CN113584133A

CN113584133A - 基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法

Info

Publication number: CN113584133A
Application number: CN202111008225.8A
Authority: CN
Inventors: 王琛; 邹秉杰; 宋沁馨
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-08-30
Also published as: CN113584133B

Abstract

本发明公开了基于颜色编码与可编程性荧光探针的高通量多重靶标原位检测方法，所述方法通过不同荧光标记核酸探针对待测靶标进行多轮次重复成像检测，并根据靶标在不同轮次成像中荧光信号颜色种类及变化顺序来区分识别多种靶标。该方法解决了荧光检测设备检测通道有限，可同时分析靶标数少的问题，因此本发明的方法突破了荧光显微镜检测多重数少的限制。此外，这种方法还弥补了现有“基于多轮成像分析技术”的多重检测方法存在多靶标分析耗时长的缺陷，例如利用具有四个荧光检测通道的显微镜检测64种靶标，现有“基于多轮成像分析技术”的方法至少需要检测16轮次，而本方法最少只需要3轮次有序颜色编码成像分析即可完成，实现了高通量多靶标分析。

Description

基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法

技术领域

本发明属于定位与多重检测领域，具体涉及基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法。

背景技术

全面分析复杂生物系统中细胞内蛋白质的能力对于增进生物学家对正常生理学和疾病发病机理的理解至关重要。“人类细胞图谱计划(Human Cell Atlas Project)”的启动，让单细胞蛋白质研究进入了快速前进轨道。

基于荧光显微镜的成像技术可在特定靶标的原位环境中对其进行检测分析(其中通过成像鉴别、原位定位和定量靶标)，保存了靶标原始的空间信息。但是，可用于荧光成像的荧光基团的激发光或发射光光谱之间存在重叠区域，使可同时用于不同靶标区分的荧光基团个数有限。因此，荧光基团光谱重叠问题限制了荧光显微镜检术同时可检测的靶标种类数，通常可同时检测靶标数不超过五个，也因此，使单细胞蛋白质成像方法受到了有限多重能力的困扰。

为解决这一问题，改进原位靶标多重检测技术，研究者们提出了各种多重成像的方法。而真正在研究实践中实现蛋白质等靶标原位多重检测技术的，则以基于甲酰胺缓冲液“脱色”策略的方法为代表。对于同一个待测样本，该方法一次利用一种荧光成像探针对其中一种靶标进行检测，然后通过甲酰胺缓冲液对该靶标的荧光信号进行脱色处理，然后再利用另一种荧光成像探针对其中另一个靶标进行检测，如此循环往复，理论上不依赖荧光显微镜的检测通道数，可以实现靶标原位多重检测。然而，其中有一点不可忽略的是，这类多重分析技术为了实现蛋白质原位检测的高度多重性，需要依赖多轮成像，靶标越多成像轮次就越多，成像轮次呈现线性增长，消耗大量时间。该技术还涉及到多次洗涤过程等步骤，靶标越多，成像轮次越多，洗涤步骤也越多。多步洗涤对低丰度靶标损失的潜在影响是不可忽略的。这些冗杂步骤积累耗费的时间以及多步洗涤问题，对于快速病理诊断领域来说仍然是不能规避的问题。因此需要改进待测样本中多靶标的原位多重检测技术，以达到检测通量高、步骤少、并且突破荧光显微镜检测通道数限制的目的。

发明内容

发明目的：为了突破荧光显微镜检测通道数的限制(如目前商用荧光显微镜多为小于5个荧光检测通道)，改进原位靶标多重检测技术，提高原位检测通量，本发明提供了一种基于颜色编码与可编程性荧光探针策略进行多重靶标原位检测方法，例如细胞内的蛋白质、多肽或其他所需靶标的检测方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，所述检测方法通过不同荧光标记核酸探针对多种待测靶标进行多轮次重复成像检测，并根据靶标在不同轮次成像中荧光信号颜色种类及变化顺序来区分识别各个靶标种类，具体包括如下步骤：将样本中的每种待测靶标通过直接或间接方式结合一种或多种序列不同的寡核苷酸片段，每种寡核苷酸片段与一种或多种序列互补的荧光标记核酸探针通过碱基互补原理进行杂交后，用荧光成像设备成像，使待测靶标呈现对应的荧光信号，成像结束后，使用外加作用力或缓冲液去除所有荧光标记核酸探针，然后再次加入荧光标记核酸探针进行杂交成像，如此进行多轮的荧光标记核酸探针杂交成像，多轮杂交成像结束后，通过荧光信号出现的种类、顺序和位置来对样本中的不同靶标进行定性和定位检测。

在一个方面，本发明的一般性涉及包含同一个靶标的重复检测策略，该策略通过使用荧光成像探针杂交与去杂交的循环过程实现相同靶标的相同和/或不同荧光的有序反复检测。

在一方面，本发明的一般性涉及荧光颜色编码策略。该策略通过将可使用的荧光颜色种类和荧光检测顺序进行组合，构成靶标颜色编码检测策略的编码。

在一个方面，本发明的样本中的相同靶标在每一轮荧光标记核酸探针杂交成像中所显示的荧光颜色均相同，不同靶标在每轮荧光标记核酸探针杂交成像中所显示的荧光颜色相同或不同，但多轮荧光标记核酸探针杂交成像后，每种靶标都具有唯一的从第一轮到最后一轮荧光杂交成像的荧光信号颜色出现顺序，这一顺序为每种靶标的荧光颜色编码，根据相同荧光颜色编码出现的位置可确定对应靶标在样品中的分布位置。

在一个方面，本发明的所述直接方式为通过核酸或核酸适配体使寡核苷酸片段直接与待测靶标结合，所述间接方式为通过寡核苷酸片段标记的抗体或抗原或其他分子与靶标结合。

在一个方面，本发明的所述样本为细胞或组织；所述靶标为蛋白质、多肽、蛋白多糖或核酸中的一种或多种。

在一个方面，本发明的所述荧光标记核酸探针包括至少一种荧光基团标记的寡核苷酸或至少一种单独合成或工程化的包含荧光发射部分及寡核苷酸标签识别结合部分的纳米材料。

在一个方面，本发明的一般性涉及使荧光成像探针杂交与去杂交的方法或系统，该方法通过外加的电场作用力使荧光成像探针从样本中解离并被除去；该系统包含丙三醇缓冲液、低盐缓冲液。

再一方面，本发明的一般性涉及原位荧光信号的识别与区分方法。该方法包含划定阳性信号阈值，扣除荧光噪点及非特异性的亮点；将不同荧光通道下的荧光信号分别用不同的颜色进行着色(伪色)处理；通过明场信号对荧光信号进行样本亚区域的划分；对分析区域内的荧光信号亮点进行位置信息和荧光强度的分析及记录，并根据高斯函数拟合统计直方图分布，以评估区分每一簇亮点的实际目标个数。

再一方面，本发明的一般性涉及同一生物样本经过多轮颜色编码重复成像后的信号解码方法。该方法包含根据多轮次成像中检测到的同一靶标分子信号亮点出现的荧光颜色种类和顺序，并对照预先对每一个靶标编码好的荧光颜色种类及顺序来判断该位置为哪一种待测靶标，最终完成突破荧光显微镜检测通道数限制的多重靶标检测。

再一方面，本发明的一般性涉及生物样本中多重靶标的定量检测方法。该方法通过对已利用颜色编码策略识别的靶标信号亮点个数进行统计而进行靶标量化分析。

在一组实施方案中，通过杂交、连接、延伸反应产生长单链核酸，因此可提供多个荧光标记探针的杂交位置，使荧光信号得到增强，然后在落射荧光显微镜或共聚焦显微镜下成像。

在另一组实施方案中，结合在样本中靶标上的寡核苷酸片段不经过核酸扩增反应，直接与具有荧光增强功能的成像材料结合，使荧光信号得到增强，然后在落射荧光显微镜或共聚焦显微镜下成像。

在另一组实施方案中，结合在样本中靶标上的寡核苷酸片段不经过核酸扩增反应，直接与单独合成或工程化的长单链核酸结合，然后成像探针和/或成像材料与所述长单链核酸部分结合，使荧光信号得到增强，然后在落射荧光显微镜或共聚焦显微镜下成像。

另一组实施方案，在部分成像轮次中，具有不同序列的成像探针或成像材料可以是相同的标记，包括被相同的荧光团标记。在其它实施例中，具有不同序列的成像探针或成像材料可以是不同的标记。这种方法可以利用多种激发波长和多通道检测器的荧光显微镜。

应当理解，在一些实施方案中，结合在样本中靶标上的寡核苷酸片段上的荧光信号得到增强之后，在传统荧光显微镜下能够形成与背景明显区分的分散亮点，更易于不同靶标来源信号的区分与识别，也更利于颜色编码策略的实施，特别适合检测低丰度靶标。也因此，无论靶标的位置如何，包括不同靶标间的相互位置如何接近，本方法都可以通过不同经标记成像探针加以区别，也因此靶标间的空间距离可以小于成像系统的分辨距离。因此，这种检测方式不依赖高分辨显微镜进行成像定位分析。

用这种方法可以对多种靶标进行表征，通过每轮次对其中几种或全部(可以超过荧光显微镜的检测通道数)靶标特异性的寡核苷酸片段进行基于经标记成像链的检测分析，然后通过外加电场力或缓冲液去除经标记成像探针，并进行下一轮次其它几种靶标特异性的寡核苷酸片段的检测分析。最终，通过多轮成像分析中同一靶标特异性寡核苷酸片段呈现的颜色种类和不同轮次间颜色变化顺序对相应靶标进行解码分析。因此，本发明披露的方法能够实现较少轮次的成像分析对多种靶标的定位与量化分析，突破了显微镜成像系统的检测多重数的限制，并降低了总体成像分析的轮次和时间。

在本发明中，应当理解，靶标特异性寡核苷酸片段能否与待分析样品结合，取决于待分析样品中是否存在给定靶标(例如：当给定靶标存在于待分析样品上，则靶标特异性寡核苷酸片段能够与待分析样品结合)。“与待分析样品结合”是指靶标特异性寡核苷酸片段结合在其对应靶标上。

