CN112444510B - 一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于小分子检测领域，涉及一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法和试剂盒。该方法包括以下步骤：S1.获得修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针；S2.MIL‑101(Cr)的合成与活化；S3.小分子真菌毒素和适配体结合；S4.信号检测：采用荧光分光光度计检测步骤S3反应所得产物的荧光信号。本发明采用稀土掺杂的上转换纳米颗粒，荧光强度稳定、背景值低，相较于其他方法，本发明的荧光检测试剂盒不需要复杂的操作步骤，适用性强，检测结果灵敏性高、特异性好，可以应用于现场样品的快速检测。

Description

一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子 真菌毒素的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于小分子检测领域，具体地，涉及一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，以及一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素试剂盒。
背景技术
T-2毒素属于自然界中镰刀菌属分泌产生的A类单端孢霉烯族毒素，并且是此类毒素中毒性最强的一种，其广泛存在于玉米、大麦、小麦、燕麦等粮食中。T-2毒素随着被污染的食物进入动物和人类的体内，对机体健康和生长发育产生很大危害，它可以在有机体内引发多种毒性作用，包括急性毒性与慢性毒性。发病症状具体表现为呕吐、厌食和体重减轻。除此之外，T-2毒素还能造成肝脏、脑组织、神经系统、生殖系统的损伤与细胞凋亡，危及人的健康和生命安全。
目前，国标对于检测T-2毒素的方法是免疫亲和层析净化液相色谱法与酶联免疫吸附实验(ELISA)，前者具有较高的准确性，但是离不开昂贵的大型仪器平台的支撑；后者虽然特异性较好，但由于抗体存在批次差异，很可能导致测试结果不稳定。近年来，许多学者已经发展出多种检测T-2毒素的新方法，如高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)、免疫学检测方法、电化学检测方法等。但是这些方法或者具有较为繁琐的操作步骤或者具有高昂的检测成本，难以大规模推广使用。随着现代纳米技术的飞速发展，基于新型荧光纳米材料检测靶标的研究变得日益成熟。建立一种能够通过简单方便的操作，灵敏准确地检测目标物的方法已经成为未来发展的方向。
因此，有必要开发一种高灵敏度的检测方法，对食品中T-2毒素含量进行检测。
发明内容
针对现有技术的上述缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、检测快速、成本较低的荧光检测试剂盒及检测方法，以实现小分子真菌毒素的快速检测。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：
S1.获得修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针，包括：
(i)将聚乙烯亚胺PEI溶解在水中，然后加入包含上转换纳米颗粒UCNPs的溶液，并剧烈搅拌，得到UCNPs-PEI；所述上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb,Tm或NaYF4:Yb,Tm@NaYF4；
(ii)通过超声处理将UCNPs-PEI分散在PBS中，然后将戊二醛添加到该混合物中，将混合物在室温缓慢振荡，离心并洗涤；
(iii)将步骤(ii)获得的UCNPs分散在缓冲溶液中；将链霉亲和素添加至该混合物中，并在室温下进行缓慢振荡反应，反应结束经离心并洗涤后，收集链霉亲和素修饰的UCNPs，重悬在缓冲溶液中；
(iv)将生物素修饰的小分子真菌毒素适配体添加到步骤(iii)得到的重悬混合物中，缓慢振荡过夜后，将混合物离心、洗涤并重悬在缓冲溶液中，得到含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液；
S2.MIL-101(Cr)的合成与活化：配制含有Cr(NO3)3·9H2O、HF和对苯二甲酸的水溶液，加入至高压反应釜中，在200-240℃下反应，反应后经纯化得到浅绿色产物；使用前经高温真空干燥以实现活化，之后悬浮于缓冲液中，所述MIL-101(Cr)的粒径为1-1.5μm；
S3.小分子真菌毒素和适配体结合：在步骤S1制得的含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液中加入待测样品，孵育后加入步骤S2制得的MIL-101(Cr)悬浮液并充分混合，然后震荡反应；
S4.信号检测：采用荧光分光光度计检测步骤S3反应所得产物的荧光信号。
