 세포 현탁액을 아우른다. 인공 조직은 예를 들면 세포 현탁액 (예컨대 혈액 세포를 포함하여)으로부터 제조될 수 있다. 세포는 매트릭스 (예컨대 겔 매트릭스, 예컨대 아가, 아가로오스 등)에 포획될 수 있고, 그런 다음 종래 방식으로 절편화 될 수 있다. 그런 과정은 면역조직화학의 맥락에서 해당 기술분야에 알려져 있다 (Andersson et al 2006, J. Histochem. Cytochem. 54(12):1413-23. Epub 2006 Sep 6).
시료 제조 방식 및 그 결과의 시료의 취급 방법은 본 발명의 방법의 전사체 또는 게놈 분석에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이 다양한 시료는 상이한 물리적 특성을 가질 것이고, 당업자에게는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 시료를 만들기 위해 필요한 조작을 수행하는 것이 잘 알려져 있다. 그러나 본원의 개시 내용으로부터, 본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 시료를 얻기 위해 어떠한 시료 제조 방법이든지 사용될 수 있다는 것이 명백하다. 예를 들어 대략 1 세포 또는 그것보다 적은 두께를 가지는 어떠한 세포 층도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 시료의 두께는 세포의 단면의 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1보다 적을 수 있다. 그러나 상기에서 주지된 바와 같이 본 발명은 단일 세포 해상도에 제한되지 않고, 따라서 시료의 두께가 1 세포 직경 또는 그 미만이어야 할 필요는 없기 때문에, 필요하다면 더 두꺼운 시료가 사용될 수 있다. 예를 들어 예컨대 10 내지 20 ㎛ 두께의 동결 절편이 사용될 수 있다.
본 발명에서 시료는 어떠한 편리한 또는 원하는 방식으로 제조될 수 있고, 본 발명은 조직 제조의 어떠한 특정 유형에 제한되지 않는다. 신선하고, 냉동된, 고정된 또는 고정되지 않은 조직이 사용될 수 있다. 어떠한 원하는 편리한 과정이, 해당 기술분야에 기술되고 공지되어 있는 것처럼 시료를 고정 또는 삽입시키기 위해 사용될 수 있다. 그러므로 어떠한 공지된 고정액 또는 삽입 물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 시료의 첫 번째 대표적인 실예로서, 조직은 조직 구조의 통합성 (즉 물리적 특성)을 유지 또는 보존하기에 적당한 온도, 예컨대 -20 ℃보다 낮은, 바람직하게는 -25, -30, -40, -50, -60, -70 또는 -80 ℃보다 낮은 온도에서 초저온 냉동에 의해 제조될 수 있다. 냉동된 시료는 어떠한 적당한 수단에 의해 기판 표면 위에 절편화 될 수 있다. 즉 얇게 슬라이스 될 수 있다. 예를 들어 시료는 시료의 구조적 통합성과 시료 중의 핵산의 화학적 특성을 둘 다 유지하기에 적당한 온도, 예컨대 -15 ℃보다 낮은 온도, 바람직하게는 -20 또는 -25 ℃보다 낮은 온도에서 설치된 저온 마이크로톰, 저온 유지 장치를 사용하여 제조될 수 있다. 그러므로 시료는 조직의 핵산, 예컨대 RNA의 변성 또는 분해를 최소화하도록 처리되어야 한다. 그런 조건은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있고, 어떠한 분해의 정도는 핵산 추출, 예컨대 총 RNA 추출 및 계속해서 시료의 제조의 다양한 단계에서 정성 분석을 통해 모니터 될 수 있다.
두 번째 대표적인 실례로, 조직은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있는 포르말린-고정 및 파라핀-삽입 (FFPE)의 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 시료의 고정과 파라핀 또는 수지 블록에의 삽입 후에, 시료는 기판 위에서 절편화, 즉 얇게 슬라이스 될 수 있다. 상기에서 주지된 것과 같이, 다른 고정액 및/또는 삽입 물질이 사용될 수 있다.
시료 절편은 삽입 물질을 제거하기 위해, 예컨대 파라핀 제거를 위해, 즉 본 발명의 방법을 수행하기 전에 시료로부터 파라핀 또는 수지를 제거하기 위해 처리될 필요가 있을 것이다. 이것은 어떠한 적당한 방법에 의해 이루어질 수 있고, 시료로부터 파라핀 또는 수지 또는 다른 물질의 제거는 해당 기술분야에 잘 수립되어 있는데, 예를 들면 시료 (어레이의 표면 위에 있는)을 적절한 용매, 예컨대 크실렌 (xylene) 중에서, 예컨대 10분 동안 2회 인큐베이션 하고, 그런 다음 에탄올 세정, 예컨대 99.5 % 에탄올 중에서 2 분 동안, 96 % 에탄올 중에서 2 분, 그리고 70 % 에탄올 중에서 2 분 동안 세정함으로써 이루어질 수 있다.
당업자들에게는 FFPE 또는 다른 고정 및 삽입 방법을 사용하여 제조된 조직 단편 중의 RNA는 냉동된 조직의 경우에서 보다 더 잘 부분적으로 분해되는 것으로 보인다는 것이 명백할 것이다. 그러나 어떠한 특별한 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 이것은 본 발명의 방법에 유익할 것으로 여겨진다. 예를 들어 만약 시료 중의 RNA가 부분적으로 분해된다면, RNA 폴리뉴클레오티드의 평균 길이는 분해되지 않은 시료보다 더 줄어들 것이고 더 무작위가 될 것이다. 그러므로 부분적으로 분해된 RNA는 본원의 다른 곳에서 설명되는 다양한 프로세싱 단계, 예컨대 어댑터 (증폭 도메인)의 결찰, cDNA 분자의 증폭 및 그것들의 서열화에서 덜 편향적이 될 것이다.
그러므로 본 발명의 한 구체예에서, 시료, 즉 기판에 접촉된 시료의 단편은 FFPE 또는 다른 고정 및 삽입 방법을 사용하여 제조된다. 달리 표현하면, 시료는 고정, 예컨대 고정되고 삽입될 수 있다. 발명의 대체 구체예에서 시료는 초저온 냉동에 의해 제조된다. 다른 구체예에서는 고정되지 않은 시료가 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 시료 절편의 두께는 시료를 제조하기 위해 사용된 방법 및 조직의 물리적 특성에 따라 좌우될 것이다. 그러므로 어떠한 적당한 절편 두께도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 대표적인 구체예에서, 시료 절편의 두께는 최소한 0.1 ㎛, 더 바람직하게는 최소한 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ㎛일 것이다. 다른 구체예에서 시료 단편의 두께는 최소한 10, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 또는 50 ㎛일 것이다. 그러나 두께는 중요하지 않고, 이것들은 단지 대표적인 값이다. 보다 두꺼운 시료, 예컨대 70 또는 100 ㎛ 또는 그 이상의 시료가 바람직하거나 편리하다면 사용될 수 있다. 전형적으로 시료 절편의 두께는 1 내지 100 ㎛, 1 내지 50 ㎛, 1 내지 30 ㎛, 1 내지 25 ㎛, 1 내지 20 ㎛, 1 내지 15 ㎛, 1 내지 10 ㎛, 2 내지 8 ㎛, 3 내지 7 ㎛ 또는 4 내지 6 ㎛이지만, 상기에서 언급된 것과 같이 더 두꺼운 시료도 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 기판에 포함된 프라이머의 서열과 상관없이 추출된 핵산이 열 혹은 UV 반응 (Cross-linking)에 의해 기판에 고정되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 표적 핵산이 이중 가닥 핵산일 경우, 핵산이 변성 (denature) 된 다음, 열 혹은 UV에 의해 단일 가닥의 형태로 기판의 표면에 고정되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 기판에 포함된 위치 바코드 서열이 포함된 프라이머와 시료에서 추출된 핵산에 상보적인 서열이 있을 경우, 서로 혼성화 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계에서 프라이머의 신장은 역전사효소 또는 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 (g) 단계는 (d) 단계의 기판 표면에 (a) 단계를 통하여 배치되고 고정된 위치 바코드 서열을 포함하는 각각의 프라이머와 인접한 (c) 단계를 통하여 추출되어 고정된 시료 핵산을 혼성화 하여 결합하고, 핵산 신장효소, 예컨대 역전사효소, 중합효소 등으로 신장반응 하고 그 결과물로 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 결합된 상보핵산 (complementary nucleic acid)을 만들어내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (g) 단계에서 상보핵산의 증폭은 어댑터 서열에 상보적인 서열을 사용하여 중합효소반응으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (g) 단계의 어레이 바코드 서열은 증폭산물의 5' 말단에 이미 알고 있는 서열로서 기판의 특정 어레이를 나타내는 3 내지 8 개로 구성된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서,
(a) 상기 방법으로 위치정보를 포함하는 증폭산물을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물을 차세대 염기서열 분석하여 리드를 수득하는 단계; 및
(c) 수득한 리드를 분석하여 핵산을 함유한 시료 내 수득한 개별리드의 위치를 결정하는 단계를 포함하는 차세대염기서열분석 (NGS) 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 프라이머가 무작위 서열을 포함하지 않을 경우,
(i) 3' 말단의 저품질 염기서열을 트리밍하는 단계;
(ii) 리드1과 리드2의 오버랩 서열을 토대로 병합하여 단일 방향의 리드를 획득하는 단계;
(iii) 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 위치 바코드 서열 및 5' 말단의 어레이 바코드 서열을 추출하여 리드에 지정하는 단계;
(iv) 상기 지정된 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열에 따라 리드를 분리하는 단계;
(v) 분리된 리드들의 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표 (x, y)를 할당하는 단계;
(vi) 좌표에 따라 표적 핵산의 참조 유전자 서열에 정렬된 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및
(vii) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는, 프라이머가 무작위 서열을 포함할 경우,
(i) 3' 말단의 저품질 염기서열을 트리밍하는 단계;
(ii) 리드1과 리드2의 오버랩 서열을 토대로 병합하여 단일 방향의 리드를 획득하는 단계;
(iii) 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 무작위 서열, 위치 바코드 서열 및 5' 말단의 어레이 바코드 서열을 추출하여 리드에 지정하는 단계;
(iv) 상기 지정된 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열에 따라 리드를 분리하는 단계;
(v) 리드 간의 염기서열 유사성을 토대로 리드를 분리하는 단계;
(vi) 분리된 리드별 상기 추출된 무작위 서열이 같은 리드를 하나의 리드로 통합하는 단계;
(vii) 상기 지정된 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 같은 리드를 재병합하는 단계;
(viii) 분리된 리드들의 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표 (x, y)를 할당하는 단계;
(ix) 좌표에 따라 표적 핵산의 참조 유전자 서열에 정렬된 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및
(x) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;
를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 도 16에 개시된 바와 같이, 지정한 좌표 서열 (어레이 바코드 및 위치 바코드 서열)을 알고 있는 서열인 어댑터 서열과, 표적 특이적 서열을 통하여 알아내고, 이 알아낸 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열을 위치 정보, 즉 좌표로 표현할 수 있다.
예를 들어, 개별 리드 #01 (5, 10)으로 지정하여 도 19의 x, y그래프에 좌표를 점 형태로 표시하게 되는 것이다. 분석된 모든 리드의 좌표를 분석하여 하나의 그래프에 점을 찍어 시퀀싱 리드를 위치에 맞게 재배치하게 되고, 이를 염기서열 지도 (Sequencing map)라 명명한다.
어떠한 핵산 서열화 방법이든지 본 발명의 방법에 활용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 그러나 소위 "차세대 염기서열 분석" 기술이 특히 본 발명에 활용될 수 있다. 고처리율 서열화가 특히 본 발명의 방법에 유용한데, 왜냐하면 그것이 대다수의 핵산이 매우 짧은 시간 동안 부분적으로 서열화되는 것을 가능하게 하기 때문이다. 전체적으로 또는 부분적으로 서열화된 많은 게놈에 있어 최근의 폭발적인 관점에서 볼 때, 각 분자에 상응하는 유전자를 측정하기 위하여 생성된 DNA 분자의 전 길이를 서열화할 필요는 없다.
대표적인 실례로써, 서열화 반응은 예컨대 IlluminaTM 기술에서 사용된 것과 같은 가역적인 염료-터미네이터 (dye-terminator)를 토대로 할 수 있다. 예를 들어 DNA 분자는 먼저 예컨대 유리 또는 실리콘 슬라이드 위의 프라이머에 부착되고, 증폭되어 국소적인 클론성 콜로니가 형성된다 (브리지 증폭). 네 가지 유형의 ddNTP가 첨가되고, 통합되지 않은 뉴클레오티드는 세척되어 제거된다. 파이로시퀀싱 (pyrosequencing)과는 달리 DNA는 한 번에 한 뉴클레오티드만 연장될 수 있다. 카메라는 형광 표지된 뉴클레오티드를 촬영하고, 그런 다음 말단 3' 차단제와 함께 염료가 DNA로부터 제거되면 다음 주기가 이어진다. 이것은 필요한 서열 데이터가 얻어질 때까지 반복될 수 있다. 이 기술을 사용하여 수천 개의 핵산이 단일 슬라이드 상에서 동시에 서열화될 수 있다.
다른 고처리율 서열화 기법, 예컨대 파이로시퀀싱도 본 발명의 방법에 마찬가지로 적당할 것이다. 이 방법에서 DNA는 오일 용액 중의 물방울 내부에서 증폭되는데 (에멀션 PCR), 이때 각 방울은 단일 프라이머-코팅된 비드에 부착된 단일 DNA 주형을 함유하고, 그런 다음 클론성 콜로니가 형성된다. 서열화 기계는 피코리터 부피의 많은 웰을 함유하고 있고, 각 웰은 단일 비드와 서열화 효소를 함유하고 있다. 파이로시퀀싱은 초기 DNA에 첨가된 개별 뉴클레오티드의 검출을 위해 빛을 생성하기 위해 루시페라제를 사용하고, 조합된 데이터는 서열 판독 결과를 생성하기 위해 사용된다.
개발중인 기술의 실례는 DNA의 중합반응 중에 방출된 수소 이온의 검출을 토대로 한다. 서열화하고자 하는 주형 DNA 가닥을 함유하고 있는 마이크로웰은 단일 유형의 뉴클레오티드로 넘치게 된다. 만약 도입된 뉴클레오티드가 리더 주형 뉴클레오티드에 상보한다면 그것은 늘어나고 있는 상보성 가닥에 통합된다. 이것은 민감성 이온 센서를 야기하는 수소 이온의 방출을 유발하고, 그것은 반응이 일어났음을 가리킨다. 만약 단일중합체 반복부가 주형 서열에 존재한다면, 다수의 뉴클레오티드가 단일 주기에 통합될 것이다. 이것은 상응하는 수의 수소 이온 방출 및 그와 비례하여 더 높은 이온 신호를 유도한다.
그러므로 미래의 서열화 방식은 더디게 실용화되고 있지만, 그런 플랫폼의 주요 특징 중 하나로서 더 짧은 작동 시간을 나타내는 것이 분명하며, 다른 서열화 기술들도 본 발명의 방법에서 유용할 것임이 명백할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 이미지는 일반 사진, 현미경 사진, 면역염색 사진, 핵산 탐침자 형광 사진 및 색소 염색 사진에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 시료 이미지는 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 편리한 조직학적 수단, 예를 들면 빛, 명시야 (bright field), 암시야 (dark field), 위상차, 형광, 반사, 간섭, 공초점 현미경 또는 그것들의 조합을 사용할 수 있다. 전형적으로 시료는 시료의 상이한 영역들, 예컨대 세포 사이의 대조를 보여주기 위한 가시화 단계 전에 염색된다. 사용된 염색의 유형은 조직 유형과 염색하고자 하는 세포의 영역에 따라 좌우될 것이다. 그런 염색 프로토콜은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 어떤 구체예에서 시료의 상이한 측면, 예컨대 시료의 상이한 영역, 특이한 세포 구조 (예컨대 세포기관) 또는 상이한 세포 유형을 가시화 (영상화)하기 위해 하나 이상의 염색이 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 시료는 예컨대 시료가 충분한 대조를 제공하는 안료를 이미 함유하고 있거나 특정 형태의 현미경이 사용되는 경우 시료를 염색하는 일 없이 가시화되거나 영상화 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 차세대염기서열분석 (NGS) 기반의 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법은 핵산을 함유한 시료의 연속된 절편을 분석하여 3차원의 위치를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 완충용액 패드; 시료 패드; 위치 바코드 서열이 포함된 프라이머가 고정된 핵산 포획 기판; 완충용액 패드; 및 가열판을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 나일론, 니트로 셀룰로스, PVDF, 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체 (COC), 고리형 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 기판은 당업자들에게 알려져 있는 어떠한 적당한 기판일 수 있다. 기판은 어떠한 적당한 형태 또는 포맷을 취할 수 있는데, 예를 들면 기판은 평평하거나, 구부러져 있다. 예를 들면 기판은 시료와 기판 사이의 상호작용이 일어나는 구역을 향해 볼록하게 또는 오목하게 구부러져 있다. 특히 바람직한 것은 기판이 평평한 것, 즉 평면이거나, 멤브레인이거나, 칩이거나 슬라이드인 경우이다.
전형적으로 기판은 고체 지지체이고, 따라서 기판 위의 위치정보의 정확하고 추적가능한 위치측정이 가능해진다. 기판의 실례는 기능성 기, 예컨대 아민 기 또는 아민-기능화 된 기를 포함하고 있는 고체 물질 또는 기판이다.
본 발명에 의해 구상되는 기판은 다공성의 핵산을 포획할 수 있는 기판이다. 바람직한 다공성 기판은 나일론, 니트로 셀룰로스, PVDF, 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체 (COC), 고리형 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트이다.
당업자들에게 알려져 있는 적당한 물질이 어느 것이든지 사용될 수 있다. 전형적으로 유리 또는 폴리스티렌이 사용된다. 폴리스티렌은 보통 상태에서는 소수의 친수성 기를 함유하고 있기 때문에 네거티브 전하의 마크로 분자를 결합하기에 적당한 소수성 물질이다. 유리 슬라이드 위에 고정된 핵산의 경우, 나아가 유리 표면의 소수성을 증가시킴으로써 핵산의 고정화가 증가될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러한 증강은 상대적으로 더 밀접하게 충전된 구성을 가능하게 한다. 폴리-L-라이신을 사용한 코팅 또는 표면 처리하는 것 외에 기판, 특히 유리는예컨대 에폭시-실란 또는 아미노-실란을 사용한 실란처리에 의해 또는 실리네이션 (silynation)에 의해 또는 폴리아크릴아미드 처리에 의해 처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 패드는 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease, Lysozyme 등의 효소와 Tween-20, Triton X-100, 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 등의 계면활성제 및 Urea, β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol)와 같은 첨가제로 구성된 군에서 선택되는 것을 포함하는 완충용액을 흡수할 수 있는 소재인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 장치는 전기영동(electrophoresis)을 사용한 전달을 위하여 음극 및 양극을 추가로 포함하거나, 유체의 이동을 사용한 전달을 위하여 진공펌프, 펌프 내지는 실린지를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 장치는 이중 가닥 샘플 핵산의 변성을 위한 변성패드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보가 유지된 채 추출된 핵산과 혼성화 되어 유전자 서열 및 길이로 위치를 할당하는 것을 특징으로 하는 위치 바코드 서열이 포함된 프라이머가 지정위치에 배열되어 고정된 핵산 수득용 기판에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 위치 정보는 기판의 멤브레인, 나노 와이어, 마이크로 와이어, 나노 입자 또는 마이크로 입자 표면에 고정되어 배치되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 전기적 양성 또는 0.20 내지 0.45 ㎛의 크기 (pore size)를 가지거나, 일정 분자량 이상의 크기를 가지는 분자들의 이동을 선별적으로 차단하는 다공성 기판인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 위치 바코드 서열이 포함된 프라이머의 배열을 위한 기판의 구조는 나노 입자, 마이크로 입자, 나노 와이어 또는 마이크로 와이어가 배치된 판형 또는 비드 형의 형태인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease 및 Lysozyme으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소; Tween-20, Triton X-100 및 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 계면활성제; Urea, β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제; DNA 또는 RNA 분해효소 및 전류이동완충액을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 시약에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 위치좌표를 포함하는 NGS 분석 결과물을 사용하여 암 미세환경을 구분한 후 분리된 리드를 산출하는 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 위치정보 서열(어레이 바코드 및 위치 바코드)을 토대로 기판 상의 위치에 따라 분리되어 위치 바코드를 포함하는 리드를 산출하는 단계;
(b) 기판 상에서 핵산을 함유한 시료와 겹쳐진 영역을 설정하는 단계;
(c) 상기 영역에서 암 영역을 설정하는 단계;
(d) 상기 영역에서 암 주변부 영역을 설정하는 단계;
(e) 상기 영역에서 정상 영역을 설정하는 단계; 및
(f) (a) 단계에서 산출된 리드를 암 영역, 암 주변부 영역 및 정상 영역에 해당하는 좌표에 따라 리드를 각각 분리하는 단계;
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 위치좌표를 포함하는 NGS 분석 결과물을 사용하여 위치 바코드별 면역활성도를 평가하는 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 위치정보 서열(어레이 바코드 및 위치 바코드)을 토대로 기판 상의 위치에 따라 분리되거나, 암 영역, 암 주변부 영역 또는 정상 영역으로 구분되어 분리된 위치 바코드를 포함하는 리드를 산출하는 단계;
(b) 위치 바코드별 면역세포 바이오마커 유전자 발현, 면역 관문 유전자 발현 및 면역 레퍼토리의 다양성으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 분석을 수행하는 단계; 및
(c) (b) 단계의 결과를 수치화 하여 면역활성도를 평가하는 단계
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 단계를 통해 위치정보가 포함된 공간 분석 데이터를 활용하여 암 미세환경의 영역별 면역활성도를 평가하는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법에 관한 것이다:
(a) 암 영역, 암 주변부 영역 및 정상 영역별 면역세포 바이오마커 유전자의 활성도를 평가하는 단계;
(b) 상기 영역별 면역 관문 유전자의 활성도를 평가하는 단계;
(c) 상기 영역별 국소적 면역 레퍼토리를 평가하는 단계;
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열의 설정
기판에서의 배치 면적과 밀집도에 따라 임의로 선별된 서열 중, 바코드 서열 사이의 최소 해밍 거리 (Hamming distance)가 3 이상이 되도록 하는 조건을 만족하는 서열들을 구하여 각각 어레이와 위치를 할당할 수 있도록 어레이 바코드 (도 14) 및 위치 바코드 (도 15)를 설정하였다.
각각의 어레이 바코드 및 위치 바코드를 3 내지 8 개의 염기서열을 포함하는 형태로 확보할 수 있으며, 이하 실시예에서는 도 14 및 도 15과 같은 형태의 염기서열로 구성된 바코드를 필요에 따라 일부 또는 전체 바코드 서열을 사용하였다.
실시예 2: 단일분자 식별자 및 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머의 제작
이하 실시예에서는 위치정보가 보존된 유전체 분석 방법 중 표적 유전자의 증폭을 사용한 증폭산물 염기서열 분석법 (amplicon sequencing)을 사용하였다.
단일분자 식별자 서열 및 위치정보 서열이 포함된 증폭산물의 생성을 위하여 어댑터 서열, 위치 바코드 서열 및 표적 특이적 서열이 포함된 프라이머를 제작하였으며, 서열번호 1로 기재되는 서열로 구성되어 있다.
본 발명에서 사용한 DNA oligomer는 네오프로브 (Neoprobe, 한국)와 코스모진텍 (Cosmogenetech, 한국)에서 PAGE 정제 방법을 통해 합성하였다.
서열번호1
GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAGNNNNNNNNNNNNLLLLLL GGTTATTGATGGTACACAAG
상기 서열은 5’ 말단에서 3’ 말단으로 표현하였으며, 'LLLLLL' 서열 (밑줄)은 위치를 할당할 수 있도록 도 15에서와 같이 지정된 위치 바코드 서열을 나타내며, 기울임체로 표시된 서열은 링커 서열을 나타낸다.
상기 단일분자 식별자 서열 및 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머는 표적 핵산과 결합하여 신장반응에 사용되는 프라이머로, 표적 핵산의 상보핵산을 만드는 역할을 하며, 상보핵산 제작과 동시에 단일분자 식별자 서열 및 위치 바코드가 할당되어 결합하게 된다 (도 8).
표적 핵산은 하우스 키핑 유전자로 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 Bos taurus GAPDH gene을 이용하였다.
서열번호 2
GCTCTCTGCTCCTGCCCGTTCGACAGATAGCCGTAACTTCTGTGCTGTGCCAGCCGCATCCCTGAGACAAGATGGTGAAGGTCGGAGTGAACGGATTCGGCCGCATCGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAATTCTGGCAAAGTGGACATCGTCGCCATCAATGACCCCTTCATTGACCTTCACTACATGGTCTACATGTTCCAGTATGATTCCACCCACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGGCAGAGAACGGGAAGCTCGTCATCAATGGAAAGGCCATCACCATCTTCCAGGAGCGAGATCCTGCCAACATCAAGTGGGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGTGGTGGAGTCCACTGGGGTCTTCACTACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCACTTGAAGGGTGGCGCCAAGAGGGTCATCATCTCTGCACCTTCTGCCGATGCCCCCATGTTTGTGATGGGCGTGAACCACGAGAAGTATAACAACACCCTCAAGATTGTCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTGGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACCACTTTGGCATCGTGGAGGGACTTATGACCACTGTCCACGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAGCTGTGGCGTGACGGCCGAGGGGCTGCCCAGAATATCATCCCTGCTTCTACTGGCGCTGCCAAGGCCGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTCAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGCGTCCCCACTCCCAACGTGTCTGTTGTGGATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAGATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCAGAGGGCCCTCTCAAGGGCATTCTAGGCTACACTGAGGACCAGGTTGTCTCCTGCGACTTCAACAGCGACACTCACTCTTCTACCTTCGATGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTACGACAATGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGTCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGGTCCCTGGACCCCCAGCCCCAGCAGGAGCACGAGAGGAAGAGTTCCTCAGCTGCTGGGGAGTCCTGCCCCATCTCCGCCACACTGAGAATCTCCTGACTTCCACATGTTTCCATCTCTAAGGCCCTGAGGAAGGGGAGGGGCTTAGGGAGCCCTGCCTTGTGTACCATCAATAAAAGTACCCTATACCTAAAAAAAAAAAAAAAA
상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 밑줄은 표적유전자 특이 프라이머 (서열번호 1)가 결합하는 부위를 나타낸다.
실시예 3: 단일분자 식별자 및 위치 바코드를 포함하는 프라이머가 배치된 핵산 포집 플레이트의 제작
실시예 2의 지정된 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 Personal arrayer 16 (Capitalbio, 중국)을 사용하여 나일론 멤브레인 위에 직사각형 모양으로 배치시켰다. 상기 멤브레인을 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000 uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85 ℃로 10 분 동안 반응시켜 배치된 프라이머를 고정하였다.
이후 흡수 필터 (2.1 cm X 2.8 cm)와 기판을 세척버퍼 (0.1 X SSC)에 적신 뒤 도 2와 같이 전극과 흡수필터 사이에 배치하고 고정한 후 주변의 물기를 모두 제거하여 전류가 외부 표변으로 흐르는 것을 방지한 후, 상온에서 25 mA의 전류를 흘려주면서 10 분 동안 반응시켰다. 이후 기판을 분리한 후 전기영동 버퍼 (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA)로 5 분 동안 3 번씩 버퍼 교체를 진행하였다.
실시예 4: 조직내 위치정보를 유지한 핵산의 추출 및 고정
조직 내 위치정보를 유지한 채 핵산을 분리하기 위하여 OCT compound를 사용하여 소 근육 동결 조직을 제작하고 cryostat을 사용하여 6 ㎛의 두께로 절편 한 후, 도 3과 같이 배치하였다. 핵산 포집 기판은 실시예 2를 통하여 제작된 위치 바코드를 포함하는 프라이머가 배치되어 고정된 기판을 사용하였다. 흡수 필터(2.1 cm X 2.8 cm)와 기판을 proteinase K를 포함하는 전기영동 버퍼 (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA)에 적시고 도 3과 같이 전극, 흡수필터 및 종이필터 사이에 배치하고 고정한 후 주변의 물기를 모두 제거하여 전류가 외부 표변으로 흐르는 것을 방지한 후, 60 ℃에서 5 mA 내지 15 mA의 전류를 흘려주면서 30 분 동안 반응시켰다. 이후 기판을 분리한 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000 uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85 ℃로 10 분 동안 반응시켜 핵산을 기판에 고정하였다. 상기 UV 조사는 기판에 포집된 조직의 핵산이 이중 가닥인 샘플이거나, 표적 하고자 하는 핵산이 이중 가닥일 경우, 기판을 500 mM NaOH로 5 분 반응시켜 단일 가닥으로 변성 (denature) 시킨 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000 uJ의 UV를 조사하고 Heating block 위에서 85 ℃로 10 분 동안 반응시켜 핵산을 기판에 고정하였다.
실시예 5: 위치바코드 프라이머가 결합된 상보핵산의 제작과 증폭
실시예 2에 따라 지정된 위치에 배치되고 고정된 위치 바코드를 포함하는 프라이머와 실시예 3의 위치 정보가 유지되어 기판에 포집된 조직 핵산의 혼성화 및 신장반응을 통하여 위치 바코드 서열이 결합된 상보핵산 (complementary nucleic acid)을 만들어내고, 만들어진 상보핵산의 증폭을 통해 도 14와 같이 기판 상의 각 어레이 별로 어레이 바코드를 결합하며 바코드 일루미나사 NGS 분석을 위한 어댑터를 결합시키기 위하여 아래와 같은 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. SuperScript™IV One-Step RT-PCR premix (Thermofisher Scientific, 미국) 50 ㎕, Forward primer (서열번호 3) 4 ㎕, Reverse primer (서열번호 4) 4 ㎕를 및 PCR grade water 4 ㎕ 총 100 ㎕의 반응액을 12 개를 준비하여 실시예 3의 기판을 잘라 반응액에 잠기게 넣어준 뒤, 45 ℃ 30 분, 95 ℃ 10 분 반응시키고 95 ℃ 30 초, 64 ℃ 1 분으로 32 cycle 반응시킨 후 64 ℃에서 5 분 반응시켜 어댑터 및 위치 바코드 서열이 결합된 상보핵산을 제작하고 증폭하였다.
서열번호 3
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG AAAA GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG
상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 'AAAA' 서열 (밑줄)은 실시예 1에서 설정된 어레이를 할당할 수 있는 어레이 바코드 서열을 나타내며, 기울임체로 표시된 서열은 어댑터 서열을 나타내고, 굵은 글씨로 표시된 서열은 NGS 분석 라이브러리 제작을 위한 어댑터가 결합하는 부위를 나타낸다.
서열번호 4
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CCATCTCTAAGGCCCTGAGGAA
상기 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 표현하였으며, 기울임체로 표시된 서열은 표적 유전자의 상보핵산에 결합하는 서열을 나타내며, 굵은 글씨로 표시된 서열은 NGS 분석 라이브러리 제작을 위한 어댑터가 결합하는 부위를 나타낸다.
반응물 12 개 모두 한 개의 튜브에 회수하고, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다.
실시예 6: 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리의 제작
실시예 5의 정제 산물을 주형으로 일루미나사의 iSeq 100 system (Illumina, 미국)을 사용한 증폭산물 염기서열 분석 (amplicon sequencing)을 위한 라이브러리 제작을 위하여 아래와 같은 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Thermofisher Scientific, 미국) 25 ㎕, Index Primer F (Nextera XT Index Kit v2, Illumina, 미국) 5 ㎕, Index Primer R (Nextera XT Index Kit v2, Illumina, 미국) 5 ㎕, 주형 DNA (실시예 5) 10 ㎕와 PCR grade water 5 ㎕, 총 50 ㎕의 반응액을 98 ℃ 30 초 반응시킨 후 98 ℃ 20 초, 55 ℃ 20 초, 72 ℃ 20 초로 8 cycle 반응시킨 후 72 ℃에서 5 분 반응시켰다.
반응산물을 회수하여, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다.
실시예 7: Illumina iSeq 100 시스템을 사용한 염기서열분석
실시예 5의 산물을 사용하여 iSeq 100 system (Illumina, 미국)의 사용자 설명과 같게 사용한 증폭산물 염기서열 분석 (amplicon sequencing)을 진행하여 분석 리드를 확보하였다.
실시예 8: 시퀀싱 리드 데이터의 전처리
얻어진 분석 리드에 대하여, 다음과 같이 도 16의 절차에 따라 시퀀싱 리드 데이터의 전처리 과정을 수행하였다.
시퀀싱을 통해 얻은 리드 데이터의 3' 말단의 저품질 염기서열을 트리밍하고 리드1과 리드2의 겹쳐지는 서열을 토대로 양방향 (paired-end)의 리드를 단일방향 (single-end) 리드 데이터로 병합하였다. 이후 서열번호 5 (어댑터 서열)과 서열번호 6 (표적 특이적 서열)을 포함하는 리드를 선별하고 5' 말단의 어레이 바코드 서열 및 서열번호 5와 서열번호 6 사이에 존재하는 단일분자 식별자 서열과 위치 바코드 서열을 추출하였다.
서열번호 5
GGTGCATTCGTTCCGGTGTAAG
서열번호 6
TTATTGATGGTACACAAG
추출된 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열을 토대로 리드 데이터를 기판 상의 스팟 별로 분리하여 (demultiplexing) 확보한 뒤, 바코드 서열 및 단일분자 식별자 서열의 트리밍을 수행하였다. 이후 데이터 내의 리드 서열의 유사성을 토대로 추가적으로 리드를 분리하여 단일분자 식별자 서열이 같은 리드끼리 통합 (deduplication) 한 뒤, 동일한 어레이 바코드 및 위치 바코드를 갖는 리드를 재병합하였다 (도 18).
실시예 9: 전처리된 시퀀싱 데이터를 활용한 공간 발현 분석
실시예 8과 같이 전처리 과정을 통해 스팟 별로 분리된 리드 데이터를 이용하여 도 17의 절차에 따라, 다음과 같이 분리된 리드 데이터로의 2차원 공간 좌표 할당 및 발현 분석을 수행하여 공간 발현 분석 데이터를 확보하였다.
본 실시예에서 사용된 기판 상의 어레이 및 스팟 배열을 토대로 스팟의 번호 순서 규칙을 부여하고 해당 규칙으로부터 XY 좌표를 변환하여 각 스팟 별 위치좌표를 할당하였다.
이후 전처리된 리드 데이터는 각 스팟 별로 표적 핵산을 발현하는 유전자인 Bos taurus GAPDH gene의 참조 유전자 서열 (서열번호 2)에 서열 정렬 (sequence alignment)하였으며, 이에 따른 스팟 별 정렬 리드 수를 테이블형 데이터로 확보하였고 스팟 별 정렬 리드 수를 하나의 그래프로 표시하여 시각화 함으로써 염기서열 리드 지도를 구성하였다 (도 19).
상기의 염기서열 리드 지도와 조직 절편사진을 겹쳐, 시료 내 위치를 도출하였다 (도 19).
실시예 10: 간접 원위치 단일분자 전사체 분석 상의 핵산 포집 플레이트 어레이 위치 별 리드 데이터 편차 분석
10-1. 프라이머, 핵산 포집 플레이트의 제작, 핵산의 추출 및 고정
실시예 2에서와 같이 단일분자 식별자 서열 및 위치정보 서열이 포함된 증폭산물의 생성을 위한 Bos taurus GAPDH gene 표적 프라이머 (서열번호 1)를 이용하였으며, 실시예 3에 기술된 바와 같이 핵산 포집 플레이트를 제작하였다.
조직 내 위치정보를 유지한 채 핵산을 분리하기 위하여 소 근육조직의 동결 절편 시료를 cryostat을 사용하여 5 ㎛의 두께로 절편 한 후 도 3과 같이 배치하였다. 흡수 패드 (2.1 cm X 2.8 cm)와 기판을 proteinase K를 포함하는 전기영동 버퍼에 적시고 도 3과 같이 전극, 흡수 패드 및 종이 필터 사이에 배치하고 고정한 후 주변의 물기를 모두 제거하여 전류가 외부 표변으로 흐르는 것을 방지한 후, 60 ℃에서 5 mA 내지 15 mA의 전류를 흘려주면서 30분 동안 반응시켰다.
이후 기판을 분리한 후 UV Crosslinker로 Cm2 당 20,000 uJ의 UV를 조사하고 85 ℃에서 10 분 동안 반응시켜 전달된 핵산을 기판에 고정하였다.
10-2. 프라이머가 결합된 상보핵산의 제작과 증폭과 정제
상기 처리된 기판에서 좌측 최상단의 어레이, 중심부 2개 어레이, 좌측 최하단의 어레이를 잘라 상보핵산을 증폭하기 위해 SuperScript™IV One-Step RT-PCR premix (Thermofisher Scientific, 미국) 50 ㎕, 20 mg/ml BSA (Sigma, 미국) 1 ㎕, Forward primer (서열번호 3) 4 ㎕, Reverse primer (서열번호 4) 4 ㎕를 및 PCR grade water 41 ㎕ 총 100 ㎕의 반응액을 4 개를 준비하여 실시예 5에서와 동일한 방법으로 위치정보 서열이 결합된 상보핵산을 증폭하였다.
반응물 4 개 모두 한 개의 튜브에 회수하고, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 정제하였다.
10-3. 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리 제작 및 염기서열분석
실시예 6에 기술된 바와 같이 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리의 제작을 수행하였다.
제작된 라이브러리는 HiSeq 4000 System (Illumina, 미국)의 사용자 설명과 같게 사용한 증폭산물 염기 분석 (amplicon sequencing)을 진행하여 분석 리드를 확보하였다.
10-4. 리드 데이터를 이용한 공간 발현 분석
실시예 8과 9에 기술된 바와 같이, 얻어진 리드 데이터를 이용하여 도 16 및 도 17의 절차에 따라 전처리 및 공간 발현 분석을 수행하여 리드의 서열 정렬을 통해 스팟 별 정렬된 리드 수를 확보하였다.
핵산 포집 플레이트 상에서의 좌측 최상단의 어레이, 중심부 2개 어레이, 좌측 최하단의 어레이에 대한 정렬 리드 수의 차이를 확인하기 위하여 각각의 어레이 별로 동일한 스팟의 데이터를 그룹화하여 스팟 당 4 개 어레이의 데이터를 그룹화한 뒤 스팟 별로 4 개 어레이에서 수득한 정렬 리드 수에 대하여 표준 오차를 계산하였다. 이후 실제 정렬 리드 수에 대한 표준 오차의 크기를 비율로 확인하기 위하여 스팟 별로 산출된 표준 오차를 해당 스팟에서의 정렬 리드 수로 나누어 백분율을 확인하였다 (도 20).
실시예 11: 간접 원위치 단일분자 전사체 분석에서의 상보핵산 증폭 과정의 데이터 수득 편차 분석
11-1. 프라이머, 핵산 포집 플레이트의 제작, 핵산의 추출 및 고정
실시예 10-1에서와 같은 방법으로 단일분자 식별자 서열 및 위치정보 서열을 포함하며 Bos taurus GAPDH gene을 표적하는 프라이머 (서열번호 1)를 이용하며, 핵산 포집 플레이트를 제작하였고 소 근육조직의 동결 절편 시료로부터 핵산을 추출한 뒤 고정하였다.
11-2. 프라이머가 결합된 상보핵산의 제작과 증폭과 정제
상기 처리된 기판을 12 개의 어레이로 잘라 상보핵산을 증폭하기 위해 SuperScript™IV One-Step RT-PCR premix (Thermofisher Scientific, 미국) 50 ㎕, 20 mg/ml BSA (Sigma, 미국) 1 ㎕, Forward primer (서열번호 3) 4 ㎕, Reverse primer (서열번호 4) 4 ㎕를 및 PCR grade water 41 ㎕ 총 100 ㎕의 반응액을 24 개를 준비하여 실시예 5에서와 동일한 방법을 어레이 당 2 회씩 수행하여 위치정보 서열이 결합된 상보핵산을 증폭하였다.
이후 12 개의 어레이에서 증폭된 상보핵산을 하나의 튜브에 회수하여 총 2 개의 튜브로 회수한 뒤, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 각각 정제하였다.
11-3. 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리 제작 및 염기서열분석
실시예 10-3에서 기술된 바와 같은 방법으로 상기의 과정에서 반복구로 증폭 및 정제된 상보핵산의 차세대염기서열분석 라이브러리의 제작을 수행한 뒤 증폭산물 염기 분석 (amplicon sequencing)을 진행하여 분석 리드를 확보하였다.
11-4. 리드 데이터를 이용한 공간 발현 분석
실시예 8과 9에 기술된 바와 같이, 얻어진 2 개의 차세대염기서열분석 리드 데이터를 이용하여 도 16 및 도 17의 절차에 따라 각각 전처리 및 공간 발현 분석을 수행하여 리드의 서열 정렬을 통해 각각의 리드 데이터에 대하여 스팟 별 정렬된 리드 수를 확보하였다.
이후 각각의 리드 데이터로부터 수득한 스팟 별 정렬 리드 수를 각각 X축, Y축으로 배열하여 두 데이터로부터 확보한 정렬 리드 수의 상관관계를 비교하였다 (도 21).
실시예 12: 간접 원위치 단일분자 전사체 분석을 통한 사람 T세포 수용체 레퍼토리 분석
12-1. 프라이머, 핵산 포집 플레이트의 제작, 핵산의 추출 및 고정
단일분자 식별자 서열과 위치정보가 포함된 사람 T세포 수용체의 레퍼토리 분석을 위한 증폭산물의 생성을 위하여 TCRA gene, TCRB gene의 불변영역 (constant region)을 표적하는 프라이머 (각각 도 22 및 도 23)를 제작하였으며, 실시예 3에 기술된 바와 같이 핵산 포집 플레이트를 제작하였다.
이후 핵산의 추출 및 고정은 실시예 10-1에 기술된 바와 동일한 방법으로 수행하였다.
12-2. 프라이머가 결합된 상보핵산의 제작과 증폭과 정제
T세포 수용체 유전자의 알파사슬 및 베타사슬에 대한 가변영역 (variable region)의 상보핵산에 결합하는 역방향 프라이머 (도 24)를 제작하여 표적 핵산 별로 제작한 프라이머를 같은 비율로 혼합한 뒤 상보핵산의 증폭에 사용하였다.
상보핵산의 제작과 증폭 및 정제 과정은 상기 실시예 5에서 기술된 바와 동일한 방법으로 수행하였다.
12-3. 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리 제작 및 염기서열분석
실시예 10-3에 기술된 바와 같이 차세대염기서열분석을 위한 라이브러리의 제작 및 염기서열분석을 수행하여 분석 리드를 확보하였다.
12-5. 국소적 T세포 수용체 레퍼토리 분석
실시예 8에 기술된 바와 같이, 얻어진 리드 데이터를 이용하여 도 16의 절차에 따라 전처리된 리드를 확보하였다.
전처리된 리드는 T세포 수용체 유전자의 알파사슬과 베타사슬의 참조 유전자 서열에 국지적 서열 정렬 (local sequence alignment)하여 V(D)J 구조를 탐색하고 상보성결정부위3 (CDR3)의 염기서열 분석을 통해 T세포 클론형을 산출하였다 (도 25).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
1. Indirect in-situ sequencing 라이브러리 제작 원리
11. 핵산 포획 기판
12. 지정된 위치에 배치되고 부분적으로 고정된 위치 바코드 올리고머
13. 핵산을 함유한 시료
14. 핵산의 전달
15. 부분적으로 고정된 시료 핵산과 위치 바코드 올리고머가 배치된 핵산 포획 기판
16. 반응 챔버
2. 위치 바코드를 포함하는 프라이머가 고정화 된 기판의 세척을 위한 적층 구조
21. 양극 (+)
22. 흡수 패드
23. 핵산 포획 기판
24. 흡수 패드
25. 음극 (-)
26. 열 플레이트
3. 시료로부터 핵산을 추출하는 장치 (Nucleic acid isolation from tissue sample)
31. 양극 (+)
32. 흡수 패드
33. 핵산 포획 기판
34. 시료/종이 필터
35. 흡수 패드
36. 음극 (-)
37. 열 플레이트
4. 시료로부터 핵산을 추출하는 장치 (Nucleic acid isolation from tissue sample)
41. 양극 (+)
42. 흡수 패드
43. 핵산 포획 기판
44. 변성 패드 (denaturing pad)
45. 시료/종이 필터
46. 흡수 패드
47. 음극 (-)
48. 열 플레이트
5. 위치 바코드 서열의 결합을 위한 고정형 (solid phase) 프라이머
51. 위치 바코드 서열의 결합을 위한 프라이머
511. 어댑터 서열 #1
512. 위치 바코드 서열
513. 표적 특이적 서열 (Forward)
514. 부분적으로 고정된 상태
52. 링커 서열을 포함하는 위치 바코드 서열의 결합을 위한 프라이머
521. 링커 서열
6. 단일 분자 지정 및 위치 바코드 서열의 결합을 위한 고정형 (solid phase) 프라이머
61. 위치 바코드 및 단일분자 식별자 서열을 포함하는 프라이머
611. 단일분자 식별자 서열 (무작위 서열)
62. 위치 바코드, 단일분자 식별자 및 링커 서열을 포함하는 프라이머
7. 증폭을 위한 액상형 (liquid phase) 프라이머
71. 시퀀싱 어댑터 및 어레이 바코드 서열을 포함하는 증폭을 위한 정방향 프라이머
711. 시퀀싱 어댑터 서열 #1
712. 어레이 바코드 서열
72. 시퀀싱 어댑터 서열을 포함하는 증폭을 위한 역방향 프라이머
721. 시퀀싱 어댑터 서열 #2
722. 표적 특이적 서열 (reverse)
8. 표적서열에 위치 바코드를 결합시키는 방법
81. 고정형 (solid phase) 프라이머의 결합 및 신장 반응
811. 표적 핵산
812. 부분적으로 결합된 상태
82. 위치 바코드가 결합된 상보 핵산
9. 표적서열에 위치 바코드를 결합시키는 방법
91. 고정형 프라이머의 결합 및 신장 반응
911. 변성화 된 (denatured) 표적 핵산
10. 어레이 바코드 및 위치 바코드가 결합된 상보 핵산의 증폭
101. 중합효소연쇄반응의 첫 번째 반응
102. 중합효소연쇄반응의 두 번째 및 이후 반응
11. 간접 원위치 염기서열 분석 결과물 리드 (Read)의 구성
111. 위치정보 서열을 포함하는 시퀀싱 리드
1111. 어레이 바코드 서열
1112. 어댑터 서열
1113. 위치 바코드 서열
1114. 표적 유전자 서열, 프라이머 부위
1115. 표적 유전자 서열
1116. 표적 유전자 서열, 프라이머 부위
112. 위치정보 서열 및 링커 서열을 포함하는 시퀀싱 리드
1121. 링커 서열
12. 간접 원위치 단일분자 염기서열 분석 결과물 리드 (Read)의 구성
121. 단일분자 식별자 서열과 위치정보 서열을 포함하는 시퀀싱 리드
1211. 단일분자 식별자 서열
122. 단일분자 식별자 서열과 위치정보 서열 및 링커 서열을 포함하는 시퀀싱 리드
13. 핵산 포획 기판
131. 고정형 프라이머가 배치된 핵산 포획 기판
132. 단일한 위치 바코드 서열을 가지는 고정형 프라이머 스팟
14. 기판 상의 핵산의 위치를 지정하기 위해 어레이 별로 할당된 어레이 바코드 서열
15. 기판 상의 핵산의 위치를 지정하기 위해 어레이 내의 위치에 따라 할당된 위치 바코드 서열
16. 간접 원위치 단일분자 염기서열 분석 절차
161. 원본 리드 데이터 상의 3' 말단 저품질 염기서열 트리밍
162. 양방향 (paired-end) 리드 R1, R2의 병합
163. 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열에 기반한 리드 분리 (demultiplexing)
164. 단일분자 식별자 서열 추출
165. 바코드 서열 및 단일분자 식별자 서열 트리밍
166. 리드 간의 염기서열의 유사도에 기반한 추가적인 리드 분리
167. 분리된 리드 별 단일분자 식별자 서열이 동일한 리드의 통합
168. 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 동일한 리드의 재병합
17. 스팟별 공간 좌표 할당 및 위치정보가 포함된 공간 분석 데이터의 생성 절차
171. 어레이 및 스팟 배열순서와 2차원 공간좌표 사이의 변환 (transformation)을 통한 공간 좌표 데이터의 생성
172. 표적 유전자의 참조 유전자 서열 (reference sequence)로의 서열 정렬 (sequence alignment)
173. 공간 발현 분석 (spatial gene expression analysis)
174. 공간 돌연변이 분석 (spatial gene mutation analysis)
175. 공간 면역 레퍼토리 분석 (spatial immune repertoire analysis)
176. 공간 메타지노믹스 분석 (spatial metagenomics analysis)
177. 공간 분석 데이터 및 공간 좌표 데이터의 병합
18. 간접 원위치 단일분자 염기서열 데이터 분석 절차에 따른 결과물
181. 차세대염기서열분석 리드 (read) 데이터 (미가공, 일루미나 시스템)
182. 단일분자 지정서열이 추출된 리드 (read) 데이터
183. 단일분자 지정서열이 동일한 리드 (read)를 통합한 데이터
184. 단일분자 지정서열을 기준으로 통합한 데이터에서 특정 위치 바코드 서열을 가지는 리드 (read)만을 통합한 데이터
19. 동결 절편 조직 이미지와 시퀀싱 결과물의 결합
191. 소 근육조직 절편 사진
192. 간접 원위치 단일분자 전사체분석의 분석영역
193. 간접 원위치 단일분자 염기서열 분석 및 이미지 결합 결과
20. 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통해 각 스팟에서 산출된 정렬 리드 수의 어레이 별 편차
21. 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통해 산출된 정렬 리드 수의 상관관계
22. 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 수용체 레퍼토리 분석에서의 T세포 알파사슬을 표적하는 위치 바코드를 포함하는 프라이머의 서열
23. 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 수용체 레퍼토리 분석에서의 T세포 베타사슬을 표적하는 위치 바코드를 포함하는 프라이머의 서열
24. 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 수용체 레퍼토리 분석에서의 상보핵산에 결합하는 프라이머의 서열
241. T세포 수용체 알파사슬의 상보핵산에 결합하는 프라이머의 서열
242. T세포 수용체 베타사슬의 상보핵산에 결합하는 프라이머의 서열
25. 간접 원위치 단일분자 전사체분석을 통한 T세포 수용체 레퍼토리 분석의 결과물
251. T세포 수용체 알파사슬 클론형 데이터
252. T세포 수용체 베타사슬 클론형 데이터
<110> Contourgen Co., Ltd <120> Method and apparatus for spatial sequencing analysis using nucleic acids maintaining two-dimensional spatial information <130> P21-B069 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 ggtgcattcg ttccggtgta agnnnnnnnn nnnnnnnnnn nggttattga tggtacacaa 60 g 61 <210> 2 <211> 1279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH <400> 2 gctctctgct cctgcccgtt cgacagatag ccgtaacttc tgtgctgtgc cagccgcatc 60 cctgagacaa gatggtgaag gtcggagtga acggattcgg ccgcatcggg cgcctggtca 120 ccagggctgc ttttaattct ggcaaagtgg acatcgtcgc catcaatgac cccttcattg 180 accttcacta catggtctac atgttccagt atgattccac ccacggcaag ttcaacggca 240 cagtcaaggc agagaacggg aagctcgtca tcaatggaaa ggccatcacc atcttccagg 300 agcgagatcc tgccaacatc aagtggggtg atgctggtgc tgagtatgtg gtggagtcca 360 ctggggtctt cactaccatg gagaaggctg gggctcactt gaagggtggc gccaagaggg 420 tcatcatctc tgcaccttct gccgatgccc ccatgtttgt gatgggcgtg aaccacgaga 480 agtataacaa caccctcaag attgtcagca atgcctcctg caccaccaac tgcttggccc 540 ccctggccaa ggtcatccat gaccactttg gcatcgtgga gggacttatg accactgtcc 600 acgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaagctg tggcgtgacg 660 gccgaggggc tgcccagaat atcatccctg cttctactgg cgctgccaag gccgtgggca 720 aggtcatccc tgagctcaac gggaagctca ctggcatggc cttccgcgtc cccactccca 780 acgtgtctgt tgtggatctg acctgccgcc tggagaaacc tgccaagtat gatgagatca 840 agaaggtggt gaagcaggcg tcagagggcc ctctcaaggg cattctaggc tacactgagg 900 accaggttgt ctcctgcgac ttcaacagcg acactcactc ttctaccttc gatgctgggg 960 ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctggtacgac aatgaatttg 1020 gctacagcaa cagggtggtg gacctcatgg tccacatggc ctccaaggag taaggtccct 1080 ggacccccag ccccagcagg agcacgagag gaagagttcc tcagctgctg gggagtcctg 1140 ccccatctcc gccacactga gaatctcctg acttccacat gtttccatct ctaaggccct 1200 gaggaagggg aggggcttag ggagccctgc cttgtgtacc atcaataaaa gtaccctata 1260 cctaaaaaaa aaaaaaaaa 1279 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaaaaggt gcattcgttc cggtgtaag 59 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagccatct ctaaggccct gaggaa 56 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor <400> 5 ggtgcattcg ttccggtgta ag 22 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target specific <400> 6 ttattgatgg tacacaag 18

Claims (32)

  1. 다음의 단계를 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보를 포함하는증폭산물의 제조방법:
    (a) 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머가 지정된 위치에 배치되어 고정된 기판을 준비하는 단계;
    (b) 핵산을 함유한 시료를 상기 (a) 단계의 기판에 배치하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 시료에서 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계의 추출한 핵산을 (a) 단계의 기판에 고정하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 고정된 핵산과 인접한 프라이머를 혼성화 하는 단계;
    (f) 상기 (e) 단계의 혼성화 된 프라이머를 신장하여 상보핵산을 제작하는 단계; 및
    (g) 상기 (f) 단계의 상보핵산을 증폭하여 위치정보 서열이 결합된 증폭산물을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 프라이머는 3’->5’ 순서로 표적 특이적 서열, 위치 바코드 서열, 및 어댑터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 프라이머는 3’->5’ 순서로 표적 특이적 서열, 위치 바코드 서열, 3 내지 12 개 무작위 염기서열, 및 어댑터 서열을 포함하여 단일 분자를 지정하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 프라이머는 표적 특이적 서열과 위치 바코드 서열 사이의 2 내지 4 개 염기서열을 포함하는 링커 서열을 포함하여 표적 핵산과 프라이머의 혼성화 과정에서 위치 바코드 서열에 의한 영향을 최소화하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 위치 바코드는 이미 알고 있는 서열로서 기판의 지정된 위치에 고정시켜 기판의 특정 위치를 나타내는 3 내지 8개로 구성된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는
    (i) 위치 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 기판의 지정된 위치에 배치하는 단계;
    (ii) UV 및 열로 기판에 고정하는 단계; 및
    (iii) 프라이머가 고정된 기판을 세척하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는
    (a) 시료를 기판 위에 위치시키는 단계; 및
    (b) 시료 위에 기질분해 시약이 포함된 버퍼가 함유된 패드를 올리는 단계;
    를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 30 ℃ 내지 65 ℃의 온도에서 핵산이 포함된 샘플의 기질을 분해하고, 노출된 핵산을 인접한 기판의 표면으로 이동시키는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산을 추출하여 기판 표면에 전달하는 단계는 전기영동 (electrophoresis) 또는 유체의 이동을 사용한 능동적인 전달인 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 기판에 포함된 프라이머의 서열과 상관없이 추출된 핵산이 열 혹은 UV에 의해 기판의 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 표적 핵산이 이중 가닥 핵산일 경우, 핵산이 변성 (denature) 된 다음, 열 혹은 UV에 의해 단일 가닥의 형태로 기판의 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 기판에 포함된 위치 바코드 서열이 포함된 프라이머와 시료에서 추출된 핵산에 상보적인 서열이 있을 경우, 서로 혼성화 하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계에서 프라이머의 신장은 역전사효소 또는 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (g) 단계에서 상보핵산의 증폭은 어댑터 서열에 상보적인 서열을 사용하여 중합효소반응으로 수행되는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (g) 단계에서 상보핵산의 증폭은 증폭산물의 5' 말단에 이미 알고 있는 서열로서 기판의 특정 어레이를 나타내는 3 내지 8 개로 구성된 염기서열을 포함하는 어레이 바코드를 결합하는 것을 특징으로 하는 증폭산물의 제조방법.
  16. 다음의 단계를 포함하는 차세대염기서열분석 (NGS) 기반의 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법으로 위치정보를 포함하는 증폭산물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 증폭 산물을 차세대 염기서열 분석하여 리드를 수득하는 단계; 및
    (c) 수득한 리드를 분석하여 핵산을 함유한 시료 내 수득한 개별 리드의 위치를 결정하는 단계
  17. 제16항에 있어서, 상기 (c) 단계는
    (i) 3' 말단의 저품질 염기서열을 트리밍 하는 단계;
    (ii) 리드1과 리드2의 오버랩 서열을 토대로 병합하여 단일 방향의 리드를 획득하는 단계;
    (iii) 제2항의 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 위치 바코드 서열 및 제15항의 5' 말단의 어레이 바코드 서열을 추출하여 리드에 지정하는 단계;
    (iv) 상기 지정된 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열에 따라 리드를 분리하는 단계;
    (v) 분리된 리드들의 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표 (x, y)를 할당하는 단계;
    (vi) 좌표에 따라 표적 핵산의 참조 유전자 서열에 정렬된 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및
    (vii) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 (c) 단계는
    (i) 3' 말단의 저품질 염기서열을 트리밍 하는 단계;
    (ii) 리드1과 리드2의 오버랩 서열을 토대로 병합하여 단일 방향의 리드를 획득하는 단계;
    (iii) 제3항의 표적 특이적 서열과 어댑터 서열 사이의 무작위 서열, 위치 바코드 서열 및 제15항의 5' 말단의 어레이 바코드 서열을 추출하여 리드에 지정하는 단계;
    (iv) 상기 지정된 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열에 따라 리드를 분리하는 단계;
    (v) 리드 간의 염기서열 유사성을 토대로 리드를 분리하는 단계;
    (vi) 분리된 리드별 상기 추출된 무작위 서열이 같은 리드를 하나의 리드로 통합하는 단계;
    (vii) 상기 지정된 어레이 바코드 및 위치 바코드 서열이 같은 리드를 재병합하는 단계;
    (viii) 분리된 리드들의 바코드 서열에 따라 2차원의 좌표 (x, y)를 할당하는 단계;
    (ix) 좌표에 따라 표적 핵산의 참조 유전자 서열에 정렬된 개별 리드들을 하나의 그래프에 배치하는 단계; 및
    (x) 배치된 개별 리드들을 포함하는 그래프를 시료 이미지 위에 겹쳐 시료 내 위치를 결정하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 시료 이미지는 일반 사진, 현미경 사진, 면역염색 사진, 핵산 탐침자 형광 사진 및 색소 염색 사진에서 선택되는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법
  20. 제16항에 있어서, 상기 핵산을 함유한 시료의 연속된 절편을 분석하여 3차원의 위치를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 NGS 기반 핵산을 함유한 시료 내 특정 핵산의 위치를 분석하는 방법
  21. 완충용액 패드; 시료 패드; 위치 바코드 서열이 포함된 프라이머가 고정된 핵산 포획 기판; 완충용액 패드; 및 가열판을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
  22. 제21항에 있어서, 상기 기판은 핵산이 결합할 수 있도록 표면 처리된 나일론, 니트로 셀룰로스, PVDF, 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체 (COC), 고리형 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
  23. 제21항에 있어서, 상기 시료 패드는 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease, Lysozyme 등의 효소와 Tween-20, Triton X-100, 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 등의 계면활성제 및 Urea, β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol)와 같은 첨가제로 구성된 군에서 선택되는 것을 포함하는 완충용액을 포함하는 흡수필터 혹은 겔로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
  24. 제21항에 있어서, 상기 장치는 음극 및 양극, 실린지, 펌프 및 진공 펌프 군에서 선택되는 하나 이상의 장치를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하는 장치.
  25. 핵산을 함유한 시료로부터 위치정보가 유지된 채 추출된 핵산과 혼성화 되어 유전자 서열 및 길이로 위치를 할당하는 것을 특징으로 하는 위치 바코드 서열이 포함된 프라이머가 지정 위치에 배열되어 고정된 핵산 수득용 기판.
  26. 제25항에 있어서, 상기 기판은 전기적 양성 또는 0.20 내지 0.45 ㎛의 크기 (pore size)를 가지거나, 일정 분자량 이상의 크기를 가지는 분자들의 이동을 선별적으로 차단하는 다공성 기판인 것을 특징으로 하는 핵산 수득용 기판.
  27. 제25항에 있어서, 상기 기판은 나노 입자, 마이크로 입자, 나노 와이어 또는 마이크로 와이어가 배치된 것을 특징으로 하는 핵산 수득용 기판.
  28. 핵산을 둘러싸고 있는 기질을 분해할 수 있는 Proteinase K, Protease 및 Lysozyme으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 효소; Tween-20, Triton X-100 및 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 계면활성제; Urea, β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제; DNA 또는 RNA 분해효소 및 전류이동완충액을 포함하는 핵산을 함유한 시료로부터 핵산의 원 위치를 유지한 채 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 시약.
  29. 다음의 단계를 포함하는 위치좌표를 포함하는 NGS 분석 결과물을 사용하여 암 미세환경을 구분한 후 분리된 리드를 산출하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법을 통하여 위치 바코드를 포함하는 리드를 산출하는 단계
    (b) 기판 상에서 핵산을 함유한 시료와 겹쳐진 영역을 설정하는 단계;
    (c) 상기 영역에서 암 영역을 설정하는 단계;
    (d) 상기 영역에서 암 주변부 영역을 설정하는 단계;
    (e) 상기 영역에서 정상 영역을 설정하는 단계; 및
    ⒡ (a) 단계에서 산출된 리드를 암 영역, 암 주변부 영역 및 정상 영역에 해당하는 좌표에 따라 리드를 각각 분리하는 단계;
  30. 다음의 단계를 포함하는 위치좌표를 포함하는 NGS 분석 결과물을 사용하여 위치 바코드별 면역활성도를 평가하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법을 통하여 위치 바코드를 포함하는 리드를 산출하는 단계
    (b) 위치 바코드별 면역세포 바이오마커 유전자 발현, 면역 관문 유전자 발현 및 면역 레퍼토리의 다양성으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 분석을 수행하는 단계; 및
    (c) (b) 단계의 결과를 수치화 하여 면역활성도를 평가하는 단계;
  31. 다음의 단계를 포함하는 위치좌표를 포함하는 NGS 분석 결과물을 사용하여 암 특이적 면역 레퍼토리를 선별하는 방법:
    (a) 제29항의 방법을 통하여 얻어지는 영역별 면역 레퍼토리 클론형을 산출하는 단계;
    (b) 제30항의 방법을 통하여 얻어지는 위치 바코드별 면역활성도를 산출하는 단계; 및
    (c) (a) 단계의 결과와 (b) 단계의 결과로 얻어지는 데이터를 위치정보에 따라 결합하여 암 주변부 영역의 면역활성도가 높은 위치 바코드에서의 면역 레퍼토리 클론형 데이터를 획득하는 단계;
  32. 제31항의 방법을 사용하여 면역 치료제 혹은 암 진단용 면역 레퍼토리 클론형을 도출하는 방법
KR1020210041777A 2021-03-31 2021-03-31 2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치 KR20220135719A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210041777A KR20220135719A (ko) 2021-03-31 2021-03-31 2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210041777A KR20220135719A (ko) 2021-03-31 2021-03-31 2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220135719A true KR20220135719A (ko) 2022-10-07

Family

ID=83595671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210041777A KR20220135719A (ko) 2021-03-31 2021-03-31 2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20220135719A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107580632B (zh) 用于全转录组扩增的方法和组合物
KR101994494B1 (ko) 조직 샘플 중의 핵산의 국지적 또는 공간적 검출을 위한 방법 및 그 방법의 생성물
CN101918590B (zh) 核酸测序
CA2906818C (en) Generating cell-free dna libraries directly from blood
JP2023514749A (ja) 統合型インサイチュ空間的アッセイのための方法および組成物
WO2018217862A1 (en) Methods for performing spatial profiling of biological molecules
CN115335520A (zh) 用于通过测序对单细胞进行空间映射的条形码化的孔
KR20190034164A (ko) 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 및 이의 제조를 위한 조합 인덱싱 방법
JP6395925B2 (ja) 遺伝子解析システム
US20230212656A1 (en) Methods of spatially resolved single cell sequencing
CN106536735A (zh) 分析dna样品的探针集合和使用所述探针集合的方法
US20230235384A1 (en) Compositions and methods for in situ single cell analysis using enzymatic nucleic acid extension
CN111492068A (zh) 与寡核苷酸相关联的颗粒
KR20210039289A (ko) 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보를 유지한 채 추출하는 방법 및 장치, 이를 이용한 위치정보를 포함하는 유전체 분석 방법
KR20220135719A (ko) 2차원 위치정보를 포함하여 추출된 핵산을 이용한 유전체 분석 방법 및 장치
EP4269615A1 (en) Biochip for spatial transcriptomic analysis, manufacturing method therefor and application thereof
RU2639513C1 (ru) Способ выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов), определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей, с использованием ОТ-ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)
WO2023154554A1 (en) Materials and methods for large-scale spatial transcriptomics
CN116376662A (zh) 空间转录组学分析的生物芯片和其制备方法及应用
KR20220106153A (ko) 표적 분석과 관련된 조성물, 세트, 및 방법
Last et al. Molecular diagnosis of lymphoma: outcome prediction by gene expression profiling in diffuse large B-cell lymphoma
POPA et al. MODERN APPLICATION OF NEXT-GENERATION SEQUENCING (NGS)
Last et al. Molecular Diagnosis of Lymphoma