CN114480582B - 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 - Google Patents
运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114480582B CN114480582B CN202210115791.7A CN202210115791A CN114480582B CN 114480582 B CN114480582 B CN 114480582B CN 202210115791 A CN202210115791 A CN 202210115791A CN 114480582 B CN114480582 B CN 114480582B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- sequence
- molecules
- target
- sparse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 105
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150014889 Gad1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用，该方法将所有靶标分子分为锚定分子和N组稀疏分子，每轮通过连接测序的方式读取全部锚定分子和其中一组稀疏分子，直至N组稀疏分子读取完毕。通过N轮成像，有效地将无法解读的高密度靶标分子信号稀疏成N组低密度信号，再通过锚定分子配准将解读后的N组稀疏分子进行整合，确定高通量高密度的空间分布模式信息。该方法通过增加成像轮数，拆分、稀疏高密度图像，换取空间位置，解决荧光信号点光学拥挤和干扰问题，获取高密度信号点的空间位置，无需通过超分辨显微成像系统在单细胞水平实现高通量、高密度荧光信号的精准空间分辨的解析，打破目前的技术限制。
Description
技术领域
本发明涉及高通量原位测序领域，具体涉及一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用。
背景技术
细胞是生物体组织结构和功能的基本单位。传统高通量测序方法是针对大量细胞的遗传信息进行读取，得到这群细胞的“整体”表征。随着研究的深入，人们发现细胞间存在异质性，而传统测序方法已经无法挖掘这种“细节”。直到单细胞测序技术的出现，实现了从单细胞的精度在分子水平解析生命活动，对单个细胞进行特写，极大地推动了发育、癌症、神经、免疫等研究领域的发展。但在单细胞悬液的制备过程中，细胞本身的空间信息丢失，无法同时兼得细胞身份信息和位置信息。而传统的原位杂交技术，如单分子荧光原位杂交(smFISH)和RNAscope，能够同时展示空间和转录信息，具有高灵敏度和背景低的优点，但检测通量低，无法获得精细的转录谱。
为了解析单个细胞的结构与功能，能够同时展现单个细胞表达谱和空间信息的空间转录组学应运而生，其中以MERFISH(multiplexed error-robust fluorescence insitu hybridization)、seqFISH(sequential fluorescence in situ hybridization)、seqFISH+、STARmap(Spatially-resolved Transcript Amplicon Readout Mapping)为代表的基于图像从而进行高通量的单分子荧光原位检测的方法应用较为广泛。目前MERFISH单个细胞中可检测～1000个基因，SeqFISH+在单个细胞中实现了10000个基因的检测，这种基于单分子杂交的方法通过条形码的引入和使用不同序列的荧光探针进行迭代成像，稀释成多个独立的图像，再重新组合构建完整图像，实现高通量的原位检测。基于原位测序的方法展示转录组的STARmap目前单个细胞的检测上限接近1020个基因，其利用带有barcode序列的锁式探针对转录本进行杂交，再通过滚环扩增的方式对信号进行扩大，使用连接测序的方法对barcode序列进行读取，实现高通量原位还原转录组信息。
空间组的高速发展为细胞构筑的刻画提供了坚实的基础，但是仍有许多不足需要进行解决。基于单分子杂交的方法探针制备繁琐且大量的荧光读取探针成本高；操作步骤繁杂，需要多次杂交-成像-探针剥离循环操作，对系统稳定性要求高；由于缺失“定位点”，光学畸变使得多轮信号的配准难度大；需要借助超分辨荧光显微镜、对仪器要求极高。基于原位测序杂交的方法利用滚环扩增放大信号，单个信号点体积大于单分子杂交，由于衍射极限的存在，限制了检测通量。每个细胞有数万到数十万个RNA，想要一次性全局分析整个细胞的转录谱难度极高；因为由于衍射极限的存在，会导致光学拥挤，对仪器的光学分辨率要求极高，所以以较低光学分辨率进行高精度原位成像一直是单细胞生物学中的一项重大挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用，本发明根据靶标分子数量(DNA通过拷贝数判定、RNA或蛋白质通过表达丰度判定)进行排序，选取排列在中间位置的1-5个靶标分子作为锚定分子，将除锚定分子外的靶标分子根据通量与数量分为N组稀疏分子，每轮通过连接测序的方式读取全部锚定分子和其中一组稀疏分子，直至N组稀疏分子读取完毕。通过N轮成像，有效地将无法解读的高密度靶标分子信号稀疏成N组低密度信号，再通过锚定分子配准将解读后的N组稀疏分子进行整合，确定高通量高密度的空间分布模式信息。该方法通过增加成像轮数，拆分、稀疏高密度图像，换取空间位置，解决荧光信号点光学拥挤和干扰问题，获取高密度信号点的空间位置，无需通过超分辨显微成像系统在单细胞水平实现高通量、高密度荧光信号的精准空间分辨的解析，打破目前的技术限制。
为实现上述目的，本发明所设计一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法，包括以下步骤：
1)待测靶标分子分类：
选取待检对象中的待靶标分子组成的靶标组，将靶标分子按其数量(DNA通过拷贝数判定、RNA或蛋白质通过表达丰度判定)进行排序，选取排列在中间位置的1-5个靶标分子作为锚定分子；将除锚定分子外的靶标分子作为稀疏分子；并以稀疏分子的通量和数量为基准，将稀疏分子分为N个稀疏组，即为第一稀疏组…第N稀疏组(使每组中稀疏分子数量总和尽可能相同，在后续的读取过程中，第一轮成像读取第一组稀疏分子与锚定分子，第二轮成像读取第二组稀疏分子与锚定分子，以此类推)，其中，
N的取值满足在成像时每轮成像后的荧光信号在光学衍射极限内可分辨即可，N≥2；
2)杂交探针设计和制备
从待检测对象的待靶标分子中选出GC含量为40％～60％、特异性高、无高级结构的靶序列区域设计和制备杂交探针；其中，所述杂交探针包括锁式探针、RCA引发探针、读取探针和测序探针；
3)探针预处理：
对锁式探针的5’端进行磷酸化处理，再将其产物与RCA引发探针进行退火结合；对读取探针的5’端进行磷酸化处理。
4)样品杂交
在反应腔室内依次对待检对象进行多聚甲醛固定、甲醇脱水和蛋白酶消化处理，再将含有锁式探针、RCA引发探针的杂交液加入反应腔室中孵育过夜。
5)连接反应
通过连接酶的连接，锁式探针与RNA上的靶序列互补配对并形成闭合的环状结构
6)滚环扩增
通过Phi29 DNA聚合酶的作用下，以RCA引发探针为引物，连接过后的锁式探针闭合环状结构为模板，进行滚环扩增，放大信号。
7)原位测序解读空间信息
(1)将N个稀疏组由第一组开始至第N组依次进行读取：
a.第一轮读取：在T4连接酶的作用下，读取探针(读取探针Seq锚和Seq1探针)和测序探针(测序探针为常用原位测序探针)进行连接测序反应，对锁式探针的barcode碱基进行测序，通过逐层成像，叠加信号进行最大投影，解读第一轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和第一组稀疏分子的barcode信息；使用信号剥离液去除读取探针和测序探针；
b.其余轮读取：按上述步骤依次对其它稀疏组的锁式探针的barcode碱基进行测序，解读每轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息，直至解读完第N轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息；
(2)解读空间信息
a.根据锚定分子对应的荧光信号将N张图片(成像的图片)进行配准重合形成一张图片，即为高密度的靶标组中的靶标分子对应的荧光信息；
b.将荧光信号与N组的barcode信息配对，N组稀疏组的稀疏分子的barcode信息和锚定分子的barcode信息也整合在一起，得到整合的所有稀疏组的barcode总信息；
c.通过barcode总信息确定靶标组中的靶标分子高密度分布模式信息，然后进行细胞分割；最后进行单细胞数据分析；还原组织精细的分子构筑。
进一步地，所述步骤1)中，待检对象为细胞或组织，所述靶标分子为DNA、RNA和条形码蛋白质中任意一种或多种。
再进一步地，所述步骤2)中，靶序列区域由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为检测区A’，loop序列和检测区B’，所述检测区A’的序列和检测区B’的序列分别与靶序列A和靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构(如果存在检测的靶序列，检测区能与靶序列互补结合，形成半闭合环状结构，在连接酶的作用下两个末端被连接起来，锁式探针成环)；
Loop区从5’端至3’端依次为barcode1序列、读取探针结合序列L、barcode2序列和读取探针结合序列R；
RCA引发探针由2部分组成，2部分分别为从5’端至3’端依次为与靶序列C互补的检测区C’，以及部分或全部的读取探针结合序列R的互补序列。
再进一步地，所述步骤2)中，所述读取探针由分别与读取探针结合序列L、读取探针结合序列R反向互补的序列组成。
再进一步地，所述barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，读取探针结合序列的长度为10-20bp；
所述barcode1序列和barcode2序列均是由A、G、C、T四个碱基随机排列组合而成(每个锁式探针的loop序列中barcode1和barcode2组合形成完整的barcode信息)；
若靶序列为锚定分子的靶序列时，其对应的读取探针Seq锚均相同，
若靶序列为稀疏分子的靶序列时，从第一组至第N组，每一组对应的读取探针依次为Seq1探针，Seq2探针，……，SeqN探针。
本发明还提供了一种利用上述方法在单分子成像、高通量原位杂交和空间多组学中的应用(该方法适用于DNA、RNA及条形码蛋白质的高密度信号，可以高通量解读基因与蛋白质分布模式信息，从而应用于单分子成像、高通量原位杂交、空间多组学)。
本发明的有益效果：
1.解决高通量原位测序中高密度荧光信号拥挤的瓶颈：本发明主要是通过滚环扩增的方法放大信号，同时通过N轮成像，有效地将靶标分子信号密度稀疏，仅运用普通共聚焦成像系统即可分辨解析高通量原位测序中高密度荧光信号点，解决了高密度荧光信号解读困难的问题。
2.操作简单：直接利用探针靶向靶序列，无需反转录等过程制备探针；
3.信号配准难度低：增加锚定分子作为“定位点”，可以减少光学畸变对多轮信号的配准难度的影响
综上所述，本发明以拆分高密度图像，增加成像轮数换取空间位置，无需超分辨成像系统，运用共聚焦成像系统即可对高密度荧光信号进行解读，推动了高通量原位空间组学的普及和发展。
附图说明
图1为运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法原理流程图；
图2为杂交探针设计原理图；
图3为运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法解读皮层3个基因2轮杂交示意图；
图4为运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法解读皮层3个基因空间分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
利用运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法解读皮层中3个高表达基因：包括如下步骤：
1.基因的选取与杂交探针的设计
选择小鼠大脑皮层中表达量基因Gad1作为锚定基因，高表达基因Cck与Npy作为待检测基因，分别配给不同的barcode，探针序列如下：
2.探针预处理
应用T4多聚核苷酸激酶对锁式探针5’端进行磷酸化处理；
3.组织样品取材
将心脏灌流处死后的小鼠大脑取出，在4％PFA中于4℃固定12h，然后放入30％蔗糖脱水12h，用OCT包埋备用；将包埋的鼠脑用冰冻切片机进行切片，厚度为10μm，将切好的组织贴在无酶载玻片上，放入-80℃保存。
3.样品杂交
①4％多聚甲醛(PFA)对脑组织固定10min，将反应腔室内溶液吸弃，用DEPC-PBST洗涤3次，每次3min。
②加入-20℃预冷的甲醇，立即放入-80℃反应15min；将反应腔室从-80℃取出，置于室温平衡5min，吸弃反应体系，用DEPC-PBST洗涤3次，每次5min；
③杂交探针以100nM的终浓度加入到杂交缓冲液中；将杂交反应体系混匀后加入反应腔室中，37℃过夜杂交。
4.连接反应
将连接酶反应体系加入到反应腔室内，置于25℃，反应4小时；
5.滚环扩增
将phi29DNA聚合酶滚环扩展反应体系加入到反应腔室内，置于30℃，反应4小时。
6.barcode测序及数据分析解读高通量空间信息：
①配制第一轮测序反应体系(读取探针为锚定探针与Seq1探针，测序探针为常用原位测序探针)入反应腔室中置于25℃，反应3h。
②将腔室内的杂交反应体系吸弃，用DEPC-PBST洗涤两次，每次5min。然后进行DAPI染色，用PBS配制浓度为0.1ug/ml的DAPI染液，加入到反应腔室中，室温反应5min。
③应用Leica TCS SP8激光共聚焦进行成像，分别设置对应荧光通道，确定组织切片的信号最顶端和最底端，以0.5μm的步径对组织进行逐层扫描，叠加各层图像获得最大投影的整体信号图。
④60％甲酰胺洗涤缓冲液置于室温洗涤两次，20分钟每次，将第一轮信号剥离，用第二轮读取探针(锚定探针与Seq2探针)按照第一轮barcode测序中的反应体系及步骤进行第二轮的解读；第二轮成像必须保持与第一次成像时相同的位置以及参数，进行第二轮图像采集。
⑤数据分析
如图3所示，对2轮图片进行校准，确定每个基团的空间位置分布；然后提出两轮同时存在的锚定基因Gad1，对两轮图片的信号进行整合，从而还原出如图4所示完整的基因表达分布。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
鲲羽生物科技（江门）有限公司
<120> 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
ttgctcctcc ccgccattac actaccaccg catttcctat tctcaagaac tgcgcagt 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
atgcggccag aagaccaagc tggatctagt actagctcga ttcaacttaa gaacggac 58
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
ccggtcactt attaccaagc tggatctagt actagctcga ttcaaagccc atgtagtc 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
gatctcttgc catccaggtg cgtctatttg ttggtagtgg agccttgtct cagggctg 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
tcgcttgtta cctccaggtg cgtctatttg ttggtagtgg agcctcacac agccccat 58
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
taccacttcc agcttgagaa tagga 25
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
aggctctgca ggtacttgaa tcgagc 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
gccaaaatcc atcgcttgaa tcgagc 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
aggtctgaaa tcatcaggct ccacta 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
agcgagggtc agttcaggct ccacta 26
Claims (4)
1.一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)待测靶标分子分类：
选取待检对象中的靶标分子组成的靶标组，将靶标分子按其数量进行排序，选取排列在中间位置的1-5个靶标分子作为锚定分子；将除锚定分子外的靶标分子作为稀疏分子；并以稀疏分子的通量和数量为基准，将稀疏分子分为N个稀疏组，即为第一稀疏组…第N稀疏组，其中，
N的取值满足在成像时每轮成像后的荧光信号在光学衍射极限内可分辨即可，N≥2；
2)杂交探针设计和制备
从待检测对象的靶标分子中选出GC含量为40％～60％、特异性高、无高级结构的靶序列区域设计和制备杂交探针；其中，所述杂交探针包括锁式探针、RCA引发探针、读取探针和测序探针；其中，靶序列区域由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为检测区A’，loop序列和检测区B’，所述检测区A’的序列和检测区B’的序列分别与靶序列A和靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；
Loop区从5’端至3’端依次为barcode1序列、读取探针结合序列L、barcode2序列和读取探针结合序列R；
RCA引发探针由2部分组成，2部分分别为从5’端至3’端依次为与靶序列C互补的检测区C’，以及部分或全部的读取探针结合序列R的互补序列；
所述barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，读取探针结合序列的长度为10-20bp；
所述barcode1序列和barcode2序列均是由A、G、C、T四个碱基随机排列组合而成；
若靶序列为锚定分子的靶序列时，其对应的读取探针Seq锚均相同，
若靶序列为稀疏分子的靶序列时，从第一组至第N组，每一组对应的读取探针依次为Seq1探针，Seq2探针，……，SeqN探针；
3)探针预处理：
对锁式探针的5’端进行磷酸化处理，再将其产物与RCA引发探针进行退火结合；对读取探针的5’端进行磷酸化处理；
4)样品杂交
在反应腔室内依次对待检对象进行多聚甲醛固定、甲醇脱水和盐酸通透处理，再将含有锁式探针、RCA引发探针的杂交液加入反应腔室中孵育过夜；
5)连接反应
通过连接酶的连接，使锁式探针与靶标分子的靶序列互补配对并形成闭合的环状结构
6)滚环扩增
通过Phi29 DNA聚合酶的作用下，以RCA引发探针为引物，连接过后的锁式探针闭合环状结构为模板，进行滚环扩增，放大信号；
7)原位测序解读空间信息
(1)将N个稀疏组由第一组开始至第N组依次进行读取：
a.第一轮读取：在T4连接酶的作用下，读取探针和测序探针进行连接测序反应，对锁式探针的barcode碱基进行测序，通过逐层成像，叠加信号进行最大投影，解读第一轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和第一组稀疏分子的barcode信息；使用信号剥离液去除读取探针和测序探针；
b.其余轮读取：按上述步骤依次对其它稀疏组的锁式探针的barcode碱基进行测序，解读每轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息，直至解读完第N轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息；
(2)解读空间信息
a.根据锚定分子对应的荧光信号将N张图片进行配准重合形成一张图片，即为靶标组中的靶标分子对应的高密度荧光信息；
b.将荧光信号与N组的barcode信息配对，将N组稀疏组的稀疏分子的barcode信息和锚定分子的barcode信息整合在一起，得到整合的所有稀疏组的barcode总信息；
c.通过barcode总信息确定靶标组中的靶标分子高密度分布模式信息，然后进行细胞分割；最后进行单细胞数据分析；还原组织精细的分子构筑。
2.根据权利要求1所述运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法，其特征在于：所述步骤1)中，待检对象为细胞或组织，所述靶标分子为DNA、RNA和条形码蛋白质中任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述读取探针由分别与读取探针结合序列L、读取探针结合序列R反向互补的序列组成。
4.利用权利要求1所述方法在单分子成像、高通量原位杂交和空间多组学中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210115791.7A CN114480582B (zh) | 2022-02-07 | 2022-02-07 | 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210115791.7A CN114480582B (zh) | 2022-02-07 | 2022-02-07 | 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114480582A CN114480582A (zh) | 2022-05-13 |
| CN114480582B true CN114480582B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=81478470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210115791.7A Active CN114480582B (zh) | 2022-02-07 | 2022-02-07 | 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114480582B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117343993A (zh) * | 2023-12-01 | 2024-01-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 原位检测样品中的靶核酸序列的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111926065A (zh) * | 2020-09-18 | 2020-11-13 | 中国科学院上海高等研究院 | 一种高效的核酸检测和基因测序方法及其装置 |
| CN112243463A (zh) * | 2018-04-09 | 2021-01-19 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 原位基因测序方法 |
| CN112592962A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-04-02 | 华中农业大学 | 适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
| CN113584133A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-11-02 | 中国药科大学 | 基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法 |
| CN113604547A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-05 | 吉林大学 | 一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法 |
-
2022
- 2022-02-07 CN CN202210115791.7A patent/CN114480582B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112243463A (zh) * | 2018-04-09 | 2021-01-19 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 原位基因测序方法 |
| CN111926065A (zh) * | 2020-09-18 | 2020-11-13 | 中国科学院上海高等研究院 | 一种高效的核酸检测和基因测序方法及其装置 |
| CN112592962A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-04-02 | 华中农业大学 | 适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
| CN113604547A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-05 | 吉林大学 | 一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法 |
| CN113584133A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-11-02 | 中国药科大学 | 基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114480582A (zh) | 2022-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Strell et al. | Placing RNA in context and space–methods for spatially resolved transcriptomics | |
| Liao et al. | Uncovering an organ’s molecular architecture at single-cell resolution by spatially resolved transcriptomics | |
| Chen et al. | High-throughput mapping of long-range neuronal projection using in situ sequencing | |
| EP4087945B1 (en) | Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample | |
| Wang et al. | Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states | |
| RU2733545C2 (ru) | Пространственное картирование молекулярных профилей образцов биологических тканей | |
| KR102500210B1 (ko) | 핵산 색인 기술 | |
| US20220026433A1 (en) | Cleavable fluorescent tyramide for sensitive and multiplexed analysis of biological samples | |
| CN109804084A (zh) | 基于具有嵌入纠错机制的伪彩色条形码的分子靶的顺序探测 | |
| US11827935B1 (en) | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes | |
| CN115198003B (zh) | 适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用 | |
| US20230175047A1 (en) | Array and method for detecting spatial information of nucleic acids | |
| Zhou et al. | Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing | |
| CN114480582B (zh) | 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 | |
| CN106536735A (zh) | 分析dna样品的探针集合和使用所述探针集合的方法 | |
| CN101962685A (zh) | 一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法 | |
| CN101130814A (zh) | 核酸配基组芯片及其制备方法 | |
| CN116445594A (zh) | 适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用 | |
| US20100029492A1 (en) | Nucleic acid chip for obtaining binding profile of single strand nucleic acid and unknown biomolecule, manufacturing method thereof and analysis method of unknown biomolecule using nucleic acid chip | |
| US20070099193A1 (en) | Probe/target stabilization with add-in oligo | |
| CN115449540A (zh) | 适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法及其应用 | |
| CN115852000A (zh) | 检测样本中甲烷代谢基因的探针、芯片、试剂盒和方法 | |
| KR100923048B1 (ko) | 미지의 생체분자와 단일가닥핵산의 결합 프로파일을생성하기 위한 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을이용한 미지의 생체분자 분석방법 | |
| Rájová et al. | Deconvolution of spatial sequencing provides accurate characterization of hESC-derived DA transplants in vivo | |
| JP3944576B2 (ja) | マイクロアレイを用いたアプタマーの取得方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |