CN113281320B - 一种基于荧光铜纳米粒子检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光铜纳米粒子检测黄曲霉毒素B1的方法,属于分析化学、材料学、纳米生物传感技术领域。本发明以Y型DNA为模板,以抗坏血酸为还原剂,以β‑CD为荧光稳定增强剂制备了β‑CD@DNA‑Cu NMs;之后以β‑CD@DNA‑Cu NMs构建了比率荧光探针;最后利用荧光探针实现了高灵敏、高选择性、高准确性的AFB1检测。本发明的方法在线性范围为0.03‑10ppb和10‑18ppb时,I433nm/I650nm的比值和AFB1的浓度分别呈现良好的线性关系,检出限为0.012ppb(S/N=3);金属离子可换成Yb3+、Y3+、Er3+、Pt2+同样适用于提高大米中AFB1的检测限。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于荧光铜纳米粒子检测黄曲霉毒素B1的方法,属于分析化学、材料学、纳米生物传感技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是谷物中最常见的污染物之一,是一类广泛分布于自然界且具有极强致畸性、致癌性、生理代谢毒性的真菌毒素。其中,黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大,致癌性最强,被国际癌症研究机构(IARC)归为I类致癌物。长期食用含有低水平黄曲霉毒素的食物,会使肝脏蓄积毒性,引起肝损伤和肝癌等,从而严重威胁到人类的健康甚至生命。传统的检测方法主要是仪器分析方法如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱联用法(LC-MS)等。这些方法虽然灵敏度高、测定结果准确可靠,但由于其需要使用大量的有机溶剂,设备昂贵,时间成本高,且需要专业的操作人员,因而在现场快速筛查中的应用受到很大的限制。目前,AFB1的快速检测主要基于免疫分析,但抗体的制备周期长,成本高。
近年来,荧光检测方法由于其灵敏性、特异性、经济性、简单易操作等优点备受关注。AFB1具有荧光性,可根据这一特性开发荧光检测方法,但AFB1在溶剂中容易发生荧光淬灭现象,导致检测灵敏度降低。张敏等人(文献1:张敏,郭婷,刘馨,肖洁,张宇昊,马良.β-环糊精及其衍生物对黄曲霉毒素B1荧光增强机理研究[J].食品科学,2012,33(15):28-33.文献2:张敏,张宇昊,马良.β-环糊精及其衍生物、金属离子协同增敏黄曲霉毒素B1的荧光光谱分析及应用研究[J].分析化学,2011,39(12):1907-1911)采用β-环糊精(β-CD)增强了AFB1的荧光强度,从而使其检测灵敏度增高,并在此基础上,构建了β-环糊精及其衍生物(β-CDs)-金属离子(M)体系对黄曲霉毒素B1的荧光进一步的增敏;其原理为:AFB1能够进入β-CD的空腔内形成包合物,增大了其溶解性,避免了溶剂对这些物质的荧光淬灭作用,使其荧光性和稳定性均得到了增强;某些金属离子,尤其是Hg2+,能够与AFB1形成金属螯合物,可大幅提高AFB1荧光强度;该方法尽管展现出较灵敏的结果,但需要外加有毒重金属元素,且采用的单信号模式容易受到探针浓度、光源或检测器的漂移和复杂基质中环境因子的干扰等。
比率检测模式依靠一个或更多个独立于感测信号的其它信号作为内标,通过两类信号的比率作为信号输出,可以有效克服单信号探针信号的上述不足,从而提高检测结果的准确性。
金属荧光纳米材料(金、银、铜)具有毒性低、斯托克斯位移大和耐光漂白的优点。将β-CD修饰到纳米材料,利用其对客体分子的识别作用,可以实现客体分子在纳米材料表面的富集及灵敏的检测。如文献3(LI Y,WEN Q-L,LIU A-Y,et al.One-pot synthesis ofgreen-emitting gold nanoclusters as a fluorescent probe for determination of4-nitrophenol[J].Microchim Acta,2020,187(2):)应用β-CD修饰的金纳米簇,可以实现4-硝基苯酚的灵敏的荧光检测。
食品安全法规对食品中AFB1的残留限量日趋严格,利用简单的荧光纳米探针设计实现高灵敏、高选择性、高准确性的检测,目前尚无相关研究报道。
发明内容
[技术问题]
目前食品安全法规对食品中AFB1的残留限量日趋严格,如何利用简单的荧光纳米探针设计实现高灵敏、高选择性、高准确性的AFB1检测,仍是具有挑战性的工作。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题,本发明以Y型DNA(Y型互补核酸双链)为模板,以抗坏血酸(AA)为还原剂,以单(6-巯基-6-去氧)β-环糊精(β-CD)为荧光稳定增强剂制备了β-CD@DNA-Cu NMs;之后以β-CD@DNA-Cu NMs构建了比率荧光探针;最后利用荧光探针实现了高灵敏、高选择性、高准确性的AFB1检测。
本发明的第一个目的是提供一种制备荧光铜纳米粒子β-CD@DNA-Cu NMs的方法,包括如下步骤:
(1)DNA-Cu NMs的制备:
将模板链Y型DNA溶液与抗坏血酸溶液混合均匀,然后添加乙酸铜溶液,混合均匀,得到DNA-Cu NMs溶液;
(2)β-CD修饰的DNA-Cu NMs:
将步骤(1)得到的DNA-Cu NMs溶液与β-CD溶液混合均匀,超滤后得到β-CD@DNA-CuNMs。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)所述的模板链Y型互补核酸双链(Y型DNA)的制备采用文献(Meng,H.M.;Zhang,X.;Lv,Y.;Zhao,Z.;Wang,N.N.;Fu,T.;Fan,H.;Liang,H.;Qiu,L.;Zhu,G.;Tan,W.DNA Dendrimer:An Efficient Nanocarrier of FunctionalNucleic Acids for Intracellular Molecular Sensing.ACS Nano 2014,8,6171-6181.)的制备方法,具体是:
将三条等量的寡核苷酸链(Y0a、Y0b、Y0c)在MOPS缓冲液中混合得到混合溶液;之后将混合溶液加热至90℃,变性5min后慢慢冷却至室温,得到Y型DNA;Y型DNA溶液放置于-18℃冰箱中保存;其中MOPS缓冲液的浓度为5-20mM,NaAc浓度为75-300mM,MgCl2浓度为1-10mM,pH为6.5-8.5;Y0a的DNA序列如SEQ ID NO.1所示:CCTGTCTGCCTAATGTGCGTCGTAAG;Y0b的DNA序列如SEQ ID NO.2所示:CTTACGACGCACAAGGAGATCATGAG;Y0c的DNA序列如SEQ IDNO.3所示:CTCATGATCTCCTTTAGGCAGACAGG。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)所述的模板链Y型DNA溶液采用MOPS缓冲液进行稀释,浓度为2μM;抗坏血酸溶液和乙酸铜溶液采用超纯水(18.2MΩ.cm)配制和稀释,抗坏血酸溶液的浓度为1.25mM,乙酸铜溶液的浓度为0.05-2mM;模板链Y型DNA溶液、抗坏血酸溶液、乙酸铜溶液的体积比为5:5:2。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)所述DNA-Cu NMs合成1-20min后才能与β-CD混合。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)所述β-CD溶液采用超纯水(18.2MΩ.cm)配制和稀释,浓度为0.5-5mM。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)所述的DNA-Cu NMs溶液与β-CD溶液的体积比为900:133。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)所述的超滤是10kd超滤管超滤。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)得到的β-CD@DNA-Cu NMs置于4℃下避光保存。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的荧光铜纳米粒子β-CD@DNA-Cu NMs。
本发明的第三个目的是提供一种制备β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器的方法,包括如下步骤:
将β-CD@DNA-Cu NMs溶液加入AFB1溶液中,以300-500rpm振荡0.5-1.5min,混合均匀,得到所述的β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器。
在本发明的一种实施方式中,所述的β-CD@DNA-Cu NMs溶液和AFB1溶液的体积比为1:8-10,进一步优选为1:9;AFB1溶液是将AFB1溶于1-40%的甲醇/水溶液(V/V%)中得到。
在本发明的一种实施方式中,所述的β-CD@DNA-Cu NMs浓度为200μM-2mM,AFB1溶液浓度为0.05-18ppb。
本发明的第四个目的是本发明所述的方法制备得到的β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器。
本发明的第五个目的是提供一种制备以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器的方法,包括以下步骤:
将AFB1溶液与金属离子M溶液混合均匀,得到M-AFB1混合溶液;之后将β-CD@DNA-Cu NMs溶液加入M-AFB1混合溶液中,以300-500rpm振荡0.5-1.5min,混合均匀,得到所述的β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器。
在本发明的一种实施方式中,所述AFB1溶液的浓度为0.05-18ppb,是以体积分数为40%的甲醇溶液作为溶剂;进一步浓度优选为10ppb。
在本发明的一种实施方式中,所述的金属离子M溶液的浓度为1-50mM,是以体积分数为40%的甲醇溶液作为溶剂。
在本发明的一种实施方式中,所述的金属离子M包括:铂离子(Pt2+)、镱离子(Yb3 +)、铒离子(Er3+)、钇离子(Y3+)、钙离子(Ca2+)、汞离子(Hg2+)。
在本发明的一种实施方式中,所述的金属离子M对应的金属化合物包括:四氯铂酸(K2PtCl4)、三氯化镱六水合物(YbCl3·6H2O)、氯化铒(ErCl3)、氯化钇六水合物(YCl3·6H2O)、无水氯化钙(CaCl2)、Hg2+标准溶液。
在本发明的一种实施方式中,所述的AFB1溶液和金属离子M溶液的体积比为7-9:1,进一步优选为8:1。
在本发明的一种实施方式中,所述的β-CD@DNA-Cu NMs溶液是将β-CD@DNA-Cu NMs分散在体积分数为40%的甲醇溶液中。
在本发明的一种实施方式中,所述的β-CD@DNA-Cu NMs溶液和M-AFB1混合溶液的体积比为1:9。
在本发明的一种实施方式中,所述的振荡是在混匀器中以400rpm振荡1min。
本发明的第六个目的是本发明所述的方法制备得到的以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器。
本发明的第七个目的是一种基于以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器检测AFB1的方法,包括如下步骤:
(1)样品的预处理:
在待测样品中加入提取溶剂进行提取,离心、过滤,得到待分析的样品;
(2)测试:
将待分析的样品进行荧光检测,得到433nm和650nm处的荧光值I433 nm和I650 nm,之后代入AFB1的标准曲线,得到待测样品中AFB1的浓度。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)所述的提取溶剂为体积分数为40%的甲醇/水溶液、乙醇/水溶液或乙腈/水溶液中的一种。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)所述待测样品和提取溶剂的比例以g/mL计为1:3-5,进一步优选为1:4。
在本发明的一种实施方式中,步骤(1)所述提取是以250rpm的转速在摇床中振荡提取30min,然后用超声处理10min;所述离心是以10000r/min的转速离心5min;过滤是将上清液通过0.22μm滤膜过滤。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)中进行检测之前需要将待分析的样品根据样品的种类不同适当稀释2-10倍,稀释是为了减少其它基质对其检测AFB1的干扰。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)中荧光检测条件为:激发宽带为10nm,狭缝宽度为10nm,激发波长为365nm,检测433nm(AFB1)和650nm(β-CD@DNA-Cu NMs)两处发射峰的荧光值。
在本发明的一种实施方式中,步骤(2)中所述的AFB1标准曲线是I433 nm/I650 nm=0.0627C-0.0068,R2=0.9963,线性范围为0.03-10ppb;同时,I433 nm/I650 nm=0.4825C-4.7038,R2=0.9736,线性范围为10-18ppb,检出限为0.012ppb(S/N=3);其中I433 nm为AFB1的最大荧光值,I650nm为β-CD@DNA-Cu NMs的最大荧光值,I433 nm/I650 nm的比值代表检测结果;C为AFB1的浓度。
本发明的第八个目的是本发明所述的荧光铜纳米粒子β-CD@DNA-Cu NMs、β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器、以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-CuNMs-M-AFB1比率荧光传感器在检测食品毒素中的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述的毒素包括黄曲霉毒素B1。
本发明的第九个目的是本发明所述的基于以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器检测AFB1的方法在检测食品毒素中的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述的毒素包括黄曲霉毒素B1。
在本发明的一种实施方式中,所述的应用是检测谷物中的黄曲霉毒素B1。
在本发明的一种实施方式中,所述的谷物包括大米、小麦、玉米、大麦、小米。
[有益效果]
(1)本文发明制备了高荧光和高稳定性的荧光铜纳米粒子(β-CD@DNA-Cu NMs),建立了基于β-CD@DNA-Cu NMs的比率荧光传感器检测AFB1的方法。本发明的检测方法实现了AFB1的高灵敏(检测限为0.012ppb)、快速(1min)、无毒或低毒性、高特异性的检测。
(2)本发明基于β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1检测AFB1的方法实现了AFB1的高灵敏荧光检测。β-CD@DNA-Cu NMs-Ca2+-AFB1比率荧光检测方法相比本发明中构建的β-CD@DNA-CuNMs-AFB1比率荧光检测方法对AFB1的检测限提高了22倍;且该方法在0.05-10ppb和10-18ppb范围内,I433nm/I650nm的比值和AFB1的浓度分别呈现良好的线性关系,线性范围为0.05-18ppb,检出限为0.012ppb。
(3)本发明构建的检测AFB1的方法具有高选择性,其他霉毒素不会对AFB1测定产生干扰。一般来说,所述谷物样品中其它常见毒素(AFB2、AFG1、AFG2、T-2、AFM1、ZEN、OTA)的添加浓度为500ppb时,所有的荧光增强率都小于4。相比之下,在AFB1添加浓度为10ppb时,荧光增强率为22倍。
(4)本发明所述的检测AFB1的方法可实现无毒或低毒性检测。低浓度的Pt2+、Yb3+、Er3+、Y3+离子作为荧光增强剂可增强β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1比率荧光传感器的灵敏度,可增强9.67-22.13倍,相比Hg2+,可实现低毒性检测。高浓度的Ca2+离子也可提高AFB1的检测结果,可增强22倍,且Ca2+无毒,来源廉价。
(5)本发明的方法具有高灵敏、高选择性、检测快速、无毒或低毒性等优势。
(6)本发明的检测原理:
首先,本发明合成了以Y型DNA(Y型互补核酸双链)为模板,以抗坏血酸(AA)为还原剂,以单(6-巯基-6-去氧)β-环糊精(β-CD)为荧光稳定增强剂制备了β-CD@DNA-Cu NMs。其次,本发明以β-CD@DNA-Cu NMs构建了比率荧光探针,β-CD不仅可以同时增强和稳定β-CD@DNA-Cu NMs的荧光,而且β-CD与AFB1之间存在主-客体相互作用,可形成β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1复合物;上述过程可增强AFB1的荧光。同时,由于AFB1的紫外吸收光谱与β-CD@DNA-CuNMs的荧光激发光谱存在重叠,从而产生内滤效应(IFE)导致β-CD@DNA-Cu NMs的荧光淬灭。最后,本发明发现铂、铒、钙等金属离子可以在上述体系中进一步增强AFB1的荧光,从而提高比率荧光检测AFB1的灵敏度。
附图说明
图1是β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1比率荧光传感器检测AFB1的原理图。
图2是不同浓度的β-CD修饰的β-CD@DNA-Cu NMs的TEM图;其中(a)是0.5mM,(b)是2mM,(c)是5mM。
图3是β-CD@DNA-Cu NMs的荧光激发光谱(Ex)和发射光谱(Em)。
图4是添加不同浓度的AFB1的β-CD@DNA-Cu NMs-Ca2+-AFB1比率荧光曲线(A)和标准曲线(B)。
图5是β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1对谷物样品(大米)中其他毒素检测的选择性图;其中A为β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1对谷物样品(大米)中其他毒素检测的荧光光谱图;B为β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1对谷物样品(大米)中其他毒素检测在I433 nm/I650 nm处的比值。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解实施例是为了更好地解释本发明,不用于限制本发明。
实施例1
一种制备荧光铜纳米粒子β-CD@DNA-Cu NMs的方法,包括如下步骤:
(1)模板链Y型互补核酸双链(Y型DNA)的制备:
将三条等量的寡核苷酸链(Y0a,Y0b,Y0c)(表1)在MOPS缓冲液(10mM,pH 7.5,150mMNaAc,1mM MgCl2)中混合得到混合溶液;然后,将混合溶液加热至90℃,变性5min后慢慢冷却至室温,得到Y型DNA;Y型DNA溶液放置在-18℃冰箱里保存。
表1寡核苷酸链的DNA序列
序号 | 序列(从5’到3’)) | |
Y<sub>0a</sub> | CCTGTCTGCCTAATGTGCGTCGTAAG | SEQ ID NO.1 |
Y<sub>0b</sub> | CTTACGACGCACAAGGAGATCATGAG | SEQ ID NO.2 |
Y<sub>0c</sub> | CTCATGATCTCCTTTAGGCAGACAGG | SEQ ID NO.3 |
(2)DNA-Cu NMs的制备:
将Y型DNA溶液(500μL,2μM)与抗坏血酸溶液(500μL,1.25mM)混合,然后添加乙酸铜溶液(200μL,2mM),充分混合20min,溶液呈黄色,得到DNA-Cu NMs溶液;
(3)β-CD修饰的DNA-Cu NMs:
取900μL的DNA-Cu NMs溶液与133μL的β-CD(2mM)充分混合1min,颜色由黄色变为无色;之后用10kd超滤管超滤去除多余试剂后获得β-CD@DNA-Cu NMs,置于4℃下避光保存;β-CD@DNA-Cu NMs合成示意图如图1。
其中,Y型DNA溶液用MOPS缓冲液(10mM,pH 7.5,150mM NaAc,1mM MgCl2)配制与稀释;抗坏血酸溶液、乙酸铜溶液和β-CD溶液用超纯水(18.2MΩ.cm)配制与稀释。
实施例2荧光铜纳米粒子制备工艺的优化
调整实施例1中的β-CD溶液的浓度为0.5、2、5mM,其他和实施例1保持一致,得到β-CD@DNA-Cu NMs。
将得到的β-CD@DNA-Cu NMs进行荧光测试,荧光测试的条件为:激发宽带为10nm,狭缝宽度为10nm,激发波长为365nm;测试结果如下:
图2是不同浓度的β-CD修饰的β-CD@DNA-Cu NMs的TEM图;其中(a)是0.5mM,(b)是2mM,(c)是5mM。从图2可以看出:随着β-CD的浓度从0.5增加到2和5mM,β-CD@DNA-Cu NMs的平均大小分别从10nm增加到12nm和14nm。β-CD的浓度在0-5mM的范围内,随着其浓度的增加,荧光越强,荧光增强与β-CD对铜纳米的稳定有关。从表征上来看随着β-CD浓度的增加,粒径变大,β-CD修饰铜纳米的量变多导致粒径变大。
β-CD@DNA-Cu NMs的荧光激发光谱(Ex)和发射光谱(Em)如图3,2mMβ-CD修饰的β-CD@DNA-Cu NMs呈球形颗粒,粒径均匀,分散性好,平均粒径为12nm,选为最优;β-CD@DNA-CuNMs的荧光激发波长范围为358-410nm。当激发波长在358nm至410nm之间时,β-CD@DNA-CuNMs的发射峰不受影响。因此,为了获得最大的AFB1荧光信号,选择365nm作为β-CD@DNA-CuNMs-AFB1或β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比例体系中的激发波长。
实施例3
一种制备β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器的方法,包括如下步骤:
将实施例1得到的β-CD@DNA-Cu NMs的溶液(100μL,200μM)加入AFB1溶液(900μL,10ppb)中,在400rpm振荡1min,混合均匀,得到β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器。
将得到的β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1比率荧光传感器进行荧光测试,测试条件为:激发宽带为10nm,狭缝宽度为10nm,激发波长为365nm,检测433nm(AFB1)和650nm(β-CD@DNA-Cu NMs)两处发射峰的荧光值。
实施例4
一种制备以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器的方法,包括以下步骤:
(1)AFB1标准溶液用体积分数为40%甲醇/水溶液稀释至10ppb;采用体积分数为40%甲醇/水溶液将实施例1制备的β-CD@DNA-Cu NMs稀释至200μM;金属离子M溶液用体积分数为40%的甲醇/水溶液进行稀释;
(2)将800μL的AFB1溶液与100μL的金属离子M溶液(浓度见表2)进行混合,得到M-AFB1混合溶液;然后,取100μLβ-CD@DNA-Cu NMs溶液加入900μL M-AFB1混合液中,在400rpm振荡1min,得到以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器;
其中,所述的金属离子M包括:铂离子(Pt2+)、钯离子(Pd2+)、镱离子(Yb3+)、铒离子(Er3+)、钇离子(Y3+)、镁离子(Mg2+)、铥离子(Tm3+)、钙离子(Ca2+)、汞离子(Hg2+)、钾离子(K+)、钠离子(Na+)、铝离子(Al3+)、铜离子(Cu2+);所使用的金属化合物分别为:四氯铂酸(K2PtCl4)、无水氯化钯(PdCl2)、三氯化镱六水合物(YbCl3·6H2O)、氯化铒(ErCl3)、氯化钇六水合物(YCl3·6H2O)、六水氯化镁(MgCl2·6H2O)、氯化铥六水合物(TmCl3·6H2O)、无水氯化钙(CaCl2)、Hg2+标准溶液、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化铝(AlCl3)、氯化铜(CuCl2)。
将得到的以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器进行荧光光谱检测:测试条件为:采用荧光光度计进行检测,激发宽带为10nm,狭缝宽度为10nm,激发波长为365nm,检测433nm(AFB1)和650nm(β-CD@DNA-Cu NMs)两处发射峰的荧光值。
测试结果如表2:
表2不同金属离子对β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1体系荧光的影响。
金属离子M | 金属离子M的浓度(mmol/L) | F<sub>C</sub>-F<sub>M</sub> | (F<sub>C</sub>-F<sub>M</sub>)/F<sub>AFB1</sub> |
Pt<sup>2+</sup> | 1mM | 554.5 | 22.13 |
Pd<sup>2+</sup> | 1mM | 30 | 1.03 |
Yb<sup>3+</sup> | 1mM | 485.5 | 18.67 |
Er<sup>3+</sup> | 1mM | 479.8 | 18.51 |
Y<sup>3+</sup> | 1mM | 251.3 | 9.67 |
Hg<sup>2+</sup> | 1mM | 425.7 | 16.37 |
Ca<sup>2+</sup> | 50mM | 551.24 | 22 |
Tm<sup>3+</sup> | 5mM | 18.6 | 0.72 |
Mg<sup>2+</sup> | 5mM | 28.1 | 1.08 |
K<sup>+</sup> | 5mM | 28.5 | 1.09 |
Cu<sup>2+</sup> | 5mM | 26.1 | 1 |
Al<sup>3+</sup> | 5mM | 26.3 | 1.01 |
Na<sup>+</sup> | 5mM | 26.9 | 1 |
注:FC是β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1的在433nm处的荧光强度;M为不同的金属离子;FM是433nm处不同金属离子的背景荧光;FAFB1是10ppb AFB1的荧光值;(FC-FM)/FAFB1是β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1体系中433nm处不同金属离子引起的AFB1增强倍数。
从表2可以看出:表明1mM的Pt2+、Yb3+、Er3+、Y3+可以提高AFB1的(FC-FM)/FAFB1值至9.67-22.13倍。在相同浓度下,相比传统的Hg2+,Pt2+、Yb3+、Er3+、Y3+对AFB1的检测效果也能达到相似的增敏效果,且毒性低得多。50mM的Ca2+可以提高AFB1的(FC-FM)/FAFB1值至22倍,且Ca2+无毒性,能够更好地应用于实际检测中。
实施例5
一种基于以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器检测AFB1的方法,包括如下步骤:
(1)标准曲线的构建
AFB1标准溶液用体积分数为40%的甲醇/水溶液分别稀释至0、0.05、2、4、6、8、10、12、14、16、18ppb;用体积分数为40%的甲醇/水溶液将实施例1制备的β-CD@DNA-Cu NMs稀释至200μM;Ca2+溶液用体积分数为40%的甲醇/水溶液稀释至50mM;
将800μL不同浓度的AFB1溶液与100μL的CaCl2溶液(50mM)混合,得到Ca2+-AFB1混合溶液;然后,取100μLβ-CD@DNA-Cu NMs溶液加入900μL Ca2+-AFB1混合液中,以400rpm振荡1min;
采用荧光光度计进行检测,激发宽带为10nm,狭缝宽度为10nm,激发波长为365nm,检测433nm(AFB1)和650nm(β-CD@DNA-Cu NMs)两处发射峰的荧光值。
将得到的I433nm/I650nm和AFB1的浓度构建标准曲线,具体如下:
AFB1标准曲线如图4,标准曲线为I433nm/I650nm=0.0627C-0.0068,R2=0.9963,线性范围为0.03-10ppb;同时,I433nm/I650nm=0.4825C-4.7038,R2=0.9736,线性范围为10-18ppb;检出限为0.012ppb(S/N=3);其中,I433nm为AFB1的最大荧光值,I650nm为β-CD@DNA-Cu NMs的最大荧光值。I433nm/I650nm的比值代表检测结果;C为AFB1的浓度。
(2)样品的预处理:
向大米样品中添加AFB1标准品,AFB1的浓度分别为0.5ppb、10ppb、15ppb,烘干后将样品在室温下避光放置2d;之后将大米样品精细研磨至粉末作为待测样品;
准确称取5.0g待测样品于50.0mL离心管中,加入20mL体积百分比为40%的甲醇/水溶液,以250rpm的转速在摇床中振荡提取30min,然后用超声处理10min进行提取,提取结束后以10000r/min的转速离心5min,得到上清液;之后上清液通过0.22μm滤膜过滤,得到待分析的样品;并保存在4℃下;
(3)测试:
在分析之前将待分析的样品预先稀释10倍;之后进行荧光测试,激发宽带为10nm,狭缝宽度为10nm,激发波长为365nm,检测433nm(AFB1)和650nm(β-CD@DNA-Cu NMs)两处发射峰的荧光值。
实施例6实施例5方法的准确性和特异性
1、方法的准确性
向大米样品中加入标准AFB1溶液的浓度为分别为0.05、10和15ppb,然后采用实施例4中以金属离子Ca2+为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器进行测试,每个样品检测3次;具体操作参考实施例5;
测试结果见表3,从表3可以看出:AFB1平均浓度分别为0.049、9.62、15.207ppb,回收率在96.2%~101%之间,相对标准偏差(RSD)值均小于3.5%,表明该方法具有较好的准确度和精密度。
表3谷物样品(大米)中AFB1的测定(n=3)
2、方法的特异性:大米样品中常见毒素对检测的影响
采用不同毒素与β-CD@DNA-Cu NMs构建比率荧光探针对AFB1进行检测;具体操作如下:
将800μL不同种类的毒素(500ppb,分别为AFB2、AFG1、AFG2、T-2、AFM1、ZEN、OTA)或800μL不同种类的毒素(500ppb)与黄曲霉毒素B1(10ppb)混合物与100μL的CaCl2溶液(50mM)混合,得到混合溶液;然后取100μLβ-CD@DNA-Cu NMs溶液(200μM)加入900μL混合溶液中,在400rpm振荡1min;最后进行荧光测试,每个样品检测3次。
结果如图5,从图5可以看出:在其它常见毒素(AFB2、AFG1、AFG2、T-2、AFM1、ZEN、OTA)的添加浓度为500ppb时,所有的荧光增强率都小于4。相比之下,在AFB1添加浓度为10ppb时,荧光增强率为22倍。结果表明,这些其他常见毒素不会对AFB1的检测结果产生干扰。
实施例7
实施例5中的CaCl2溶液(50mM)可更换成K2PtCl4(1mM)、YbCl3·6H2O(1mM)、ErCl3(1mM)、YCl3·6H2O(1mM)同样适用于大米中AFB1的检测。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110> 江南大学
<120> 一种基于荧光铜纳米粒子检测黄曲霉毒素B1的方法
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Claims (11)
1.一种制备β-CD@DNA-Cu NMs -AFB1的比率荧光传感器的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将β-CD@DNA-Cu NMs的溶液加入AFB1溶液中,以300-500 rpm振荡0.5-1.5 min,混合均匀,得到所述的β-CD@DNA-Cu NMs -AFB1的比率荧光传感器;
其中,所述的β-CD@DNA-Cu NMs浓度为200 μM-2 mM,AFB1溶液浓度为0.05-18 ppb;
荧光铜纳米粒子β-CD@DNA-Cu NMs的制备方法,包括如下步骤:
(1)DNA-Cu NMs的制备:
将模板链Y型DNA溶液与抗坏血酸溶液混合均匀,然后添加乙酸铜溶液,混合均匀,得到DNA-Cu NMs溶液;
(2)β-CD修饰的DNA-Cu NMs:
将步骤(1)得到的DNA-Cu NMs溶液与β-CD溶液混合均匀,超滤后得到β-CD@DNA-CuNMs。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述β-CD溶液的浓度为0.5-5 mM。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的β-CD@DNA-Cu NMs溶液和AFB1溶液的体积比为1:8-10。
4.权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的β-CD@DNA-Cu NMs -AFB1的比率荧光传感器。
5.一种制备以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将AFB1溶液与金属离子M溶液混合均匀,得到M-AFB1混合溶液;之后将β-CD@DNA-CuNMs的溶液加入M-AFB1混合溶液中,以300-500 rpm振荡0.5-1.5 min,混合均匀,得到所述的以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs -AFB1的比率荧光传感器;
其中,荧光铜纳米粒子β-CD@DNA-Cu NMs的制备方法,包括如下步骤:
(1)DNA-Cu NMs的制备:
将模板链Y型DNA溶液与抗坏血酸溶液混合均匀,然后添加乙酸铜溶液,混合均匀,得到DNA-Cu NMs溶液;
(2)β-CD修饰的DNA-Cu NMs:
将步骤(1)得到的DNA-Cu NMs溶液与β-CD溶液混合均匀,超滤后得到β-CD@DNA-CuNMs;
所述的金属离子M包括铂离子、镱离子、铒离子、钇离子、钙离子、汞离子。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述AFB1溶液的浓度为0.05-18 ppb,所述的金属离子M溶液的浓度为1-50 mM。
7.权利要求5或6所述的方法制备得到的以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器。
8.一种基于权利要求7所述的以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器检测AFB1的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)样品的预处理:
在待测样品中加入提取溶剂进行提取,离心、过滤,得到待分析的样品;
(2)测试:
将待分析的样品进行荧光检测,得到433 nm和650 nm处的荧光值I433 nm和I650 nm,之后代入AFB1的标准曲线,得到待测样品中AFB1的浓度。
9.权利要求4所述的β-CD@DNA-Cu NMs-AFB1的比率荧光传感器在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
10.权利要求7所述的以金属离子M为AFB1的荧光增强剂的β-CD@DNA-Cu NMs-M-AFB1比率荧光传感器在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
11.权利要求8所述的方法在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
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