CN111398576A - 一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法，该试剂盒包含：纳米磁珠‑核酸适配体探针、RCA引物、RCA模板、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶和NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针。本发明通过以Fe3O4纳米磁珠为快速磁分离载体，以与氧氟沙星特异性结合的核酸适配体为识别元件，通过滚环扩增技术将核酸信号放大，以时间分辨荧光为信号源，构建了一种新型的对食品中残留抗生素氧氟沙星进行特异性快速灵敏检测技术。本发明的方法检测周期短，不依色谱仪器，灵敏度高，检出限和定量限均低至pmol/L级，适合市场或企业中检测人员的使用。

Description

一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法
技术领域
本发明涉及一种用于氧氟沙星检测的试剂盒，具体涉及一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法。
背景技术
氧氟沙星(ofloxacin,OFL)属于氟喹诺酮类抗生素，对葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、淋球菌等致病菌具有良好的抑制作用。作为一种在畜牧业中的常用药物，氧氟沙星被广泛用于治疗和防治牲畜的呼吸道和泌尿系统等疾病。氧氟沙星为人工合成抗生素，难以自然降解，滥用和动物代谢产生的废水进入环境中会在土壤、水体中产生长期污染。氧氟沙星等兽药残留通过食物链在人体的肝肾等靶器官蓄积，使部分人群产生过敏反应或脏器损伤。氧氟沙星等抗生素在自然界或人体的积累还会或导致细菌耐药性增加，致使达到相同的治疗效果需要更大剂量的抗生素使用。因此，一些国家或组织对氧氟沙星的使用做出了严格的规定，我国农业部在2015年发布的第2292号公告中明确禁止氧氟沙星作为兽药使用；欧盟将食品中氧氟沙星残留量规定为不能检出。
然而，由于氧氟沙星的疗效和方便使用性，氧氟沙星被用作兽药屡禁不止，动物性食品中氧氟沙星残留抽检超标的案例仍时常被报道。近期(2020年)一篇发表在知名期刊《Environment International》的报告显示，通过对上海市762名孕妇的尿液进行抗生素的检测，抗生素的检出率高达98.2％，在被检出的抗生素中，氟喹诺酮类含量最高。同时，有预测显示到2030年，我国的抗生素消费量将占全球生产的抗生素的30％。食品中以氧氟沙星为代表的抗生素残留的检测和控制问题严峻。因此，能快速、准确地检测食品中以氧氟沙星为代表的抗生素残留，进而有效预防和控制食物中的污染，一直是食品安全有关科研工作者所追求的目标。
目前，食品中氧氟沙星等氟喹诺酮类抗生素残留的检测主要基于仪器分析法、免疫分析法和微生物法。氧氟沙星残留的仪器分析检测方法有质谱和色谱等，既是国标中对农兽药残留的检测的主要方法也是农兽药残留是否超标的最终鉴定方法。免疫分析法理论上具有抗原抗体反应的专一性、高灵敏度和适于大批量样品快速筛选等优点，在农兽药残留分析中具有广泛的前景。微生物法通过测试药物对特定标准菌生长的抑制程度来判定药物残留的含量，其优点在于检测成本低，适用于对食品中抗生素残留的初步筛查。
但是，以高效液相色谱法为代表的仪器分析法依赖昂贵且不方便移动的检测设备，要求专业的操作人员，因此检测成本昂贵。同时，样品的前处理步骤多，处理周期较长，因此只适用于实验室检测，难以进行现场大规模的筛选。免疫分析法涉及抗体识别，其抗体一般需要通过实验动物或杂交瘤细胞获得，制备费时且成本高。作为球蛋白，抗体活性易受温度影响，对保存和运输有较高的温度控制要求，这使得免疫分析检测方法的发展和实际应用很受限制。微生物法如管碟法，由于菌落形成时间的要求，其检测周期长达十余小时。微生物法操作过程要求无菌环境，以防止杂菌对检测结果的干扰，因此只适合实验室检测。此外，微生物法还受试验标准菌株的变异的影响，很难满足对氧氟沙星残留的的高灵敏度检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法，解决了现有检测方法设备昂贵、周期长，且不利于现场检验的问题，能够缩短时间，降低检测成本，检测限低，灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明提供了一种氧氟沙星灵敏检测的试剂盒，该试剂盒包含：纳米磁珠-核酸适配体探针(纳米磁珠-Apt)、RCA(Rolling circle amplification)引物、RCA模板、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶和NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针。
其中，所述纳米磁珠-核酸适配体探针以氨基化Fe3O4纳米颗粒为磁分离载体，在氨基化Fe3O4纳米颗粒表面上固定有核酸序列P1，且该核酸序列P1与核酸适配体(Aptamer,Apt)通过碱基互补配对杂交；所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列；所述核酸适配体具有如SEQ.ID NO 2所示的核苷酸序列。
所述RCA引物具有如SEQ.ID NO 3所示的核苷酸序列。
所述RCA模板具有如SEQ.ID NO 4所示的核苷酸序列。
所述NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针包含：氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨纳米颗粒和可与RCA产物互补的核酸序列cDNA；所述核酸探针序列cDNA具有如SEQ.ID NO 5所示的核苷酸序列。
优选地，该试剂盒还包含：T4 DNA连接酶缓冲液、Phi29 DNA聚合酶缓冲液；所述T4DNA连接酶缓冲液包含：Tris-HCl buffer、MgCl2、二硫苏糖醇、ATP、PEG4000；所述Phi29DNA聚合酶缓冲液包含：Tris-HCl buffer、(NH4)2SO4、MgCl2、二硫苏糖醇。
本发明的另一目的是提供一种用于检测氧氟沙星的探针组，该探针组包含：纳米磁珠-核酸适配体探针和Phi29 DNA聚合酶和NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针。
其中，所述纳米磁珠-核酸适配体探针以氨基化Fe3O4纳米颗粒为磁分离载体，氨基化Fe3O4纳米颗粒表面上固定有核酸序列P1，且该核酸序列P1与核酸适配体通过碱基互补配对杂交；所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列；所述核酸适配体具有如SEQ.ID NO 2所示的核苷酸序列。
所述NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针包含：氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒和与RCA产物互补的核酸序列cDNA；所述核酸探针cDNA具有如SEQ.ID NO 5所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种与所述核酸适配体部分互补的核酸序列P1，所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种与所述的核酸序列P1部分互补的RCA引物，所述RCA引物具有如SEQ.ID NO 3所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种与所述的RCA引物部分互补的RCA模板，所述RCA模板具有如SEQ.ID NO 4所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种氧氟沙星快速灵敏检测的方法，该方法采用所述的试剂盒进行检测。
优选地，该方法包含：将所述的纳米磁珠-核酸适配体探针分散在待测样品中振荡孵育，结束后进行磁分离，得到脱落核酸适配体后的纳米磁珠-P1探针；将所述纳米磁珠-P1探针与所述的RCA引物振荡孵育，加入所述的RCA模板、T4 DNA连接酶缓冲液、水和T4 DNA连接酶，振荡孵育，结束后灭活所述T4 DNA连接酶，磁分离后加入Phi29 DNA聚合酶缓冲液、牛血清白蛋白、dNTPs、Phi29 DNA聚合酶和水进行孵育，结束后灭活所述Phi29 DNA聚合酶，得到反应产物纳米磁珠-RCA；将所述的NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针和纳米磁珠-RCA混合均匀并孵育，结束后进行磁分离，得到NaYF4:Ce/Tb-cDNA-RCA-纳米磁珠复合物；将所述NaYF4:Ce/Tb-cDNA-RCA-纳米磁珠复合物进行荧光信号强度检测以检测待测样品中的氧氟沙星。
本发明的另一目的是提供一种纳米磁珠-核酸适配体探针的制备方法，该制备方法包含：
将氨基化Fe3O4纳米颗粒于PBS缓冲液中，加入戊二醛溶液，室温振荡孵育，分离得到活化的纳米材料，将该活化纳米材料于生物素溶液中35～40℃孵育过夜，得到修饰亲和素的纳米材料；
将所述修饰亲和素的Fe3O4纳米材料于PBS缓冲液中，加入所述的核酸序列P1，35～40℃振荡孵育，得到纳米磁珠-P1探针；
将所述纳米磁珠-P1探针于经过淬火处理的核酸适配体的PBS缓冲液中，该核酸适配体为所述的核酸适配体，35～40℃振荡孵育，得到纳米磁珠-核酸适配体探针。
本发明的另一目的是提供一种NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针的制备方法，该制备方法包含：
将氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒分散于PBS缓冲液中，加入戊二醛溶液，室温振荡孵育，离心分离得到活化的荧光纳米颗粒，将活化的荧光纳米颗粒于生物素溶液中35-40℃孵育，离心后得到修饰亲和素的荧光纳米颗粒；
将所述修饰亲和素的荧光纳米颗粒分散于PBS缓冲液中，加入所述的核酸序列cDNA，35～40℃振荡孵育，得到NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针。
本发明的氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法，解决了现有检测方法设备昂贵、周期长，且不利于现场检验的问题，具有以下优点：
(1)本发明通过将RCA、Apt和时间分辨荧光相结合，构建以核酸为识别和检测元件的新型高效检测方法，为氧氟沙星等农兽药残留检测提供新的方法。通过以Fe3O4纳米磁珠为快速磁分离载体，以Apt为氧氟沙星特异性识别元件，以时间分辨荧光技术(Time-resolved fluorescence,TRF)为信号源，并通过RCA技术放大核酸信号，构建了一种新型的对食品中残留抗生素氧氟沙星进行特异性快速灵敏检测技术；
(2)本发明为第一次在氟喹诺酮类药物残留检测中使用RCA技术。作为一种方便高效的核酸体外扩增方法，RCA在恒定的常温环境下即可在短时间内将模板核酸上成百上千倍复制，从而放大核酸信号。本发明采用的TRF技术具有荧光材料易合成、荧光发光寿命长、斯托克斯位移大(>200nm)、抗光漂白能力强以及低毒性等优点。相较于普通荧光材料，TRF的显著特性是能在成分复杂的生物样品通过区分样品中所含荧光物质荧光寿命的长短，达到消除背景荧光目的。该特性使TRF特别适用于生物样品中痕量物质的荧光检测。本发明以与氧氟沙星特异性结合的核酸适配体作为样品中氧氟沙星的识别元件，Apt与抗体相比合成成本低，价格更廉价，能够解决检测试剂的冷链保藏和运输问题，并进一步降低检测成本；
(3)本发明第一次结合RCA和TRF两种技术用于食品中兽药残留的灵敏检测。为了达到这个目的，本发明特别设计了如SEQ.ID NO 4所示的RCA模板核苷酸序列。RCA模板为RCA反应的重要组成部分，不同的模板设计使RCA发挥不同的作用。在本发明中，通过设计RCA模板的复制产物为TRF的结合提供位点，使RCA和TRF两种技术有机结合在一起；
(4)本发明的方法检测周期短，不需要色谱仪器，适合市场或企业中检测人员的使用。本发明对氧氟沙星具有高灵敏度的信号响应，检测范围宽达4个数量级，检出限和定量限均低至pmol/L级，准确度高，能满足对禁用兽药氧氟沙星残留的检测要求。
附图说明
图1为本发明的氧氟沙星快速灵敏检测的方法的原理图。
图2为本发明的不同梯度浓度的氧氟沙星的检测结果图。
图3为本发明的不同药物的检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种氧氟沙星快速灵敏检测的方法，包括：纳米磁珠-核酸适配体探针(即纳米磁珠-Apt探针)、RCA引物、RCA模板、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶、NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针、磁分离架以及荧光光谱仪。纳米磁珠-Apt探针中采用氨基化Fe3O4纳米颗粒为磁分离载体，氨基化Fe3O4纳米颗粒表面上固定有核酸序列P1，核酸序列P1与Apt通过碱基互补配对杂交，达到构建纳米磁珠-Apt探针的目的。NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针由氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒和与RCA产物互补的核酸序列cDNA构成。
如图1所示(图中，avidin-MNPs为抗生物素蛋白修饰的氨基化Fe3O4纳米颗粒，aptamer为Apt，padlock template为锁式模板，biotinylated P1为生物素化的P1，Phi29DNA polymerase为Phi29 DNA聚合酶，ofloxacin为氧氟沙星，primer为引物，magnet为磁铁或磁力架)，为本发明的氧氟沙星快速灵敏检测的方法的原理图，在氧氟沙星存在的情况下，纳米磁珠-Apt探针识别氧氟沙星，Apt从其上脱落，RCA引物得以与纳米磁珠上的核酸序列P1相杂交。之后，在T4 DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶以及相关辅助材料的作用下，纳米磁珠上的RCA反应开始，RCA产物大量产生，NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针得以大量结合在纳米磁珠上，通过测定荧光强度，达到检测的目的。
上述核酸序列P1、核酸序列cDNA、氧氟沙星特异识别Apt、RCA引物和RCA模板的序列如表1所示，其中P1的下划线部分与Apt和RCA引物的下划线部分互补，RCA引物的粗体部分和RCA模板的粗体部分为互补区域，核酸序列cDNA的斜体部分与RCA模板的斜体部分相匹配。
表1检测所用核酸序列
Figure BDA0002494396120000061
Figure BDA0002494396120000071
为了对本发明提供的一种氧氟沙星快速灵敏检测的方法进行
实验例1氨基化Fe3O4纳米颗粒的合成
称取2.0g CH3COONa和1.0g FeCl3·6H2O于小烧杯中，之后加入30mL乙二醇。将6.5g 50℃水浴融化的1,6-己二胺在加入上述混合液中，50℃下油浴磁力搅拌，待形成酒红色透明溶液，将该溶液转移至高压反应釜内，在198℃高温反应6h。
待反应完成后，将反应釜置于室温下自然冷却，利用磁铁分离收集产物，弃掉上层液体，用超纯水和无水乙醇交替超声洗涤产物三次，最后将黑色粉末于50℃下干燥10h，干燥产物用研磨至粉末备用。
实验例2氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒的合成
采用一步溶剂热法合成Na YF4:Ce/Tb无机纳米材料，具体过程如下：
称取1mmol的磷酸乙醇胺(AEP)和1mmol的NaCl溶于30mL乙二醇中并不断搅拌，随后加入0.9mmol六水合硝酸钇(Y(NO3)3·6H2O)、0.05mmol六水合硝酸铈(Ce(NO3)3·6H2O)、0.05mmol五水合硝酸铽(Tb(NO3)3·5H2O)，继续搅拌至溶解。在45℃水浴搅拌，将4mmol氟化铵(NH4F)溶于10mL乙二醇溶液，然后，逐滴加入上述透明溶液中。
将上述混合溶液在室温下剧烈搅拌40min后，转移至高压反应釜内，180℃反应4h。
待反应结束后，将反应釜取出冷却至室温，以离心的方式收集产物，之后以乙醇、超纯水交替超声洗涤，粉末于50℃下干燥12h，干燥产物用研磨至粉末备用。
实验例3NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针或纳米磁珠-Apt探针的构建
取5mg纳米材料(上述制备的氨基化Fe3O4纳米颗粒或氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒)分散在5mL的PBS缓冲液(10mmol/L Na2HPO4、2mmol/L KH2PO4、2.7mmol/LKCl、137mmol/L NaCl，pH为7.4)中并加入1.25mL戊二醛溶液(25％,V/V)，在温和振荡下25℃孵育3h，分离得到活化的纳米材料，用PBS缓冲液洗涤纳米材料。
将洗涤后的活化纳米材料分散在5mL 0.1mg/mL生物素溶液中37℃孵育12h，之后用PBS缓冲液洗涤纳米材料除去未固定的亲和素，得到修饰亲和素的纳米材料。
将修饰亲和素的纳米材料分散在5mL PBS缓冲液中，加入90μL 10μmol/L核酸序列P1(氨基化Fe3O4纳米颗粒加核酸序列P1)或核酸序列cDNA(氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒加核酸序列cDNA)混合均匀，37℃振荡孵育4h。
孵育完成后，用PBS缓冲液洗涤除去未固定的P1或cDNA，得到NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针或纳米磁珠-P1探针。
将纳米磁珠-P1探针分散在10mL含200nmol/L淬火(90℃孵育8min之后4℃孵育10min，冷却至室温)后的Apt的PBS缓冲液中，37℃振荡孵育1h。孵育完成后，用BB缓冲液(100mmol/L NaCl、20mmol/LTris–HCl、2mmol/L MgCl2、1mmol/L CaCl2，pH为7.6)洗涤除去未杂交的Apt，得到纳米磁珠-Apt探针。
实验例4食品中氧氟沙星残留检测
1、样品前处理方法
称取绞碎后的肉类样品1.0±0.05g加入到5mL含有5％(V/V)乙酸的乙腈中剧烈振荡10min，以11600g的离心力离心10min取上清液，滤渣重复处理两次。将合并的上清液在50℃下旋转蒸发，除去有机溶剂。
将蒸发残留物用10mL BB缓冲液复溶，得到待测溶液。
将0.05mg纳米磁珠-Apt探针分散在200μL待测溶液中，21℃振荡孵育1h。用磁力架磁分离得到脱落Apt后产生的纳米磁珠-P1探针，并用PBS缓冲液洗涤纳米磁珠-P1探针3次。
2、RCA反应的进行
在纳米磁珠-P1探针上进行RCA反应以放大信号，具体步骤如下：
将纳米磁珠-P1探针与200μL含150nmol/L的RCA引物的PBS溶液在37℃下振荡孵育1h，之后用PBS缓冲液洗涤3次，彻底除去未杂交的RCA引物。加入20μL 1.0μmol/L的RCA模板、3.0μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液(500mmol/L Tris-HCl buffer、100mmol/L MgCl2、100mmol/L dithiothreitol、10mmol/L ATP，pH为7.5)、6.5μL UP水(高纯水)在37℃下孵育30min。之后，将200U 0.5μLT4 DNA连接酶加入其中，并在25℃下振荡孵育1.5h。
在T4 DNA连接酶完成RCA模板的环化后，以65℃水浴10min灭活T4 DNA连接酶。在磁分离后，进行Phi29 DNA聚合酶催化得到RCA-纳米磁珠探针，具体过程为：
在总反应体积30μL包括：3.0μL 10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L Tris-HCl、100mmol/L(NH4)2SO4、100mmol/L MgCl2、40mmol/L dithiothreitol)、0.5μL 200mg/mLBSA(牛血清白蛋白)、3μL dNTPs(2.5mmol/L)、3U Phi29DNA聚合酶和UP水。30℃下孵育1.5h，孵育完成后，65℃水浴10min灭活Phi29 DNA聚合酶，并用PBS缓冲液洗涤3次，得到RCA-纳米磁珠探针。
3、样品检测
在300μL 0.05mg/mL的NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针溶液中加入RCA-纳米磁珠探针，并在37℃下振荡孵育1h，磁分离后以用PBS缓冲液洗涤3次，彻底除去未杂交在RCA-纳米磁珠探针上的NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针，得到NaYF4:Ce/Tb-cDNA-RCA-纳米磁珠复合物。
将上述NaYF4:Ce/Tb-cDNA-RCA-纳米磁珠复合物重悬在300μL PBS缓冲液中，通过带有磷光检测器的荧光光谱仪得到时间分辨荧光信号强度Ft。
4、检测结果
(4.1)标准曲线及氧氟沙星残留计算式
在BB缓冲液中配制不同梯度浓度的氧氟沙星标准溶液(5×10-11、1×10-10、5×10-10、1×10-9、1×10-8、5×10-8mol/L)。使用上述方法对氧氟沙星标准溶液进行测定，结果如图2所示(图2中a为荧光响应图，b为标准曲线)，根据测定结果计算出标准曲线的公式如等式(1)，检出限＝32.1pmol/L，定量限＝107.1pmol/L。以时间分辨荧光信号强度Ft为纵坐标，氧氟沙星的对数摩尔浓度为横坐标，绘制出标准曲线，如图2中的b所示。
Ft＝5320.10×lgM+66150.45 (1)
根据标准曲线公式，得出样品中氧氟沙星残留浓度计算式(2)为：
C＝M×3.61×102 (2)
式中，C为样品中氧氟沙星残留浓度，g/Kg；M为所测试样中氧氟沙星浓度，mol/L。
(4.2)特异性分析
根据上述标准曲线测定的结果，选择达氟沙星(danofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、红霉素(erythromycin)、氨苄青霉素(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、四环素(tetracycline)与氧氟沙星(ofloxacin)各自用BB缓冲液中配制浓度为1nmol/L溶液，使用上述方法进行特异性分析。将测定的荧光强度值作出结果分析图，显示本方法与氧氟沙星特异性良好，如图3所示，图中ΔFt＝Ft-F0，ΔFt为不同抗生素引发的相对荧光强度，Ft为不同抗生素引发的荧光强度响应，F0为空白荧光强度。
(4.3)准确性分析
为了对本发明的准确性进行鉴定，使用市场中购买的新鲜猪肉进行加标实验。按上述样品前处理过程对分别添加50、100、1000pmol/L氧氟沙星溶液的猪肉样品进行前处理。处理后的样品分别按上述检测方法进行检测。计算得到的方法回收率和精密度如表2所示。结果显示本方法能准确地对肉类食品中氧氟沙星残留量进行测定。
表2检测方法的准确性
Figure BDA0002494396120000101
本发明以Fe3O4纳米磁珠为快速磁分离载体，以Apt为氧氟沙星特异性识别元件，通过RCA技术将核酸信号进行放大，以TRF为信号源，构建了一种新型的对食品中残留抗生素氧氟沙星进行特异性快速灵敏检测技术。本发明的检测范围在50pmol/L～50nmol/L，检出限(指样品中的被分析物能被检测到的最低量)和定量限(指样品中的被分析物能够被定量测定的最低量)分别为32pmol/L和107pmol/L，加标回收率90％以上，特异性实验表明了对氧氟沙星明显的特异识别性。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 西华大学
<120> 一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gatcgagcct ca 12
<210> 2
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ataccagctt attcaattag ttgtgtattg aggtttgatc taggcatagt caacagagca 60
cgatcgatct ggcttgttct acaatcgtaa tcagttag 98
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ttccaaccca ggattttttt ttgaggctcg atc 33
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggttggaaaa gttataaata caaacataca aacataaata caaacataca tacaaaaatc 60
ctg 63
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ataaatacaa acatac 16

Claims (10)

1.一种氧氟沙星灵敏检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：纳米磁珠-核酸适配体探针、RCA引物、RCA模板、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶和NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针；
其中，所述纳米磁珠-核酸适配体探针以氨基化Fe3O4纳米颗粒为磁分离载体，在氨基化Fe3O4纳米颗粒表面上固定有核酸序列P1，且该核酸序列P1与核酸适配体通过碱基互补配对杂交；所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列；所述核酸适配体具有如SEQ.ID NO 2所示的核苷酸序列；
所述RCA引物具有如SEQ.ID NO 3所示的核苷酸序列；
所述RCA模板具有如SEQ.ID NO 4所示的核苷酸序列；
所述NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针包含：氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨纳米颗粒和可与RCA产物互补的核酸序列cDNA；所述核酸探针序列cDNA具有如SEQ.ID NO 5所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包含：T4 DNA连接酶缓冲液、Phi29 DNA聚合酶缓冲液；所述T4 DNA连接酶缓冲液包含：Tris-HCl buffer、MgCl2、二硫苏糖醇、ATP、PEG4000；所述Phi29 DNA聚合酶缓冲液包含：Tris-HCl buffer、(NH4)2SO4、MgCl2、二硫苏糖醇。
3.一种用于检测氧氟沙星的探针组，其特征在于，该探针组包含：纳米磁珠-核酸适配体探针和Phi29 DNA聚合酶和NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针；
其中，所述纳米磁珠-核酸适配体探针以氨基化Fe3O4纳米颗粒为磁分离载体，氨基化Fe3O4纳米颗粒表面上固定有核酸序列P1，且该核酸序列P1与核酸适配体通过碱基互补配对杂交；所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列；所述核酸适配体具有如SEQ.ID NO 2所示的核苷酸序列；
所述NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针包含：氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒和与RCA产物互补的核酸序列cDNA；所述核酸探针cDNA具有如SEQ.ID NO 5所示的核苷酸序列。
4.一种与如权利要求1中所述核酸适配体部分互补的核酸序列P1，其特征在于，所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列。
5.一种与如权利要求4所述的核酸序列P1部分互补的RCA引物，其特征在于，所述RCA引物具有如SEQ.ID NO 3所示的核苷酸序列。
6.一种与如权利要求5所述的RCA引物部分互补的RCA模板，其特征在于，所述RCA模板具有如SEQ.ID NO 4所示的核苷酸序列。
7.一种氧氟沙星快速灵敏检测的方法，其特征在于，该方法采用如权利要求1或2所述的试剂盒进行检测。
8.根据权利要求7所述的氧氟沙星灵敏检测的方法，其特征在于，该方法包含：
将如权利要求1中所述的纳米磁珠-核酸适配体探针分散在待测样品中振荡孵育，结束后进行磁分离，得到脱落核酸适配体后的纳米磁珠-P1探针；
将所述纳米磁珠-P1探针与如权利要求1中所述的RCA引物振荡孵育，加入如权利要求1中所述的RCA模板、T4 DNA连接酶缓冲液、水和T4 DNA连接酶，振荡孵育，结束后灭活所述T4DNA连接酶，磁分离后加入Phi29 DNA聚合酶缓冲液、牛血清白蛋白、dNTPs、Phi29 DNA聚合酶和水进行孵育，结束后灭活所述Phi29 DNA聚合酶，得到反应产物纳米磁珠-RCA；
将如权利要求1中所述的NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针和纳米磁珠-RCA混合均匀并孵育，结束后进行磁分离，得到NaYF4:Ce/Tb-cDNA-RCA-纳米磁珠复合物；
将所述NaYF4:Ce/Tb-cDNA-RCA-纳米磁珠复合物进行荧光信号强度检测以检测待测样品中的氧氟沙星。
9.一种纳米磁珠-核酸适配体探针的制备方法，其特征在于，该制备方法包含：
将氨基化Fe3O4纳米颗粒于PBS缓冲液中，加入戊二醛溶液，室温振荡孵育，分离得到活化的纳米材料，将该活化纳米材料于生物素溶液中35～40℃孵育过夜，得到修饰亲和素的纳米材料；
将所述修饰亲和素的Fe3O4纳米材料于PBS缓冲液中，加入如权利要求1中所述的核酸序列P1，35～40℃振荡孵育，得到纳米磁珠-P1探针；
将所述纳米磁珠-P1探针于经过淬火处理的核酸适配体的PBS缓冲液中，该核酸适配体为如权利要求1中所述的核酸适配体，35～40℃振荡孵育，得到纳米磁珠-核酸适配体探针。
10.一种NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针的制备方法，其特征在于，该制备方法包含：
将氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒分散于PBS缓冲液中，加入戊二醛溶液，室温振荡孵育，离心分离得到活化的荧光纳米颗粒，将活化的荧光纳米颗粒于生物素溶液中35-40℃孵育，离心后得到修饰亲和素的荧光纳米颗粒；
将所述修饰亲和素的荧光纳米颗粒分散于PBS缓冲液中，加入如权利要求1中所述的核酸序列cDNA，35～40℃振荡孵育，得到NaYF4:Ce/Tb-cDNA时间分辨荧光探针。
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