CN114752705A - 一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114752705A CN114752705A CN202210355033.2A CN202210355033A CN114752705A CN 114752705 A CN114752705 A CN 114752705A CN 202210355033 A CN202210355033 A CN 202210355033A CN 114752705 A CN114752705 A CN 114752705A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- dna
- sequence
- magnetic
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 86
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000012800 visualization Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims abstract description 19
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 12
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 10
- 101100316897 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 E gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100240079 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 N gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 5
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 3
- -1 aminocarboxyl Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 3
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 58
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 5
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 101150050559 SOAT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100021993 Sterol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N (3aR,4R,9bS)-golgicide A Chemical compound C1([C@@H]2NC3=C(F)C=C(C=C3[C@H]3C=CC[C@H]32)F)=CC=CN=C1 NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 101710147059 Nicking endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒包括磁性检测探针和DNA扩增元件F1、F2；所述磁性检测探针包括磁颗粒，磁颗粒表面修饰有DNA锚定链P1，DNA探针链L1、L2、L3及DNA荧光链R1；L1和L2的序列分别与两段待测病毒核酸特征序列T1、T2互补；P1的序列与L1的序列部分互补；L1上杂交有荧光修饰的序列R1以及L2；L2与L3的序列部分互补；F1和F2可以在T1、T2同时存在时打开杂交体，释放出荧光链R1，指示体系中待测病毒核酸特征序列T1、T2的同时存在。本发明的试剂盒无需PCR扩增，仅用荧光激发灯便可以方便地检测病毒，节约诊断时间。
Description
技术领域
本发明属于荧光生物传感及核酸检测技术领域，具体涉及一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎在全球造成极大的影响，引起了各国政府与世界卫生组织(WHO)的高度关注。新型冠状病毒肺炎是由2019新型冠状病毒感染导致的肺炎引起的，对全人类的健康与世界经济发展造成巨大威胁。因此，针对新型冠状病毒的检测方案有助于将公共卫生安全风险降至最低，以便于更快地治疗现有案例，并减缓疫情传播速度。PCR是新冠病毒核酸(SARS-CoV-2)检测的有效方法，可实现对目标基因的扩增和检测，但是传统的PCR技术需要在反应终点时，通过凝胶电泳来判断目标基因是否存在，且其检测灵敏度比较低，定量也不够准确。通过PCR技术与荧光标记相结合，使用荧光标记的引物为探针来产生荧光信号，可极大的提高检测的准确性。但是，RT-PCR技术仍需要专业的控温仪器与专业的实验人员，需要针对目标核酸设计引物并进行核酸扩增，存在耗时长、成本高及操作繁琐的问题，无法满足在短时对病毒核酸进行现场即时检测需求。尤其在资源匮乏地区，由于专业仪器的缺乏可能会对检测造成延误。因此，发展即时、快速、准确、经济的核酸检测传感器对于核酸现场即时监测意义重大。
相比于需要复杂升温程序和专业仪器的RT-PCR技术，核酸等温扩增技术只需要简单的水浴或金属浴就可以实现对目标核酸序列的扩增，实现灵敏度的快速提高，在现有病毒检测方案中有明显的优势。常见的等温核酸技术可以分为两类：第一类恒温扩增反应依赖于特异性引物延伸，如环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated IsothermalAmplification，LAMP)，转录介导扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)；第二类恒温扩增反应依赖于限制性内切酶，如缺口内切酶扩增反应(Nicking EndonucleaseAmplification Reaction，NEAR)等。但基于这些方式的扩增方法也存在一些缺点，如操作过程中易污染出现假阳性结果，反应过程中需要多种酶的参与，操作较为复杂等。基于核酸链置换引发的等温扩增反应近年来吸引了研究者的广泛关注，包括链置换扩增(StrandDisplacement Amplification，SDA)、杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)等，由于特定的核酸序列易于合成和精确修饰，检测策略具有更高的灵活性与极高的稳定性，该方法在生物分子检测和生物传感器构建中潜力巨大。磁颗粒(Magentic Beads，MB)具有优异的高比表面积、良好的分子富集特性及快速分离特性，在即时传感器的构建中独具优势。荧光分析法是通过定性定量分析待测物质被光源照射后发出反应该物质荧光强度的方法。基于荧光检测装置测量荧光标记物是生物传感器中最灵敏的策略之一。
综上，当前检测新型冠状病毒的检测方案存在耗时长、受大型仪器限制、有条件限制、操作复杂等缺点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用，可用于新型冠状病毒的核酸检测，实现对新型冠状病毒核酸的即时、快速、准确、经济检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，包括磁性检测探针和DNA扩增元件F1、F2；所述磁性检测探针包括磁颗粒，所述磁颗粒表面修饰有DNA锚定链P1，DNA探针链L1、L2、L3及DNA荧光链R1；
所述L1和L2的序列分别与两段待测病毒核酸特征序列T1、T2互补；
所述P1一端连有生物素或氨基，可以使DNA锚定链连接到亲和素或羧基修饰的磁珠上，P1的序列与L1的序列部分互补；
所述L1上杂交有荧光修饰的序列R1以及L2，并且L1的序列与一段待测病毒核酸特征序列T1部分互补；
所述L2与L3的序列部分互补，并且L2的序列与另一段待测病毒核酸特征序列T2部分互补；
所述F1与L1的序列部分互补；所述F2与L2的序列部分互补；
所述F1和F2可以在T1、T2同时存在时打开P1/L1/L2/L3/R1的杂交体，释放出荧光链R1，指示体系中待测病毒核酸特征序列T1、T2的同时存在；在此过程中释放出T1、T2进行循环利用，实现信号扩增。
优选地，所述R1所修饰的荧光为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。
优选地，还包括待测病毒核酸阳性检测样本和Tris缓冲液；所述待测病毒核酸阳性检测样本包括特征序列T1、T2。
优选地，所述T1、T2分别为SARS-CoV-2N基因片段、SARS-CoV-2E基因片段，或ORF1ab特征基因片段。
优选地，所述待测病毒为SARS-CoV-2；
所述P1具有如SEQ ID No.1所示的序列；
所述L1具有如SEQ ID No.2所示的序列；
所述L2具有如SEQ ID No.3所示的序列；
所述L3具有如SEQ ID No.4所示的序列；
所述R1具有如SEQ ID No.5所示的序列；
所述F1具有如SEQ ID No.6所示的序列；
所述F2具有如SEQ ID No.7所示的序列；
所述T1为SARS-CoV-2N基因片段，具有如SEQ ID No.8所示的序列；
所述T2为SARS-CoV-2E基因片段，具有如SEQ ID No.9所示的序列。
优选地，所述磁颗粒是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm。
一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将DNA锚定链P1通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面；通过磁分离去除多余的DNA锚定链，并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散；
(2)向步骤(1)得到的磁颗粒中加入DNA探针链L1、L2、L3和DNA荧光链，在磁颗粒表面形成杂交结构；通过磁分离去除多余的DNA探针链和DNA荧光链并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散，组装成磁性检测探针；
(3)向步骤(2)得到的磁颗粒中加入DNA扩增元件F1、F2，即得。
优选地，步骤(1)所述将DNA锚定链P1通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面的具体步骤为以下两种方案之一：
(a)将生物素化的DNA锚定链和链霉亲和素修饰的磁颗粒混合，并对组装后的磁颗粒进行清洗，去除多余的DNA锚定链，将得到的磁颗粒分散在Tris缓冲液中储存；
所述Tris缓冲液为：50mM Tris-HCl，140mM NaCl，1mM MgCl2，pH＝7.4；
(b)将羧基修饰的磁颗粒稀释在MES缓冲液中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液洗涤三次，加入基修饰的DNA锚定链，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁颗粒分散在PBS缓冲液中；
所述MES缓冲液为：100mM MES，pH＝6.0；
所述EDC缓冲液为：100mM MES，200mM EDC，pH＝6.0；
所述NHS缓冲液为：100mM MES，100mM NHS，pH＝6.0；
所述PBS缓冲液为：10mM PBS，pH＝7.2。
优选地，步骤(1)所述DNA锚定链P1是由生物素或氨基修饰的，P1的浓度为10～5000nM；步骤(2)所述DNA探针链L1、L2均与目标核酸部分互补，L1、L2、L3的浓度均为10～5000nM；步骤(3)所述DNA扩增元件F1、F2可催化等温核酸扩增反应的进行，F1、F2的浓度均为10～5000nM。
优选地，步骤(1)所述P1的浓度为500nM；步骤(2)所述L1、L2、L3的浓度均为750nM；步骤(3)所述F1、F2的浓度均为1250nM。
上述的试剂盒在SARS-CoV-2核酸检测中的应用。
优选地，检测方法包括以下步骤：
向所述磁性检测探针中加入目标核酸，在20～45℃下反应10～120min进行等温核酸扩增反应，再通过磁分离，收集上清液；上清液在荧光激发灯的照射下，发出荧光则为阳性，不发荧光则为阴性。
优选地，所述等温核酸扩增反应的反应温度为37℃，反应时间为75min。
本发明的有益效果如下：
(1)磁颗粒具有优异的高比表面积、良好的分子富集特性及快速分离特性，在即时传感器的构建中独具优势。
(2)本发明通过荧光修饰技术设计DNA，基于荧光检测装置测量荧光标记物是生物传感器中最灵敏的策略之一，通过荧光激发灯激发即可实现对SARS-CoV-2的现场即时检测。
(3)可以在单个体系中实现两段病毒核酸特征序列的同时检测，提高SARS-CoV-2检测结果的可靠性。
(4)等温核酸扩增方法条件温和、无需蛋白酶参与反应，提高了传感器的灵敏度和稳健性；操作简单，成本低廉，不受场地和仪器的控制，不要求操作者受过良好的培训即可操作。
附图说明
图1为本发明的用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的原理示意图；
图2为实施例2中试剂盒对SRAS-CoV-2超灵敏可视化检测对比图；
图3为实施例3中试剂盒添加不同浓度的DNA扩增元件(F1、F2)下检测能力的测试结果；
图4为实施例4中试剂盒存在和不存在DNA扩增元件(F1、F2)下SDA反应时间动力学图；
图5为实施例5中试剂盒在不同温度下检测能力的测试结果；
图6为实施例6中试剂盒对SARS-CoV-2两段核酸(N基因片段和E基因片段)存在与否的检测结果：a为空白样，b为单独加入SARS-CoV-2E基因片段，c为单独加入SARS-CoV-2N基因片段，d为同时加入SARS-CoV-2E基因片段和SARS-CoV-2N基因片段；
图7为实施例7中试剂盒针对不同种类的病毒核酸特异性检测结果。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明，以下实施例中所有原料和试剂如无特殊说明，均为市售可得。
以下实施例以SARS-CoV-2作为目标病毒进行研究。
实施例1
一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，包括磁性检测探针和DNA扩增元件(F1、F2)；所述磁性检测探针包括磁颗粒，磁颗粒表面修饰的DNA锚定链(P1)、DNA探针链(L1、L2、L3)及DNA荧光链(R1)。所述磁颗粒是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm。
所述磁性检测探针的具体制备步骤如下：
(1)将所有DNA链加热至95℃并保持5min，然后冷却至室温至少2h，以形成设计的发卡结构，之后再使用。首先，将5μL的链霉亲和素修饰的磁珠稀释并用连接缓冲液(10mMTris-HCl，2M NaCl，pH＝7.4)反复洗涤3次，以去除表面保护剂。然后，用磁力架将磁珠吸附，吸出洗涤液，加入45μL的连接缓冲液，在磁珠分散液中加入5μL 10μM生物素修饰的锚定链P1以形成含有1μM生物素修饰的50μL P1溶液，并在37℃恒温摇匀仪中孵育1h。磁分离后，将P1修饰的磁珠用Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，140mM NaCl，1mM MgCl2，pH＝7.4)洗涤3次后，用磁力架将磁珠吸附，吸出洗涤液。再向溶液中加入DNA探针链(L1、L2、L3)、DNA荧光链(R1)(DNA探针链和DNA荧光链的终浓度均为0.5μM)以及反应缓冲液，形成50μL反应体系，在37℃恒温摇匀仪中孵育1h后，组装成磁性检测探针，将所得到的磁性检测探针放入冰箱4℃保存，以备之后对病毒SRAS-CoV-2核酸进行超灵敏可视化检测时使用。
DNA锚定链P1一端连有生物素或氨基，可以使DNA锚定链连接到亲和素或羧基修饰的磁珠上，其序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-biotin-TTTTT TTTTT TTTTT TGCTGCTAAC TTACT G-3’。
DNA锚定链P1是通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒表面的，具体步骤为以下两种方案之一：
(a)将生物素化的DNA锚定链P1和链霉亲和素修饰的磁颗粒混合，并对组装后的磁颗粒进行清洗，去除多余的DNA锚定链，将得到的磁颗粒分散在Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，140mM NaCl，1mM MgCl2，pH＝7.4)中储存。
(b)将羧基修饰的磁颗粒稀释在MES缓冲液(100mM MES，pH＝6.0)中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液(100mM MES，200mM EDC，pH＝6.0)和NHS缓冲液(100mM MES，100mM NHS，pH＝6.0)，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液(10mM PBS，pH＝7.2)洗涤3次，加入基修饰的DNA锚定链P1，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁颗粒分散在PBS缓冲液(10mM PBS，pH＝7.2)中。
本实施例采用的是(a)方案。
DNA探针链(L1、L2、L3)分别具有如SEQ ID No.2～4所示的序列，具体为：
L1(SEQ ID No.2)：5’-TACTG GTCAT CCGAA GAACG CTGAA GCGCT GGTAG GGCAGTAAGT TAGCA GCA-3’；
L2(SEQ ID No.3)：5’-TTCTT CGGAT GACCA GTATT TCGCT AGTGT AACTA GCAAGAATAC-3’；
L3(SEQ ID No.4)：5’-GCTAG TTACA CTAGC GAAAC AC-3’。