在一些实施例中，成像探针或成像材料可以标记的荧光团是一个、多个或更多个。

在一些实施例中，该分析样品可以是细胞或者来自细胞的裂解物。该靶标可以是蛋白质、多肽。

在一些实施例中，该分析样品可以是与固体支持物相连的样本。

在一些实施例中，该样品是细胞、组织，该靶标是蛋白质。

在一些实施例中，成像探针或成像材料的杂交与去杂交执行方法包括电泳、丙三醇水溶液、低盐缓冲液等。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明提供的方法提出了基于荧光探针颜色编码的多重检测策略，解决了多重靶标检测时，因需多轮成像而造成的耗时费力问题，实现了用更短的时间实现更多重的靶标定位、定量分析。本方法通过将多色、少数轮次的颜色编码分析整合在一起，实现了以指数增长的高通量检测，可以以高通量检测单个细胞中数十至上百个分子靶标，突破了荧光显微镜的检测通道限制。该策略只需要扩展每个成像轮次(n)所用的荧光探针颜色种类(m)，其多重性理论上可以达到“m的n次方”水平，极大地节约了多靶标检测总时间，有效缩减了成像轮次，避免了以往原位多重技术中多次成像和多次洗涤过程。例如，利用具有4个检测通道的荧光显微镜对待测样本中64个靶标进行原位检测分析，至少需要16轮次的成像分析，并且包含大于50次的洗涤过程，耗时超过20小时；而利用本发明的方法最少只需要3轮次的成像分析，洗涤过程不超过15次，甚至不需要洗涤(在一些实施例中，电泳代替了洗涤)，总耗时在5小时以内。

因此，这种方法突破了荧光显微镜的检测多重数的限制，并有效弥补了现有技术方法的不足。

附图说明

图1，是本发明提供的一种基于靶标特异性寡核苷酸标签及有序颜色编码成像的高通量多重靶标定位与定量检测方法的一个原理示意图。在该原理图中，靶标可以是蛋白质，则寡核苷酸标签与蛋白质可以通过抗体进行间接结合。寡核苷酸标签可以是人工合成的核酸片段，合成片段的长度越长，所提供的荧光标记探针杂交的位置也越多，与荧光探针杂交后的荧光信号也越强；也可以是在与靶标间接或直接结合后通过杂交、连接、延伸反应而产生的长核酸片段，这些通过原位反应产生的核酸片段长度越长，所提供的荧光标记探针杂交的位置也越多，与荧光探针杂交后的荧光信号也越强。其中成像链可以是荧光基团标记的寡核苷酸探针，也可以是具有荧光增强作用的荧光标记探针/材料。

图2，是本发明提供的一种基于有序颜色编码策略的用于待分析样本(如细胞样本)中16种靶标(如蛋白质)检测的方法原理示意图。

图3，是本发明提供的一种用于有序颜色编码策略检测的64种靶标有序颜色编码表原理示意图。

图4，是在本发明中提供的一种细胞原位中靶标有序颜色编码成像的实施例示意图。

具体实施方式

本发明特别提供了例如基于荧光基团标记成像探针及颜色编码检测策略的细胞原位环境中多个靶标快速多重成像的方法。此方法涉及分析多个特定样品(例如：生物样品)中的多种靶标(例如：蛋白质)，尤其是远多于荧光显微镜检测通道数的多种靶标。在一些情况下，靶标是否存在样品中是未知的，一个样品可能含有一个或多个给定的待分析靶标。因此，本披露的方法可以用于确定一个或多个给定的靶标是否存在特定样品中。

此方法依赖于采用一种正交寡核苷酸标签，这些标签可以稳定地结合在靶标特异性结合分子上(例如：抗体)，具有寡核苷酸标签的靶标特异性结合分子能够与待测样本中潜在的靶标进行稳定结合，然后通过添加与这些寡核苷酸标签互补的特定经标记成像探针或成像材料而形成稳定的部分双链杂交结构。其中，可以先利用核酸放大方法(例如：原位延伸反应)对寡核苷酸标签进行扩增延伸，然后再将其与特定经标记成像探针或成像材料杂交。此外，其中还可以先利用工程化或人工合成的长单链核酸材料与这些寡核苷酸标签杂交，然后再将结合在寡核苷酸标签上的长单链核酸材料与特定经标记成像探针或成像材料杂交。

上述成像探针或材料杂交完毕后，使用落射荧光或共聚焦显微镜检术将该样品成像，在荧光显微镜下，每种靶标对应的荧光颜色相同或不同。成像结束后，使用外加作用力或缓冲液去除成像探针或成像材料。再一次，每种靶标对应的长单链核酸重复杂交相同或不同标记的成像探针(材料)，并使用落射荧光或共聚焦显微镜检术将该样品成像，在荧光显微镜下，每种靶标对应的荧光颜色相同或不同。成像结束后，使用外加作用力或缓冲液去除成像探针或成像材料。如此循环多轮。其中，根据预先对每一个靶标编码好的颜色顺序及种类，选择每一轮中使用的成像探针标记基团。

最终，根据每一个寡核苷酸标签成像后荧光颜色的种类和变化顺序，对样品中特异性结合分子对应的靶标种类进行判读。其中寡核苷酸标签成像后荧光颜色的种类和变化顺序决定了对应靶标的种类，而成像后的荧光量化数目决定了对应靶标的含量信息。因此，本方法实现了生物样品中多重靶标的原位定位及定量检测分析。

在一些实施例中，具体颜色编码规律原理参见图2，以具有4个可用检测通道的荧光显微镜为例，拟定分析单细胞样本中16种蛋白质靶标来阐述该原理流程。1)首先对拟分析的16种蛋白质靶标设计不同的寡核苷酸标签标记的靶标特异性结合分子，针对每种寡核苷酸标签再分别设计不同荧光基团标记的成像探针。2)根据不同靶标使用的荧光成像探针顺序和种类对其设计一种独特的组合，参见图2中的表格，也即是在第一轮成像时，靶标01、02、03、04均使用红色荧光基团标记的特异性荧光成像探针进行表征；靶标05、06、07、08均使用绿色荧光基团标记的特异性荧光成像探针进行表征；靶标09、10、11、12均使用蓝色荧光基团标记的特异性荧光成像探针进行表征；靶标13、14、15、16均使用黄色荧光基团标记的特异性荧光成像探针进行表征。3)因此，经过第一轮的成像，16种靶标可以全部被检测，得到了第一轮成像结果。然后需要对使用相同颜色荧光表征的靶标进行进一步区分，也即是再进行第二轮成像。4)在第二轮成像前，利用“漂白”方法(如丙三醇溶液、低盐缓冲液洗涤)去除上一轮特异性杂交的荧光成像探针，使样本脱去荧光，然后再进行第二轮的特异性荧光成像探针的杂交，参加图2中的表格，第一轮使用红色荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征的四种靶标01、02、03、04，在第二轮表征时分别使用不同颜色(即分别为红色、绿色、蓝色、黄色)荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征；第一轮使用绿色荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征的四种靶标05、06、07、08，在第二轮表征时分别使用不同颜色(即分别为红色、绿色、蓝色、黄色)荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征；第一轮使用蓝色荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征的四种靶标09、10、11、12，在第二轮表征时分别使用不同颜色(即分别为红色、绿色、蓝色、黄色)荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征；第一轮使用黄色荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征的四种靶标13、14、15、16，在第二轮表征时分别使用不同颜色(即分别为红色、绿色、蓝色、黄色)荧光基团标记的特异性荧光成像探针表征。特异性荧光成像探针杂交完毕后，然后对样本进行成像分析，得到第二轮成像结果。5)最终，样本中潜在的16种待测靶标分别经过了两轮的成像，参见图2下半部分的单个细胞成像示意图，每一个成像后的荧光亮点都对应有两轮有顺序的荧光成像，然后根据每一个荧光亮点成像的颜色种类和颜色变化顺序，并对照图2中的表格即可知道该亮点是哪一种靶标的信号。如：若亮点颜色第一轮成像时是红色，第二轮成像时还是红色，则该亮点为靶标01的信号；若亮点颜色第一轮成像时是红色，第二轮成像时是绿色，则该亮点为靶标02的信号；若亮点颜色第一轮成像时是红色，第二轮成像时是蓝色，则该亮点为靶标03的信号；以此类推，可以知道每一个亮点对应的靶标种类，即(红色，红色)靶标01，(红色，绿色)靶标02，(红色，蓝色)靶标03，(红色，黄色)靶标04，(绿色，红色)靶标05，(绿色，绿色)靶标06，(绿色，蓝色)靶标07，(绿色，黄色)靶标08，(蓝色，红色)靶标09，(蓝色，绿色)靶标10，(蓝色，蓝色)靶标11，(蓝色，黄色)靶标12，(黄色，红色)靶标13，(黄色，绿色)靶标14，(黄色，蓝色)靶标15，(黄色，黄色)靶标16。

因此，本发明的有序颜色编码成像规律可以总结为：若使用具有4个可用检测通道的荧光显微镜，经过两轮有序颜色的表征，最多可以有16(4×4，也即4²)种有序的颜色组合，即对应最多可以同时分析16种靶标(参见图2中表格)；经过三轮有序颜色的表征，最多可以有64(4×4×4，也即4³)种有序的颜色组合，即对应最多可以同时分析64种靶标(参见图3)；若经过n轮有序颜色的表征，最多可以有4ⁿ(4×4×···×4，也即4ⁿ)种有序的颜色组合，即对应最多可以同时分析4ⁿ种靶标；以此类推，若使用具有m个可用检测通道的荧光显微镜，经过n轮有序颜色的表征，最多可以有mⁿ(m×m×···×m，也即mⁿ)种有序的颜色组合，即对应最多可以同时分析mⁿ种靶标。

应当理解，其中所述4个可用检测通道的荧光显微镜是指能够同时检测四种不同荧光基团发射光的荧光显微镜。

应当理解，不同的荧光基团在其最适激发光下发射出的荧光颜色不同，因此，其中所述红色、绿色、蓝色、黄色并非荧光基团的颜色，也不是荧光基团发射光的颜色，而是可以用来区分四种荧光基团发射光的任何不同种的颜色，即可以是通过显微镜自动伪色着色的颜色，也可以是人工手动处理图像时伪色着色的颜色。

应当理解，不同靶标在不同成像轮次中使用的荧光成像探针的荧光基团标记可以相同，也可以不同，是根据预先编排好的有序颜色编码决定的。但是，不同靶标的特异性荧光成像探针的核苷酸序列是不同的，是具有靶标特异性的。

应当理解，其中所述亮点可以是寡核苷酸标签经过原位核酸扩增，并与特异性荧光成像探针杂交之后，在荧光显微镜下观测到的荧光信号。

因此，结合本发明的方法，使用具有四个荧光检测通道的荧光显微镜，通过两轮的有序颜色编码成像，可以检测16种靶标；通过三轮的有序颜色编码成像，可以检测64种靶标(参见图3)；通过n轮的有序颜色编码成像，可以检测4ⁿ种靶标。也因此，这种方法就突破了具有四个荧光检测通道的荧光显微镜一次最多只能区分检测4种靶标，两轮成像最多只能区分检测8种靶标，三轮成像最多只能检测12种靶标，n轮成像最多只能检测4n种靶标的限制。因此，本发明的一般性涉及通过上述寡核苷酸标签在每一轮检测中的荧光颜色种类和颜色变化顺序对其进行解码分析，根据成像后荧光位置和数量分别对相应靶标进行定位与定量分析。本发明一般性还涉及用于颜色编码策略的寡核苷酸标签-标签特异性杂交寡核苷酸模板-特异性荧光探针的三元组合物，其中寡核苷酸标签的序列为正交设计的，与待测靶标一一对应，而标签特异性杂交寡核苷酸模板能够与特定序列的寡核苷酸标签杂交，可利用该模板对寡核苷酸标签进行扩增放大，扩增放大形成的产物能够与特定序列的特异性荧光探针杂交。因此每一个寡核苷酸标签经过扩增放大最终可杂交多个荧光探针，使信号得到增加，也因此靶标信号更易于识别读出，利于颜色编码策略的实施。此外，在此过程中，扩增放大产物上杂交的荧光探针能够通过特定缓冲液或外加电场去除，去除荧光探针的扩增放大产物还可以继续与其它颜色的荧光探针杂交，因此，本发明的一般性还涉及对同一靶标的不同或相同颜色的荧光重复检测。

在靶标特异性的成像探针(材料)与一种寡核苷酸标签杂交并成像后，进行成像探针(材料)的去除(例如：使用丙三醇溶液、低盐缓冲液、电泳)以便消除来自上一轮成像探针(材料)的荧光。随后重复成像探针(材料)的杂交和成像过程，以便进行基于颜色编码策略的成像。从而实现多重靶标的成像。

对于本发明披露的高通量多重检测，不会受到传统成像方法中对荧光显微镜有限荧光检测通道数的限制。正交寡核苷酸标签及对应成像探针设计容易，此方法可以通过重复步骤地多轮成像实现理论上的数十至上百个靶标的检测与分析。

这些方法具有在例如分子生物学(例如：循环肿瘤细胞的检测与表征、肿瘤细胞恶性程度多靶标表征)中的适用性。在此披露的方法还可以对同一个样品或不同样品中靶标之间的相对含量进行分析。

在本发明中，术语“靶标”是希望观察或量化分析的并且存在能与其特异性结合耦合物的任何生物成分。在一些实施例中，靶标可以是工程化的或非天然存在的生物分子。此“生物分子”是由一种活体生物产生的任何分子，包括大分子，诸如蛋白质、蛋白多糖、脂质及核酸，以及小分子，诸如代谢产物以及天然产物。生物分子的实例包括但不限于：DNA、RNA、cDNA、或经受逆转录的RNA的DNA产物。

在一些实施例中，一种靶标可以是一种蛋白质靶标，例如，一种细胞环境的蛋白质(例如：细胞质蛋白、细胞膜蛋白或细胞核蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于：纤维状蛋白质，诸如细胞支架蛋白质(例如，肌动蛋白、arp2/3、冠蛋白、肌养蛋白、FtsZ、角蛋白、肌球蛋白、伴肌动蛋白、血影蛋白、tau蛋白、肌联蛋白、原肌球蛋白、微管蛋白以及胶原质)，以及细胞外基质蛋白(例如，胶原质、弹性蛋白、底板反应蛋白、皮卡丘素、以及纤连蛋白)；球状蛋白质，诸如血浆蛋白质(例如，血清淀粉样蛋白P成分和血清白蛋白)、凝血因子(例如，补体蛋白质、C1-抑制剂以及C3-转化酶、因子VIII、因子XIII、纤维蛋白、蛋白质C、蛋白质S、蛋白质Z、蛋白质Z相关蛋白酶抑制剂、凝血酶、血管假性血友病因子)，以及急性期蛋白质，诸如C反应蛋白质；血红素蛋白；细胞粘附蛋白(例如，钙粘蛋白、室管膜蛋白、整合蛋白、Ncam以及选择蛋白)；跨膜运输蛋白质(例如，CFTR、血型糖蛋白D和混杂酶)，诸如离子通道(例如，配体门控离子通道，诸如烟碱型乙酰胆碱受体和GABAa受体，以及电压门控离子通道，诸如钾、钙和钠通道)，同向运输/反向运输蛋白质(例如，葡萄糖转运蛋白)；激素和生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肽类激素(诸如胰岛素、胰岛素样生长因子以及催产素)以及类固醇激素(诸如雄激素、雌激素和黄体酮)；受体，诸如跨膜受体(例如，G蛋白偶联受体、视紫红)和细胞内受体(例如，雌激素受体)；DNA结合蛋白质(例如，组蛋白、鱼精蛋白、CI蛋白)；转录调节物(例如，c-myc、FOXP2、FOXP3、MyoD以及P53)；免疫系统蛋白质(例如，免疫球蛋白、主要组织相容性抗原以及T细胞受体)；营养物储存/转运蛋白质(例如，铁蛋白)；以及酶。

实施例1

(1)实验材料及试剂：

Anti-HBEGF(Biotin)购自Abcam公司；生物素化抗体Anti-ERBB2(Biotin)购自R＆D SYSTEMS公司；SSC缓冲液、甲酰胺、胺反应性交联剂BS(PEG)₅、鲑鱼精DNA(Salmon SpermDNA)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Glass Bottom Cell Culture Dish细胞培养皿购自无锡耐思生物科技有限公司；细胞培养级磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，不含氯化钙、氯化镁，1×PBS pH 7.4)购自美国

DMEM培养基(含青霉素-链霉素双抗)购自凯基生物；胰蛋白酶(Trypsin)购自美国

无菌胎牛血清(FBS)购自阿根廷Natocor-Industria

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自美国Amresco公司；生物素及聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100)购自美国Sigma-Aldrich公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自武汉博士德(Boster)公司；所有寡核苷酸探针、生物素化寡核苷酸探针、磷酸化寡核苷酸探针、荧光基团修饰寡核苷酸探针均由上海生工生物有限公司合成制备，纯化级别为HPLC级；5×TBE缓冲液购自上海生工生物有限公司；dNTPs购自北京赛百盛生物科技有限公司；T4 DNA ligase连接酶、phi29 DNApolymerase聚合酶购自NEB公司；氯化铵、氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司；分析级实验用水(出水测量值18.2MΩ)来自净水仪器Explorer series Water Purification system，购自美国Blue

细胞级实验用水来自经高压灭菌的分析级实验用水；其它分子生物学实验用水购自屈臣氏蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

寡核苷酸标签1：Biotin-AAAAA AAAAA AAAAA TTCAC TGGAC GCTAA TAGTT AAGACGCTTA AATAT GAC

寡核苷酸标签2：Biotin-AAAAA AAAAA AAAAA TGAGG ATAGG ACATG CGATA AGCGATCTTC ACAGT TG

单链DNA分子1：PO4-CTATT AGCGT CCAGT GAATG CGACC AGCAG ACAGA GAGTAGTACA GCACG ACCAG CAGAC ATCTA GTTCT GTCAT ATTTAAGCGT CTTAA

单链DNA分子2：PO4-CGCAT GTCCT ATCCT CAGCT ACGAC CACGC AGGTG ATCATCAGAA CTACG ACCAC GCAGC CACCA GCTCC AACTG TGAAG ATCGC TTAT

荧光探针1.1：Cy5-CGACC AGCAG ACA

荧光探针2.1：Cy5-ACGAC CACGC AG

荧光探针1.2：Cy3-CGACC AGCAG ACA

荧光探针2.2：Alexa Fluor 488-ACGAC CACGC AG

荧光探针1.3：Alexa Fluor 488-CGACC AGCAG ACA

(2)细胞培养实验步骤、内容及条件：

MDA-MB-231细胞系使用含10％FBS和50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素双抗混合溶液的DMEM培养基培养。细胞培养条件为：95％相对湿度，5％二氧化碳气体，37℃。当细胞生长到约90％融合度时开始传代，为保证细胞生长处于对数生长期，需要控制细胞接种密度，以细胞传代周期为2～3天为宜。传代时，使用0.25％胰酶-EDTA在37℃下对贴壁细胞进行消化，当细胞呈现流沙状脱落时，立即使用含10％FBS的培养基终止消化。重悬后的细胞悬液经血球计数板计数后，按细胞大小及生长速度取合适密度的细胞接种于细胞培养瓶或培养皿内继续培养。

(3)寡核苷酸标签标记抗体修饰实验步骤、内容及条件：

取25μL体积的2.5μM寡核苷酸标签1或2，与25μL体积的2.5μM链霉亲和素充分混合，在37℃下恒温孵育30分钟。然后，在反应混合液中加入50μL的1.25μM抗体Anti-HBEGF(Biotin)(对应寡核苷酸标签1)或抗体Anti-ERBB2(Biotin)(对应寡核苷酸标签2)，充分混匀，在25℃下恒温孵育30分钟。最后加入1mM生物素，25℃下恒温孵育20分钟。该过程中的反应稀释液为Assay Buffer(8mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，150mM NaCl，0.1％BSA，0.025％Tween 20，pH 7.4)。最终用于样本检测的寡核苷酸标签标记抗体浓度以未修饰的生物素化抗体的当量浓度计算，为0.5～2.5μg/100μL范围，并含0.5mg/mL的鲑鱼精DNA溶液。

(4)靶标检测实验步骤、内容及条件：

在步骤(2)中，用玻底培养皿培养的MDA-MB-231细胞生长至细胞融合度50％时，将其作为待分析细胞样品1×PBS充分润洗3次，除去血清、培养基成份与细胞分泌物，4％多聚甲醛溶液常温孵育45分钟，然后在100mM NH₄Cl的1×PBS溶液中淬灭反应20分钟，1×PBS清洗5分钟，将细胞在0.1％Triton X-100的1×PBS中透化5分钟，1×PBS溶液润洗三次，然后在5％BSA溶液中封闭2小时，然后37℃下摇晃孵育在0.05mg/mLRNaseA中，1×PBS润洗三次，加入0.1mg/mL链霉亲和素(含0.5mg/mL Salmon Sperm DNA)37℃下摇晃孵育30分钟，弃去溶液，加入1mM生物素37℃下摇晃孵育30分钟，并用1×PBS润洗3次。

将经过以上处理的待分析细胞样品与按步骤(3)合成的寡核苷酸标签1标记抗体Anti-HBEGF(Biotin)和寡核苷酸标签2标记抗体Anti-ERBB2(Biotin)(含0.5mg/mL SalmonSperm DNA，其中Anti-HBEGF(Biotin)或Anti-ERBB2(Biotin)抗体当量浓度为0.5μg/100μL)于4℃下过夜摇晃孵育，第二天用含0.1％Triton X-100和2％BSA的1×PBS洗涤3次，每次持续10分钟。然后将样品用1×PBS洗涤两次，每次5分钟，蒸馏水润洗一次。

使用5mM浓度的胺反应性交联剂BS(PEG)₅的PBS溶液，在室温下孵育30分钟，以将特异性结合的抗体(步骤(4)中所述按步骤(3)合成的寡核苷酸标签1标记抗体Anti-HBEGF(Biotin)和寡核苷酸标签2标记抗体Anti-ERBB2(Biotin))交联固定在上述待分析细胞样品上，然后用100mM NH₄Cl的PBS淬灭反应5分钟，1×PBS洗涤两次，每次3分钟。

接下来，将经过以上处理的待分析细胞样品与100nM单链DNA分子1和2的混合溶液(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，摇晃孵育15-30min，1×PBS润洗三次，DEPC水润洗一次，吸去所有液体后立即加入T4连接酶体系(50mMTris-HCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP，0.1U/μL T4 DNA ligase，pH 7.5)，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，吸去所有液体后立即加入phi29聚合酶体系(0.5mM dNTPs，0.25U/μL phi29 DNApolymerase，0.2mg/mL BSA，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM (NH₄)₂SO₄，4mMDTT，pH 7.5)，于37℃下摇晃孵育60分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次。

靶标蛋白质HBEGF及ERBB2荧光检测：第一轮：加入2.5μM靶标特异性荧光探针1.1和2.1混合溶液(稀释在含2×SSC，0.5mg/mL Salmon SpermDNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20min。将样本放置在水平电泳槽内，25-37℃下，1×TBE电泳缓冲液，电压90V(两极垂直距离16cm的水平电泳槽)，电泳5min。然后通过荧光显微镜进行成像，以观察靶标特异性荧光探针1.1和2.1对应的不同颜色的荧光(也即完成了所述待分析细胞样品第一轮成像)。去除杂交的荧光探针1.1和2.1：将样本放置在水平电泳槽内，25-37℃下，1×TBE电泳缓冲液，电压260V(两极垂直距离16cm的水平电泳槽)，电泳5min。第二轮：加入2.5μM靶标特异性荧光探针1.2和2.2混合溶液(稀释在含2×SSC，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20min。将样本放置在水平电泳槽内，25-37℃下，1×TBE电泳缓冲液，电压90V(两极垂直距离16cm的水平电泳槽)，电泳5min。然后通过荧光显微镜进行成像，以观察靶标特异性荧光探针1.2和2.2对应的不同颜色的荧光(也即完成了所述待分析细胞样品第二轮成像)。去除杂交的荧光探针1.2和2.2：将样本放置在水平电泳槽内，25-37℃下，1×TBE电泳缓冲液，电压260V(两极垂直距离16cm的水平电泳槽)，电泳5min。第三轮：加入2.5μM靶标特异性荧光探针1.3和2.1混合溶液(稀释在含2×SSC，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20min。将样本放置在水平电泳槽内，25-37℃下，1×TBE电泳缓冲液，电压90V(两极垂直距离16cm的水平电泳槽)，电泳5min。然后通过荧光显微镜进行成像。以观察靶标特异性荧光探针1.3和2.1对应的不同颜色的荧光(也即完成了所述待分析细胞样品第三轮成像)。

对于相同靶标的重复多轮检测，需要控制增益和曝光时间一致。细胞成像及数据处理：在Nikon ECLIPSE Ni显微镜下进行样本采集并记录曝光时间及增益值。所有图像通过TCapture采集软件获取及伪彩处理。

最终，经过三轮的荧光探针杂交与显微镜成像，所述待分析细胞样品中两个待测蛋白质靶标HBEGF及ERBB2分别有三次荧光成像，即分别对应一组荧光成像颜色种类和变化顺序。

检测结果参见图4，左侧颜色编码/解码表是预先编排的荧光颜色种类和顺序，分别代表本实施例上述实验中：第一轮中荧光探针1.1(用于HBEGF)和2.1(用于ERBB2)、第二轮中荧光探针1.2(用于HBEGF)和2.2(用于ERBB2)、第三轮中荧光探针1.3(用于HBEGF)和2.1(用于ERBB2)的电脑虚拟伪色及其对应荧光出现轮次。其中，按照颜色编码/解码表，在第一轮成像中荧光探针1.1与2.1的荧光信号均用紫色(电脑虚拟伪色)展示，在第二轮成像中荧光探针1.2和2.2的颜色分别用黄色和蓝色(电脑虚拟伪色)展示，在第三轮成像中荧光探针1.3和2.1分别用蓝色和黄色(电脑虚拟伪色)展示。

图右侧，是利用该“有序颜色编码策略”对所述待分析细胞样品中同一个单细胞的荧光成像图，从该图中可以看到，每一轮中该单细胞都呈现出了特定颜色的荧光亮点，其中第一轮中仅出现了紫色的荧光亮点，第二轮中出现了黄色和蓝色的荧光亮点，第三轮中也出现了黄色和蓝色的荧光亮点。这些亮点的出现表明了蛋白质靶标HBEGF和ERBB2存在于所述待分析细胞样品中，这些亮点的位置指示了两种蛋白质在所述单细胞中的亚细胞位置。此外，从图4的最右侧局部放大图可以发现，可以很容易地区分辨别每一个荧光亮点在不同轮次成像过程中展示出的颜色种类及颜色变化顺序信息，将这些信息与图4中预先编排的颜色编码/解码表对照可知，每一个亮点分别代表了其来源于HBEGF或ERBB2，并且每一个亮点展示的颜色种类和变化顺序均能够通过所述颜色编码/解码表进行读取解码。也因此，该实施例证明了有序颜色编码策略在实施过程中的原理可行性。

此外，在通过对照所述颜色编码/解码表识别了每一个荧光亮点的靶标信息之后，本发明方法还可以通过荧光亮点的计数实现靶标的量化分析。这是因为：靶标HBEGF(或ERBB2)是通过对应的抗体anti-HBEGF(biotin)(或anti-ERBB2(biotin))与其寡核苷酸标签1(或寡核苷酸标签2)间接相连的，该寡核苷酸标签通过核酸扩增延伸出的长单链DNA与对应特异性荧光探针(HBEGF对应荧光探针1.1、1.2、1.3，ERBB2对应荧光探针2.1、2.2)杂交后，在荧光显微镜下就形成了图4右侧图中的荧光亮点。所以，在数量关系上，荧光亮点的数量能够反映出对应靶标的数量，于是可以通过荧光亮点的计数实现靶标的量化分析。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 寡核苷酸标签1(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaaaaaa aaaaattcac tggacgctaa tagttaagac gcttaaatat gac 53

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 寡核苷酸标签2(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaaaaaaaa aaaaatgagg ataggacatg cgataagcga tcttcacagt tg 52

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> 单链DNA分子（Padlock分子）1(Artificial Sequence)

<400> 3

ctattagcgt ccagtgaatg cgaccagcag acagagagta gtacagcacg accagcagac 60

atctagttct gtcatattta agcgtcttaa 90

<210> 4

<211> 89

<212> DNA

<213> 单链DNA分子（Padlock分子）2(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcatgtcct atcctcagct acgaccacgc aggtgatcat cagaactacg accacgcagc 60

caccagctcc aactgtgaag atcgcttat 89

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213> 荧光探针1.1(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaccagcag aca 13

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 荧光探针2.1(Artificial Sequence)

<400> 6

acgaccacgc ag 12

<210> 7

<211> 13

<212> DNA

<213> 荧光探针1.2(Artificial Sequence)

<400> 7

cgaccagcag aca 13

<210> 8

<211> 12

<212> DNA

<213> 荧光探针2.2(Artificial Sequence)

<400> 8

acgaccacgc ag 12

<210> 9

<211> 13

<212> DNA

<213> 荧光探针1.3(Artificial Sequence)

<400> 9

cgaccagcag aca 13

Claims

1.基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，其特征在于，所述检测方法通过不同荧光标记核酸探针对多种待测靶标进行多轮次重复成像检测，并根据靶标在不同轮次成像中荧光信号颜色种类及变化顺序来区分识别各个靶标种类，具体包括如下步骤：将样本中的每种待测靶标通过直接或间接方式结合一种或多种序列不同的寡核苷酸片段，每种寡核苷酸片段与一种或多种序列互补的荧光标记核酸探针通过碱基互补原理进行杂交后，用荧光成像设备成像，使待测靶标呈现对应的荧光信号，成像结束后，使用外加作用力或缓冲液去除所有荧光标记核酸探针，然后再次加入荧光标记核酸探针进行杂交成像，如此进行多轮的荧光标记核酸探针杂交成像，多轮杂交成像结束后，通过荧光信号出现的种类、顺序和位置来对样本中的不同靶标进行定性和定位检测。

2.根据权利要求1所述的基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，其特征在于，样本中的相同靶标在每一轮荧光标记核酸探针杂交成像中所显示的荧光颜色均相同，不同靶标在每轮荧光标记核酸探针杂交成像中所显示的荧光颜色相同或不同，但多轮荧光标记核酸探针杂交成像后，每种靶标都具有唯一的从第一轮到最后一轮荧光杂交成像的荧光信号颜色出现顺序，这一顺序为每种靶标的荧光颜色编码，根据相同荧光颜色编码出现的位置可确定对应靶标在样品中的分布位置。

3.根据权利要求1所述的基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，其特征在于，所述直接方式为通过核酸或核酸适配体使寡核苷酸片段直接与待测靶标结合，所述间接方式为通过寡核苷酸片段标记的抗体或抗原或其它分子与靶标结合。

4.根据权利要求1所述的基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，其特征在于，所述的样本为细胞或组织；所述靶标为蛋白质、多肽、蛋白多糖或核酸中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，其特征在于，所述荧光标记核酸探针包括至少一种荧光基团标记的寡核苷酸或至少一种单独合成或工程化的包含荧光发射部分及寡核苷酸标签识别结合部分的纳米材料。

6.根据权利要求1所述的基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，其特征在于，所述用于去除样品中的荧光标记核酸探针的外加作用为电场作用力，所述缓冲液为含有丙三醇、低盐的弱化氢键作用力的化合物成分的缓冲液。

7.根据权利要求5所述的基于颜色编码与可编程性荧光探针的多重靶标原位检测方法，其特征在于，所述纳米材料是至少一种纳米尺度的核酸、金属颗粒或量子点性质的材料。