CN110501494B - 一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法 - Google Patents

一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110501494B
CN110501494B CN201910641973.6A CN201910641973A CN110501494B CN 110501494 B CN110501494 B CN 110501494B CN 201910641973 A CN201910641973 A CN 201910641973A CN 110501494 B CN110501494 B CN 110501494B
Authority
CN
China
Prior art keywords
manganese dioxide
fluorescent material
target microorganism
nanoflower
complex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910641973.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110501494A (zh
Inventor
林建涵
郝丽
薛丽
黄凤春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201910641973.6A priority Critical patent/CN110501494B/zh
Publication of CN110501494A publication Critical patent/CN110501494A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110501494B publication Critical patent/CN110501494B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法，包括：先将二氧化锰纳米花和荧光材料结合得到二氧化锰纳米花‑荧光材料复合体，使荧光材料的荧光猝灭，再将二氧化锰纳米花‑荧光材料复合体与目标微生物结合，得到目标微生物‑二氧化锰纳米花‑荧光材料复合体，然后还原目标微生物‑二氧化锰纳米花‑荧光材料复合体中的二氧化锰，使荧光材料被释放出来，在外界激发条件下重新发射荧光，最后测量荧光强度计算目标微生物浓度。本发明利用二氧化锰纳米花和荧光材料之间能量转移，使荧光材料荧光猝灭，再将二氧化锰还原为锰离子，将荧光材料释放出来可重新发射荧光，同时利用纳米花的高负载特性，进行信号放大，实现微生物的灵敏检测。

Description

一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法。
背景技术
近年来食品安全问题受到国际社会的广泛关注，全球每年发生腹泻等病例高达1.5亿，其中70％与各种致病性微生物污染有关。在我国病原微生物也是造成食品中毒的主要因素，所以快速检测食源性致病菌是预防和控制微生物性食物中毒的关键。
目前，常见的食源性致病菌检测方法包括培养计数法、聚合酶链式反应、酶联免疫吸附测定等。
培养计数法是国家标准方法，准确度和灵敏度都很高，但需要较长的检测时间；聚合酶链式反应是推荐的国家标准方法，检测时间较短，灵敏度和检测通量较高，但需要复杂的核酸提取过程；酶联免疫吸附测定也是推荐的国家标准方法，检测时间较短，自动化水平和检测通量较高，但灵敏度较低。因此，研究新型的食源性致病菌检测方法具有重要意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法，包括：
先将二氧化锰纳米花和荧光材料结合得到二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，使所述荧光材料的荧光猝灭，再将所述二氧化锰纳米花-荧光材料复合体与目标微生物结合，得到目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，然后还原所述目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体中的二氧化锰，使所述荧光材料被释放出来，在外界激发条件下重新发射荧光，最后测量荧光强度计算目标微生物浓度。
上述技术方案中，先利用二氧化锰纳米花和荧光材料之间能量转移，从而使荧光材料的荧光猝灭，之后再将二氧化锰还原为锰离子，荧光材料被释放出来，使其在适当的激发条件下可重新发射荧光，同时利用纳米花的高负载特性，进行信号放大，实现目标微生物的灵敏检测。
本发明所使用的二氧化锰有很广泛紫外吸收峰，是很好的荧光猝灭材料，在4℃冰箱保存半年仍有很好的分散性，且二氧化锰纳米花合成原料易得、合成方法简单、对环境无危害，被谷胱甘肽还原溶解成的锰离子对环境也无害。本发明中的二氧化锰纳米花为分散在溶液中的二氧化锰纳米颗粒。
优选地，在所述二氧化锰纳米花-荧光材料复合体与所述目标微生物结合之前，还包括纯化和富集所述目标微生物的步骤。
上述技术方案中，可采用抗体等生物识别元件特异性纯化和富集目标微生物，减少样本背景中其它分子的干扰影响，便于目标微生物的检测，提高准确度。
在本发明优选实施方式中，所述微生物检测方法包括以下步骤：
S1.利用修饰有所述目标微生物的第一生物识别元件(如抗体)的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的和富集的磁性元件-目标微生物复合体；
S2.将修饰有所述目标微生物的第二生物识别元件(如另一种配对的抗体)的免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体和所述磁性元件-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体；
S3.还原溶解所述磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体上的二氧化锰纳米花，使荧光材料受激发后重新发射荧光；
S4.利用光谱仪检测荧光，并根据荧光强度与目标微生物浓度之间的关系曲线，可计算得到所述目标微生物的浓度。
其中，所述磁性元件优选为磁珠。
所述第一生物识别元件和所述第二生物识别元件与所述目标微生物的结合位点不同。
进一步地，所述步骤S1具体步骤如下：
S11.利用链霉亲和素修饰的磁性元件以及生物素化的第一生物识别元件(如抗体)制备所述免疫磁性元件，并将所述免疫磁性元件溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
S12.将所述免疫磁性元件与含有目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁性元件捕获目标微生物，形成磁性元件-目标微生物复合体；
S13.利用磁场从免疫磁性元件与样本溶液形成的混合溶液中分离并富集S12中所形成的磁性元件-目标微生物复合体。
在S11中，为了提高目标微生物的检测精确度，所述修饰有目标微生物的第一生物识别元件的免疫磁性元件的制备如下：
先用PBS将链霉亲和素修饰的磁性元件表面保护剂洗去，再将生物素修饰在所述目标微生物的第一生物识别元件上，形成生物素化的第一生物识别元件，然后将所述链霉亲和素修饰的磁性元件和所述生物素化第一生物识别元件进行混合孵育，所述磁性元件上的链霉亲和素与所述第一生物识别元件上的生物素偶联，并通过磁分离除去多余的所述第一生物识别元件。
进一步地，所述步骤S2具体步骤如下：
S21.利用表面活性剂辅助法制备所述二氧化锰纳米花；
S22.先对所述二氧化锰纳米花进行氨基化，所述氨基化二氧化锰纳米花与所述荧光材料通过缩合反应得到二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，然后修饰第二生物识别元件，形成所述免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，将所述免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体复溶于超纯水；
S23.将所述免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体与所述磁性元件-目标微生物复合体进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，并利用磁场分离得到。
在本发明一个优选实施方式中，所述S21具体为利用高锰酸钾、盐酸和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)通过表面活性剂辅助法制备二氧化锰纳米花。
在本发明一个优选实施方式中，所述S22具体包括：利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和溶于99％乙醇的二氧化锰纳米花混匀过夜孵育，反应完成生成氨基化的二氧化锰纳米花；
将羧基化荧光材料与氨基化二氧化锰纳米花在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)的存在下搅拌孵育，离心去除多余的荧光材料；接着投入所述目标微生物的第二生物识别元件在EDC存在下进行搅拌孵育，离心去除多余第二生物识别元件，即得所述免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体。
进一步地，所述步骤S3具体步骤如下：将谷胱甘肽溶液或双氧水加入到装有所述磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体的容器中，待谷胱甘肽或双氧水与二氧化锰之间的氧化还原反应结束，利用磁场进行磁分离，得到含有被释放出来的荧光材料的上清液。
进一步地，上述技术方案中，可通过取样测试所述上清液中的荧光强度，当荧光强度不再变化时，表明氧化还原反应结束。
优选地，步骤S3中所述谷胱甘肽浓度为20mM，加入量为100μL。对于浓度低于107CFU/mL的目标微生物，所述100μL浓度为20mM的谷胱甘肽可以完全溶解其所能结合的所有二氧化锰纳米花。实际中，一般要求食品中不可检出如大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌等病原微生物，所以目标微生物浓度通常较低，不会超过104CFU/mL，则故上述用量的谷胱甘肽足矣。
优选地，步骤S4中所述荧光强度与目标微生物浓度间的关系曲线的建立包括：将多组含有已知浓度目标微生物的样品经过所述步骤S1-S3后得到相应的多组荧光强度，基于多组已知目标微生物浓度和所得多组荧光强度通过线性拟合获得。