一种优选的方案，所述R1所修饰的荧光为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。在本实施例中，DNA荧光链R1是由6-FAM(含芳香烃/杂环结构的荧光团)修饰的，其序列如SEQ ID No.5所示，具体为：5’-6-FAM-TGTCC CTACC AGCGC TTCAG CG-3’。
其中，L1的序列与P1、L2和R1的序列部分互补；L2的序列与L1和L3的序列部分互补；L1的序列可以识别SARS-CoV-2部分DNA片段(T1)，与T1的序列部分互补；L2的序列可以识别SARS-CoV-2部分DNA片段(T2)，与T2的序列部分互补。
(2)将步骤(1)中制作好的荧光检测逻辑传感器(磁性检测探针)用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，140mM NaCl，1mM MgCl2，pH＝7.4)洗涤3次后，用磁力架将磁珠吸附，吸出洗涤液；再向溶液中加入DNA扩增元件(F1、F2)(DNA扩增元件的终浓度均为1250nM)，即得所述用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒。
DNA扩增元件(F1、F2)可催化等温核酸扩增反应的进行，其序列分别如SEQ IDNo.6～7所示，具体为：
F1(SEQ ID No.6)：5’-CTAAC TTACT GCCCT ACCAG CGCTT CAGCG-3’；
F2(SEQ ID No.7)：5’-GCTAG TTACA CTAGC GAAAT ACTGG TCATC CGAAG AA-3’。
其中，F1的序列与L1的序列部分互补；F2的序列与L2的序列部分互补；F1和F2可以在T1、T2同时存在时打开P1/L1/L2/L3/R1的杂交体，释放出荧光链R1，指示体系中SARS-CoV-2特征序列T1、T2的同时存在；在此过程中释放出T1、T2进行循环利用，实现信号扩增。
实施例2核酸检测
将实施例1制得的试剂盒用于核酸检测，原理如图1所示，具体步骤如下：
向所述磁性检测探针中加入终浓度为100nM的SARS-CoV-2目标核酸(T1、T2)阳性检测样本以及Tris缓冲液，在37℃下等温核酸扩增反应75min，反应完后通过磁珠分离收集上清液50μL。上清液在荧光激发灯(本实施例采用蓝光灯)的照射下，会发出绿色的荧光，通过裸眼观察便可得到明显的实验现象，如图2所示，发出荧光则为阳性，不发荧光则为阴性。
所述T1为SARS-CoV-2N基因片段，具有如SEQ ID No.8所示的序列，具体为：5’-CCAGC GCTTC AGCGT TCTTC G-3’；
所述T2为SARS-CoV-2E基因片段，具有如SEQ ID No.9所示的序列，具体为：5’-GTATT CTTGC TAGTT ACACT AG-3’。
实施例3DNA扩增元件(F1、F2)浓度测试
在实施例1步骤(2)中分别加入终浓度为0nM、250nM、500nM、750nM、1000nM、1250nM、1500nM、1750nM的DNA扩增元件(F1、F2)，分别组装好磁性检测探针，随后各取50μL制得的磁性检测探针，分别向其中加入终浓度为100nM SARS-CoV-2目标核酸(T1、T2)阳性检测样本。37℃下等温核酸扩增反应75min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。将各组上清液分别置于DNA荧光皿中，通过荧光仪进行荧光检测记录上清液荧光强度变化。
测试结果如图3所示，当F1、F2浓度为1250nM时，得到了最高的检测信噪比。因此，F1、F2的浓度优选为1250nM。
实施例4等温核酸扩增反应时间的优化
各取50μL实施例1制得的磁性检测探针及DNA扩增元件(F1、F2)，分别向其中加入终浓度为100nM SARS-CoV-2目标核酸(T1、T2)阳性检测样本。在37℃下分别反应15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。将各组上清液分别置于DNA荧光皿中，通过荧光仪进行荧光检测记录上清液荧光强度变化。
测试结果如图4所示，当反应时间为75min时，溶液荧光强度趋于平缓。因此，等温核酸扩增反应的时间优选为75min。
实施例5等温核酸扩增反应温度的优化
各取50μL实施例1制得的磁性检测探针及DNA扩增元件(F1、F2)，分别向其中加入终浓度为100nM SARS-CoV-2目标核酸(T1、T2)阳性检测样本。在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃下分别进行等温核酸扩增反应75min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。将各组上清液分别置于荧光比色皿中，通过荧光仪进行荧光检测记录上清液荧光强度变化。
测试结果如图5所示，当等温核酸扩增反应温度在25℃～37℃之间时，都可以得到良好的检测效果和较高的信噪比。当温度为37℃时，可得到最高的荧光强度。因此，等温核酸扩增反应的温度优选为37℃。
实施例6
将实施例1制得的试剂盒，分为4组试剂进行试验，分别为：a—无SARS-CoV-2目标核酸(T1、T2)，即空白样；b—仅加入T2(SARS-CoV-2E基因片段)100nM；c—仅加入T1(SARS-CoV-2N基因片段)100nM；d—同时加入T1、T2各100nM。测试上清液荧光强度光谱图随所加基因片段不同的变化实验，具体步骤如下：
各取50μL实施例1制得的磁性检测探针及DNA扩增元件(F1、F2)，向其中分别加入a～d组的试剂。在37℃下等温扩增反应75min，反应完后通过磁分离分离出上清液50μL。将各组上清液分别置于DNA荧光皿中，通过荧光仪记录上清液荧光强度变化。
测试结果如图6所示，只有反应液中同时具有T1、T2(d)时，才会出现强荧光强度，增加了检测结果的准确性。
因此作为一种优选的方案，实施例1制得的用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒还包括SARS-CoV-2阳性检测样本和Tris缓冲液，所述SARS-CoV-2阳性检测样本包括特征序列T1、T2。
一种优选的方案，所述T1、T2包括但不限于SARS-CoV-2N基因片段、SARS-CoV-2E基因片段或ORF1ab特征基因片段。
实施例7特异性实验
各取50μL实施例1制得的磁性检测探针及DNA扩增元件(F1、F2)，分别向其中加入以下终浓度为100nM的核酸：a—不加核酸，b—H1N1 DNA，c—H7N9 DNA，d—ZIKA DNA，e—SARS-CoV DNA，f—MERS-CoV DNA，g—SARS-CoV-2DNA。
H1N1 DNA具有如SEQ ID No.10所示的序列，具体为：5’-CTCCA CAGCA AGCTCATGGT C-3’；
H7N9 DNA具有如SEQ ID No.11所示的序列，具体为：5’-AAGAG AGAAC AAGCAGGAAT T-3’；
ZIKA DNA具有如SEQ ID No.12所示的序列，具体为：5’-CTGGC ATCAT GAAGAATCCC G-3’；
SARS-CoV DNA具有如SEQ ID No.13～14所示的序列，具体为：
SEQ ID No.13：5’-CAAGT GCCTC TGCAT TCTTT GG-3’；
SEQ ID No.14：5’-GTATT CTTGC TAGTC ACACT AG-3’；
MERS-CoV DNA具有如SEQ ID No.15～16所示的序列，具体为：
SEQ ID No.15：5’-GATCT ACTTT ACCTT GATCT TC-3’；
SEQ ID No.16：5’-ACACT CAGTT CACAA TTGGC TT-3’；
SARS-CoV-2DNA具有如SEQ ID No.8～9所示的序列。
测试结果如图7所示，仅在SARS-CoV-2核酸存在时可以产生较高的荧光信号(g)，说明本发明的试剂盒对新型冠状病毒核酸检测具有良好的特异性。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt ttttttgctg ctaacttact g 31
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tactggtcat ccgaagaacg ctgaagcgct ggtagggcag taagttagca gca 53
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcttcggat gaccagtatt tcgctagtgt aactagcaag aatac 45
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctagttaca ctagcgaaac ac 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtccctacc agcgcttcag cg 22
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctaacttact gccctaccag cgcttcagcg 30
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctagttaca ctagcgaaat actggtcatc cgaagaa 37
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccagcgcttc agcgttcttc g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtattcttgc tagttacact ag 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctccacagca agctcatggt c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagagagaac aagcaggaat t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggcatcat gaagaatccc g 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagtgcctc tgcattcttt gg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtattcttgc tagtcacact ag 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gatctacttt accttgatct tc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acactcagtt cacaattggc tt 22
Claims (13)
1.一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，其特征在于，包括磁性检测探针和DNA扩增元件F1、F2；所述磁性检测探针包括磁颗粒，所述磁颗粒表面修饰有DNA锚定链P1，DNA探针链L1、L2、L3及DNA荧光链R1；
所述L1和L2的序列分别与两段待测病毒核酸特征序列T1、T2互补；
所述P1一端连有生物素或氨基，可以使DNA锚定链连接到亲和素或羧基修饰的磁珠上，P1的序列与L1的序列部分互补；
所述L1上杂交有荧光修饰的序列R1以及L2，并且L1的序列与一段待测病毒核酸特征序列T1部分互补；
所述L2与L3的序列部分互补，并且L2的序列与另一段待测病毒核酸特征序列T2部分互补；
所述F1与L1的序列部分互补；所述F2与L2的序列部分互补；
所述F1和F2可以在T1、T2同时存在时打开P1/L1/L2/L3/R1的杂交体，释放出荧光链R1，指示体系中待测病毒核酸特征序列T1、T2的同时存在；在此过程中释放出T1、T2进行循环利用，实现信号扩增。
2.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，其特征在于，所述R1所修饰的荧光为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，其特征在于，还包括待测病毒核酸阳性检测样本和Tris缓冲液；所述待测病毒核酸阳性检测样本包括特征序列T1、T2。
4.根据权利要求3所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，其特征在于，所述T1、T2包括但不限于SARS-CoV-2N基因片段、SARS-CoV-2E基因片段，以及ORF1ab特征基因片段。
5.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，其特征在于，所述待测病毒为SARS-CoV-2；
所述P1具有如SEQ ID No.1所示的序列；
所述L1具有如SEQ ID No.2所示的序列；
所述L2具有如SEQ ID No.3所示的序列；
所述L3具有如SEQ ID No.4所示的序列；
所述R1具有如SEQ ID No.5所示的序列；
所述F1具有如SEQ ID No.6所示的序列；
所述F2具有如SEQ ID No.7所示的序列；
所述T1为SARS-CoV-2N基因片段，具有如SEQ ID No.8所示的序列；
所述T2为SARS-CoV-2E基因片段，具有如SEQ ID No.9所示的序列。
6.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒，其特征在于，所述磁颗粒是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm。
7.权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将DNA锚定链P1通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面；通过磁分离去除多余的DNA锚定链，并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散；
(2)向步骤(1)得到的磁颗粒中加入DNA探针链L1、L2、L3和DNA荧光链，在磁颗粒表面形成杂交结构；通过磁分离去除多余的DNA探针链和DNA荧光链并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散，组装成磁性检测探针；
(3)向步骤(2)得到的磁颗粒中加入DNA扩增元件F1、F2，即得。
8.根据权利要求7所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述将DNA锚定链P1通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表面的具体步骤为以下两种方案之一：(a)将生物素化的DNA锚定链和链霉亲和素修饰的磁颗粒混合，并对组装后的磁颗粒进行清洗，去除多余的DNA锚定链，将得到的磁颗粒分散在Tris缓冲液中储存；
所述Tris缓冲液为：50mM Tris-HCl，140mM NaCl，1mM MgCl2，pH＝7.4；(b)将羧基修饰的磁颗粒稀释在MES缓冲液中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液洗涤三次，加入基修饰的DNA锚定链，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁颗粒分散在PBS缓冲液中；
所述MES缓冲液为：100mM MES，pH＝6.0；
所述EDC缓冲液为：100mM MES，200mM EDC，pH＝6.0；所述NHS缓冲液为：100mM MES，100mM NHS，pH＝6.0；
所述PBS缓冲液为：10mM PBS，pH＝7.2。
9.根据权利要求7所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述DNA锚定链P1是由生物素或氨基修饰的，P1的浓度为10～5000nM；步骤(2)所述DNA探针链L1、L2均与目标核酸部分互补，L1、L2、L3的浓度均为10～5000nM；步骤(3)所述DNA扩增元件F1、F2可催化等温核酸扩增反应的进行，F1、F2的浓度均为10～5000nM。
10.根据权利要求9所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述P1的浓度为500nM；步骤(2)所述L1、L2、L3的浓度均为750nM；步骤(3)所述F1、F2的浓度均为1250nM。
11.权利要求1-6任一项所述的试剂盒、或权利要求7-10任一项所述制备方法制得的试剂盒在SARS-CoV-2核酸检测中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
向所述磁性检测探针中加入目标核酸，在20～45℃下反应10～120min进行等温核酸扩增反应，再通过磁分离，收集上清液；上清液在荧光激发灯的照射下，发出荧光则为阳性，不发荧光则为阴性。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述等温核酸扩增反应的反应温度为37℃，反应时间为75min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210355033.2A CN114752705B (zh) | 2022-04-06 | 2022-04-06 | 一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210355033.2A CN114752705B (zh) | 2022-04-06 | 2022-04-06 | 一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114752705A true CN114752705A (zh) | 2022-07-15 |
| CN114752705B CN114752705B (zh) | 2024-01-23 |
Family
ID=82329010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210355033.2A Active CN114752705B (zh) | 2022-04-06 | 2022-04-06 | 一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114752705B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111398576A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-07-10 | 西华大学 | 一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法 |
| CN111593141A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-28 | 商城北纳创联生物科技有限公司 | 基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN111808989A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-10-23 | 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 | 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法 |
| CN113201582A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-03 | 南京邮电大学 | 一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用 |
| CN113234865A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-08-10 | 西北农林科技大学 | 猪病毒性疾病的磁纳米微粒可视化病原检测试剂盒 |
| WO2021175298A1 (zh) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 浙江东方基因生物制品股份有限公司 | 新冠病毒检测的试剂以及检测方法 |
| US20220042117A1 (en) * | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF INFLUENZA A, INFLUENZA B, AND SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2) |
| WO2022033331A1 (zh) * | 2020-08-11 | 2022-02-17 | 上海奕谱生物科技有限公司 | 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用 |
| CN114075611A (zh) * | 2020-08-10 | 2022-02-22 | 华南理工大学 | 一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试剂盒 |
-
2022
- 2022-04-06 CN CN202210355033.2A patent/CN114752705B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021175298A1 (zh) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 浙江东方基因生物制品股份有限公司 | 新冠病毒检测的试剂以及检测方法 |
| CN111398576A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-07-10 | 西华大学 | 一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法 |
| CN111593141A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-28 | 商城北纳创联生物科技有限公司 | 基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN111808989A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-10-23 | 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 | 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法 |
| US20220042117A1 (en) * | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF INFLUENZA A, INFLUENZA B, AND SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2) |
| CN114075611A (zh) * | 2020-08-10 | 2022-02-22 | 华南理工大学 | 一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试剂盒 |
| WO2022033331A1 (zh) * | 2020-08-11 | 2022-02-17 | 上海奕谱生物科技有限公司 | 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用 |
| CN113201582A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-03 | 南京邮电大学 | 一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用 |
| CN113234865A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-08-10 | 西北农林科技大学 | 猪病毒性疾病的磁纳米微粒可视化病原检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DAN ZHU等: "Modular DNA Circuits for Point-of-Care Colorimetric Assay of Infectious Pathogens", 《ANAL CHEM》, vol. 93, no. 41, pages 13861 - 13869 * |
| 朱丹等: "框架核酸在活细胞分子诊断和成像中的应用", 《广州大学学报(自然科学版)》, vol. 19, no. 6, pages 1 - 12 * |
| 梁超等: "高灵敏度等温扩增法可视化检测血液中的病毒核酸", 《中国输血杂志》, vol. 24, no. 12, pages 1023 - 1027 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114752705B (zh) | 2024-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102378388B1 (ko) | 개선된 분석 방법 | |
| US7642056B2 (en) | Method and kit for detecting a target protein using a DNA aptamer | |
| CN112852921B (zh) | 一种基于即时检测试纸条的核酸检测方法、检测探针及其试剂盒 | |
| WO2017181339A1 (zh) | 蛋白配体和基因同时检测方法及试剂盒 | |
| JP2006501817A (ja) | 新規高密度アレイおよび検体分析方法 | |
| ES2767853T3 (es) | Detección de la restricción de cadena ligera de inmunoglobulina por hibridación in situ de ARN | |
| CN110218818B (zh) | 一种登革病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN112852922B (zh) | 一种检测dna甲基化的荧光生物传感器、检测方法和应用 | |
| Zhang et al. | Hybridization chain reaction circuit-based electrochemiluminescent biosensor for SARS-cov-2 RdRp gene assay | |
| Liu et al. | A graphene oxide and exonuclease-aided amplification immuno-sensor for antigen detection | |
| Lin et al. | Rapid detection of hepatitis B virus in blood samples using a combination of polymerase spiral reaction with nanoparticles lateral-flow biosensor | |
| CN112961907B (zh) | 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法 | |
| Raab et al. | Transport and detection of unlabeled nucleotide targets by microtubules functionalized with molecular beacons | |
| CN114752705B (zh) | 一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用 | |
| EP3924514A1 (en) | Solution-phase, trans-activated reporter systems for use in crispr-based nucleic acid sequence detections | |
| CN116497090A (zh) | 一种核酸检测试剂盒及其应用 | |
| CN105838790B (zh) | 一种银纳米簇传感器及其制备方法和在检测病毒基因中的应用 | |
| CN109828120A (zh) | 基于靶标激发金纳米粒子表面dna循环的蛋白质荧光分析方法 | |
| CN108646014B (zh) | 基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法 | |
| CN110208226B (zh) | 一种高度特异性的单分子荧光检测方法 | |
| Zhang et al. | A CRISPR/Cas12a-assisted array for Helicobacter pylori DNA analysis in saliva | |
| CN106319091A (zh) | 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒 | |
| CN106754902A (zh) | 一种荧光共振探针及其应用和试剂盒 | |
| CN112553379A (zh) | 基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法及试剂盒 | |
| CN104561290A (zh) | 一种基于混合探针基因芯片检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhu Dan Inventor after: Wu Hongyu Inventor after: Wang Lianhui Inventor after: Chao Jie Inventor after: Zhang Juncheng Inventor before: Zhang Juncheng Inventor before: Wu Hongyu Inventor before: Zhu Dan Inventor before: Wang Lianhui Inventor before: Chao Jie |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |