CN113604547A

CN113604547A - 一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法

Info

Publication number: CN113604547A
Application number: CN202110899807.3A
Authority: CN
Inventors: 张俊虎; 梁重阳; 于年祚; 金正洋; 杨柏
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-08-06
Also published as: WO2023011628A1; CN113604547B

Abstract

本发明适用于一种组织样本的高分辨率空间组学检测装置、系统和方法，提供了一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测的装置、系统和方法，分别包含：一种带有可容纳微载体的微井反应室阵列的玻片，一种修饰核酸分子标识符的方法和一种在捕获组织样本空间组学信息过程中降低组学信息交叉污染的方法。采用本公开的空间组学检测方法，显著提高了空间组学检测的分辨率，降低了检测成本，同时从根本上降低了空间组学信息的交叉污染。

Description

一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法

技术领域

本发明主要涉及一种组织样本的高分辨率空间组学检测装置、系统和方法，尤其涉及一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法。

背景技术

人体组织是由数万亿个细胞组成的高度复杂的系统，它们在种类、时间和空间上各不相同，比如哺乳动物大脑不同区域的组织具有不同的功能和细胞类型，此时组织的空间异质性检测显得尤其重要。空间组学是指在组织切片上完成，保留样本空间信息的组学研究。空间组学可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路，完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间组学完成了病理数字化结合病理影像化的技术革新，对于诊断标志物、耐药位点以及靶向药物的研发，免疫治疗等新兴领域都具有重要作用。

空间组学检测方法主要可以分为四种，分别为结合计算策略和组学实验的空间重构法、基于激光显微切割的直接测量法、基于荧光探针及图像处理的原位组学法和基于寡核苷酸空间条形码的原位捕获技术。

空间重构法通过整合组织中单细胞转录组数据获取细胞的内在基因表达趋势及细胞之间的联系，但其只能呈现空间趋势或特定组织的总体布局。基于LCM的空间组学技术可以实现单细胞分辨率的组学测序，然而该技术检测通量较低，适用于局部组织空间组学检测。基于荧光探针和图像处理的原位组学法包括原位测序(in situ sequencing，ISS)和原位杂交(in situ hybridization，ISH)两种方式，这些方法在检测分辨率方面有突出的表现，可以实现亚细胞分辨率水平的空间组学测试，然而此类方法对检测技术要求高，需借助高灵敏度的单分子荧光成像系统，并且检测需要经历复杂的单分子杂交和图像分析过程，这显著增加了空间组学测试的成本和时间，目前仍然停留在实验室应用范围。

基于寡核苷酸空间条形码的原位捕获技术主要包含采用荧光解码的微球组装技术和10×Genomics公司的喷墨点样方法。前者将修饰有随机编码序列的微球紧密堆积于玻片表面，采用荧光解码技术实现微球序列的解码和定位，这种方式虽然提高了捕获序列的空间编码分辨率，但仍依赖于复杂且昂贵的单分子荧光成像系统，且该方法的寡核苷酸捕获效率较低，难以实现高密度序列的空间组学检测。目前，使用最为广泛的空间组学测试方法为10×Genomics公司的Visium产品，该产品采用喷墨点样方法在玻片表面制备了高通量的寡核苷酸捕获序列，当组织样品贴附于该玻片表面上后，对组织进行透化处理，在此过程中组织样本的待测序列被寡核苷酸序列原位捕获，经过反转录及第二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)后，实现了组织样品空间组学测序。该方法与前几种方法相比具有测序成本低、时效高、易操作等优势，目前，基于该方法的10×Visium产品已成功商品化，其应用范围已涉及多个重要研究领域。

然而，10×Visium仍有几个重要问题亟待解决：第一，玻片表面的寡核酸序列阵列是采用喷墨点样技术制备的，目前该技术在玻片上所制备阵列尺寸的最高分辨率为55μm，每个序列点阵对应十几至数十个细胞的空间组学信息，这限制了其在组织样本中单细胞空间组学分析及细胞间相互作用机制的探究，也可能导致重要信息的遗漏；第二，采用喷墨点样方法制备寡核酸序列阵列时会出现点样不均一的现象，导致寡核苷酸序列区域之间的修饰效果产生差别，甚至会出现漏点的情况，即目标区域内没有被点上样品。第三，采用该产品进行序列抓捕过程时，透化液在促使组织样本中序列渗出的同时也使序列发生横向扩散，导致组织空间序列信息发生交叉污染，特别是在高分辨率空间组学测序过程中，这种现象尤为严重。第四，这种方式需要对阵列中每个位置的寡核苷酸捕获序列分别进行全长合成，而大批量的寡核苷酸合成增加了该产品的成本和设计复杂程度。

可见，传统技术的缺陷和局限性是亟待优化和解决的，这也是行业的共同诉求和普遍共识。因此，开发出一种高分辨率、低成本、交叉污染少、易操作的组织样本空间组学检测方法是尤为重要的。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，旨在开发出一种高分辨率、低成本、交叉污染少、易操作的组织样本空间组学检测方法。

第一方面，本公开提供了一种带有可容纳微载体的微井反应室阵列的玻片。

具体地，构建包含带有微井阵列的玻片，将微载体分散于微井阵列中，每个微井和其中的微载体构成微反应室，将分子标识符转移至微井反应室中，分子标识符连接于微载体或微井表面，采用该套件进行组织的空间组学研究。

可选地，所述套件中玻片的材质包含任何可以用于制备形貌结构的材料，例如，玻璃、硅、二氧化硅、聚合物。

可选地，所述微井反应室的制备方法包括任何可以构建形貌结构的方法。例如，通过自下而上方法在玻片内部刻蚀出凹陷形貌、通过自下而上方法在玻片上表面生长出凹陷形貌或通过将带有微井阵列的基片、多孔膜覆盖于玻片表面而形成凹陷形貌。

可选地，所述微井形状包含规则和不规则的三维形貌结构，例如，圆柱、圆台、方柱形貌结构。

可选地，所述微井反应室内容积范围为0.1fm³-1 cm³，优选地，微井反应室体积为10μm³。

可选地，所述微井反应室阵列的排布包含规则和不规则排布的阵列，优选地，微井反应室阵列的排布为方阵阵列。

可选地，所述微井反应室阵列中的每个微井中至少包含1个微载体。例如，微井可包含至少2、至少5、至少10或至少100个微载体。

可选地，所述微井反应室阵列至少包含1个微井。例如，微井阵列可包含至少10、至少100、至少1000或至少10000个微井。

可选地，所述玻片至少包含1个微井反应室阵列。例如，玻片可包含至少2、至少10、至少1000或至少1000个微井反应室阵列。

可选地，所述微载体为可连接分子标识符的微珠、凝胶或聚合物，也包含本领域技术人员所知的任何可连接分子标识符的固相或液相载体及可生成微载体的任何材料。

可选地，所述将分子标识符连接于微载体的连接部位，包含微载体的内部、表面以及任何其他可与分子标识符连接的部位。

可选地，所述将分子标识符转移至微井反应室阵列中的方法包含直接或间接添加方法，例如采用喷墨点样、接触式印刷方式将分子标识符转移到微井反应室中。

可选地，所述的分子标识符的种类包含核酸序列、蛋白分子以及其他生物分子，本公开对核酸分子标识符的分析、检测同样适用于蛋白、多糖分子标识符，即包含采用本公开方法进行蛋白、多糖分子的捕获、分析、检测。

可选地，所述的转入至微井反应室中的分子标识符可以是互不相同的分子标识符。

可选地，本公开的方法中包含将已连接分子标识符的微载体分散于微井阵列中，本公开方法包含将已经连接有分子标识符的微载体通过任何方式转移到微井反应室中，本公开方法包含通过任何方式使本公开微井中的微载体连接有互不相同的分子标识符，也包含将分子标识符连接于微井反应室内部或表面。

第二方面，本公开提供了一种将唯一分子标识符连接于微载体的方法。

具体地，借助微芯片技术，将平行排布的微孔道对准于微井反应室阵列，在孔道中分别通入不同的第一分子标识符，当第一分子标识符与微载体连接后，洗去未连接的标识符，将平行排布微孔道以不同于上述孔道方向的方向重新对准于微井反应室阵列，在孔道中分别通入不同的第二分子标识符，第一分子标识符与第二分子标识符结合，经过延伸、扩增或连接等方式使微载体连接唯一分子标识符。其中，所述的唯一分子标识符与微载体的连接包含通过任何适当的方法连接于本公开所述的微载体上。

其中，所述的第一分子标识符可为核酸序列，即第一核酸分子标识符，该序列由5’至3’方向上包括：通用域、第一定位域、连接域。所述的第二分子标识符可为核酸序列，即第二核酸分子标识符，由3’至5’方向上包括：连接域互补区、第二定位域、分子标记、捕获域前体。所述的唯一分子标识符可为核酸序列，即唯一核酸分子标识符，由5’至3’方向上包括：通用域、第一定位域、连接域、第二定位域、分子标记、捕获域。其中，所述的唯一核酸分子标识符，包含所述第一核酸分子标识符与第二核酸分子标识符互补后的核酸序列，也包含所述互补后核酸序列经过延伸、扩增或连接的核酸序列。所述的“唯一”指的是其不同于其他连接于微载体的核酸分子标识符、与细胞或组织相关的核酸序列以及与本公开相关的核酸序列。

可选地，所述的分子标识符的种类包含核酸序列、蛋白分子以及其他生物分子。

可选地，所述的平行排布微孔道中的孔道数量是1条及以上。例如，平行微孔道可包含至少10、至少100、至少1000或至少10000个平行排布的微孔道。

可选地，所述的平行排布微孔道中的孔道宽度范围为0.1nm-1000μm。例如，所述的平行微孔道宽度可以是1、10、100、1000μm。

可选地，所述的平行排布微孔道中的孔道间的间距宽度范围为0.1nm-1000μm。例如，所述的孔道间距宽度可以是1、10、100、1000μm。

可选地，所述的平行排布微孔道中的液体入口排布包含每个孔道分别连接于独立的液体入口，也包含多个孔道连接于同一液体入口，也包含一个孔道连接于多个液体入口。

可选地，所述的平行排布微孔道中的液体出口排布包含每个孔道分别连接于独立的液体出口，也包含多个孔道连接于同一液体出口或一个孔道连接于多个液体出口。

可选地，所述的分子标识符与微载体之间的连接方法包含通过化学固定法连接于微载体，也包含通过热反应或特定波长的激发光促进连接反应完成的方式。

可选地，所述的微载体与分子标识符的连接方法包含提前将微载体官能化的方法，其中，官能化包含通过化学、物理、生物的方法实现，例如活化微载体内的化学基团或将带活性的官能团掺入微载体结构中进行所述的连接。

可选地，所述的提前将微载体官能化的官能团包含具有反应性的或能够被活化以形成具有反应性官能团的前体，例如经1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的羧酸基团、醛基基团、环氧基、1，4-苯基异硫氰酸异氰酸酯(PDITC)基团等官能团。

可选地，所述的通用域可包含官能团修饰位点和PCR通用扩增起始端，官能团修饰位点包含任何具有反应性的能够和微载体结合的物质，也包含能够被活化以形成反应性官能团的前体。任何合适的序列都可以用作本发明的PCR通用扩增起始端。“合适的序列”的意思是，该序列不会影响组织样本核酸(例如RNA)和捕获域之间的相互作用，同时该序列可以与通用引物互补结合，以用于核酸分子的扩增(例如cDNA)。

可选地，所述的通用PCR扩增起始端序列的长度至少是1个核苷酸，例如，所述的长度可以是2、10、50、100、1000个核苷酸。

可选地，所述的通用域可以含有剪切域，用于将生成的核酸分子标识符从微载体释放，比如poly-U寡核苷酸序列。

可选地，所述的分子标识符的与所述微载体的连接功能可以是通过其固有的化学基团来完成，也可以通过引入基团至分子标识符的方式来完成。

可选地，所述的分子标识符中与微载体的连接方式包含但不限于物理、化学、生物修饰，例如静电结合、氨基修饰、生物素基团修饰、磷酸化修饰、光催化修饰、自由基聚合等。

可选地，在将所述的核酸分子标识符和所述微载体连接后，可以进行一个清洗的步骤。该步骤的目的在于减少核酸分子标识符和所述微载体的非特异性吸附。该步骤可以使用本领域任何已知的方法进行，优选地，可以使用含有表面活性剂、盐等成分的缓冲液。

本公开的方法中，第一定位域也可以被定义为第一特征标识域或第一标签域，可以被看作是该核酸的标签、标识或者名字，通常位于通用域的下游，与通用域相邻，第一定位域之间可以被区分，可以为捕获域所捕获组织或细胞的核酸序列提供空间位置信息(例如，确定被捕获的核酸在组织中的空间位置或来源于某个细胞)，不会对组织或细胞样本的核酸序列的捕获形成干涉，任何合适的序列都可以用作本发明的第一定位域。“合适的序列”的意思是该序列不会影响组织样本核酸(例如RNA)和捕获探针的捕获域之间的相互作用。

可选地，所述的不同的第一标分子识符中的“不同”是指相对于本公开其他连接于微载体的分子标识符以及本公开其他标识符是互不相同的，不同的第一分子标识符可以为组织或细胞中被捕获的组学信息提供空间位置信息(例如，确定被捕获的核酸在组织中的空间位置或来源于某个细胞)；

可选地，所述的通入每一条所述平行排布微孔道的第一分子标识符的第一定位域彼此不同且可以相互区分。

可选地，所述的第一定位域序列的长度至少是1个核苷酸，例如，所述的长度可以是2、10、50、100、1000个核苷酸。

本公开的方法中，第二定位域也可以被定义为第二特征标识域或第二标签域，可以被看作是该核酸的标签、标识或者名字，通常位于通用域的下游，与通用域相邻，第二定位域之间可以被区分，可以为捕获域所捕获组织或细胞的核酸序列提供空间位置信息(例如，确定被捕获的核酸在组织中的空间位置或来源于某个细胞)，不会对组织或细胞样本的核酸序列的捕获形成干涉，任何合适的序列都可以用作本发明的第二定位域。“合适的序列”的意思是该序列不会影响组织样本核酸(例如RNA)和捕获探针的捕获域之间的相互作用。

可选地，所述的不同的第二标分子识符中的“不同”是指相对于本公开其他连接于微载体的分子标识符以及本公开其他标识符是互不相同的，不同的第二分子标识符可以为组织或细胞中被捕获的组学信息提供空间位置信息(例如，确定被捕获的核酸在组织中的空间位置或来源于某个细胞)；

可选地，所述的通入每一条所述平行排布微孔道的第二分子标识符的第二定位域彼此不同且可以相互区分。

可选地，所述的第二定位域序列的长度至少是1个核苷酸，例如，所述的长度可以是2、10、50、100、1000个核苷酸。

本公开的方法中，所述的连接域可以是任何合适的核酸序列，该序列可与连接域互补区按Watson-Crick碱基互补配对原则产生互补。该部分序列不会影响组织样本核酸(例如RNA)和捕获探针的捕获域之间的相互作用以及后续的步骤。

本公开的方法中，所述的连接域互补区可以是任何合适的核酸序列，该序列可与连接域按Watson-Crick碱基互补配对原则产生互补。该部分序列不会影响组织样本核酸(例如RNA)和捕获探针的捕获域之间的相互作用以及后续的步骤。

可选地，所述的连接域和连接域互补区的序列长度至少是1个核苷酸，例如，所述的长度可以是2、10、50、100、1000个核苷酸。

本公开的方法中，所述的分子标记指的是可以提供与核酸分子标识符杂交的核酸种类信息的核酸序列，与同一微载体缀合的寡核苷酸可以包括不同的分子标记。所述的分子标记的核酸序列顺序是唯一的。分子标记也可以被定义为独特分子标签(uniquemolecular identifier，UMI)，分子标记包含用于区分与不同核酸分子标识符杂交的核酸(例如mRNA)的类型。

可选地，所述的分子标记的长度至少是1个核苷酸，例如，所述的长度可以是2、10、50、100、1000个核苷酸。

本公开的方法中，所述的捕获域前体可包含用于形成捕获域的核酸序列。所述的捕获域前体可包含由poly-A序列构成的核酸序列。

可选地，所述的捕获域前体的长度至少是1个核苷酸，例如，所述的长度可以是2、10、50、100、1000个核苷酸。

本公开的方法中，包含将所述的杂交互补后的第一核酸分子标识符和第二核酸分子标识符与反应混合液共同孵育，使微载体产生所述的唯一核酸分子标识符的步骤(图4)，所述的唯一核酸分子标识符由5’至3’方向上包括：通用域、第一定位域、连接域、第二定位域、分子标记、捕获域，也包括：通用域、第一定位域、第二定位域、分子标记、捕获域。所述的反应混合液可以包含任何可以使核酸序列延伸、扩增或连接的成分，例如核苷酸、扩增酶(例如DNA聚合酶)或连接酶(例如T4 DNA连接酶)、缓冲液、超纯水等成分。

可选地，所述的捕获域包含可以捕获核酸序列的核酸序列。

可选地，所述的捕获域可包含随机序列，随机序列可以与poly-T寡核苷酸序列(或poly-T类似物等)结合使用，促进捕获mRNA。

可选地，所述的捕获域可包含完全随机的序列，根据本领域已知的原理，也可以是简并捕获结构域。

可选地，所述的捕获域可包含poly-T寡核苷酸序列，该序列可结合与其互补的序列，例如携带有poly-A序列的核酸(例如mRNA)。捕获域不局限于poly-T寡核苷酸序列，包含在功能上或结构上类似于poly-T寡核苷酸序列的序列，例如poly-U寡核苷酸或由脱氧胸苷类似物等组合的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸保留与poly-A序列结合的功能特性。

可选地，所述的捕获域的序列长度可以至少是1个核苷酸，优选地，至少5、10、15、20、30个核苷酸。

可选地，所述的捕获域可包含能够引导反转录反应的核酸序列，也可包含能生成与已捕获的核酸分子互补的核酸序列。

可选地，本公开的方法中，所述的第一核酸分子标识符、第二核酸分子标识符、唯一核酸分子标识符的功能区域的排列包含但并不局限于本发明中所列举的顺序、位置或内容，上述的分子标识符中的一种或多种功能序列可以以任何合适的顺序或内容排列。

可选地，在通入所述的反应混合液前，可以包含一个预杂交步骤，通过连接域-连接域互补区使所述的第一核酸分子标识符和第二核酸分子标识符按照Watson-Crick碱基互补配对原则产生互补，此步有利于唯一核酸分子标识符的产生。

优选地，在生成所述的唯一核酸分子标识符后，可以进行一个清洗的步骤，该步骤可以对微井反应室内除所述微载体和连接于微载体的唯一核酸分子标识符之外的物质进行清洗。

可选地，可以通过本领域任何已知的方法对唯一核酸分子标识符进行表征，例如，使用荧光标记的标签序列或者测序分析等。

第三方面，本公开提供了一种在捕获组织样本空间组学信息过程中降低组学信息交叉污染的方法。

具体地，在所述的存放微载体的微反应室阵列中引入固相或液相化合物，将组织切片贴附于微井阵列表面，组织样本内嵌于微井中或铺展于微井表面，此时带有特定唯一核酸分子表示的微载体的位置信息与组织的位置一一对应，对组织样本进行成像，在微井表面覆盖多孔膜，用于防止组织样本空间组学信息间的交叉污染。在多孔膜表面添加组织透化液，此时所述的微载体通过唯一核酸分子标识符对限域在微井中组织的核酸序列进行捕获，清洗表面；将反应混合液孵育于微井阵列中，对已捕获组学信息的杂交链进行延伸与合成，使被捕获的核酸序列和唯一核酸分子标识符形成互补双链核酸序列，随后对双链核酸序列进行扩增和建库；回收核酸序列，并对回收的核酸序列进行分析，接下来，根据第一定位域和第二定位域信息，将被分析的源于组织或细胞样本的组学信息按位置信息对应于组织样本的空间位点上，从而得到组织样本的空间组学信息。

本公开所述方法可以用于组织的空间转录组学研究。

具体地，在所述的存放微载体的微反应室阵列中引入固相或液相化合物，将组织切片贴附于微井阵列表面，组织样本内嵌于微井中，在微井表面覆盖多孔膜，用于防止组织样本空间组学信息间的交叉污染，在多孔膜表面添加组织透化液，此时所述的微载体通过唯一核酸分子标识符的捕获域对限域在微井中组织的mRNA进行捕获，清洗表面；将逆转录反应混合液孵育于微井阵列中，对已捕获组学信息的杂交链进行延伸与合成，使被捕获的mRNA与唯一核酸分子标识符形成cDNA，随后对cDNA进行扩增和建库；回收核酸序列，并对回收的核酸序列进行分析，接下来，根据第一定位域和第二定位域信息，将被分析的源于组织或细胞样本的转录组学信息按位置信息对应于组织样本的空间位点上，从而得到组织样本的空间转录信息。

可选地，所述的组织样本内嵌于微井中的方式包含采用任何外力方式或借助微井反应室固有性质将组织样本引入微井中，例如，采用机械力、物理或化学诱导法。

可选地，所述的固相或液相化合物种类包含任何能够将组织切片引入微井中的化合物，包含聚合物、单体、混合物，比如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、干冰、水、石蜡。

可选地，所述的固相或液相化合物添加量体积可以大于、小于或等于微井的容积，优选地，其添加量体积等于微井的容积。

可选地，所述的多孔膜种类包含任何材质的多孔膜，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)多孔膜，聚乙烯多孔膜。

可选地，所述的多孔膜孔径范围为0.1nm-100mm，优选地，其孔径大小应足以使组织透化液渗入，同时可以将所述的微井中组织的核酸序列(例如mRNA)限制在微井中。

可选地，为了方便分析唯一分子标识符对应于组织样本的空间位置，可以使用本领域任何已知的方法对所述的组织样本进行成像，例如光、暗视场、共聚焦成像等。该步骤可以在对组织样本的处理步骤之前或之后进行，例如，在本方法的cDNA生成步骤之前或之后。

可选地，可以使用本领域任何已知的方法对所述的组织样本进行标记，使其能够在成像时被检测。例如组织染色、荧光标记等。

可选地，所述的透化液可包含任何使细胞或组织样本中核酸、蛋白分子释放的液体，例如酶类。

可选地，本公开中降低横向扩散方法的应用范围包含用于捕获组织样本中任何核酸、蛋白、多糖分子，优选为mRNA分子，也包含将所述的方法用于细胞中任何核酸、蛋白、多糖分子，例如，tRNA、rRNA、病毒RNA。

可选地，本公开方法包含在组织透化步骤后将所述微载体从微井反应室阵列回收后进行后续实验的步骤。

在本公开的方法中，包含通过本领域任何已知的方法使所述的唯一核酸分子标识符与被捕获核酸的杂交链延伸成互补双链核酸序列的方法。例如，逆转录反应。通过该方法生成的双链核酸序列可以视为组织样本的被捕获成分的拷贝，反映组织样本所包含的信息，例如转录组信息。

可选地，所述的反应混合液可包含任何可使被捕获的核酸序列(例如mRNA)扩增、延伸或连接的成分，例如，可使寡核苷酸序列逆转录成双链核酸序列(例如cDNA)的逆转录反应混合液。

可选地，所述的捕获域包含可以引发被捕获核酸生成其互补链的序列，此被捕获核酸互补链包含但不局限于在唯一核酸分子标识符的下游生成。

可选地，本公开的方法中，包含在生成所述的互补双链核酸序列后，移除被捕获核酸所在核酸链的步骤，例如mRNA，本步骤可以采用本领域任何已知的方法用于移除已捕获的核酸，例如化学法、物理法、生物法等。

可选地，本公开的方法中，可以在生成所述的互补双链核酸序列后，移除组织切片。该步骤可以使用本领域任何已知的方法进行，例如酶降解法。

可选地，本公开的方法中，在合成所述的互补双链核酸序列前，也可以进行唯一分子标识符的扩增。

本公开的方法中，包含将所述的互补双链核酸序列解旋成寡核苷酸序列并对该序列进行其互补链合成的步骤，该步骤可理解为生成互补双链核酸序列的第二链，其目的是生成唯一核酸分子标识符所捕获核酸的序列信息。

可选地，在生成所述的第二链的反应中，可以使用随机引物，由此，将产生随机长度的核酸片段，该核酸产物可以对应于被捕获序列的信息。

可选地，在生成所述的第二链的反应中，可以使用特定引物，例如模板转换引物，由此将产生完整长度的唯一核酸分子标识符对应片段。

可选地，在生成所述的第二链的反应中，可以使用模板转换法。例如本领域已知的SMART技术。优选地，该步骤可以在本发明所述微载体上原位进行。

可选地，在生成所述的第二链的反应中，使用的聚合酶种类包含与核酸相关的任何酶，例如DNA聚合酶类、RNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶、转录酶、逆转录酶等。

可选地，在生成所述的第二链的反应中，可以引入核酸序列扩增接头，这些序列可以包含与聚合酶链式反应或其他扩增、延伸反应引物结合的位点。

可选地，本公开的方法包含将所述唯一核酸分子标识符或由其与被捕获核酸生成的互补双链核酸序列从微载体回收的步骤。该步骤可以通过本领域任何已知的方法完成，例如酶促剪切释放或高温或盐等方法，目的是破坏所述核酸和微载体间的相互作用。

本公开的方法中，包含对所述第二链(例如cDNA)的数量增加步骤，该步骤可以在所述微载体上进行，也可以在将所述带有被捕获核酸信息的唯一核酸分子标识符或其互补双链核酸序列从微载体回收后进行。该步骤可以产生的核酸互补链的数量应可以用于后续步骤的进行，例如测序分析。

可选地，对所述第二链(例如cDNA)数量增加的方法可以使用本领域任何已知的方法完成，例如聚合酶链式反应。可选地，聚合酶链式反应的模板可以是含有唯一核酸分子标识符的互补双链核酸序列，该反应的产物也可以作为后续反应的模板。

本公开的方法中，包含对含有所述被捕获序列信息的目标序列核酸的文库建立步骤，该步骤可以使用本领域任何已知的方法进行，优选地，可以通过聚合酶链式反应在所述第二链扩增产物中引入Illumina引物序列后进行核酸文库建立。

可选地，在建立核酸文库之前，可以将目标序列进行片段化，该步骤有利于后续的建库以及测序分析，该步骤可以使用本领域任何已知的方法进行，例如物理法、化学法或生物法等。

可选地，在建立核酸文库之前，可以对目标序列进行适当的处理步骤，例如末端修复、加尾等，该步骤应利于核酸文库的建立。该步骤可以使用本领域任何已知的方法进行，例如酶处理。

可选地，在建立所述核酸文库之前，可以对所述第二链的生成反应中引入的引物序列进行切除，该步骤可以使用本领域任何已知的方法进行，例如酶切法。

可选地，在建立核酸文库之前，可以进行cDNA的扩增产物的片段长度筛选步骤。该步骤可以使用本领域任何已知的方法进行，例如核酸序列长度分析等。

可选地，在建立核酸文库之前，可以在目标序列中引入特定序列，例如测序引物结合位点序列等，该步骤可以增加核酸文库分析结果的准确性。

可选地，在建立核酸文库之前，可以采用适当的DNA分子纯化方法，以移除可能引入的干扰物，例如非目标核酸序列、核苷酸、盐等，这有利于分析结果的可靠性。该步骤可以使用本领域任何已知的方法，例如磁珠分离法。

可选地，对含有所述被捕获序列信息的目标序列进行扩增和建库时，扩增和建库方法包含任何已知的核酸扩增和建库方法，例如增加测序或扩增接头，添加扩增反应混合液，对目标序列进行建库和扩增。

本公开的方法中，包含对所述核酸文库的分析步骤。可以使用本领域已知的任何方法来分析目标核酸序列。一般来说，此类方法是序列特异性方法，比如，该方法可以使用针对被分析序列的引物，采用扩增反应类型的序列分析方法。可选地，扩增反应可以是线性或非线性反应，例如聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增反应(例如RPA)等。

可选地，所述的分析步骤可以包含对所述唯一分子标识符的分析，由此可以获取被分析序列的空间定位。

可选地，所述的互补双链核酸序列及其第二链中的每条链都可以用于分析，可以采用第一代测序，第二代测序、第三代测序等分析过程。可选地，本发明的序列分析方法可以基于任何本领域已知的手段，例如，Illumina^TM技术、焦磷酸测序等。

可选地，本公开的方法包含将所述唯一核酸分子标识符或由其与被捕获核酸生成杂交链、互补双链核酸序列以及通过本公开方法转换得到的任何核酸序列从微载体回收、建库、分析的步骤，该步骤可以在所述微载体上进行，也可以在将所述带有被捕获核酸信息的唯一核酸分子标识符或其互补双链核酸序列回收后进行。

可选地，在所述的序列分析之前，可以采用适当的DNA分子纯化方法，以移除可能引入样本的干扰物，例如非目标核酸序列、核苷酸、盐，这有利于增加结果的可信性。该步骤可以使用本领域任何已知的方法，例如磁珠分离法。

可选地，本公开的方法中的组织样本可以是任何生物体的组织样本或生物体空间结构，例如，植物、动物、真菌。

可选地，本公开的方法中的组织样本可以是任何类型或种类的组织样本，例如死体或活体组织样本、新鲜的组织都可以作为本公开的组织样本。本公开的组织样本也包含任何经过处理或未处理的组织样本，例如固定的、未固定的、冷冻的、常温的、石蜡的组织样本。在本发明的一个实施例中，使用了冷冻的组织样本，通过OCT化合物进行了组织的包埋，该化合物利于组织结构的保持、也利于组织的切片处理，同时可以与后续的步骤兼容。

可选地，本公开的方法包含将本公开方法用于获取或检索个体细胞独有或独立的组学信息。

可选地，本公开的方法包含将该方法用于样本中任何细胞或任何细胞类型的组学分析，例如，血液样本。也就是说，本公开的方法可适用的细胞不仅仅是组织细胞，也可以单细胞(例如，从未固定组织中分离的细胞)。所述的单细胞包含固定在组织的某个位置上的细胞，也包含引入微井的单细胞悬液。

可选地，本公开的方法包含将该方法用于任何生物样本中组学信息的捕获和检测，例如用于捕获细胞、组织、病毒样本中DNA、mRNA、蛋白分子、tRNA、rRNA、病毒RNA。

可选地，本公开的方法中包含将本公开方法用于任何种类的生物组学测试和分析，例如转录组学、基因组学、表观基因组学、蛋白质组学、代谢组学。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1.本发明制备过程简单，通过两次微芯片操作即可制备出高通量的具有空间定位域的核酸分子标识符阵列，有效地降低了制备芯片所需的仪器成本。

2.本发明的制备方法避免了捕获探针的全长合成，减少了所需捕获探针的使用种类，有效地降低了制备空间定位域所需的材料成本。

3.本发明制备的唯一核酸分子标识符阵列具有较高的分辨率，阵列线宽范围为0.1nm-1000μm，可以达到单细胞分辨率。

4.本发明所制备的唯一核酸分子标识符阵列修饰密度高，显著提升了组织样本中空间组学信息获取的完整性。

5.本发明所制备的唯一核酸分子标识符阵列的修饰区域效果均一，保证了组织样本空间组学信息获取的均一性。

6.本发明有效降低了组织样本中空间组学信息的横向扩散，为高分辨率空间组学信息捕获打下基础。

7.本方法扩展应用于基因组学、表观基因组学、蛋白质组学、代谢组学，例如用于组织细胞的突变或表观遗传的分析。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法的用于分散微载体的微井阵列图；

图2为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的微井反应室阵列图；

图3为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的用于在微载体上修饰核酸分子标识符的微芯片孔道图；

图4为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的连接有唯一核酸分子标识符微载体的制备图，*表示互补序列；

图5为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的通过荧光标记的poly-A探针对连接有唯一核酸分子标识符的微珠质检图；

图6为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中将装有微载体的微井反应室阵列用于高分辨率空间转录组分析的整体概念；

图7为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的cDNA扩增产物的浓度测定图；

图8为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的cDNA扩增产物质控图；

图9为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的核酸文库浓度测定图；

图10为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的核酸文库质控图。

图11为本发明实施例提供的一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法中的核酸文库分析图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1：微井玻片制备

将带有均匀铬膜和光刻胶层的玻璃板置于由透明阵列的掩膜版下紫外灯曝光10s，再将基片置于显影液中浸泡30s，得到旋有铬层的图案化光刻胶阵列玻片表面；之后置于铬刻蚀液中浸泡5min，再将玻片置于玻璃刻蚀液(质量比HF：HNO₃：NH₄F：H₂O＝25:23.5:9.35:450)中浸泡80min得到图案化微井阵列玻片(图1)，其中微井高度为40μm，直径为30μm，微井中心间距为60μm。

实施例2：微反应室制备

将直径为5-7μm的微珠载体悬液铺展于微井玻片表面，静置5min，微珠沉降于微井阵列中，清洗微井玻片表面，洗去微井阵列外的微珠，得到含有微珠的微井反应室阵列(图2)。

实施例3：微芯片的制备

将带有均匀铬膜和光刻胶层的玻璃板置于平行排布孔道的掩膜版下紫外灯曝光10s，再将基片置于显影液中浸泡30s，得到旋有铬层的微孔道图案的光刻胶玻璃表面；之后置于铬刻蚀液中浸泡5min，再将表面置于玻璃刻蚀液(质量比HF：HNO₃：NH₄F：H₂O＝25:23.5:9.35:450)中浸泡40min得到微孔道图案的形貌结构的玻璃孔道模具；将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚体与固化剂按质量比10:1的比例混合均匀，真空脱气30min后，倾倒至所述的玻璃模具表面，置于温度为60℃的烘箱中，固化10h，将其揭起便得到了平行排布的PDMS微流体孔道(图3)，其孔道高度为20μm，宽度为40μm，孔道中心间距为60μm。显而易见，微芯片的制备成本远低于喷墨点样机，因此采用微芯片式的修饰方法，明显降低了唯一核酸分子标识符修饰的仪器成本。

实施例4：连接有唯一核酸分子标识符微珠的制备及表征

将粒径为5-7μm的微珠分散到含有10000个可容纳微载体的微井阵列中，进而形成10000个微反应室，除去微井阵列以外的微珠，将平行排布的100条微孔道对准于微井反应室阵列。在每个孔道中分别通入第一核酸分子标识符溶液，孔道间的第一核酸分子标识符互不相同(部分序列见表1)，使微珠连接上第一核酸分子标识符。

表1：部分第一核酸分子标识符序列信息

在孔道中通入清洗液，洗去未连接的第一核酸分子标识符。将平行排布的100条微孔道以垂直于上述孔道方向的方向重新对准于微井反应室阵列，在孔道中通入第二核酸分子标识符，孔道间的第二核酸分子标识符互不相同(部分序列见表2)，通过连接域互补区使第二核酸分子标识符与第一核酸分子标识符的连接域产生杂交互补，再通入清洗液洗去未杂交的第二核酸分子标识符。在此实施方式中，采用200种核酸分子标识符即实现了10000个不同的唯一核酸分子标识符微珠阵列的修饰，这明显降低了现有技术中喷墨打印修饰方法中序列全长合成所需的试剂成本。

在所述的微孔道中通入扩增反应混合液，在恒定温度下孵育，以产生所述的唯一核酸分子标识符，其由5’至3’端的构成为：通用域、第一定位域、连接域、第二定位域、分子标记、捕获域。在孔道中通入清洗液对微井反应室内微珠进行清洗，即得到连接有唯一核酸分子标识符的微珠(图4)。在微井反应室阵列表面滴加能与唯一核酸分子标识符产生杂交互补的荧光标记核酸序列A20(见表3)，采用荧光显微镜进行表征，修饰结果显示微珠已经连接上唯一核酸分子标识符(图5)，对唯一核酸分子标识符进行扩增测序，结果同样表明了唯一核酸分子标识符组成正确，含有所述的定位域、分子标记及捕获域。唯一核酸分子标识符的修饰分辨率为30μm。在一些实施方式中，唯一核酸分子标识符的修饰分辨率明显高于现有的喷墨打印修饰方法。此外，在此实施方式中，唯一核酸分子标识符阵列制备密度高，间距为30μm，低于现有技术修饰方法，显著提升了组织样本中空间组学信息获取的完整性。在此实施方式中，本发明所制备的唯一核酸分子标识符阵列的修饰效果均一，保证了组织样本空间组学信息获取的均一性。

表2：部分第二核酸分子标识符序列信息

序列名称	序列信息5’→3’
		P2-1	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNATATTGTGGCAGGCCAGT
P2-2	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNCTAGGTGTGCAGGCCAGT
		P2-3	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTTGCGTTCGCAGGCCAGT
P2-4	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNGTACGACTGCAGGCCAGT
		P2-5	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNCTGTATTTGCAGGCCAGT
P2-6	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTCTGCGCCGCAGGCCAGT
		P2-7	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNCGATCATTGCAGGCCAGT
P2-8	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTTCTCTTGGCAGGCCAGT
		P2-9	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTAGAGATCGCAGGCCAGT
P2-10	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNCGCGTGTTGCAGGCCAGT
		P2-11	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTAACTACCGCAGGCCAGT
P2-12	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNCCCTCCTGGCAGGCCAGT
		P2-13	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTAAGCGGAGCAGGCCAGT
P2-14	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTACTAGCAGCAGGCCAGT
		P2-15	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNATCGAAGTGCAGGCCAGT
P2-16	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTCGATACAGCAGGCCAGT
		P2-17	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTAAGGAGCGCAGGCCAGT
P2-18	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTGTGTGCCGCAGGCCAGT
		P2-19	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNTGTCTGAGGCAGGCCAGT
P2-20	NBAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNCAACACGTGCAGGCCAGT

实施例5：组织样本处理

将盛有异戊烷的容器和采集器具放置在液氮中预冷10min，然后将新鲜的小鼠脑组织浸没于异戊烷中，直至组织完全冷冻，然后转移至-80℃储存。使用预冷的器具将冷冻的小鼠脑组织放入预冷的OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇混合物)上，用OCT将组织暴露的表面覆盖，在确认组织周围没有气泡后立即将其放在干冰上，直至OCT完全冻结。将组织剪裁至合适大小并立即进行冷冻切片(或转移至-80℃密封保存)。

将冷冻切片机提前预冷，切割厚度调整至10μm，然后将微井反应室阵列放置在冷冻切片机中预冷，并将OCT冻结的组织样本放置在微井反应室阵列上，切取厚度为10μm的组织切片。

实施例6：组织样本染色

将微井反应室阵列放置在预热的PCR仪上，切片面向上，在37℃的条件下孵育1min。用预冷的甲醇在-20℃的条件下固定组织切片30min后，清除阵列表面的甲醇，并用异丙醇室温孵育切片样本1min并晾干。滴加苏木精染色液覆盖切片样本，孵育5min以上，不超过10min，弃掉染色液并充分清洗微井反应室阵列。滴加返蓝染色液覆盖切片样本，孵育2min，弃掉染色液并充分清洗微井反应室阵列。滴加伊红染色液(伊红：三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝6.0)＝1:9)覆盖切片样本，孵育1min，弃掉染色液并充分清洗微井反应室阵列。最后将微井反应室阵列在37℃下孵育5min以上，不超过10min。使用明场显微镜进行拍照，调整曝光时间和拍摄范围使得微井反应室阵列的边界可见。

实施例7：组织透化及cDNA合成

在微井反应室阵列上贴附半透膜(图6)，然后在半透膜上滴加组织透化液(0.1％的胃蛋白酶，0.1M盐酸)，在37℃下孵育30min后移除液体，并添加柠檬酸钠缓冲液至微井反应室阵列进行清洗并移除半透膜及废液。在微井反应室阵列上添加逆转录反应液(含有热启动的逆转录酶及相应缓冲体系、模板转换引物，模板转换引物见表3)，在50℃下孵育1h后，移除逆转录反应液。

在微井反应室阵列上滴加KOH溶液(100mM)，室温孵育3min后移除并加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝8.5)。将缓冲液从微井反应室阵列上移除，加入第二链合成反应液(含有Bst 2.0聚合酶及相应缓冲体系及相应引物，引物序列见表3)，在65℃的条件下孵育30min后移除反应液，并加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝8.5)。再次移除缓冲液，加入KOH溶液(100mM)，室温孵育5min，然后将该溶液转移至无核酸酶污染的EP管中，加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(1M Tris-HCl，pH＝7.2)，低温保存。

实施例8：cDNA扩增

将第二链合成产物和三羟甲基氨基甲烷缓冲液的混合物置于冰上，加入cDNA第二链扩增反应液(Taq酶、dNTP及相应缓冲体系)和引物(引物序列见表3)，充分混合后，进行聚合酶链式反应，条件设置：

步骤1：98℃，3min；

步骤2：98℃，15s；

步骤3：63℃，20s；

步骤4：72℃，60s；

步骤5：转至步骤2，总共21个循环数；

步骤6：72℃，60s；

步骤7：4℃，停止。

产物储存于-20℃条件下备用。

引物信息如表3所示。

实施例9：cDNA扩增产物纯化

使用SPRIselect核酸片段选择试剂盒(贝克曼·库尔特)，将扩增产物与SPRIselect溶液混合，室温静置5min以上，用磁铁分离磁珠，弃掉上清液。向磁珠中加入80％的乙醇溶液，静置30s后用磁铁分离磁珠，弃掉上清，重复两次并彻底去除残留乙醇。加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝8.5)，用移液器吹打后室温静置2min，用磁铁分离磁珠，保留上清液，低温保存。使用自动化电泳系统(安捷伦科技)测定cDNA片段大小分布，使用NanoDrop测定cDNA浓度。

cDNA扩增产物浓度和纯化结果如图7和8所示。对抓捕mRNA后微反应室中的杂交序列进行反转录，将得到的cDNA进行富集和收集，接下来对cDNA的分布和浓度进行测定，检测结果显示，产生300-1000bp的cDNA序列，与预期结果一致。

实施例10：cDNA扩增产物建库

将cDNA的纯化产物转移至冰上，加入预冷的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mMTris-HCl，pH＝8.5)和引物切除液，充分混匀后转移至预先设置为4℃的PCR仪上，之后32℃条件下孵育5min。在反应产物中加入SPRIselect溶液，充分混匀，室温静置5min，用磁铁分离磁珠，上清液转移至新的EP管中，加入SPRIselect溶液，充分混匀，室温静置5min，用磁铁分离磁珠并弃掉上清液。向磁珠中加入80％的乙醇溶液，静置30s后用磁铁分离磁珠，弃掉上清，重复两次并彻底去除残留乙醇。加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝8.5)，用移液器吹打后室温静置2min。取部分上清液，加入cDNA修饰反应液(含有DNA连接酶及相应缓冲体系以及寡核苷酸接头，寡核苷酸接头见表3)，充分混匀，在20℃条件下孵育20min。反应产物与SPRIselect溶液混合，室温静置5min以上，用磁铁分离磁珠，弃掉上清液。向磁珠中加入80％的乙醇溶液，静置30s后用磁铁分离磁珠，弃掉上清，重复两次并彻底去除残留乙醇。加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝8.5)，用移液器吹打后室温静置2min，用磁铁分离磁珠，吸取部分上清液到新的EP管中，加入PCR反应液(Taq酶、dNTP及相应缓冲体系)和Illumina引物(表3)，充分混合后，进行聚合酶链式反应，条件设置：

步骤1：98℃，1min；

步骤2：98℃，20s；

步骤3：63℃，30s；

步骤4：72℃，20s；

步骤5：转至步骤2，总共12个循环数；

步骤6：72℃，60s；

步骤7：4℃，停止。

将核酸文库产物与SPRIselect溶液混合，室温静置5min以上，用磁铁分离磁珠，弃掉上清液。向磁珠中加入80％的乙醇溶液，静置30s后用磁铁分离磁珠，弃掉上清，重复两次并彻底去除残留乙醇。加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝8.5)，用移液器吹打后室温静置2min，用磁铁分离磁珠，保留上清液，低温保存。使用自动化电泳系统(安捷伦科技)测定核酸片段大小分布，使用NanoDrop测定核酸浓度。扩增后核酸文库的浓度和分布如图9和10所示。

相关核酸序列信息如表3所示，扩增后核酸文库的浓度和分布结果如图9和10所示。对微井反应室中源于组织及唯一核酸分子标识符的cDNA进行建库，对建库后的序列分布进行测定，检测结果显示，产生了长度为300-700bp的核酸序列，与预期结果一致。

表3实施例部分相关序列

实施例11：核酸文库分析

选用Novaseq对文库进行测序，对经测序的核酸文库进行序列分析，结合磁珠微载体中核酸分子标识符的序列信息，确定核酸序列的位置信息。通过对靶基因进行匹配来确定目的基因在空间中特定位置的表达信息，通过对目的基因对应的分子标记进行计数来进行目的基因表达的计数定量，此方式可以减小目的基因扩增偏差产生的数据误差。对测序数据进行处理，将每个空间点的唯一核酸分子标识符阵列与组织切片的组织染色图像进行匹配，从而将核酸文库的测序数据在组织切片的空间位置进行可视化。

结果表明可以在核酸文库分析结果中找到所有对应的核酸分子标识符信息，第一定位域、第二定位域及分子标记的序列信息正确，数据质量可以达到分析要求，数据分析结果表明每个微井反应室均能可以捕获到2000个基因以上。nFeature、nCount、mito统计数据质量较好，umap分群结果正确，Snap25、Slc32a1、Slc17a6、Aqp4及Cldn5脑组织典型基因染色结果正确(图11)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，包括，步骤a：装置包含带有微井阵列的玻片，将微载体分散于微井阵列中，每个微井和其中的微载体构成微反应室，其特征在于，还包括：

步骤b：将第一分子标识符转移至微井反应室中，第一分子标识符连接于微载体或微井表面，采用微芯片转移技术将第一分子标识符转移至微井反应室中，具体地，将平行排布的微孔道对准于微井反应室阵列，在孔道中分别通入不同的第一分子标识符，第一分子标识符与微载体连接，第一分子标识符可为核酸序列，即第一核酸分子标识符，该序列由5’至3’方向上可包括：

（i）通用域；

（ii）第一定位域，第一定位域之间彼此不同且可以相互区分，该序列信息与其在孔道中通入的液体位置相对应；

（iii）连接域，该序列用于第一、二核酸分子标识符之间的连接；

步骤c：将第二分子标识符转移至微井反应室中，采用微芯片转移技术将第二分子标识符转移至微井反应室中，具体地，将平行排布微孔道以不同于上述孔道方向的方向重新对准于微井反应室阵列，在孔道中分别通入不同的第二分子标识符，第一分子标识符与第二分子标识符结合，所述的第二分子标识符可为核酸序列，即第二核酸分子标识符，由3’至5’方向上可包括：

a)连接域互补区，可与连接域按Watson-Crick碱基互补配对原则杂交；

b) 第二定位域，第二定位域之间彼此不同且可以相互区分，该序列信息与其在孔道中通入的液体位置相对应；

c)分子标记，用于提供与核酸分子标识符杂交的核酸种类信息以及区分与不同核酸分子标识符杂交的核酸类型，与同一微载体缀合的第二核酸分子标识符可以包括不同的分子标记；

d) 捕获域前体，包含用于形成捕获域的核酸序列；

其中，所述的不同的第一/二核酸分子标识符中的“不同”是指相对于本公开连接于微载体的分子标识符和本公开其他分子标识符是互不相同的，不同的第一/二分子标识符可以为组织或细胞中被捕获的组学信息提供空间位置信息；

步骤d：将所述的杂交互补后的第一分子标识符和第二分子标识符与反应混合液共同孵育，经过延伸、扩增或连接等方式使微载体连接唯一分子标识符，其中，所述的唯一分子标识符与微载体的连接包含通过任何适当的方法连接于本公开所述的微载体上，唯一分子标识符可为核酸序列，即唯一核酸分子标识符，由5’至3’方向上可包括：

1) 通用域；

2) 第一定位域；

3) 连接域；

4) 第二定位域；

5) 分子标记；

6) 捕获域，可包含能够捕获核酸序列的核酸序列、随机序列、简并捕获结构域、测序及启动子接头序列或其组合，也可包含在功能上或结构上类似于poly-T寡核苷酸序列的序列；

其中，所述的唯一核酸分子标识符，包含所述第一核酸分子标识符与第二核酸分子标识符互补后的核酸序列或该互补后核酸序列经过延伸、扩增或连接的核酸序列，所述的唯一核酸分子标识符指的是其不同于其他连接于微载体的核酸分子标识符、与细胞或组织相关的核酸序列以及与本公开相关的核酸序列；

步骤e：进行组织样本的空间组学研究，降低组学信息交叉污染:具体地，在存放微载体的微反应室阵列中引入固相或液相化合物，将组织切片贴附于微井阵列表面，组织样本内嵌于微井中或铺展于微井表面，此时带有特定唯一核酸分子标识的微载体的位置信息与组织的位置一一对应，对组织样本进行成像，在微井表面覆盖多孔膜，用于防止组织样本空间组学信息间的交叉污染，在多孔膜表面添加组织透化液，此时所述的微载体通过唯一核酸分子标识符对限域在微井中组织的核酸序列进行捕获，清洗表面；将反应混合液孵育于微井阵列中，对已捕获组学信息的杂交链进行延伸与合成，使被捕获的核酸序列和唯一核酸分子标识符形成互补双链核酸序列，随后对双链核酸序列进行扩增和建库；回收核酸序列，并对回收的核酸序列进行分析，接下来，根据第一定位域、第二定位域序列位置和影像学检测信息，将被分析的源于组织或细胞样本的组学信息按位置信息对应于组织样本的图像空间位点上，从而得到组织样本的空间组学信息。

2.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，将微载体分散于微井阵列中的微载体包含已经连接有分子标识符的微载体，本公开方法包含将已经连接有分子标识符的微载体通过任何方式转移到微井反应室中，本方法包含通过任何方式使本公开微井中的微载体连接有互不相同的分子标识符，也包含将分子标识符连接于微井反应室内部或表面。

3.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述分子标识符的种类包含核酸序列、蛋白分子和多糖分子，本公开对核酸分子标识符的分析和检测同样适用于蛋白和多糖分子标识符，即包含采用本公开方法进行蛋白和多糖分子的捕获、分析和检测。

4.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述微载体为可与分子标识符连接的微珠、凝胶、聚合物，也包含本领域技术人员所知的任何可连接分子标识符的固相、液相载体及可生成微载体的任何材料，分子标识符与微载体的连接部位，包含微载体的内部、表面以及任何其他可与分子标识符连接的部位。

5.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述套件中玻片的材质包含任何可以用于制备形貌结构的材料，玻片至少包含1个微井反应室阵列，所述微井反应室阵列至少包含1个微井，且所述微井反应室阵列中的每个微井中至少包含1个微载体。

6.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述微井形状包含规则、不规则的三维形貌结构，且所述微井反应室内容积范围为0.1 fm³-1cm³。

7.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，将分子标识符转移至微井反应室阵列中的方法包含直接、间接添加方法，所述的分子标识符中与微载体的连接方式包含但不限于物理、化学、生物修饰。

8.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述平行排布微孔道中的孔道数量是1条及以上。

9.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述平行排布微孔道中的孔道宽度及孔道间的间距宽度范围都为0.1 nm-1000 μm。

10.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述通用域可包含：

i.官能团修饰位点，能够与微载体结合的物质或能够被活化以形成反应性官能团的前体；

ii.PCR通用扩增起始端，可以与通用引物互补结合，用于核酸分子的延伸或扩增；和

iii.剪切域，用于将生成的核酸分子标识符从微载体释放。

11.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开的方法中，包含将所述的杂交互补后的第一核酸分子标识符和第二核酸分子标识符与反应混合液共同孵育，使微载体产生所述的唯一核酸分子标识符的步骤，所述的唯一核酸分子标识符由5’至3’方向上包括：通用域、第一定位域、连接域、第二定位域、分子标记、捕获域，也包括：通用域、第一定位域、第二定位域、分子标记、捕获域，所述的反应混合液可以包含任何可以使核酸序列延伸、扩增或连接的成分。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开的方法中，所述的第一核酸分子标识符、第二核酸分子标识符、唯一核酸分子标识符的功能区域的排列包含但并不局限于本发明中所列举的顺序、位置或内容，上述的分子标识符中的一种或多种功能序列可以以任何合适的顺序或内容排列。

13.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述通用域、通用PCR扩增起始端、第一定位域、第二定位域、连接域、连接域互补区、分子标记、捕获域前体和捕获域序列的长度至少是1个核苷酸。

14.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，所述的组织样本内嵌于微井中的方式包含采用任何外力方式或借助微井反应室固有性质或借助固相或液相化合物性质将组织样本引入微井中，所述的固相或液相化合物种类包含任何能够将组织切片引入微井中的化合物，所述的多孔膜种类包含任何材质的多孔膜，多孔膜孔径范围为0.1 nm-100 mm。

15.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开的方法包含将所述唯一核酸分子标识符或由其与被捕获核酸生成杂交链、互补双链核酸序列以及通过本公开方法转换得到的任何核酸序列从微载体回收、建库、分析的步骤，该步骤可以在所述微载体上进行，也可以在将所述带有被捕获核酸信息的唯一核酸分子标识符或其互补双链核酸序列从微载体回收后进行。

16.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，对含有所述被捕获序列信息的目标序列核酸进行扩增和建库时，扩增和建库方法包含任何已知的核酸扩增和建库方法。

17.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开中拓展应用于捕获和分析组织、细胞、病毒样本中的核酸、蛋白、多糖分子。

18.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开的方法中的组织样本可以是任何生物体的组织样本或生物体空间结构。

19.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开的方法中的组织样本可以是任何类型或种类的组织样本，本公开的组织样本也包含任何经过处理或未处理的组织样本。

20.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开的方法包含将本公开方法用于获取或检索任何类型单细胞或多细胞独有或独立的组学信息。

21.根据权利要求1所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开所述方法可以用于组织切片的空间转录组学研究：

22.根据权利要求1-11、13-21中任一项所述的用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法，其特征在于，本公开的方法中包含将本公开方法用于任何种类的生物组学测试和分析。