CN110208226B - 一种高度特异性的单分子荧光检测方法 - Google Patents

一种高度特异性的单分子荧光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高度特异性的单分子荧光检测方法。所述单分子检测方法包括如下步骤：(1)将两条识别探针与待检测的目标物结合，形成复合物；(2)将捕获探针固定于玻片上，并加入复合物，捕获探针与一条识别探针结合；(3)向玻片上加入带荧光标记的信号探针，信号探针与两条识别探针动态结合；(4)将玻片置于显微镜载物台上进行监测，利用电子增强型相机记录单分子荧光时间影像序列，筛选得到荧光强度‑时间轨迹呈现ON‑OFF交替变化且荧光的ton和toff相对较短的单分子点即为目标物。本发明能够在单分子水平直接指认目标物分子，高度可信的区分目标物与非目标物，可以大幅度提高单分子荧光检测的灵敏度、特异性和重复性。

Description

一种高度特异性的单分子荧光检测方法
技术领域
本发明涉及一种高度特异性的单分子荧光检测方法，属于单分子检测领域。
背景技术
生物分子识别与检测对于基础生物学研究和诊断具有重要的意义。一些关键的生物分子(核酸、蛋白等)在检测体系中浓度较低，一般需要扩增或信号放大以提高灵 敏度，但扩增过程易受干扰，导致假阳性或假阴性信号。过去二十年显微技术与照相技 术的发展使探测单个生物分子变为现实。单分子检测不仅灵敏度高，而且定量方式简单，样 品需求量少。单分子水平的探测能够揭示单分子异质性，提供更为丰富的信息，这为准确识 别生物分子提供了可能。单分子荧光传感主要基于全内反射荧光(TIRF)显微镜，能够 在单个分子水平探测目标物，具有超高的灵敏度。在TIRF的激发模式下，只有靠近 界面100nm以内的荧光分子能够被激发，从而大大降低溶液中的背景信号。分子探针 (核酸探针、抗体、核酸适配体等)在单分子荧光检测中广泛使用。但是在复杂体系 中，分子探针易与其他物质发生非特异性相互作用。尤其当目标物浓度较低时，目标 物所提供的荧光点数只占基底检测到的荧光点数的较少部分，难以通过简单的对照实 验扣除背景的荧光点来确认目标物的检出，从而难以达到较高的灵敏度和较低的检测 限，而且会影响检测的重复性和可靠性。在单分子水平直接区分目标物与非目标物是 提高单分子检测可靠性的有效手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高辨识度信号的匹配单分子荧光检测的通用型探针系统，以及利用这种系统的高度特异性的单分子检测方法，可以用于核酸、蛋白以 及代谢小分子检测。
本发明所构建的单分子荧光检测探针系统基于由核酸纳米结构构建的动态three-way junction(TWJ)模型。
所述单分子荧光检测探针系统包括带荧光标记的信号探针和能与待检测的目标物结合的两条识别探针；
当两条所述识别探针均与待检测的目标物结合时，会诱导两条所述识别探针与所述信号探针之间的结合稳定度的变化，即荧光强度-时间轨迹呈现ON-OFF交替变化。
具体地，一条所述识别探针由捕获探针结合域、目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；
另一条所述识别探针由目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；
一条所述识别探针通过所述捕获探针结合域与捕获探针形成稳定结合，所述捕获探针结合域的长度至少为20个碱基；
两条所述识别探针均通过所述目标物结合域与目标物形成稳定结合；
两条所述识别探针均通过所述信号探针接收臂与所述信号探针形成动态结合，即，两条所述识别探针通过所述信号探针接收臂的组装，共同与所述信号探针形成动 态杂交；
所述短互补桥主要起到一个缓冲区段的作用，互补桥足够短才能确保在无目标物结合时，两条所述识别探针不会通过所述短互补桥结合，所述短互补桥的长度至多为 4个碱基。
具体地，所述信号探针与所述信号探针接收臂互补的碱基个数为5～7个；
所述信号探针与所述信号探针接收臂相互作用区段的GC含量≤50％；
将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端；
所述荧光基团为Cy3荧光基团。
本发明提供的“动态TWJ模型”探针由三条单链寡核苷酸组成，包括带荧光标记 的信号探针以及与待检测的目标物结合的两条识别探针，其中一条识别探针与固定在 玻片表面的捕获探针稳定结合，当两条识别探针均与目标物结合时，诱导识别探针与 信号探针之间结合稳定度的变化，从而产生有别于未结合时的单分子荧光动力学信号。
该检测探针体系适用于“夹心型”分子识别模式，适用的探针包括核酸探针、核 酸适配体、抗体等，适用的检测目标物分子包括核酸、蛋白质、小分子等。
本发明进一步提供的单分子检测方法，包括如下步骤：
(1)将两条识别探针与待检测的目标物结合，形成复合物；
(2)将捕获探针固定于玻片上，并加入所述复合物，所述捕获探针与一条所述 识别探针结合；
(3)向所述玻片上加入带荧光标记的信号探针，所述信号探针与两条所述识别 探针动态结合；
(4)将所述玻片置于显微镜载物台上进行监测，利用电子增强型相机(EMCCD) 记录单分子荧光时间影像序列，筛选得到荧光强度-时间轨迹呈现若干次ON-OFF交替 变化且荧光的ton和toff相对较短的单分子点即为目标物；
所述ON-OFF交替变化指的是所述信号探针结合时(与所述复合物)表现的荧光 ON状态(上升)与其解离时表现的荧光OFF状态(下降)的交替变化；
所述ton指的是荧光ON状态持续的时间，所述toff指的是荧光OFF状态持续的时 间。
上述的单分子检测方法中，所述信号探针与每条所述识别探针的接收臂互补的碱基个数为5～7个；
所述信号探针与所述识别探针的接收臂相互作用区段的GC含量≤50％，以确保快速结合和解离动力学。
上述的单分子检测方法中，将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端，以降低荧光团和目标物分子之间堆叠相互作用的影响；
所述荧光基团为Cy3荧光基团；
所述捕获探针与所述识别探针之间互补的碱基个数至少为20个，以形成稳定杂交，从而将目标物分子固定于玻片表面。
上述的单分子检测方法中，步骤(1)中，形成所述复合物的条件如下：
温度为20～27℃，时间为30～60分钟；
上述的单分子检测方法中，步骤(3)中，所述信号探针与所述复合物中的两条 所述识别探针发生动态结合，形成动态TWJ，能够诱导产生特征性单分子动力学信号。
所述“动态TWJ”指的是当目标物存在并与识别探针结合形成“夹心”结构时， 两条识别探针上的信号探针接收臂靠近组装并触发与荧光探针的动态结合反应。荧光 探针处于结合状态时，进入显微镜的激发范围，并停留足够时间，得到荧光ON状态； 反之，当荧光探针解离时，荧光探针逃逸出显微镜的激发范围，得到荧光OFF状态， 荧光探针与识别探针的反复结合使单分子荧光在ON和OFF态之间循环交替。这种荧 光ON-OFF交替信号称为特征性的单分子动力学信号，根据上述描述，其与目标物分 子一一对应。
上述的单分子检测方法中，步骤(4)中，在监测时间500s内荧光状态变化次数 大于3次的单分子点为所述目标物；
曝光时间为500ms。
上述的单分子检测方法中，步骤(4)中，当所述信号探针结合时与其解离时的 荧光强度差异>1000且信噪比>3时的单分子点为所述目标物；
可利用matlab进行候选区域选取、荧光强度计算、单分子荧光动力学信号拟合以及信号筛选，并用matlab程序对时间影像序列(电影)进行分析：
(1)识别电影内的候选区域(通常为5×5像素)，候选区域表现出比背景区域更 大的帧到帧的荧光强度波动；
(2)计算每个候选区域的逐帧荧光强度；
(3)利用隐马尔可夫模型(HMM)拟合以计算单分子指纹图谱的结合和解离动 力学；
(4)根据信噪比、荧光强度和探针结合-解离动力学区分特异性结合和非特异性结合。
本发明将动态TWJ模型引入单分子荧光检测体系，通过合理的设计，使检测目标物分子的结合激活DNA动态结合事件，形成具有高辨识的单分子动力学信号，这种 信号与单个目标物分子严格对应。本发明能够在单分子水平直接指认目标物分子，高 度可信的区分目标物与非目标物，可以大幅度提高单分子荧光检测的灵敏度、特异性 和重复性。
附图说明
图1为动态TWJ探针检测模式示意图，图1(A)中检测目标物为DNA；图1(B) 中检测目标物为ATP。
图2为有(图2(A))/无(图2(B))DNA存在时的单分子荧光强度-时间轨迹。
图3为有(图3(A))/无(图3(B))ATP存在时的单分子荧光强度-时间轨迹。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明检测方法为一种基于单分子荧光传感的以核酸动态结合为信号基元的生物 目标物指认方法，具体地，包括以下步骤：
A、根据目标物设计捕获探针和荧光探针
捕获探针和识别探针1和2均为单链寡核苷酸，捕获探针长度一般为25～30个碱基，与识别探针1一端的碱基序列互补。室温下，捕获探针通过识别探针1与待检测 的目标物分子稳定结合，将底物结构固定在功能化的玻片表面；其中捕获探针标记有 生物素，其能通过生物素-亲和素(例如，链霉亲和素)相互作用偶联在修饰有带生物 素标记的聚乙二醇的玻片上。当体系中存在目标物时，识别探针1和2会与目标物结 合，同时目标物的结合触发两条识别探针信号臂的组装，从而激活了荧光探针与识别 探针的信号臂形成动态TWJ(图1)。
信号探针为一端带有Cy3标记的单链短核苷酸序列，与识别探针组装后的信号臂形成动态结合；一般，信号探针与两段信号臂分别互补的碱基个数为5～7个，以保证 在室温及合适的离子强度下能够形成动态TWJ，从而产生高辨识度单分子动力学信 号。
B、将捕获探针固定在经过修饰的玻片上；加入信号探针与目标物分子形成的复合物，目标物分子与捕获探针稳定结合，固定于玻片表面；加入荧光探针，与识别探 针的信号臂形成动态TWJ。在TIRF照射下，利用EMCCD监测单分子动态TWJ的结 合与解离过程。
C、利用matlab对检测记录的电影进行分析。
根据本发明，当结合状态和未结合状态之间的荧光强度差异>1000，信噪比>3， 观察到荧光探针结合和解离事件的数量≥3时，被认为是核酸动态结合单分子荧光点， 进而被确认为存在目标物。
实施例1、基于动态TWJ探针的单分子荧光传感用于检测寡聚核苷酸
(1)识别探针与目标物分子形成复合物
建立50μL体系，反应缓冲液环境为1×PBS，分别加入待检测的寡核苷酸链、识别探针1和识别探针2，使它们在体系中的浓度均为1μM。若体系总体积小于50μL，则用 ddH2O补充。
应用退火程序确保识别探针与待检测的寡核苷酸链正确结合。设定程序如下： 85℃，2min；75℃，1min；65℃，1min；55℃，1min；45℃，1min；35℃，1min； 25℃，1min；15℃，1min；4℃，保持。
(2)捕获探针固定与目标物捕获
取100μL的T50缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl和1mM EDTA，pH＝8)加 入样品池中，润洗玻片后舍弃。
取50μL的1mg/mL的链霉亲和素(pH＝8)，加入润洗后的样品池中，孵育10-15min后舍弃，并用100μL的1×PBS清洗玻片两次。
在包被了链霉亲和素的玻片上，加入100μL浓度为10pM的生物素标记的捕获探针，孵育10min后吸去，并用100μL的1×PBS清洗玻片两次。
取100μL浓度为5pM的(1)中形成的复合物，加入固定有捕获探针的玻片上， 孵育60min后吸去，并用100μL的1×PBS清洗玻片两次。
(3)单分子荧光传感与数据分析
取100μL含有25nM的信号探针、2.5mM的3,4-二羟基苯甲酸甲酯、25nM的 原儿茶多加氧酶，1mM的水溶性维生素E的4×PBS溶液滴加在玻片上。将准备好的 待检测玻片置于全内反射荧光显微镜载物台上。
选用信号探针激发波长为520nm，发射波长为(593±20)nm，物镜为放大倍数 100倍的TIRF物镜。显微镜配备有EMCCD相机，对光子具有高灵敏度。
拍摄记录玻片上荧光闪烁点的电影，曝光时间为500ms，记录时长约为8.5min。 并用MATLAB软件分析筛选荧光点的个数，用于指认目标物分子是否存在。
当不存在寡核苷酸目标物时，荧光值无规律性变化，则认为该单分子点是短荧光DNA探针与检测表面的非特异性相互作用引起的荧光变化(图2(B))；当存在寡核 苷酸目标物时，荧光值呈规律性变化，即当结合状态和未结合状态之间的荧光强度差 异>1000，信噪比>3，观察到荧光探针结合和解离事件的数量≥3时，则认为该单分子 点是与捕获分子结合从而被固定在玻片表面的目标物(图2(A))。
实施例2、基于动态TWJ探针的单分子荧光传感用于检测ATP
(1)识别探针(核酸适配体)与目标物分子形成复合物
应用退火程序处理核酸适配体，设定程序如下：85℃，2min；75℃，1min； 65℃，1min；55℃，1min；45℃，1min；35℃，1min；25℃，保持。
建立50μL反应体系，反应缓冲液环境为1×Tris-HCl(含有140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2)，分别加入ATP、识别探针1(适配体1)和识别探 针2(适配体2)，使它们在体系中的浓度均为1μM。若体系总体积小于50μL，则用 ddH2O补充。使用水浴锅温育，令适配体与ATP结合，反应条件：37℃，温育30min。
(2)捕获探针固定与目标物捕获
参见实施例1。
(3)单分子荧光传感与数据分析
参见实施例1(3)。
当不存在ATP时，荧光值无规律性变化，则认为该单分子点是短荧光DNA探针 与检测表面的非特异性相互作用引起的荧光变化(图3(B))；当存在ATP时，荧光 值呈规律性变化，即当结合状态和未结合状态之间的荧光强度差异>1000，信噪比>3， 观察到荧光探针结合和解离事件的数量≥3时。则认为该单分子点是与捕获分子结合 从而被固定在玻片表面的目标物(图3(A))。
本发明实施例中所采用的核酸序列如表1所示。
表1各核酸序列
Figure BDA0002027599430000061
Figure BDA0002027599430000071

Claims (4)

1.一种单分子荧光检测探针系统，包括带荧光标记的信号探针和能与待检测的目标物结合的两条识别探针；
当两条所述识别探针均与待检测的目标物结合时，会诱导两条所述识别探针与所述信号探针之间的结合稳定度的变化，即荧光强度-时间轨迹呈现ON-OFF交替变化；
一条所述识别探针由捕获探针结合域、目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；
另一条所述识别探针由目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；
一条所述识别探针通过所述捕获探针结合域与捕获探针形成稳定结合；
两条所述识别探针均通过所述目标物结合域与目标物形成稳定结合；
两条所述识别探针均通过所述信号探针接收臂与所述信号探针形成动态结合；
所述信号探针与所述信号探针接收臂互补的碱基个数为5～7个；
所述信号探针与所述信号探针接收臂相互作用区段的GC含量≤50％；
将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端；
所述荧光基团为Cy3荧光基团。
2.一种单分子检测方法，包括如下步骤：
(1)将两条识别探针与待检测的目标物结合，形成复合物；
(2)将捕获探针固定于玻片上，并加入所述复合物，所述捕获探针与一条所述识别探针结合；
所述捕获探针与所述识别探针之间互补的碱基个数至少为20个；
(3)向所述玻片上加入带荧光标记的信号探针，所述信号探针与两条所述识别探针动态结合；
所述信号探针与每条所述识别探针的接收臂互补的碱基个数为5～7个；
所述信号探针与所述识别探针的接收臂相互作用区段的GC含量≤50％；
将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端；所述荧光基团为Cy3荧光基团；
(4)将所述玻片置于显微镜载物台上进行监测，利用电子增强型相机记录单分子荧光时间影像序列，筛选得到荧光强度-时间轨迹呈现若干次ON-OFF交替变化且荧光的ton和toff相对较短的单分子点即为目标物；
所述ON-OFF交替变化指的是所述信号探针结合时表现的荧光ON状态与其解离时表现的荧光OFF状态的交替变化；
所述ton指的是荧光ON状态持续的时间，所述toff指的是荧光OFF状态持续的时间；
在监测时间500s内荧光状态变化次数大于3次的单分子点为所述目标物；
当所述信号探针结合时与其解离时的荧光强度差异>1000且信噪比>3时的单分子点为所述目标物。
3.根据权利要求2所述的单分子检测方法，其特征在于：步骤(1)中，形成所述复合物的条件如下：
温度为20～27℃，时间为30～60分钟。
4.权利要求1所述单分子荧光检测探针系统检测下述单分子中的应用：
寡聚核苷酸、蛋白质和小分子；
利用固定于玻片表面的捕获探针与所述识别探针结合；
所述捕获探针与所述识别探针之间互补的碱基个数至少为20个。
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