本发明检测过程原理图如图1所示。本发明开发了一种基于上转换纳米粒子(UCNP)和金属有机骨架(MOF)之间的荧光共振能量转移(FRET)灵敏检测T-2毒素的适体传感器。由于MIL-101(Cr)的有机配体与核酸碱基之间存在π-π堆积，MIL-101(Cr)吸附了修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针并引起上转换荧光猝灭。加入T-2毒素后，由于T-2毒素与修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针发生特异性结合后导致其远离MIL-101(Cr)，FRET过程被阻断，因而荧光强度发生恢复。不同浓度的T-2毒素结合修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针后产生不同的荧光恢复程度。基于该响应特性，可以通过荧光强度的高低来定量检测反应体系中T-2毒素的浓度。
本发明所用的上转换纳米颗粒可商购或通过本领域常规方法合成，优选地，所述上转换纳米颗粒通过以下制备方法制得：
(a)将YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O和TmCl3·6H2O溶解在水中，然后加入到装有OA和1-ODE的三颈烧瓶中；
(b)将溶液在室温下搅拌8-12分钟，并在140-160℃下加热1-2小时以除去水，形成镧系油酸盐复合物，然后冷却至45-55℃；
(c)将溶解在CH3OH中的NaOH和NH4F加入上述混合物中，并在45-55℃下搅拌20-40分钟；将体系在N2气氛中加热至95-100℃以除去CH3OH，然后在300-350℃保持1-2小时；在反应结束时，将溶液冷却至室温，加入无水乙醇，通过离心获得沉淀物，用水和乙醇反复洗涤沉淀物后，得到所述上转换纳米颗粒。
根据本发明，优选地，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照S1-S4的方法，检测一系列已知浓度的小分子真菌毒素的标准溶液，测得多组荧光值，分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图，得到小分子真菌毒素的标准曲线。
根据本发明，优选地，步骤S4还包括：基于标准曲线，计算待检测样品中小分子真菌毒素的含量。
本发明的方法原则上适用于各种符合上述检测要求的小分子真菌毒素，根据本发明一种优选实施方式，所述小分子真菌毒素为T-2毒素，T-2毒素适配体的序列为5’-CAGCTC AGA AGC TTG ATC CTG TAT ATC AAG CAT CGC GTG TTT ACA CAT GCG AGA GGT GAAGA CTC GAA GTC GTG CAT CTG-biotin-3’(SEQ ID NO：1)。
根据本发明，步骤S1中的缓冲溶液包括但不限于pH7.3 10mM Tris-HCl、pH7.310mM PBS或HEPES，优选为pH7.3 10mM Tris-HCl。
根据本发明，优选地，步骤S2包括：
将含有2-4mmol Cr(NO3)3·9H2O、35-45％HF和30-40mg/mL对苯二甲酸的水溶液加入至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并在210-230℃下反应6-10h；反应结束时，自然冷却后得到绿色产物和结晶的H2BDC副产物；通过用热乙醇与DMSO洗涤离心三次以上来纯化产物，并将纯化的浅绿色产物在真空下、在70-90℃下干燥；使用前在140-160℃真空干燥6-10h以实现活化，之后悬浮于8-12mM、pH 7-7.5的Tris-HCl中。
根据本发明，优选地，步骤S3包括：
在0.4-0.6mg/mL的含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液中加入待测样品，37℃孵育0.2-1h后，加入MIL-101(Cr)悬浮液并充分混合，然后缓慢振荡并在37℃下震荡反应10-30min，其中，上转换纳米颗粒与MIL-101(Cr)的质量比为1：1。
本发明在制备MIL-101时对粒径进行调控，在检测T-2毒素时优化了MIL-101与UCNPs的添加比例、反应时间与缓冲液种类，于最适条件下可以实现T-2毒素的高灵敏检测。
根据本发明，优选地，步骤S4包括：用F97pro荧光分光光度计，在室温下检测荧光信号，激发波长为980nm，发射波长为482nm。
本发明的方法适用于多种样品，所述待测样品可来自玉米粉、啤酒、豆粉、面粉。上述样品经简单处理即可作为所述待测样品。
本发明的第二方面提供一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素试剂盒，包括以下组分：
(1)修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针，根据上述步骤S1中所述的方法制得；
(2)MIL-101(Cr)，根据上述步骤S2中所述的方法制得。
本发明采用稀土掺杂的上转换纳米颗粒，荧光强度稳定、背景值低，相较于其他方法，本发明的荧光检测试剂盒不需要复杂的操作步骤，适用性强，检测结果灵敏性高、特异性好，本方法检测限为0.087ng mL-1，线性范围是0.1～100ng mL-1，可以应用于现场样品的快速检测。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明的检测原理图。
图2为上转换纳米粒子(UCNPs)透射电镜图。
图3为金属有机框架(MIL-101(Cr))透射电镜图。
图4为T-2毒素存在与否时UCNPs-MIL-101(Cr)复合物的透射电镜图，左侧两幅图的标尺为200nm，右侧两幅图的标尺为100nm。
图5为以T-2毒素标准品的浓度为横坐标，各浓度对应的荧光强度为纵坐标绘制的标准曲线。
图6为基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测T-2毒素的特异性实验，紫色柱代表2ng/mL，蓝色柱代表10ng/mL。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
以下实施例中，上转换纳米颗粒合成所用试剂购自美国Sigma-Aldrich公司，MIL-101(Cr)合成所需试剂购自阿拉丁生化试剂有限公司，其他常用有机试剂购自国内化学试剂厂家。
实施例1
本实施例用于说明本发明的T-2毒素的快速检测试剂盒和检测方法。具体实施步骤如下：
1)修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒的制备与修饰
(a)将0.78mmol YCl3·6H2O，0.2mmol YbCl3·6H2O和0.02mmol TmCl3·6H2O溶解在4mL水溶液中，然后添加到装有9mL OA和15mL1-ODE的100mL三颈烧瓶中。
(b)将溶液在室温下搅拌10分钟，并在150℃下加热1.5小时以除去水，形成镧系油酸盐复合物。此时，溶液呈透明浅黄色，然后冷却至50℃。
(c)将溶解在10mL CH3OH中的2.5mmol NaOH和4mmol NH4F加入上述混合物中，并在50℃下搅拌30分钟。将体系在N2气氛中加热至100℃保持1小时以除去CH3OH，然后在320℃保持1.5小时。在反应结束时，将溶液冷却至室温，加入无水乙醇，通过离心获得沉淀物，用水和乙醇反复洗涤沉淀物三次后，得到UCNPs。制得的上转换纳米颗粒(UCNPs)透射电镜图如图2所示。
(d)将300mg聚乙烯亚胺(PEI)溶解在5mL超纯水中，然后添加包含10mg UCNP的环己烷溶液，并剧烈搅拌24h。反应后，将UCNPs-PEI用超纯水和乙醇洗涤几次，最后通过冷冻干燥获得产物。
(e)通过超声处理15分钟将2mg UCNPs-PEI分散在1mL PBS(10mM pH 7.4)中，然后将0.5mL 25％戊二醛添加到该混合物中。将混合物在室温缓慢振荡2小时，离心并用PBS洗涤3次。
(f)将获得的UCNPs分散在1mL 10mM PBS中。将100μL 1.0mg mL-1链霉亲和素(SA)添加至该混合物中，并在室温下进行缓慢振荡反应12小时。离心并洗涤几次后，收集SA修饰的UCNPs，重悬在10mM Tris-HCl(pH7.3)中备用。
(g)将生物素修饰的T-2毒素适配体(10μM，20μL)添加到步骤(f)得到的重悬混合物中。在37℃缓慢振荡过夜后，将混合物离心、洗涤并重悬在10mM Tris-HCl(pH7.3)中，得到含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液，备用。
2)MIL-101(Cr)的合成与活化：配制14.4mL水溶液，其中含有Cr(NO3)3·9H2O(1200mg，3mmol)，40％HF(120μL)和对苯二甲酸(H2BDC)(492mg)，将混合溶液加入至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并在220℃下反应8小时。在反应结束时，自然冷却后得到绿色产物和结晶的H2BDC副产物。通过用热乙醇与DMSO洗涤离心三次以上来纯化产物，并且将纯化的浅绿色产物在真空下在80℃下干燥备用。所述MIL-101(Cr)的粒径为1-1.5μm。使用之前150℃真空干燥8h以实现活化，之后悬浮于10mM Tris-HCl(pH 7.3)中，浓度为2mg mL-1备用(稀释后使用)。制得的金属有机框架(MIL-101(Cr))的透射电镜图如图3所示。
3)T-2毒素和适配体结合：在含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液中(100μL，0.5mg/mL)，加入一系列浓度梯度的T-2毒素标准品50μL，37℃孵育0.5h。将等体积的MOFs悬浮液加入离心管中并充分混合，然后缓慢振荡并在37℃下震荡反应20min。T-2毒素存在与否时UCNPs-MIL-101(Cr)复合物的透射电镜图如图4所示。
4)信号检测：用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度20nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长为482nm。
根据上述方法测定已知浓度的一系列浓度梯度的T-2毒素标准品，并制作标准曲线，如图5所示。
实施例2
本实施例用于说明本发明的一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光适配体传感器检测玉米粉中的T-2毒素的方法，采用实施例1制得的上转换纳米颗粒探针和金属有机框架MIL-101(Cr)。
具体包括以下步骤：
1)以三种不同浓度向水中添加T-2毒素：1ng/mL，5ng/mL和20ng/mL。将1g玉米粉与10mL含有各种浓度T-2毒素的提取溶剂(甲醇：水＝6：4(v/v))混合。
2)将样品涡旋震荡5分钟，然后以13000rpm离心10分钟，收集上清。
