CN106754902A - 一种荧光共振探针及其应用和试剂盒 - Google Patents

一种荧光共振探针及其应用和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种荧光共振探针及其应用和试剂盒，属于生物化学领域。本发明提供的荧光共振探针，适用于检测靶核酸片段，其包括能够与靶核酸片段形成T型结构的第一荧光探针和第二荧光探针，该T型结构可以确保第一荧光探针上的第一荧光基因和第二荧光探针上的第二荧光基因发生荧光共振能量转移。通过检测荧光共振能量转移效率实现对靶核酸片的定性或定量检测，该荧光共振探针具有较高的特异性和灵敏度，能够将碱基序列差异程度低至一个碱基的靶核酸片段检测出。

Description

一种荧光共振探针及其应用和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体而言，涉及一种荧光共振探针及其应用和试剂盒。
背景技术
目前，现有的用于检测微小RNA(miRNA)的方法主要有Northern印迹分析，微点阵分析和实时荧光定量聚合酶链式反应。
其中，Northern印迹分析是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于微小RNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。微点阵分析也是基于杂交的原理来检测微小RNA，它通过测定特定过程中微小RNA的表达水平，来分析了解微小RNA的表达调控机制以及由微小RNA调控的基因的表达。
微点阵分析采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。
实时荧光定量聚合酶链式反应通过扩增技术，是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。
但是，上述的现有检测方法无法清楚的区分出或者准确的检测出碱基序列差异程度很小(例如只有几个或一个碱基的差异程度)的miRNA片段或者是其他类型的RNA片段或DNA片段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光共振探针，该荧光共振探针能够检测或区分出碱基序列差异程度很小(例如只有几个或一个碱基的差异程度)的靶核酸片段，其具有较高的特异性和灵敏度。
本发明的另一目的在于提供上述荧光共振探针在检测靶核酸片段中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述荧光共振探针在制备靶核酸片段检测试剂盒中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种包括上述的荧光共振探针的试剂盒。
本发明是这样实现的：
一种荧光共振探针，适于检测靶核酸片段，其包括第一荧光探针和第二荧光探针，第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区，第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区，第一结合区与第二结合区反向互补，第一结合区的末端标记有第一荧光基团，第二结合区的末端标记有第二荧光基因，第一荧光基因的荧光光谱与第二荧光基团的激发光谱重叠，第一识别区和第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。
上述的荧光共振探针在检测靶核酸片段中的应用。
上述的荧光共振探针在制备用于试剂盒中的应用。
一种试剂盒，其包括上述的荧光共振探针。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的提供的荧光共振探针包括第一荧光探针和第二荧光探针。第一荧光探针具有与靶核酸片段的第一靶标区反向互补的第一识别区，第二荧光探针具有与靶核酸片段的第二靶标区反向互补的第二识别区。
在检测时，如果待测样品中存在靶核酸片段，则第一荧光探针的第一识别区和第二荧光探针的第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区通过碱基互补配对结合；同时，第一结合区与和第二结合区通过碱基补配对结合。这样，靶核酸片段、第一荧光探针以及第二荧光探针三者形成一个T型结构，稳定状态的T型结构能够使得第一荧光探针上的第一荧光基团和第二荧光探针上的第二荧光基因的距离变短，该距离能够保证第一荧光基因和第二荧光基团之间发生荧光共振能量转移。
而该T型结构只有在第一识别区和第二识别区与靶核酸片段的相应靶标区的碱基完全互补配对结合的情况下才稳定(只要有一个碱基不能互补配对，T型结构都不稳定，不能保证发生荧光共振能量转移)。这样，通过激发第一荧光基因则可检测到第二荧光基因的荧光发射信号，再根据荧光共振能量转移效率，实现对碱基序列差异程度很小的靶核酸片段的检测目的，以及通过对荧光共振能量转移效率的计算，还可以实现对靶核酸片段的定性或定量检测。
因此，本发明提供的荧光共振探针基于一种全新的检测原理，其不仅能够实现对靶核酸片段的定性或定量检测，还能够将靶核酸片段从数量或类型众多的且碱基序列差异很小的核酸片段中检测出来，该碱基序列差异可低至只有一个碱基的差异，具有较高的特异性和灵敏度，并且其可适用于检测各种类型的DNA和RNA尤其是miRNA，也可适用于制备试剂盒，具有非常广阔的应用前景和市场价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的荧光共振探针的检测原理示意图；
图2为本发明提供的实验例1的荧光光谱检测结果图；
图3为本发明提供的实验例2的荧光共振能量转移效率检测结果图；
图4为本发明提供的实验例3的荧光共振能量转移效率检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明提供的一种荧光共振探针及其应用和试剂盒进行具体说明。
一方面，本发明提供了一种荧光共振探针，其适于检测核酸片段，其包括第一荧光探针和第二荧光探针。第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区。容易理解到，第一结合区和第一识别区相连接。第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区。容易理解到，第二结合区和第二识别区相连接。
第一结合区与第二结合区反向互补，第一结合区的末端标记有第一荧光基团(也可以理解为第一荧光基因标记在第一结合区远离第一识别区的一端)，第二结合区的末端标记有第二荧光基因(也可以理解为第二荧光基因标记在第二结合区远离第二识别区的一端)。第一荧光基因的荧光光谱与第二荧光基团的激发光谱重叠。第一识别区和第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。
本发明提供的荧光共振探针的检测原理(如图1所示)大致如下：
首先，第一荧光基因和第二荧光基团各自均具有激发光谱和荧光光谱，且第一荧光基因的荧光光谱与第二荧光基团的激发光谱重叠。当二者的距离足够靠近时，用第一荧光基因的激发光谱的激发光激发第一荧光基因，第一荧光基团产生的荧光可以激发第二荧光基因产生荧光，则可以检测到第二荧光基因的荧光发射信号，即发生了荧光共振能量转移(FRET)，其中，第一荧光基因为荧光共振能量供体，第二荧光基团为荧光共振能量受体。而第一荧光基因和第二荧光基因的之间的距离是荧光共振能量转移发生的重要因素。
基于上述原理，在检测时，将第一荧光探针、第二荧光探针以及待测样品加入到杂交液是进行杂交反应，如果待测样品中存在靶核酸片段，则第一荧光探针的第一识别区和第二荧光探针的第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区通过碱基互补配对结合(第一识别区和第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补)。同时，第一结合区与和第二结合区通过碱基互补配对结合(第一结合区与第二结合区反向互补)。
这样，靶核酸片段、第一荧光探针以及第二荧光探针形成一个T型结构(如图1所示，图1中的最右侧为形成的T型结构，箭头代表荧光共振能量的转移方向)。该T型结构能够使得第一荧光基团和第二荧光基因的距离变短，该距离能够确保发生荧光共振能量转移。
再通过第一荧光基因的激发波长进行激发则可检测到第二荧光基因的荧光发射信号。以第二荧光基因的荧光信号和第一荧光信号的比值作为荧光共振能量转移效率，该荧光共振能量转移效率的高低与靶核酸片段的浓度大小相关，靶核酸片段浓度越大，该荧光共振能量转移效率就最大。因此，通过对该荧光共振能量转移效率的检测和计算就可以实现对靶核酸片段的定性或定量检测。
而如果待测样品中不存在靶核酸片段，则第一荧光探针和第二荧光探针只能依赖第一结合区与和第二结合区通过碱基反向互补配对结合形成不稳定双链结构。但是双链结构不稳定，在温度达到37℃时会发生解离，因此不发生荧光共振能量转移，通过第一荧光基因的激发波长进行激发则不能检测到第二荧光基因的荧光信号，只能检测到第一荧光基因的荧光发射信号，这样，相应的荧光共振能量转移效率就非常低。
本发明的发明人通过长期的研究探索发现，第一荧光探针的第一识别区和第二荧光探针的第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区只有在碱基完全互补配对结合的情况下，才能形成稳定T型结构，只有形成稳定的T型机构，也才能够确保发生荧光共振能量转移。
因此，即使待测样本中存在其他的核酸片段，这种核酸片段与靶核酸片段相似，或者二者的差异仅是几个碱基甚至是一个碱基，这种相似的核酸片段的存在也不会导致形成稳定的T型结构。那么第二荧光基因的荧光发射信号就会很弱甚至是没有，相应的荧光共振能量转移效率也很低。
所以，基于上述的原理，采用本发明提供的荧光共振探针在进行检测时，如果待测样本中存在对应的靶序列，就能够形成T型结构，具有较强的荧光共振能量转移效率；如果没有对应的靶核酸片段存在，或存在与靶核酸片段相似的其他核酸片段，则具有较低的荧光共振能量转移效率。进而将靶核酸片段从数量众多的且碱基序列差异很小的核酸片段中检测出来，该碱基序列差异可低至只有一个碱基的差异，其具有较高的特异性和灵敏度。
优选地，第一结合区的长度为7-9bp。由于第一结合区与第二结合区反向互补，应当很容易地理解到，第二结合区的长度与第一结合区的长度一致。
本发明的发明人通过长期的研究和探索发现，当第一结合区和第二结合区的长度低于了7bp的长度时，二者存在结合不稳定的情况(容易导致假阴性的结果)，而高于了9bp又存在不能顺利解离的情况(容易导致假阳性的结果)。所以，第一结合区和第二结合区的长度均控制在7-9bp的范围，一方面保证二者能够通过碱基互补配对结合时的稳定(避免假阴性的结果)，另一方面也能够保证在没有靶核酸片段的情况下，当杂交反应温度在37℃的条件下，第一结合区和第二结合区之间能够顺利地解离开，避免假阳性结果的出现。
优选地，第一识别区的长度为10-12bp，第二识别区的长度为10-12bp。
第一识别区或第二识别区的长度一方面可根据靶核酸片段的长度进行设计，另一方面要使得所形成的T型结构稳定，确保荧光共振能量的转移发生。现有的miRNA的长度一般为20-24bp，因此，将第一识别区的长度控制在10-12bp的范围，或第二识别区的长度控制在10-12bp的范围内，即可以实现对较短的靶核酸片段的检测目的，同时保证形成的T型结构稳定，有利于发生荧光共振能量的转移。
优选地，第一荧光基团为Cy3，第二荧光基团为Cy5；或者，第一荧光基团为Cy5，第二荧光基团为Cy5.5；或者，第一荧光基团为CFP或GFP，第二荧光基团为YFP；或者，第一荧光基团为Rluc，第二荧光基团为QDs-655。
Cy3、Cy5、Cy5.5均是具有不同激发光谱和荧光光谱的花青素荧光染料，其中，Cy3的激发光谱为530-550nm、荧光光谱为590-650nm；Cy5的激发光谱为640-660nm，荧光光谱为660-680nm；Cy5.5的激发光谱为665-685nm，荧光光谱为684-704nm。
CFP为青色荧光蛋白，激发光谱为426-446nm，荧光光谱为490-510nm。
GFP为绿色荧光蛋白，激发光谱为488-508nm，荧光光谱为508-524nm。
YFP为黄色荧光蛋白，激发光谱为490-510nm，荧光光谱为520-550nm。
Rluc为荧光素酶(自发光)，其荧光光谱为470-490nm；QDs-655为纳米荧光量子点(任意波长的光均可以激发)，其荧光光谱为645-665nm。
采用上述的荧光能量转移供体-受体的配对方式，能够提高荧光能量转移效率，易于检测并提高检测结果的准确性。
进一步地，第一荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，第一荧光基团为Cy3，第一荧光基团标记于第一荧光探针的3’端，第二荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，第二荧光基团为Cy5，第二荧光基团标记于第一荧光探针的5’端。该荧光共振探针可适用于检测SEQ ID NO.3所示的miR208-a，miR208-a即为RNA型的靶核酸片段。
其中，第一荧光探针的第1-11位是第一识别区(5’-ACAAGCTTTTT-)，其位于第一荧光探针的5’端，可与miR208-a的第12-22位的第一靶标区(-AAAAAGCUUGU-3’)通过碱基反向互补配对结合；第一荧光探针的第12-18位是第一结合区(-TTTGATC-3’)，其位于第一荧光探针的3’端；第一荧光基因Cy3标记在第一结合区的末端即第一荧光探针的3’端。
其中，第二荧光探针的第8-18位是第二识别区(-GCTCGTCTTAT-3’)，其位于第二荧光探针的3’端，可与miR208-a的第1-11位的第二靶标区(5’-AUA AGACGAGC-)通过碱基反向互补配对结合；第二荧光探针的第1-7位是第二结合区(5’-GATCAAA-)，其位于第二荧光探针的5’端；第二荧光基因Cy5标记在第二结合区的末端即第二荧光探针的5’端。
基于前述的检测原理，在检测时，SEQ ID NO.1所示的第一荧光探针和SEQ IDNO.2所示的第二荧光探针与SEQ ID NO.3所示的miR208-a可形成稳定的T型结构(如图1所示)。如果待测样品存在靶核酸片段miR208-a，则可以检测到较强的第二荧光基因Cy5的荧光发射信号，如果待测样品不存在靶核酸片段miR208-a或者存在于miR208-a序列相似的其他核酸片段，则检测不到第二荧光基因Cy5的荧光发射信号。通过对荧光共振能量转移效率的计算结果，可实现对miR208-a高特异性和高灵敏度的检测目的。
在此，需要说明的，对于第一荧光探针的第一识别区和第二荧光探针的第二识别区的具体碱基序列，设计者或使用者均可以根据所要检测的靶核酸片段的序列进行设计。同样，第一荧光探针的第一结合区和第二荧光探针的结合区的碱基序列也可以根据实际情况自进行设计。只要是其所设计出的碱基序列，使得第一荧光探针和第二荧光探针可与靶核酸片段形成前述的T型结构，用于确保荧光共振能量转移的发生，根据荧光能量的转移效率来实现对靶核酸片段的定性或定量检测即属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明还提供了前述的荧光共振探针在检测靶核酸片段中的应用。
进一步，靶核酸片段为miRNA。当然，靶核酸片段也可是其他类型的RNA片段例如mRNA、siRNA等RNA片段，还可以是任何类型的DNA片段。只要是用于核酸片段，即属于本发明的保护范围。
进一步地，该应用包括：将荧光共振探针的第一荧光探针和第二荧光探针加入至杂交液中进行杂交反应，杂交液含有镁离子。镁离子的浓度优选为49-51mM。
应当容易理解：杂交液中加入有待测样本。另外，待测样本可以是RNA，也可以是DNA；待测样本可能含有靶核酸片段、也可能不含有核酸片段。
更优选地，杂交液包括：浓度为49-51mM的Tris-HCl和浓度为49-51mM的MgCl2；杂交液的pH为7.3-7.5。
优选地，进行杂交反应的条件是：时间29-31min，温度37-39℃。
在待测样本含有靶核酸片段的情况下，上述的杂交液为靶核酸片段、第一荧光探针以及第二荧光探针提供了一个适宜的杂交反应环境。在该反应环境中，靶核酸片段、第一荧光探针以及第二荧光探针相互之间的配对结合能够快速准确地完成，配对效率高，缩短了杂交反应的时间，仅需半个小时即可完成反应，用于后续检测。
目前，现有最好的技术是实时荧光定量聚合酶链式反应，该方法操作复杂，需要酶的参与，且对实验室条件要求较高。相对于该技术，利用本发明提供的荧光共振探针在检测靶核酸片段的过程中只需要一步杂交过程，节约了工作强度，且操作简单、快捷；杂交反应仅需半小时就可以完成，耗时短；整个杂交反应体系中不需要酶的参与，成本低(杂交液的成分组成简单仅包括Tris-HCl、MgCl2)。
另一方面，本发明还提供了前述的荧光共振探针在制备用于检测靶核酸片段的试剂盒中的应用。本发明提供的荧光共振探针可以应用到制备用于检测核酸片段的试剂盒的领域中，所制得的试剂盒具有操作简单、检测结果准确，成本低、耗时短、特异性好和灵敏高等特点。
进一步地，靶核酸片段为miRNA。当然，靶核酸片段也可是其他类型的RNA片段例如mRNA、siRNA等RNA片段，还可以是任何类型的DNA片段。只要是用于核酸片段的检测，即属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括任一项前述的荧光共振探针。该试剂盒可用于检测靶核酸片段，具有操作简单、检测结果准确，成本低、耗时短、特异性好和灵敏高等特点。
综上，本发明提通过的荧光共振探针能够将靶核酸片段从数量或类型众多的且碱基序列差异很小的核酸片段中检测出来，该碱基序列差异可低至只有一个碱基的差异，其具有较高的特异性和灵敏度。且其可适用于检测各种类型的DNA和RNA尤其是miRNA，具有非常广阔的应用前景和市场价值。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的荧光共振探针，其包括第一荧光探针和第二荧光探针。
第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区。第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区。
第一结合区的碱基序列与第二结合区的碱基序列反向互补，第一结合区的末端标记有第一荧光基团，第二结合区的末端标记有第二荧光基因。
第一荧光基因的荧光光谱与第二荧光基团的激发光谱重叠。第一识别区和第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。
在本实施例中，第一结合区的长度为7bp，相应地，第二结合区的长度也为7bp。
在本实施例中，第一识别区的长度为11bp，第二识别区的长度为11bp。第一荧光探针的总长度为18bp，第二荧光探针的总长度为18bp。
在本实施例中，第一荧光基团为Cy3，第二荧光基团为Cy5。
第一识别区的碱基序列和第二识别区的碱基序列可以根据待检测靶核酸片段的序列进行设计。同样，第一结合区和第二结合区的碱基序列也可以根据实际情况进行设计，只要二者反向互补即可。
采用本实施例提供的荧光共振探针检测核酸片段的方法可参考后文的实施例10提供的方法。
实施例2
本实施例提供的荧光共振探针的结构与实施例1基本相同。不同的是：在本实施例中，第一结合区的长度为8bp，第二结合区的长度与第一结合区的长度相同。
实施例3
本实施例提供的荧光共振探针的结构与实施例1基本相同。不同的是：在本实施例中，第一结合区的长度为9bp，第二结合区的长度与第一结合区的长度相同。
实施例4
本实施例提供的荧光共振探针的结构与实施例1基本相同。不同的是：在本实施例中，第一结合区的长度为8bp，第二结合区的长度与第一结合区的长度相同；第一识别区的长度为11bp，第二识别区的长度为12bp；第一荧光基因为Cy5，第二荧光基因为Cy5.5。
实施例5
本实施例提供的荧光共振探针的结构与实施例1基本相同。不同的是：在本实施例中，第一结合区的长度为9bp，第二结合区的长度与第一结合区的长度相同；第一识别区的长度为12bp，第二识别区的长度为10bp；第一荧光基因为CFP，第二荧光基因为YFP。
实施例6
本实施例提供的荧光共振探针的结构与实施例1基本相同。不同的是：在本实施例中，第一结合区的长度为8bp，第二结合区的长度与第一结合区的长度相同；第一识别区的长度为11bp，第二识别区的长度为11bp；第一荧光基因为GFP，第二荧光基因为YFP。
实施例7
本实施例提供的荧光共振探针的结构与实施例1基本相同。不同的是：在本实施例中，第一结合区的长度为8bp，第二结合区的长度与第一结合区的长度相同；第一识别区的长度为11bp，第二识别区的长度为10bp；第一荧光基因为Rluc，第二荧光基因为QDs-655。
实施例8
本实施例提供的荧光共振探针的结构与实施例1基本相同。不同的是：在本实施例中，第一结合区的长度为9bp，第二结合区的长度与第一结合区的长度相同；第一识别区的长度为12bp，第二识别区的长度为12bp；第一荧光基因为Cy3，第二荧光基因为Cy5。
实施例9
在实施例1提供的荧光共振探针的结构基础上，在本实施例中根据所要检测的靶核酸片段即miR208-a的碱基序列(如SEQ ID NO.3所示)设计得到了具有具体碱基序列的荧光共振探针，其可用于检测miR208-a。本实施例提供的荧光共振探针的第一荧光探针和第二荧光探针的具体碱基序列如表1所示。
表1.本实施例提供的用于检测miR208-a片段的荧光共振探针的结构
探针名称 碱基序列(5’-3’) 序列标识符
第一荧光探针 ACAAGCTTTTTTTTGATC-Cy3 SEQ ID NO.1
第二荧光探针 Cy5-GATCAAAGCTCGTCTTAT SEQ ID NO.2
其中，第一荧光探针的第1-11位是第一识别区(5’-ACAAGCTTTTT-)，其位于第一荧光探针的5’端，可与miR208-a的第12-22位的第一靶标区(-AAAAAGCUUGU-3’)通过碱基互补配对结合；第一荧光探针的第12-18位是第一结合区(-TTTGATC-3’)，其位于第一荧光探针的3’端；第一荧光基因Cy3标记在第一结合区的末端即第一荧光探针的3’端。
其中，第二荧光探针的第8-18位是第二识别区(-GCTCGTCTTAT-3’)，其位于第二荧光探针的3’端，可与miR208-a的第1-11位的第二靶标区(5’-AUAAGACGAGC-)通过碱基互补配对结合；第二荧光探针的第1-7位是第二结合区(5’-GATCAAA-)，其位于第二荧光探针的5’端；第二荧光基因Cy5标记在第二结合区的末端即第二荧光探针的5’端。
实施例10
本实施例提供了上述的荧光共振探针用于检测靶核酸片段的方法。步骤如下。
(1)获取核酸模板
采用常规方法提取样品的总RNA或DNA基因组，得到核酸模板即待测样本。当然，在其他的实施例中，如果已提供核酸模板，则可省略此步骤。
(2)杂交反应
将提取的核酸模板和上述的荧光共振探针的第一荧光探针和第二荧光探针按摩尔比为1:1:1加入至含有杂交液的反应试管中进行杂交反应。其中，杂交反应的条件是：时间30min，温度37℃。
其中，杂交液的包括：浓度为50mM的Tris-HCl，浓度为50mM的氯化镁；杂交液中的镁离子(mg2+)浓度为50mM；杂交液的pH为7.4。
(3)荧光检测
杂交反应结束后，将反应试管置于检测仪器(VICTOR X4型号酶标仪，美国PE公司)上，用第一荧光基因的激发波长进行激发，检测第一荧光基团和第二荧光基团的荧光信号强度，以第二荧光基团的荧光强度与第一荧光基因的荧光强度的比值作为荧光共振能量转移效率(FRET Ratio)。该荧光共振能量转移效率大于或等于阈值(0.2)，可判读为阳性结果(即核酸模板中存在对应的靶核酸片段)，若小于阈值(0.2)，则判读为阴性结果(即核酸模板中存在对应的靶核酸片段)。该荧光共振能量转移效率越大，核酸模板中含有的靶核酸片段的浓度也就越高。需要说明的是，上述的阈值是可以根据不同的荧光共振探针、实验条件等因素进行调整的。
本实施例提供的检测核酸片段的方法只需要一步杂交过程，其具有操作简单；杂交仅需半小时，耗时短；不需要酶的参与，方便快捷，成本较低等优点。
实施例11
本发明提供了检测核酸片段的试剂盒，该试剂盒包括实施例1-9中任一项所述的荧光共振探针。
使用该试剂盒对靶核酸片段检测的方法可实施例10，其效果同实施例10。
实验例1
本实验例采用实施例10提供的检测核酸片段的方法，检测实施例9提供的荧光共振探针的可行性。具体如下。
设置三个实验组，第一个实验组：在杂交液中加入实施例9提供的荧光共振探针的第一荧光探针和第二荧光探针、以及靶核酸片段mir-208a；第二个实验组：在杂交液中加入第一荧光探针和第二荧光探针；第三个试验组：在杂交液中只加入第二荧光探针。其他步骤同实施例10，分别检测上述三个实验组的荧光发射信号，结果如图2所示。
图2的结果显示(图2为上述三个实验组检测出的荧光光谱图，图中：a为第一个实验组的荧光光谱曲线，b为第二个实验组的荧光光谱曲线，c为第三个实验组的荧光光谱曲线)，第一个实验组能够检测到第二荧光基团Cy5的荧光发射信号(如图2中的a所示)，说明第一荧光探针、第二荧光探针和靶核酸片段形成了稳定的T型结构，发生了荧光共振能量的转移；第二个实验组只能检测到第一荧光基因Cy3的荧光发射信号，不能检测到第二荧光基团的荧光发射信号(如图2中的b所示)，说明第一荧光探针和第二荧光探针之间发生了解离，不能促使荧光共振能量的转移发生；而第三个实验组没有检测到荧光发射信号(如图2中的c所示)。由此表明，实施例9提供的荧光共振探针能够检测到相应的靶核酸片段mir-208a，对靶核酸片段有响应效果，具有可行性。
实验例2
本实验例采用实施例10提供的检测核酸片段的方法，以RNA片段作为待测样本验证实施例9提供的荧光共振探针的灵敏度和特异性。具体如下。
以分别含有mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b、mir-208a的核酸模板溶液以及含有mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b和mir-208a混合核酸模板溶液(mixture)作为待测样本，检测实施例9提供的荧光共振探针的特异性和灵敏度。其中，mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b与mir-208a为同源RNA，其碱基序列如表2所示。
表2.实验例1和实验例2所用的核酸片段的碱基序列
核酸模板名称 碱基序列(5’-3’)
mir-208a AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU
mir-208b AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU
mir-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC
mir-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU
mir-183 GUGAAUUACCGAAGGGCCAUAA
D-mi208a ATAAGACGAGCAAAAAGCTTGT
D-mi208b ATAAGACGAACAAAAGGTTTGT
D-mi208a-1 ATAAGACGAACAAAAAGCTTGT
D-mi208a-2 ATAATACGAGCAAAAAGCTTGT
D-mi208a-3 ATAAGAAGAGCAAAAAGCTTGT
检测方法同实施例10。检测结果如图3所示。
图3的结果显示(图中：横坐标为不同类型的RNA片段，纵坐标为荧光能量转移效率即荧光共振能量转移效率)，仅含mir-208a的待测样本和mixture样品具有较高的荧光共振能量转移效率(分别是1.57、1.37)；而单独含有mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b的各待测样本的荧光共振能量转移效率较低(分别是0.157、0.156、0.158、0.161)，均低于阈值0.2；由此说明，实施例9所提供的针对mir-208a检测的荧光共振探针能够检测出mir-208a，且还能够从同时含有同源的mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b、mir-208a、mir-208a的mixture待测样本中将mir-208a分子特异性地检出，此外，含mir-208b(其与mir-208a的差异仅有3个碱基，如表2中下划线部分所示)的待测样本也没有阳性的荧光共振能量转移效率，这就表明，实施例9所提供的荧光共振探针具有较高的特异性和灵敏度，能够有效区分高度相似RNA家族(mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b与mir-208a为同源RNA)，其可以用于检测复杂生物样本中的靶核酸片段。
实验例3
本实验例采用实施例10提供的检测核酸片段的方法，以DNA片段作为待测样本验证实施例9提供的荧光共振探针的灵敏度和特异性。
以分别含有D-mi208b、D-mi208a-1、D-mi208a-2、D-mi208a-3、D-mi208a的核酸模板溶液作为待测样本，其中，D-mi208a为靶核酸片段，以空白溶液作为对照(blank)，检测实施例9提供的荧光共振探针的特异性和灵敏度。其中，D-mi208b、D-mi208a-1、D-mi208a-2、D-mi208a-3碱基序列与D-mi208a碱基序列的差异仅为一个碱基(如表2中的下划线部分所示)，其碱基序列如表2所示。
检测方法同实施例10，检测结果如图4所示。
图4的结果显示(图中：横坐标为不同类型的DNA片段，纵坐标为荧光共振能量转移效率)，只有含D-mi208a的待测样本具有较高的荧光共振能量转移效率(1.57)，而含D-mi208b、D-mi208a-1、D-mi208a-2、D-mi208a-3的各待测样本的荧光共振能量转移效率(分别是0.16399、0.12997、0.21428、0.33725)较低，它们与空白对照的荧光共振能量转移效率(0.157)差别很小；由此，进一步说明，实施例9提供的荧光共振探针具有非常好特异性和灵敏度强(其能够检测出只有一个碱基差异的核酸片段)；该荧光共振探针不仅适用于RNA检测尤其适用于需要高特异性和高灵敏度的miRNA的检测，同时也能够适用于DNA的检测，其同样具有较强的特异性和灵敏度。
通过实验例1和2的结果说明了实施例9提供的荧光共振探针具有检测出RNA片段(mir-208a)和DNA片段(D-mi208a)的能力，且其具有较高的特异性和灵敏度(能够将仅为一个碱基差异的核酸片段检测出)，这也同样表明了，实施例1-8所提供的荧光共振探针具有同样的检出能力，也就是说，只要所设计出的荧光共振探针具有实施例1-8任一项所述的荧光共振探针的结构(该结构用于与靶核酸片段反向互补配对形成T型结构)，就能够实现对靶核酸片段的高效检出和区分。
综上所述，本发明提供的荧光共振探针通过第一荧光探针和第二荧光探针的结构的特殊设置(即第一荧光探针的第一识别区和第二荧光探针的第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补，第一荧光探针的第一结合区和第二荧光探针的结合区反向互补)，使得第一荧光探针和第二荧光探针与对应的靶核酸片段的靶标区通过碱基互补配对结合时能够形成稳定的T型结构。稳定的T型结构能够确保第一荧光探针上的第一荧光基团和第二荧光探针上的第二荧光基因之间发生荧光共振能量转移，通过对荧光共振能量的转移效率的计算，实现对碱基序列差异程度很小(低至一个碱基的差异程度)的靶核酸片段的检测目的。
本发明提供的荧光共振探针是基于一种全新的检测原理进行核酸片段的检测，通过T型结构的稳定存在的特殊条件(即第一识别区和第二识别区要分别与靶核酸片段第一靶区和第二靶标区完全互补配对)来实现对碱基差异很小(低至一个碱基的差异)的靶核酸片段的高特异性和高灵敏度的顺利检出或区分。
总之，本发明实例提供的荧光共振探针以及检测方法不仅能够检测出RNA片段，还能够对DNA片段进行检测，对不同类型的靶核酸片段检测都具有很好的特异性和灵敏度，能将对应的靶核酸片段从数量或类型众多的且碱基序列差异很小的核酸片段中检测出来，该碱基序列差异可低至只有一个碱基的差异。相应的采用本发明的荧光共振探针进行检测的方法也只需要一步杂交过程，节约了工作强度，且操作简单、快捷；杂交反应仅需半小时就可以完成，耗时短；整个杂交反应体系中不需要酶的参与，成本低。具有非常广阔的应用前景和市场价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种荧光共振探针及其应用和试剂盒
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaagctttt ttttgatc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatcaaagct cgtcttat 18
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
auaagacgag caaaaagcuu gu 22

Claims (12)

1.一种荧光共振探针，适于检测靶核酸片段，其特征在于，其包括第一荧光探针和第二荧光探针，所述第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区，所述第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区，所述第一结合区与所述第二结合区反向互补，所述第一结合区的末端标记有第一荧光基团，所述第二结合区的末端标记有第二荧光基因，所述第一荧光基因的荧光光谱与所述第二荧光基团的激发光谱重叠，所述第一识别区和所述第二识别区分别与所述靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。
2.根据权利要求1所述的荧光共振探针，其特征在于，所述第一结合区的长度为7-9bp。
3.根据权利要求1所述的荧光共振探针，其特征在于，所述第一识别区的长度为10-12bp，所述第二识别区的长度为10-12bp。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的荧光共振探针，其特征在于，所述第一荧光基团为Cy3，所述第二荧光基团为Cy5；
或者，所述第一荧光基团为Cy5，所述第二荧光基团为Cy5.5；
或者，所述第一荧光基团为CFP或GFP，所述第二荧光基团为YFP；
或者，所述第一荧光基团为Rluc，所述第二荧光基团为QDs-655。
5.根据权利要求1所述的荧光共振探针，其特征在于，所述第一荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一荧光基团为Cy3，所述第一荧光基团标记于所述第一荧光探针的3’端，所述第二荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述第二荧光基团为Cy5，所述第二荧光基团标记于所述第一荧光探针的5’端。
6.权利要求1-5中任一项所述的荧光共振探针在检测靶核酸片段中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述靶核酸片段为miRNA。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其包括：将所述荧光共振探针的所述第一荧光探针和所述第二荧光探针加入至杂交液中进行杂交反应，所述杂交液含有镁离子，所述镁离子的浓度为49-51mM。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述杂交反应条件是：时间29-31min、温度37-39℃。
10.权利要求1-5中任一项所述的荧光共振探针在制备用于检测靶核酸片段的试剂盒中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，所述靶核酸片段为miRNA。
12.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-5中任一项所述的荧光共振探针。
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