JP2024508042A - 空間トランスクリプトーム解析用のバイオチップ、その製造方法及び使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、生物試料の核酸情報を解析するためのチップの製造方法を提供する。前記チップは、生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報の解析に適用される。本発明は、生物試料の核酸情報を解析するチップ及び前記チップを用いて生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報を解析する方法をさらに提供する。本発明の方法及び設備は、組織試料の細胞中の核酸発現情報（空間オミックス情報を含む）を効果的に取得することができる。【選択図】図１

Description

本出願は、２０２０年１２月２５日に提出された中国出願第２０２０１１５６８７８７．３号（発明の名称：空間トランスクリプトーム解析用のバイオチップの製造方法）の優先権を主張し、その内容全体は参照により本出願に組み込まれる。

本発明は、生物学及び医療機器分野に関する。具体的には、本発明は、生物試料の細胞の核酸情報を分析するためのチップを製造する方法に関する。前記チップは、生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報の分析に適用される。

生物組織の細胞組織と発現パターンの分析は、生物医学の研究と診断学のマイルストーンである。細胞組織学は、さまざまな染色技術を使用して、１世紀以上前に健康な臓器の基本的な構造メカニズムと一般的な病理学的変化を初めて確定した。この分野の発展により、免疫組織化学及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子発現でタンパク質分布を研究することが可能になった。

新しい研究では、組織に関する空間情報を保存しながら、組織内のトランスクリプトーム及び／又はゲノムの変異を特徴付けることができることが期待されている。

遺伝子発現解析の最近の発展により、マイクロアレイ又はＲＮＡシーケンシングを使用して組織の完全なトランスクリプトームを評価することが可能となった。しかしながら、典型的なトランスクリプトーム解析は、組織全体（又は生物体全体）から抽出されたｍＲＮＡを対象としているが、小さな組織領域又は個々の細胞を収集してトランスクリプトームを解析することは、通常、手間と費用がかかり、精度も低い。

本発明は、生物試料の細胞の核酸情報、特に、生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報の分析に適したバイオチップの製造方法を提供する。具体的には、本発明によれば、以下のステップＡからステップＣを含む、アレイを有するバイオチップの製造方法であって、
ステップＡ：平行に設けられた複数のマイクロ流路により、第１群のバーコード核酸をチップ表面に固定し、第１方向の複数本の第１バーコードストリップを形成し、前記第１群のバーコード核酸は、異なるバーコード配列を有する複数種の第１バーコード核酸を含み、各本の第１バーコードストリップには、１種の第１バーコード核酸が固定され、かつ各条の第１バーコードストリップに固定される第１バーコード核酸は、異なるバーコード配列を有し、
ステップＢ：平行に設けられた複数のマイクロ流路により、第２群のバーコード核酸を、第２方向に沿ってチップ表面の第１方向を有する前記複数本の第１バーコードストリップに加え、複数本の第２バーコードストリップを形成し、前記第２群のバーコード核酸は、異なるバーコード配列を有する複数種の第２バーコード核酸を含み、各本の第２バーコードストリップは、１種の第２バーコード核酸を有し、かつ各本の第２バーコードストリップ上の第２バーコード核酸は、異なるバーコード配列を有し、
ステップＣ：第１バーコード核酸と第２バーコード核酸とが結合反応を発生する条件下で、前記複数本の第１バーコードストリップと前記複数本の第２バーコードストリップとが交差したチップ表面で第２バーコード核酸と第１バーコード核酸とを結合させ、プローブを形成し、前記プローブは、アレイの交差点を構成し、各交差点は、配列が互いに異なるプローブを有する、方法が提供される。

本発明の一態様では、前記方法において、平行に設けられた複数のマイクロ流路を有するマイクロ流路装置により、前記第１群のバーコード核酸又は第２群のバーコード核酸をチップ表面に輸送して固定し、前記マイクロ流路のチップ表面と接触する面は、溶液又は溶液中の核酸が通過可能である。

本発明の一態様では、前記方法において、前記マイクロ流路装置の各本のマイクロ流路に異なるバーコード配列を含む第１群のバーコード核酸又は第２群のバーコード核酸を加える。

本発明の一態様では、前記方法において、前記第１群のバーコード核酸における第１バーコード核酸は、第１バーコード断片を含み、好ましくは、前記第１バーコード核酸は、５'端に増幅反応のためのプライマー断片をさらに有する。

本発明の一態様では、前記方法において、前記第１群のバーコード核酸における第１バーコード核酸は、５'端に、チップ表面に結合するための基を有する。

本発明の一態様では、前記第２群のバーコード核酸における第２バーコード核酸は、３'端に、生物試料中の目的核酸を識別、結合するための捕捉断片（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを識別、結合する断片、例えばｐｏｌｙ－Ｔ配列）及び第２バーコード断片を含む。

本発明の一態様では、前記方法において、前記第２群のバーコード核酸における第２バーコード核酸は、固有分子識別子（ＵＭＩ）をさらに有する。

本発明の一態様では、前記方法において、前記第１バーコード核酸の３'端は、１つの一本鎖結合核酸により第２バーコード核酸に結合するための第１結合断片を有し、前記第２バーコード核酸の５'端は、前記一本鎖結合核酸により第１バーコード核酸に結合するための第２結合断片を有し、前記第１結合断片及び第２結合断片は、それぞれ前記一本鎖リンカー（Linker）核酸の両端の配列と逆相補的である。

本発明の一態様では、前記方法において、ステップＣで形成されたプローブは、３'端にある生物試料中の目的核酸を識別、結合するための捕捉断片、及び第１バーコード断片と第２バーコード断片を含み、好ましくは、前記プローブは、５'端に増幅反応のためのプライマー断片をさらに有する。

本発明の一態様では、前記方法において、前記第１群のバーコード核酸における各種の第１バーコード核酸のバーコード断片の配列は、指定のものであり、及び／又は前記第２群のバーコード核酸における各種の第２バーコード核酸のバーコード断片の配列は、指定のものである。

本発明の一態様では、前記方法において、前記プローブの第１バーコード断片及び第２バーコード断片の配列は、指定のものである。

本発明の一態様では、前記方法において、ステップＡにおいて、流路内の核酸濃度は、約０．１－１００ｕＭ、例えば約１－２０ｕＭである。

本発明の一態様では、前記方法において、ステップＢにおいて、流路内の核酸濃度は、約０．１－１００ｕＭ、例えば約１－２０ｕＭである。

本発明の一態様では、前記方法において、ステップＡでは、前記第１群のバーコード核酸の核酸は、チップ表面に固定される。第１群のバーコード核酸の核酸は、好ましくは化学結合によりチップ表面に固定される。化学結合は、例えば、アミノ基－アルデヒド基反応などの基結合及び共有結合架橋から選択されるいずれか１種である。チップの表面は、表面化学反応によりアミノ、アルデヒド、エポキシ、イソチオシアネート、メルカプト、シリルなどの活性化基などにより被覆されてもよい。前記第１群のバーコード核酸の核酸は、チップ表面に結合した一端（通常、５'端）は、被覆される活性化基と化学結合を形成する基を有する。

本発明の一態様では、前記方法において、ステップＡ及びステップＢでは、前記平行に設けられたマイクロ流路の各マイクロ流路の幅は、約２－２００μｍ、好ましくは約５－５０μｍ、最も好ましくは約５－２５μｍ、例えば約５μｍ、１０μｍ又は５０μｍである。

本発明の一態様では、前記方法において、ステップＡ及びステップＢでは、前記平行に設けられたマイクロ流路は、隣接するマイクロ流路間の距離が約５－４００μｍ、好ましくは約１０－１００μｍ、最も好ましくは約１０－５０μｍ、例えば約２０μｍ、５０μｍ又は１００μｍである。

本発明で製造されたチップは、組織試料、特に組織薄切片に対して細胞内分子の分析（核酸及びタンパク質の分析）を行うことに適用され、例えば、ＰＣＲ、質量分析法、次世代シーケンシング、又はＥＬＩＳＡにより分析して発現及び空間情報を得ることができる。

本発明の一態様では、前記生物試料は、被験体に由来する組織試料、例えば、手術で切除した組織試料であり、好ましくは、顕微切片法により加工して得られた組織薄切片である。本発明の一態様では、前記組織試料は、固定及び包埋され（例えばパラフィンに包埋される）、支持物、例えば、ガラスシートに付着される。

本発明の一態様では、前記組織薄切片に対して形態学的解析及び／又は組織学的解析を行うことができ、この組織学的解析は、Ｈ＆Ｅ染色、ＩＨＣ染色、ＩＳＨ染色及びＦＩＳＨ染色により行われる。

本発明の一態様では、１種又は複数種の生物分子に対する分析は、ＰＣＲ、質量分析法、次世代シーケンシング又はＥＬＩＳＡにより行われる。

本発明の一態様では、被験体は、動物、家畜、ペット、ヒト被験体から選択される。

本発明の一態様では、分析物は、さらに、非ヒト細胞、ヒト細胞、非天然タンパク質、核酸、小分子、染料、ウイルス、細菌、寄生虫、原生動物又は化学物質のうちの１種又は複数種を含む。小分子は、ハプテン、ペプチドタグ、プロテインタグ、蛍光タグ、核酸タグ、及びそれらの組み合わせを含む。

本発明の一態様では、前記チップは、試料におけるマーカーの定量及び／又は定性データの分析に適用できる。このマーカーは、ＤＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ、脂質、細胞小器官、代謝産物、又は細胞を含む。このタンパク質は、修飾されたものを含んでもよい。前記修飾は、アセチル化、ＡＤＰ－リボース化、アシル化、ＡＤＰ－リボース化、アミド化、フラビンとの共有結合、ヘムとの共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体との共有結合、脂質または脂質誘導体との共有結合、ホスファチジルイノシトールとの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解加工、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン化、硫酸化、アルギニル化、及びユビキチン化から選択される。このマーカーは、ゲノム多型、薬理ゲノミクス一塩基多型（ＳＮＰ）、ゲノムＳＮＰ、体細胞多型、並びにタンパク質、脂質及び／又は細胞小器官の差次的発現を含む。前記マーカーは、一塩基位置；遺伝子内領域または遺伝子間領域；エクソン、イントロン、またはそれらの断片；コード領域または非コード領域；プロモーター、エンハンサー、５'未翻訳領域（５'ＵＴＲ）、３'未翻訳領域（３'ＵＴＲ）又はその断片；ｃＤＮＡ又は断片；ＳＮＰ；体細胞変異及び／又は生殖系列変異；点突異または単一変異；欠失変異；インフレーム欠失、遺伝子内欠失、全遺伝子欠失；挿入変異；遺伝子内挿入；逆位変異；染色体内逆位、連鎖変異、連鎖挿入変異；反転変異；タンデム重複；染色体内タンデム重複；転座；染色体転座、非相互転座；再編成；ゲノム再編成；１つ又は複数のイントロンまたはその断片の再編成；再編成されたイントロン；５'－、３'－ＵＴＲ又はそれらの組み合わせを含む。正常な健康組織又は細胞と比較して、がん組織又はがん細胞において、このマーカーは、改変アミノ酸配列をコードする改変ヌクレオチド配列、染色体転座、染色体内逆位、コピー数の変化、発現レベルの変化、タンパク質レベルの変化、タンパク質活性の変化、又はメチル化状態の変化を含む。単一細胞シーケンシング、単核シーケンシング、フローサイトメトリー、免疫組織化学的染色、ヘマトキシリン及びエオシン染色、全ゲノムシーケンシング、高スループットシーケンシング、質量分析法、ＤＮＡマイクロアレイ、又はそれらの組み合わせによりこのマーカーを測定することができる。

本発明のチップは、組織試料の分析に適用できる。この組織試料は、１種又は複数種の前がん細胞又は悪性細胞、固形腫瘍、軟部組織腫瘍または転移巣由来の細胞、手術断端由来の組織又は細胞、組織学的正常組織、１種又は複数種の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、正常隣接組織（ＮＡＴ）、腫瘍に罹患しているか又は腫瘍に罹患するリスクがある同一被験体由来の血液試料、ＦＦＰＥ試料を含む。

本発明の実施例又は従来技術における技術的手段をより明確に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に必要な図面を簡単に紹介する。明らかなように、以下の説明における図面は、本発明のいくつかの実施例だけであり、当業者が創造的努力なしでこれらの図面に基づいて他の図面を得ることができる。

本発明で提供されるチップの製造方法の手順の模式図である。 本発明の方法で使用される平行に設けられた複数のマイクロ流路を有する設備の例示的な実施形態の一つである。 本発明で提供されるチップの製造方法の手順の模式図である。 本発明で提供されるバイオチップの製造方法の例示的な実施形態のフローチャートである。 本発明で提供されるバイオチップの製造方法の別の例示的な実施形態のフローチャートである。 本発明で提供されるバイオチップの製造過程におけるそのバーコード核酸の結合反応に対する観察である。 本発明で提供されるバイオチップを用いてサンプル組織に対して生物空間オミックス研究を行う際に組織切片をＨＥ染色した後の画像である。

本発明の実施例の目的、技術的手段及び利点をより明確にするために、以下、本発明の実施例における図面を参照しながら、本発明の実施例における技術的手段を明確で完全に説明する。明らかなように、以下の実施例は、本発明の実施例の一部であり、全ての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的努力なしで得た全ての他の実施例は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。

実施例１
本発明は、生物試料の細胞の核酸情報を分析するのに適したバイオチップの製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、アレイを有するバイオチップの製造方法を提供する。本発明の一態様では、本発明で提供されるチップは、生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報の分析に適している。

図１は、本発明で提供されるアレイを有するバイオチップを製造する例示的な方法のフローチャートである。

図１に示すように、前記方法は、主に以下のステップを含む。
ステップ１：チップ基板を提供する。
ステップ２：平行に設けられた複数のマイクロ流路により、第１群のバーコード核酸（複数種の第１バーコード核酸を含む。各種の第１バーコード核酸は、異なるバーコード配列を有する（図面におけるＢａｒｃｏｄｅ Ａ））をチップ表面と接触させてチップ表面に固定し、チップ表面に方向が第１方向である複数本の第１バーコードストリップを形成する。ここで、各本の第１バーコードストリップに固定された第１バーコード核酸は、異なる第１バーコード配列を有する。

図２は、平行に設けられた複数のマイクロ流路により複数種のバーコード核酸をチップ表面と接触させてチップ表面に固定する例示的な実施形態を示す。図２における左図の下方は、チップである。図２における左図の中央は、平行に設けられた複数のマイクロ流路（マイクロ流路１からマイクロ流路ｎ）を有するマイクロ流路装置を示し、マイクロ流路のチップ表面と接触する面、即ち、図示されるマイクロ流路の底部は、溶液又は溶液中の核酸が通過（透過）できるものである。例えば、前記マイクロ流路のチップ表面と接触する面には、マイクロ流路壁が存在しない。このマイクロ流路装置を第１方向に沿ってチップ表面に被覆し、その後、マイクロ流路内に所定の溶液、例えば、バーコード核酸を含む溶液を導入する。図２の左図の上方は、溶液の導入を協力するための例示的な装置、例えば、マイクロ流路の出口に設けられる負圧を使用した真空吸引装置を示す。図２における右図は、各マイクロ流路に、入口を通して異なるバーコード配列を含むバーコード核酸（図面におけるバーコード核酸１－ｎ）を導入することを示す。本発明の別の態様では、前記各マイクロ流路に導入されるバーコード核酸のバーコード配列は、既知又は所定のヌクレオチド配列を有する。

ステップ３：ステップ２におけるマイクロ流路を取り外し、もう１群の平行に設けられた複数のマイクロ流路により第２群のバーコード核酸（複数種の第２バーコード核酸を含む。各種の第２バーコード核酸は、異なるバーコード配列（図面におけるＢａｒｃｏｄｅ Ｂ）を有する）を第１バーコードストリップの方向と異なる第２方向（通常、第１方向に垂直な方向）に沿ってチップ表面と接触させ、複数本の第２バーコードストリップを形成する。ここで、各第２バーコードストリップに固定された第２バーコード核酸は、異なる第２バーコード配列を有する。

第１バーコード核酸と第２バーコード核酸とが結合反応を発生可能な条件下で、前記複数本の第１バーコードストリップと前記複数本の第２バーコードストリップとが交差したチップ表面において第２バーコード核酸と第１バーコード核酸とを結合してプローブを形成する。

ステップ４：ステップ３におけるマイクロ流路を取り外し、表面にプローブアレイを有するバイオチップを得る。前記プローブアレイ上の各交差点は、前記複数本の第１バーコードストリップと前記複数本の第２バーコードストリップとが交差した位置に対応する。各交差点は、１種のプローブ分子を有し、第１バーコード配列及び第２バーコード配列を含む。各交差点が有するプローブ分子に含まれる第１バーコード配列と第２バーコード配列の組み合わせは、互いに異なる。本発明の一態様では、前記各マイクロ流路に導入されるバーコード核酸の第１バーコード配列及び第２バーコード配列は、既知又は所定のものであるため、各交差点が有するプローブ分子に含まれる第１バーコード配列、第２バーコード配列及びその組み合わせも既知である。これによって、各交差点が具するプローブ分子の第１バーコード配列及び第２バーコード配列に基づいてチップ表面のアレイにおける空間位置を確定することができる。

本発明において、チップは、通常、固体基板を指し、その上で化学、生物、生物物理又は生物化学的のプロセスを実施することができる。チップは、チップ上に発生する化学、生物、生物物理又は生物化学的プロセスに有利するために、通路及びウェル、電極素子、電磁素子などのマイクロ構造又はマイクロスケール構造を有してもよい。チップ表面は、平坦又は不平坦であってもよい。表面が不平坦なチップは、表面に構築された通路又はウェルを含んでもよい。

チップは、任意の適切な材料で作成することができる。チップ材料の例示的なタイプは、ガラス、改質ガラス、機能性ガラス、無機ガラス、マイクロスフェア（不活性粒子及び／又は磁性粒子を含む）、プラスチック、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ、シリカ系材料、カーボン、ファイバー又はファイバー束、上記以外の様々なポリマー、及びマルチウェルマイクロタイタープレートを含む。例示的なプラスチックの具体的なタイプは、アクリル樹脂（ａｃｒｙｌｉｃｓ）、ポリスチレン、スチレンとその他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン及びＴｅｆｌｏｎ^ＴＭを含む。例示的なシリカ系材料の具体的なタイプは、シリコン及び変性シリコンの様々な形式を含む。チップ表面には、通常、生体高分子（核酸、ポリペプチド及び／又は他の重合体を含む）を堆積する必要がある。当業者に知られている様々な方法により、目的生体高分子の付着のためにチップ表面を修飾することができる。

本発明において、製造された前記チップ表面のアレイは、プローブ（又は捕捉プローブと呼ばれる）を有する。プローブとは、目的核酸、例えば、組織サンプルからの核酸の一本鎖ヌクレオチド分子を遺伝子特異的又は標的特異的に識別及び結合するものを指し、特異的なヌクレオチド配列を有し、即ち、標的核酸のヌクレオチド配列に選択的にアニールすることができ、通常、相補的なヌクレオチド配列である。組織試料中の分析物の例は、ゲノムＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、特定のメチル化ＤＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ポリＡ ｍＲＮＡ、断片化ｍＲＮＡ、断片化ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｉｎ ｓｉｔｕ合成されたＰＣＲ産物、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、脂質、炭水化物、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、タンパク質の特定のリン酸化又はアセチル化変異体、ウイルスカプシドタンパク質を含む。捕捉プローブは、遺伝子特異的捕捉プローブであってもよく、資料中の特異的標的ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリッド化する。

本発明において、前記プローブは、バーコード配列を有し、後のハイスループットの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）又は合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）の分析の応用、例えば、ハイスループットのシーケンシング分析に使用される。これらのシーケンシングにおいて、バーコード配列を用いてシーケンシングにより得られた核酸配列の核酸源をマークして同定する。バーコード分子は、生物粒子（例えば、細胞）に由来する核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）をバーコード化してシーケンシングライブラリを生成し、その後、前記シーケンシングライブラリをシーケンシングして複数のシーケンシングリード長を産生する。複数のシーケンシングリード長のうちの一部又は全部は、バーコード配列を含む。これらのシーケンシング応用において、通常、対象中のバーコード化オーバーラップ断片が細胞ゲノムの特定の部分又は全部の少なくとも１Ｘカバー率、少なくとも２Ｘ、少なくとも３Ｘ、少なくとも４Ｘ、少なくとも５Ｘ、少なくとも１０Ｘ、少なくとも２０Ｘ、少なくとも４０Ｘ又はそれ以上のカバー率を構成するまで細胞核酸を増幅する。バーコード化断片が産生されると、それらを適切なシーケンシングシステム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステム）上で直接シーケンシングすることができる。複数の配列上の同じバーコードの存在は、この配列の由来に関する情報を提供することができる。

ポリヌクレオチドシーケンシングでは、独特なバーコード配列に基づいて核酸断片の由来を同定することができ、及び、例えば、シーケンシングされた断片を用いてより大きな配列を組み立てることができる。バーコードにより、シーケンシング過程において単一のポリヌクレオチド断片を同定及び／又は定量化することが可能となる。

本発明において、製造されたプローブには、２つのバーコード配列が含まれる。２つのバーコード配列は、チップ表面のアレイにおけるプローブの位置を特定（それぞれＸ座標及びＹ座標の位置を特定）するのに役立つため、位置タグの作用も有する。プローブ上のバーコード配列は、チップ上のアレイにおける交差点（ｆｅａｔｕｒｅ）に対応することができ、それが識別する組織における細胞（単一の細胞を含む）のこの組織試料における位置を示すこともできる。核酸タグに結合可能な他の分子の例には、抗体、抗原結合ドメイン、タンパク質、ペプチド、受容体、ハプテンなどが含まれる。

本発明において、前記プローブは、１つ又は複数の固有分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。固有分子識別子は、連続した核酸断片又は２つ若しくは複数の不連続な核酸断片であり、それらは、特定の分析物、又は特定の分析物に結合する捕捉プローブのマーカー若しくは識別子として機能する。ＵＭＩは、基本的に生物試料中の分析物の核酸分子とハイブリッド化しない核酸配列である。ＵＭＩは、捕捉プローブの配列内に含まれる約６から約２０又はそれ以上のヌクレオチドであってもよい。

本態様の方法のステップ２において、第１群のバーコード核酸とチップとの固定は、当該技術分野における様々な既知方法により行うことができる。核酸の固定とは、共有結合又は非共有結合によりチップに直接又は間接付着することをいう。本発明の一態様では、固定とは、核酸増幅及び／又はシーケンシングを必要とする反応においてチップに静止又は付着することを指す。例示的な非共有結合は、非特異的な相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用など）又は特異的な相互作用（例えば、親和相互作用、受容体－リガンド相互作用、抗体－エピトープ相互作用、アビジン－ビオチン（Biotin）相互作用、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用、レクチン－炭水化物の相互作用な）を含むが、これらに限定されない。

本態様の方法のステップ３において、第１バーコード核酸と第２バーコード核酸との接続は、当該技術分野における様々な既知方法により行うことができる。例えば、それぞれが別の一本鎖核酸断片（リンカー核酸）の異なる末端の配列に相補的であることにより、結合反応が可能な条件下で３つの核酸断片（第１バーコード核酸、第２バーコード核酸及びリンカー核酸）の組み合わせを形成した後、結合の目的を達成することができる。

本発明の一態様では、前記第１バーコード核酸は、第１バーコード断片を含む。本発明の一態様では、前記第１バーコード核酸は、５'端に後の増幅反応に使用されるプライマー断片（例えば、既知のシーケンシング方法に使用される汎用プライマー配列）を有する。本発明の一態様では、前記第１バーコード核酸は、５'端にチップ表面に結合するための基又は配列を有する。例えば、チップ表面がアルデヒドで修飾された場合、第１バーコード核酸は、５'端にアミノ基を有する。本発明の一態様では、前記第１バーコード核酸は、チップ上で修飾する因子と特異的な相互作用を形成する配位子を有する。例えば、前記因子及び配位子は、それぞれ抗体－エピトープ、アビジン－ビオチン、ストレプトアビジン－ビオチン、レクチン－炭水化物である。

本発明の一態様では、前記第２バーコード核酸は、第２バーコード断片を含む。本発明の一態様では、前記第２バーコード核酸は、３'端に生物試料中の目的を識別、結合するための捕捉断片、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを識別、結合するための断片、例えば、ｍＲＮＡを識別するためのｐｏｌｙ－Ｔ配列を有する。

本発明の一態様では、前記第１バーコード核酸の３'端は、第２バーコード核酸に結合するための第１結合断片（３'結合断片）を有する。本発明の別の態様では、前記第２バーコード核酸の５'端は、第１バーコード核酸に結合するための第２結合断片（５'結合断片）を有する。本発明の別の態様では、前記第１結合断片及び第２結合断片は、それぞれリンカー核酸の一端と相補的であり、結合可能な条件下（例えば、Ｔ４リガーゼ（Ligase）などの存在下）で、第１結合断片及び第２結合断片は、リンカー核酸と組み合わせて、第１バーコード核酸と第２バーコード核酸との結合を達成する。

本発明で提供される方法により製造されたチップは、組織試料、特に、組織薄切片に対して細胞内分子（核酸及びタンパク質を含む）を分析するのに適用できる。例えば、ＰＣＲ、質量分析法、新一代シーケンシング、又はＥＬＩＳＡにより分析してその発現及び空間情報を得ることができる。

「シーケンシング」とは、通常、１種又は複数種のポリヌクレオチド中のヌクレオチド塩基配列を確定する方法及び技術を指す。ポリヌクレオチドは、例えば、核酸分子、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）（その変形又は誘導体（例えば、一本鎖ＤＮＡ）を含む）であってもよい。シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ或Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのシーケンシングシステム（これらに限定されない）などの現在利用可能な様々なシステムにより実行することができる。或いは、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、デジタルＰＣＲ、定量ＰＣＲ、又はリアルタイムＰＣＲ）又は等温増幅によりシーケンシングを実行することができる。このようなシステムは、被験体（例えば、ヒト）の遺伝情報に対応する複数の生の遺伝データを提供することができる。例えば、被験体から提供されるサンプルは、システムにより産生される。いくつかの実施例において、このようなシステムは、シーケンシングリード長（本明細書において、「リード長」とも呼ばれる）を提供する。リード長は、シーケンシングされた核酸分子の配列に対応する一連の核酸塩基を含んでもよい。いくつかの場合、本明細書で提供されるシステム及び方法は、プロテオーム情報と一緒に使用することができる。

本発明で製造されたチップは、生物試料の細胞の核酸情報、特に、生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報の分析に適用される。本発明に適した「組織試料」は、被験体から取得し、固定し、切片して平面である表面に取り付けた組織を含む。組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料、新鮮な組織試料、又は凍結組織試料などであってもよい。本明細書で開示される方法は、組織試料の染色の前後に行うことができる。例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色後、本明細書で提供される方法により組織試料に対して空間分析を行うことができる。方法は、試料の組織学的分析（例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色を使用）の後、組織を空間分析することを含む。組織切片をホルマリンで固定してパラフィンで包埋（ＦＦＰＥ）することは、通常、被験体から取得した組織をホルムアルデヒド（例えば、リン酸緩衝生理食塩水中の３％－５％ホルムアルデヒド）又はＢｏｕｉｎ溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、薄切片にスライスした後、平坦な表面に取り付けること（例えば、顕微鏡スライドガラスでの生検）を含む。

本発明のチップを使用する際に、組織切片をアレイと接触させることを含む。アレイ上のプローブは、組織中の細胞の核酸、特に、ｍＲＮＡを識別、結合することができる。次の分析は、逆転写及び増幅などを含み、ハイスループットの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）又は合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）により分析することができる。

いくつかの実施形態において、組織切片（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片）中の核酸はアレイに転移され、捕捉プローブとハイブリッド化することによりアレイ上に捕捉される。いくつかの実施形態において、捕捉プローブは、汎用の捕捉プローブであってもよく、例えば、核酸シーケンシングライブラリにおけるアダプター領域、又はｍＲＮＡのポリＡ尾部とハイブリッド化する。いくつかの実施形態において、捕捉プローブは、遺伝子特異性捕捉プローブであってもよく、例えば、試料中の特異的に標的とするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリッド化する。

いくつかの実施形態において、組織切片（例えば、ＦＦＰＥ切片）中の核酸をアレイに移し、汎用のアダプターオリゴヌクレオチドの一本鎖に結合することによりアレイに捕捉する。他の実施形態において、チップ上の核酸を組織切片（例えば、ＦＦＰＥ切片）に移してもよい。当該技術分野の既知方法により、チップに結合したプローブを、溶液中で脱落した後にそれと接触する組織上の細胞に入らせることができる。例えば、核酸プローブとチップとの結合箇所に光分解性リンカーなどを加えるか、又はｐＨ感受性リンカーにより核酸プローブをチップに結合した後、溶液のｐＨ値を変化させることで核酸プローブをチップから分離させる。

本発明のチップ及びその使用については、各交差点が有するプローブ分子の第１バーコード配列及び第２バーコード配列に基づいてチップ表面のアレイにおける空間位置を知ることができ、これにより、核酸分子が位置する細胞の前記組織における位置情報を知ることもできる。

本発明で提供されるプローブアレイを有するチップの製造方法によれば、同一の基板上で複数の同じコード領域のアレイを有するチップの並行合成を実現することができる。図３に示すように、必要に応じて、チップ基板の第１方向及び第２方向に複数群の同じの第１バーコードストリップ及び第２バーコードストリップを形成することができる。これによって、対応する交差点に同じの第１バーコード及び第２バーコード配列で定義されるプローブを有する複数のチップが得られる。

本発明の一実施形態において、本発明者は、前記方法のステップ２（即ち、本発明で提供されるアレイを有するバイオチップの製造方法のステップＡ）において、前記第１群のバーコード核酸の核酸をチップ表面に固定する際に、前記第１群のバーコード核酸の核酸とチップ表面（チップ表面全体又は位置が第１群のバーコードと同じのチップ表面部分を含む）に固定された核酸（本明細書において、チップ表面リンカー核酸又はチップ表面リンカーと呼ばれる）とを核酸と核酸の結合反応（例えば、核酸リガーゼ及び前記２つの核酸を結合させる核酸リンカー断片）により結合させることによって、第１群のバーコード核酸のチップへの固定効率が顕著に改善され、チップにおける各プローブアレイの交差点上のプローブの密度が顕著に増加し、均一性が顕著に改善されることを予想外に見出した。この理論にとらわれずに、本発明者は、核酸と核酸との結合反応の効率及び安定性が核酸とチップ表面の他の固定方式（例えば、共有結合など）よりも強いことで、プローブ上の各核酸断片の長さが小さくなり、各断片の結合効率が向上するためであると考えている。そのため、本発明の一実施形態において、ステップＡの前に予備ステップをさらに含む。この予備ステップは、チップ（例えば、スライドガラス）表面（例えば、チップの表面全体）に第１群のバーコード核酸に結合するためのチップ表面リンカー核酸を事前に固定することを含む。チップ表面リンカー核酸は、化学結合によりチップ表面に固定することができる。化学結合は、例えばアミノ－アルデヒド反応などの基結合、共有結合架橋から選択されるいずれか１種である。チップの表面は、表面化学反応によりアミノ、アルデヒド、エポキシ、イソチオシアナト、メルカプト、シランなどの活性化基などで被覆することができる。前記チップ表面リンカー核酸のチップ表面に結合する端（通常、５'端）は、被覆する活性化基と化学結合を形成する基を有する。本発明の別の実施形態において、前記チップ表面リンカー核酸の３'端は、一本鎖結合核酸により第１バーコード核酸に結合するための結合断片を有する。本発明の別の実施形態において、前記第１バーコード核酸の５'端は、一本鎖結合核酸により前記チップ表面リンカー核酸に結合するための結合断片を有し、前記チップ表面リンカー核酸の３'端は、前記一本鎖結合核酸により第１バーコード核酸に結合するための結合断片を有し、前記チップ表面リンカー核酸の３'端の結合断片及び第１バーコード核酸の５'端の結合断片は、それぞれ前記一本鎖結合核酸の両端の配列と逆相補的である。前記第１バーコード核酸の３'端は、一本鎖結合核酸により第２バーコード核酸に結合するための結合断片を有し、前記第２バーコード核酸の５'端は、前記一本鎖結合核酸により第１バーコード核酸に結合するための結合断片を有し、前記第１バーコード核酸の３'端の結合断片及び第２バーコード核酸の５'端の結合断片は、それぞれ前記一本鎖結合核酸の両端の配列と逆相補的である。本発明の別の実施形態において、前記チップ表面リンカー核酸は、５'端に次の増幅反応に使用されるプライマー断片を有し、例えば、既知のシーケンシング方法に使用される汎用のプライマー配列である。

本発明は、生物試料の核酸情報を分析するためのチップをさらに提供する。本発明の一態様では、前記分析生物試料の核酸情報を分析するためのチップは、上記の方法により製造される。本発明の一態様では、前記生物試料の核酸情報を分析するためのチップの表面は、アレイが形成されたプローブを有する。前記プローブアレイは、直行した行と列を含む。前記アレイにおけるプローブは、それぞれ異なる配列を有し、前記プローブの空間位置を示すことができる。本発明の一態様では、前記プローブは、第１バーコード及び第２バーコードを含む。本発明の別の態様では、前記プローブアレイの各行のプローブは、同じ第１バーコードを有し、各列のプローブは、同じ第２バーコードを有する。各行のプローブが有する第１バーコードは、互いに異なり、各列のプローブが有する第２バーコードは、互いに異なる。本発明の一態様では、前記生物試料の核酸情報を分析するためのチップは、その表面全体にチップ表面リンカー核酸を有する。本発明の別の態様では、前記プローブアレイにおける各プローブの５'端は、前記チップ表面リンカー核酸である。本発明の別の態様では、前記プローブアレイにおける各プローブの配列は、５'端から３'端まで前記チップ表面リンカー核酸、第１バーコード、第２バーコード、生物試料中の目的核酸を識別、結合するための捕捉断片を含む。本発明の別の態様では、前記プローブアレイにおける各プローブの配列は、５'端にある増幅反応用のプライマー断片を含む。本発明の別の態様では、前記プローブアレイにおける各プローブの配列は、固有分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。

本発明は、生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報の分析方法をさらに提供する。前記方法は、前記チップのアレイを組織試料と接触させることを含む。本発明に適した「組織試料」は、被験体から取得し、固定し、切片して平面である表面に取り付けた組織を含む。組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料、新鮮な組織試料、又は凍結組織試料などであってもよい。本発明の方法は、組織試料の染色の前後に行うことができる。例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色後、本明細書で提供される方法により組織試料に対して空間分析を行うことができる。方法は、試料の組織学的分析（例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色を使用）の後、組織を空間分析することを含む。組織切片をホルマリンで固定してパラフィンで包埋（ＦＦＰＥ）することは、通常、被験体から取得した組織をホルムアルデヒド（例えば、リン酸緩衝生理食塩水中の３％－５％ホルムアルデヒド）又はＢｏｕｉｎ溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、薄切片にスライスした後、平坦な表面に取り付けること（例えば、顕微鏡スライドガラスでの生検）を含む。本発明の方法では、組織切片をチップ上のプローブアレイと接触させる。アレイ上のプローブは、組織中の細胞の核酸、特に、ｍＲＮＡを識別、結合することができる。次の分析は、逆転写及び増幅などを含み、ハイスループットの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）又は合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）により分析することができる。

実施例２：チップ（表面局所修飾）の製造
図４は、本発明で提供されるバイオチップの製造方法の例示的な実施形態のフローチャートである。

ここで、ガラスシートをチップ基板とする。

ソフトリソグラフィプロセスによりポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて図２に示される平行に設けられた複数のマイクロ流路を含む装置を作製した。マイクロ流路の底部は開口した。

マイクロ流路の装置は、約５０－５００本の平行に設けられたマイクロ流路を含む。前記平行に設けられたマイクロ流路の各マイクロ流路の幅は、約２－２００μｍ、好ましくは約５－５０μｍ、最も好ましくは約５－２５μｍ、例えば約５μｍ、１０μｍ又は５０μｍである。隣接するマイクロ流路間の距離は、約５－４００μｍ、好ましくは約１０－１００μｍ、最も好ましくは約１０－５０μｍ、例えば約２０μｍ、５０μｍ又は１００μｍである。

ＰＬＬ－ＰＥＧ－ビオチンを合成し、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌのＰＬＬ－ＰＥＧ－ビオチン溶液を調製した。

５'端がビオチンで修飾された下記の配列を有する第１群のバーコード核酸を１００本合成した。
５'ビオチン－ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ １２３４５６７８ ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴ－３'
ここで、「１２３４５６７８」は、８つのヌクレオチドを有するバーコード断片を示す。前記８つのヌクレオチドの配列は、既知（指定）のものである。１００本の前記第１群のバーコード核酸の第１バーコードの配列は、互いに異なる。このバーコード断片の５'側のＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴは、次のシーケンシングプロセスにおいて増幅反応に使用されるプライマー断片である。このバーコード断片の３'側のＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴは、第２バーコード断片と結合を形成するための結合断片である。

下記の配列を有する第２群のバーコード核酸を１００本合成した。
５'リン酸化－ＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＧＴＧＡＣＧＣＣＴＴ ８７６５４３２１ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ－３'
ここで、「８７６５４３２１」８つのヌクレオチドを有するバーコード断片を示す。前記８つのヌクレオチドの配列は、既知（指定）のものである。１００本の前記第２群のバーコード核酸の第１バーコードの配列は、互いに異なる。本発明の一態様では、第２群のバーコード核酸中の各バーコード核酸のバーコード断片は、第１群のバーコード核酸中の各バーコード核酸のバーコード断片と同じである。このバーコード断片の５'側のＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＧＴＧＡＣＧＣＣＴＴは、第１バーコード断片と結合を形成するための結合断片である。このバーコード断片の３'側は、ｐｏｌｙＴ ＶＮ配列を有し、ｍＲＮＡとの結合に使用され得る。

第１バーコード核酸と第２バーコード核酸を結合させるためのリンカー核酸を合成した。その配列は、下記の通りである。
５'－ＡＡＧＧＣＧＴＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧ－３'
ＰＤＭＳマイクロ流路装置とガラスシートとを貼り合わせ、流路を密閉した。界面特性に応じて、挟持ツールを用いて流路の頂部と基板であるガラスシートとを圧接して密封性を向上させてもよい。マイクロ流路の一端は、溶液入口であり、他端は、インターフェースを介して真空吸引装置に接続される。

１番目のＰＤＭＳマイクロ流路装置とガラスシートとを貼り合わせ、エタノールを導入して気泡を排除し、さらに、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、その後、流路内に１ｍｇ／ｍｌのＰＬＬ－ＰＥＧ－ビオチン溶液を加え、室温で約３０分間反応させた。消費された反応物は補充されるように低負圧を保持して流体の低速流動を維持した。

反応終了後、ＰＢＳ緩衝液を導入して流路を洗浄し、次に、ストレプトアビジンを導入し、流路が満たされた後、室温で１０分間静置した。反応終了後、流路が被覆する箇所のチップの局所修飾が達成された。

ＰＢＳ緩衝液を導入して洗浄した。洗浄後、マイクロ流路内にビオチン化された第１群のバーコード核酸を導入した。各流路に１５ｕＭの１種の第１バーコード核酸（各流路の第１バーコード核酸は、他の流路の第１バーコード核酸と異なるバーコード配列を有する）を導入した。流路が満たされた後、室温で１０分間静置した。反応終了後、流路が被覆する箇所での第１群のバーコード核酸のチップへの固定が達成され、第１群のバーコードストリップが形成された。

ＰＢＳ緩衝液及び超純水で流路を洗浄し、洗浄した後、マイクロ流路装置と取り外し、チップを室温で乾燥させた。

乾燥後、もう１つのＰＤＭＳマイクロ流路装置を、１番目のＰＤＭＳマイクロ流路装置の流路と直行する方向に沿ってガラスシートと張り合わせた。流路内に緩衝液を導入して流路内のガスを排出した後、１５ｕＭの第２群のバーコード核酸を導入した。各流路に１種の第２バーコード核酸（各流路の第２バーコード核酸は、他の流路の第２バーコード核酸と異なるバーコード配列を有する）、リンカー核酸及びＴ４リガーゼを導入した。流路を満たした後、室温で３０分間静置した。

結合反応が終了した後、緩衝液を導入し、超純水で流路を洗浄し、その後、流路を取り外し、基板を乾燥させた。これによって、チップ製造が完成した。

実施例３：チップ（表面完全修飾）の製造
図５は、本発明で提供されるバイオチップの製造方法の別の例示的な実施形態のフローチャートである。

まず、ガラスシートをチップ基板とし、表面化学反応により、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、イソチオシアネート基、メルカプト基、シラン基などの活性化基などでチップの表面を修飾した。

本実施例において、購入された光学エポキシ修飾ガラスシート（Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（登録商標） ＳｌｉｄｅＥ）をチップ基板とした。

５'端がアミノ基で修飾された下記の配列を有する第１群のバーコード核酸を１００本合成した。
５'アミノ－ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ １２３４５６７８ ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴ－３'
「１２３４５６７８」は、８つのヌクレオチドを有するバーコード断片を示し、前記８つのヌクレオチドの配列は、既知（指定）のものである。前記１００本の第１群のバーコード核酸の前記バーコード断片（第１バーコードと呼ばれる）の配列は、互いに異なり、かつ各本の第１群のバーコード核酸の第１バーコードの配列は、既知（指定）のものである。下線付きのＴ塩基は、ＦＩＴＣ修飾である。本実施例において、バーコード断片を蛍光修飾及び生産検出する蛍光信号を用いてチップ合成におけるバーコード断片を加える各ステップに対して観察又は生産品質管理を行った。他の実施形態において、バーコード断片を蛍光修飾しなくてもよい。

下記の配列を有する第２群のバーコード核酸を１００本合成した。
５'リン酸化－ＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＧＴＧＡＣＧＣＣＴＴ ８７６５４３２１ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ－３'
「８７６５４３２１」は、８つのヌクレオチドを有するバーコード断片を示し、前記８つのヌクレオチドの配列は、既知（指定）のものである。前記１００本の第２群のバーコード核酸のバーコード断片（第２バーコードと呼ばれる）の配列は、互いに異なり、かつ各本の第２群のバーコード核酸の第２バーコードの配列は、既知（指定）のものである。下線付きのＴ塩基は、Ｃｙ３修飾である。

下記の配列を有するリンカー核酸を１本合成した。
５'－ＣＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＴＣＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴ－３'
実施例２で説明されたＰＤＭＳマイクロ流路装置とガラスシートとを貼り合わせ、流路の密閉を実現した。挟持ツールを用いて流路の頂部と基板であるガラスシートとを圧接して密封性を向上させた。マイクロ流路の一端は、溶液入口であり、他端は、インターフェースにより真空吸引装置に結合した。

１番目のＰＤＭＳマイクロ流路装置とガラスシートとを貼り合わせ、エタノールを導入して気泡を排除し、さらに、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、その後、流路内に１５ｕＭの第１群のバーコード核酸（３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解；ｐＨ８．５）を加えた。各流路に１種の第１バーコード核酸（各流路の第１バーコード核酸は、他の流路の第１バーコード核酸と異なるバーコード配列を有する）を導入した。流路が満たされた後、ガラスシートを３５℃飽和塩化ナトリウムウェットボックスに置き、室温で３時間静置した。反応終了後、１×ＰＢＳ緩衝液で流路を１分間洗浄した。その後、ＰＤＭＳマイクロ流路装置を取り外し、修飾されたガラスシートを順に０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭのＨＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌで洗浄し、その後、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭエタノールアミン、０．１％のＳＤＳを用いて５０℃でブロックした。ブロック終了後、脱イオン水で基板を１分間洗浄した後、窒素ガスを基板に吹き付けて乾燥させた。蛍光顕微鏡で第１バーコード核酸のＦＩＴＣ蛍光信号を観察し、完全に反応したこと、及び流路が被覆した箇所での第１群のバーコード核酸のチップへの固定を実現し、第１群のバーコードストリップが形成されたことを確定した。

もう１つのＰＤＭＳマイクロ流路装置を、１番目のＰＤＭＳマイクロ流路装置の流路と直交する方向に沿ってガラスシートと貼り合わせた。流路内に緩衝液を導入して流路内のガスを排出した後、１５ｕＭの第２群のバーコード核酸を導入した。各流路に１種の第２バーコード核酸（各流路の第２バーコード核酸は、他の流路の第２バーコード核酸と異なるバーコード配列を有する）、リンカー核酸及びＴ４リガーゼを導入した。流路が満たされた後、３７℃で３０分間静置した。

結合反応が終了した後、１×ＰＢＳ緩衝液を導入して、超純水で流路を洗浄した。その後、流路と取り外し、脱イオン水で基板を１分間洗浄し、その後、窒素ガスを基板に吹き付けて乾燥させた。蛍光顕微鏡用いて第２バーコード核酸のＣｙ３蛍光信号を観察し、完全に反応したこと、及び第２バーコード核酸と第１群のバーコード核酸との流路交差点での結合反応が達成され、バーコードアレイが形成されたことを確定し、これによって、チップの製造が完成した。

製造されたチップ上の蛍光信号を測定することにより、各バーコード核酸の結合反応の効率及び製造されたチップのプローブの強度（密度）と均一性を評価した。図６は、顕微鏡（オリンパスｂｘ５３）下での各バーコード核酸の結合反応の観察図を示す。図６に示すように、チップの横方向のアレイでは、第１群のバーコード核酸が持つＦＩＴＣ修飾蛍光信号が示され、チップの縦方向のアレイでは、第２群のバーコード核酸が持つＣｙ３修飾蛍光信号が示される。

実施例４：組織試料の作製と染色
（一）組織ＯＣＴ包埋
新鮮なマウス脳組織サンプルを取り、直ちに事前に冷却したＰＢＳ溶液又は生理食塩水で組織表面を洗浄して残留物を除去し、その後、清潔な吸水紙で液体を吸い取った。組織を包埋槽に置き、組織が完全に被覆されるまでＯＣＴ包埋剤を添加した。組織の周囲に気泡がないことを確認した後、包埋槽を氷上に置き、ＯＣＴが完全に凍結するまで静置した。

（二）凍結切片
凍結切片機の温度について、箱体温度：－２０℃、サンプルヘッド温度：－１０℃に設定した。切片前に凍結組織及び基板を－２０℃凍結切片機の箱体に入れて３０分間以上平衡した後、凍結切片機の箱体中において厚さ１０μｍで凍結切片を行った。

（三）組織固定、ＨＥ染色
作製された組織切片を実施例３で製造されたバーコードアレイ修飾基板に貼り付け、その後、３７℃で１分間インキュベートした。組織が貼り付けられた基板を事前に冷却したメタノール中に完全に浸漬し、－２０℃で３０分間固定した。固定後に、基板を取り出し、裏面の液体を拭き取り、組織切片に５００μｌのイソプロパノールを滴下し、室温で１分間インキュベートした。１分間後、イソプロパノールを除去し、その後、室温で５－１０分間乾燥させた。

１ｍｌヘマトキシリンを加え、それを基板上の組織切片に均一に被覆させ、室温で７分間インキュベートした。ヘマトキシリン試薬を除去し、基板をＲＮａｓｅフリー水中に浸漬して洗浄し、乾燥させた。１ｍｌ青色化液を加えて室温で２分間インキュベートした。青色化液を除去し、基板をＲＮａｓｅフリー水に浸漬して洗浄した後、基板の裏面の液体を拭き取った。１ｍｌエオシン混合物を加えて室温で１分間インキュベートした。

エオシンを除去し、基板をＲＮａｓｅフリー水に浸漬して洗浄し、組織が不透明になるまで乾燥させた。３７℃でガラスシートを５分間インキュベートした後、明視野イメージングを行った。

図７は、ＨＥ染色後の組織画像である。

（四）組織透過化
組織切片が対応するキャビティの内部に位置するように、治具キャビティを製造された組織チップに取り付けた。キャビティに７０ｕｌの透過化酵素（０．１ＮのＨＣｌで希釈した０．１％ペプシン）を加え、３７℃で組織を透過化し、透過化酵素を除去した後、０．１×ＳＳＣで洗浄した。

実施例５：チップにより組織試料切片に対して逆転写反応、ライブラリ構築及びシーケンシングを行った。
実施例４で洗浄されたキャビティに７０μｌ逆転写混合液を加えた。逆転写混合液は、１ｘ第一鎖緩衝液、５ｍＭのＤＴＴ、５００μＭのｄＮＴＰ、０．１９μｇ／μｌのＢＳＡ、１％ＤＭＳＯ、２．５μＭのテンプレートスイッチオリゴ、２０Ｕ／μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ及び２Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む。

テンプレートスイッチオリゴの配列：
５'ビオチン－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴｒＧｒＧｒＧ－３'
テンプレートスイッチオリゴにおいて、最後から１、２及び３番目の塩基はリボグアノシンで修飾された。

テープでキャビティを密封した後、温度制御ボードに置き、５０℃に調整して逆転写を行い、１６時間反応させた。

逆転写終了後、キャビティ中の逆転写混合液を吸い出して捨てた。キャビティに７０μｌ、０．０８ＭのＫＯＨを加え、室温で５分間インキュベートした後、１００ｕｌのＲＮａｓｅフリー水を加えて１回洗浄した。

洗浄後のキャビティにｃＤＮＡ第二鎖合成反応溶液を加えた。第二鎖合成反応溶液は、１×Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ、０．８ｕＭの第二鎖プライマーを含む。テープでキャビティを密封した後、温度制御ボードに置き、約３７℃に調整してｃＤＮＡ第二鎖合成を行い、３０分間反応させた。

第二鎖プライマーの配列：
５'－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴ－３'

反応終了後、キャビティ内の第二鎖合成反応溶液を吸い出して除去した。その後、１００ｕｌのＲＮａｓｅフリー水を加えて１回洗浄した。キャビティに７０μｌ、０．０８ＭのＫＯＨを加え、室温で１０分間インキュベートした。いくつかの新しい１．５ｍｌ遠沈管を用意し、そこに１０μｌのＴｒｉｓ（１Ｍ，ｐＨ７．０）を加えた。キャビティ中の７０μｌ試料を対応するＴｒｉｓ含有遠沈管内に移し、均一に混合してｃＤＮＡの第二鎖を作製した。

ｃＤＮＡ増幅
新しい１．５ｍｌ遠沈管を取って氷上に置き、ＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、１×Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ、０．８μＭのｃＤＮＡフォワードプライマー、０．８μＭのｃＤＮＡリバースプライマー、３５μｌのｃＤＮＡテンプレートを含み、総体積は１００μｌである。以下のスキームに従ってｃＤＮＡ増幅を行った
ｃＤＮＡ フォワードプライマーの配列：
５'－ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ－３'
ｃＤＮＡ リバースプライマーの配列：
５'－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧ－３'
結果として、ＣＴ値は、約１０．６であった。

増幅終了後、ＡＭｐｕｒｅ ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ Ｂｅａｄｓにより増幅産物を精製した。

増幅産物に対してライブラリ構築／シーケンシングを行った。

以上の説明は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を制限するものではない。本発明の思想及び原則内になされる全ての修正、同等置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

Claims (13)

1. 以下のステップＡからステップＣを含む、アレイを有するバイオチップの製造方法であって、
   ステップＡ：平行に設けられた複数のマイクロ流路により、第１群のバーコード核酸をチップ表面に固定し、第１方向の複数本の第１バーコードストリップを形成し、前記第１群のバーコード核酸は、異なるバーコード配列を有する複数種の第１バーコード核酸を含み、各本の第１バーコードストリップには、１種の第１バーコード核酸が固定され、かつ各条の第１バーコードストリップに固定される第１バーコード核酸は、異なるバーコード配列を有し、
   ステップＢ：平行に設けられた複数のマイクロ流路により、第２群のバーコード核酸を、第２方向に沿ってチップ表面の第１方向を有する前記複数本の第１バーコードストリップに加え、複数本の第２バーコードストリップを形成し、前記第２群のバーコード核酸は、異なるバーコード配列を有する複数種の第２バーコード核酸を含み、各本の第２バーコードストリップは、１種の第２バーコード核酸を有し、かつ各本の第２バーコードストリップ上の第２バーコード核酸は、異なるバーコード配列を有し、
   ステップＣ：第１バーコード核酸と第２バーコード核酸とが結合反応を発生する条件下で、前記複数本の第１バーコードストリップと前記複数本の第２バーコードストリップとが交差したチップ表面で第２バーコード核酸と第１バーコード核酸とを結合させ、プローブを形成し、前記プローブは、アレイの交差点を構成し、各交差点は、配列が互いに異なるプローブを有する、方法。
2. 平行に設けられた複数のマイクロ流路を有するマイクロ流路装置により、前記第１群のバーコード核酸又は第２群のバーコード核酸をチップ表面に輸送して固定し、前記マイクロ流路のチップ表面と接触する面は、溶液又は溶液中の核酸が通過可能であり、前記マイクロ流路装置の各本のマイクロ流路に異なるバーコード配列を含む第１群のバーコード核酸又は第２群のバーコード核酸を加える、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１群のバーコード核酸における第１バーコード核酸は、第１バーコード断片を含み、かつ５'端に増幅反応のためのプライマー断片を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１群のバーコード核酸における第１バーコード核酸は、５'端に、チップ表面に結合するための基を有する、請求項３に記載の方法。
5. 前記第２群のバーコード核酸における第２バーコード核酸は、３'端に、生物試料中の目的核酸を識別、結合するためのプローブ断片（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを識別、結合する断片、例えばｐｏｌｙ－Ｔ配列）及び第２バーコード断片を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記第２群のバーコード核酸における第２バーコード核酸は、固有分子識別子（ＵＭＩ）をさらに有する、請求項５に記載の方法。
7. 前記第１バーコード核酸の３'端は、１つの一本鎖結合核酸により第２バーコード核酸に結合するための第１結合断片を有し、前記第２バーコード核酸の５'端は、前記一本鎖結合核酸により第１バーコード核酸に結合するための第２結合断片を有し、前記第１結合断片及び第２結合断片は、それぞれ前記一本鎖結合核酸の両端の配列と逆相補的である、請求項１に記載の方法。
8. ステップＣで形成されたプローブは、３'端にある生物試料中の目的核酸を識別、結合するための捕捉断片、及び第１バーコード断片と第２バーコード断片を含み、好ましくは、前記プローブは、５'端に増幅反応のためのプライマー断片をさらに有する、請求項１に記載の方法。
9. 前記第１群のバーコード核酸における各種の第１バーコード核酸のバーコード断片の配列及び前記第２群のバーコード核酸における各種の第２バーコード核酸のバーコード断片の配列は、指定のものである、請求項１に記載の方法。
10. ステップＡ又はＢにおいて、流路内の核酸濃度は、約０．１－１００ｕＭ、例えば、約１１－２０ｕＭである、請求項１に記載の方法。
11. ステップＡにおいて、前記第１群のバーコード核酸の核酸は、化学結合によりチップ表面に固定され、前記化学結合は、例えば、アミノ－アルデヒド反応、静電吸着、共有結合架橋から選択されるいずれか１種である、請求項１に記載の方法。
12. ステップＡ及びステップＢにおいて、前記平行に設けられたマイクロ流路の各本のマイクロ流路は、幅が約２－２００μｍ、好ましくは約５－５０μｍ、最も好ましくは約５－２５μｍ、例えば約５μｍ、１０μｍ又は５０μｍであり、
    前記平行に設けられたマイクロ流路は、隣接するマイクロ流路間の距離が約５－４００μｍ、好ましくは約１０－１００μｍ、最も好ましくは約１０－５０μｍ、例えば約２０μｍ、５０μｍ又は１００μｍである、請求項１に記載の方法。
13. 請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により製造されたアレイを有するバイオチップを用いて生物組織試料の空間トランスクリプトーム情報を解析する方法であって、
    前記チップのアレイを組織試料と接触させ、アレイ上のプローブは組織中の細胞の核酸、特に、ｍＲＮＡを識別、結合し、その後、逆転写及び増幅などの反応を行い、選択的に、ハイスループットの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）又は合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）により、得られた核酸をさらに解析することを含む、方法。