3)在含有上转换纳米颗粒探针的缓冲液中(100μL，0.5mg/mL)，加入三种玉米提取的上清液各50μL，37℃孵育0.5h。
4)将等体积的MIL-101(Cr)悬浮液加入离心管中并充分混合，然后缓慢振荡并在37℃下震荡反应20min。
5)然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度20nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长为482nm。
6)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，回收率的范围为97.52％-109.53％，RSD范围为1.7％-2.4％。结果表明该检测方法可以应用到实际玉米粉检测，并且前处理简单。
实施例3
本实施例用于说明本发明一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光适配体传感器检测啤酒中的T-2毒素的方法，采用实施例1制得的上转换纳米颗粒探针和金属有机框架MIL-101(Cr)。
1)啤酒在使用前于4℃冷藏30分钟或通过超声波脱气，将不同浓度的T-2毒素添加到啤酒中，然后将10μL混合物添加到990μL 10mM Tris-HCl中，使T-2毒素终浓度分别为1ng/mL，5ng/mL和20ng/mL。得到三种浓度的待测样品。
2)在含有上转换颗粒探针的缓冲液中(100μL，0.5mg/mL)，加入三种啤酒样品溶液各50μL，37℃孵育0.5h。
3)将等体积的MOFs悬浮液加入离心管中并充分混合，然后缓慢振荡并在37℃下震荡反应20min。
4)然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度20nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长为482nm。
5)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，回收率的范围为92.72％-100.02％，RSD范围为2.4％-2.7％。结果表明该检测方法可以应用到实际啤酒样品检测，并且前处理简单。
实施例4
本实施例用于说明本发明的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测T-2毒素的特异性。
特异性实验检测步骤：
1)吸取100μL UCNPs-aptamer(0.5mg mL-1)加入离心管，加入2、10ng mL-1的黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏马毒素B1(FB1)、玉米赤烯酮(ZEN)、T-2毒素50μL，于37℃下振荡孵育30min；
2)将等体积的MIL-101(Cr)悬浮液加入离心管中并充分涡旋混合，之后在37℃继续缓慢振荡反应20min；
3)最后将样品加入微量石英比色皿中，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度20nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长为482nm。
结果分析：将目标物和类似物的浓度设置为2ng mL-1和10ng mL-1，结果如图6所示。可以看出，只有添加T-2毒素，荧光强度才能大大恢复，即在这种情况下荧光强度最高。而添加其他毒素后，仅发生了少量的荧光恢复。这是因为只有T-2毒素可以特异地与适配体结合，从而导致修饰有T-2毒素适配体的上转换纳米颗粒探针远离MIL-101(Cr)，最终导致上转换荧光的恢复，这是由于其他毒素不能特异地与修饰有T-2毒素适配体的上转换纳米颗粒探针结合，所以不可能引发荧光强度发生明显变化。通过特异性实验，证明了毒素类似物对上转换荧光传感器几乎没有影响，该荧光传感器具有令人满意的特异性。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法和试剂盒
<130> BJI2001647WY
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagctcagaa gcttgatcct gtatatcaag catcgcgtgt ttacacatgc gagaggtgaa 60
gactcgaagt cgtgcatctg 80

Claims (9)

1.一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1.获得修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针，包括：
(i)将聚乙烯亚胺PEI溶解在水中，然后加入包含上转换纳米颗粒UCNPs的溶液，并剧烈搅拌，得到UCNPs-PEI；所述上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb,Tm或NaYF4:Yb,Tm@NaYF4；
(ii)通过超声处理将UCNPs-PEI分散在PBS中，然后添加戊二醛，将所得混合物在室温缓慢振荡，离心并洗涤；
(iii)将步骤(ii)获得的UCNPs分散在缓冲溶液中；然后添加链霉亲和素，并在室温下进行缓慢振荡反应，反应结束经离心并洗涤后，收集链霉亲和素修饰的UCNPs，重悬在缓冲溶液中；
(iv)将生物素修饰的小分子真菌毒素适配体添加到步骤(iii)得到的重悬混合物中，缓慢振荡过夜后，将混合物离心、洗涤并重悬在缓冲溶液中，得到含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液；
S2.MIL-101(Cr)的合成与活化：配制含有Cr(NO3)3·9H2O、HF和对苯二甲酸的水溶液，加入至高压反应釜中，在200-240℃下反应，反应后经纯化得到浅绿色产物；使用前经高温真空干燥以实现活化，之后悬浮于缓冲液中，所述MIL-101(Cr)的粒径为1-1.5μm；
S3.小分子真菌毒素和适配体结合：在步骤S1制得的含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液中加入待测样品，孵育后加入步骤S2制得的MIL-101(Cr)悬浮液并充分混合，然后震荡反应；
S4.信号检测：采用荧光分光光度计检测步骤S3反应所得产物的荧光信号；
所述小分子真菌毒素为T-2毒素，T-2毒素适配体的序列为5’-CAG CTC AGA AGC TTGATC CTG TAT ATC AAG CAT CGC GTG TTT ACA CAT GCG AGA GGT GAA GA CTC GAA GTCGTG CAT CTG-biotin-3’(SEQ ID NO：1)。
2.根据权利要求1所述的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其中，所述上转换纳米颗粒通过以下制备方法制得：
(a)将YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O和TmCl3·6H2O溶解在水中，然后加入到装有OA和1-ODE的三颈烧瓶中；
(b)将溶液在室温下搅拌8-12分钟，并在140-160℃下加热1-2小时以除去水，形成镧系油酸盐复合物，然后冷却至45-55℃；
(c)将溶解在CH3OH中的NaOH和NH4F加入上述混合物中，并在45-55℃下搅拌20-40分钟；将体系在N2气氛中加热至95-100℃以除去CH3OH，然后在300-350℃保持1-2小时；在反应结束时，将溶液冷却至室温，加入无水乙醇，通过离心获得沉淀物，用水和乙醇反复洗涤沉淀物后，得到所述上转换纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其中，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照S1-S4的方法，检测一系列已知浓度的小分子真菌毒素的标准溶液，测得多组荧光值，分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图，得到小分子真菌毒素的标准曲线。
4.根据权利要求3所述的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其中，步骤S4还包括：基于标准曲线，计算待检测样品中小分子真菌毒素的含量。
5.根据权利要求1所述的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其中，步骤S2包括：
将含有2-4mmol Cr(NO3)3·9H2O、35-45％HF和30-40mg/mL对苯二甲酸的水溶液加入至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并在210-230℃下反应6-10h；反应结束时，自然冷却后得到绿色产物和结晶的H2BDC副产物；通过用热乙醇与DMSO洗涤离心三次以上来纯化产物，并将纯化的浅绿色产物在真空下、在70-90℃下干燥；使用前在140-160℃真空干燥6-10h以实现活化，之后悬浮于8-12mM、pH 7-7.5的Tris-HCl中。
6.根据权利要求1所述的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其中，步骤S3包括：
在0.4-0.6mg/mL的含有修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针的缓冲液中加入待测样品，37℃孵育0.2-1h后，加入MIL-101(Cr)悬浮液并充分混合，然后缓慢振荡并在37℃下震荡反应10-30min，其中，上转换纳米颗粒与MIL-101(Cr)的质量浓度比为1：1。
7.根据权利要求1所述的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其中，步骤S4包括：用F97pro荧光分光光度计，在室温下检测荧光信号，激发波长为980nm，发射波长为482nm。
8.根据权利要求1所述的基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素的方法，其中，所述待测样品来自玉米粉、啤酒、豆粉、面粉。
9.一种基于金属有机框架与上转换纳米颗粒的荧光检测小分子真菌毒素试剂盒，包括以下组分：
(1)修饰有小分子真菌毒素适配体的上转换纳米颗粒探针，根据权利要求1步骤S1中所述的方法制得；
(2)MIL-101(Cr)，根据权利要求1步骤S2中所述的方法制得。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322259A (zh) * 2021-05-28 2021-08-31 江南大学 一种特异性识别t-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用
US11828761B2 (en) 2021-06-07 2023-11-28 Jiangnan University Method for detecting aflatoxin B1 based on fluorescent copper nanoparticles
CN113281320B (zh) * 2021-06-07 2022-04-29 江南大学 一种基于荧光铜纳米粒子检测黄曲霉毒素b1的方法
CN113624730A (zh) * 2021-08-26 2021-11-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 贵金属掺杂的金属有机框架复合材料在检测河豚毒素中的应用、河豚毒素的检测方法
CN114002355B (zh) * 2021-11-03 2023-12-05 上海市农业科学院 一种用于农产品中九种真菌毒素同时富集净化的固相萃取柱
CN114324279B (zh) * 2021-12-29 2023-05-30 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 伏马毒素b1的检测方法及生物传感器、试剂盒的制备方法及其应用
CN114487061A (zh) * 2022-01-05 2022-05-13 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种基于金属有机框架杂化纳米片的电化学生物传感器及其用于检测汗液中乳酸含量的方法
CN114577749B (zh) * 2022-01-29 2022-10-14 大连海事大学 一种船舶压载水微藻含量的原位检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103901000A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 江南大学 一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素b1的方法
WO2016061256A1 (en) * 2014-10-14 2016-04-21 The University Of Chicago Nanoparticles for photodynamic therapy, x-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof
CN107764784A (zh) * 2017-09-01 2018-03-06 杨蕾 一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素b1的荧光方法
WO2020141498A1 (en) * 2020-03-04 2020-07-09 Gill Pooria Nanomolecular detection of aflatoxin b 1

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103901000A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 江南大学 一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素b1的方法
WO2016061256A1 (en) * 2014-10-14 2016-04-21 The University Of Chicago Nanoparticles for photodynamic therapy, x-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof
CN107764784A (zh) * 2017-09-01 2018-03-06 杨蕾 一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素b1的荧光方法
WO2020141498A1 (en) * 2020-03-04 2020-07-09 Gill Pooria Nanomolecular detection of aflatoxin b 1

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Magnetic nanobead-based immunoassay for the simultaneous detection of aflatoxin B 1 and ochratoxin A using upconversion nanoparticles as multicolor labels;Shijia Wu.et al;《Biosensors and Bioelectronics》;20110825;全文 *

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