本发明的微生物检测方法还可同时检测多种微生物。其中每一种微生物的检测方法都按照步骤S1-S4进行，且各种微生物的检测是同步进行的，节约时间和成本。需要注意的是，同时检测多种微生物时，针对不同的微生物，所用荧光材料发射波长不同。
在本发明一个优选实施方式中，提供了同时检测大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
(a)将抗大肠杆菌O157:H7和抗鼠伤寒沙门氏菌的免疫磁珠同时加入到含有大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的样品中，使免疫磁珠上的抗体分别特异性捕获目标菌，形成磁珠-细菌复合体。
(b)结合免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体：将修饰有抗大肠杆菌O157:H7多抗的免疫二氧化锰纳米花-绿色荧光材料复合体和修饰有抗鼠伤寒沙门氏菌多抗的免疫二氧化锰纳米花-红色荧光材料复合体同时加入到磁珠-细菌复合体溶液中，通过抗原抗体结合分别形成磁珠-细菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，即得到磁珠-大肠杆菌O157:H7-二氧化锰纳米花-绿色荧光材料复合体和磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-二氧化锰纳米花-红色荧光材料复合体。
(c)谷胱甘肽还原溶解二氧化锰纳米花：向磁珠-细菌-二氧化锰纳米花-荧光材料中加入谷胱甘肽溶液，在谷胱甘肽和二氧化锰之间的氧化还原反应作用下，磁珠-细菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体上的二氧化锰纳米花被溶解成Mn2+，荧光材料被释放到溶液中并可在适当的激发条件重新发射荧光。
(d)荧光强度分析测定：分别测定溶液中两种材料的荧光强度，再结合各自标准曲线，进而可分别得到大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
本发明利用二氧化锰纳米花和荧光材料之间能量转移，使荧光材料的荧光在二氧化锰存在的条件下猝灭，之后再将二氧化锰还原为锰离子，将荧光材料释放出来，使其在适当的激发条件下可重新发射荧光，同时利用纳米花的高负载特性，进行信号放大，实现目标微生物的灵敏检测。
附图说明
图1为本发明实施例所得二氧化锰纳米花电镜图；
图2为本发明实施例所得二氧化锰纳米花-荧光材料复合体电镜图；
图3为本发明实施例中对微生物进行检测的原理图；
图4为本发明实施例中合成二氧化锰纳米花-荧光材料复合体时，对荧光材料加入量的优化结果；
图5为本发明实施例中对投入细菌样品中免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体的量的优化结果；
图6为本发明实施例中磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体的电镜图；
图7为按照实施例1的方法对不同浓度(1.0×101-1.0×106CFU/mL)的鼠伤寒沙门氏菌的光谱检测结果；
图8为按照实施例1的方法对不同浓度(101-106CFU/mL)纯细菌样本及人工添加鸡肉样本中鼠伤寒沙门氏菌的检测结果；
图9为按照实施例1的方法对相同浓度(105CFU/mL)的鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌的检测结果；
图10为同时检测不同浓度(1.0×101-1.0×106CFU/mL)的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的光谱检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法，其中以鼠伤寒沙门氏菌作为目标微生物。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。因此，本实施例以鼠伤寒沙门氏菌为例，提供一种快速、灵敏的微生物检测方法。
1、主要试剂和材料
链霉亲和素化150nm磁珠；高锰酸钾(KMnO4)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)；磷酸盐缓冲液(PBS，10mM,pH 7.4)；磷酸缓冲液(PB，10mM,pH 6.0)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)；Luria-Bertani培养基(LB)；牛血清蛋白(BSA)；谷胱甘肽(GSH)；羧基化的荧光材料等。
2、实验材料的制备
2.1免疫磁珠的制备
取200μL链霉亲和素化磁珠(1mg/mL)加入500μL的PBS洗涤1次，之后用500μL的PBS复溶并向其中加入0.04mg的抗鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体，涡旋混匀10s，然后孵育45min(15rpm)；磁分离2min，弃上清，用500μL的PBS洗涤2次，并用200μL的PBS溶解磁珠制备1mg/mL的免疫磁珠溶液，并置于4℃中备用。
2.2二氧化锰纳米花的制备
将KMnO4(0.1M,100mL)和PVP(0.0261g,10mL)混合，将混合溶液加热至90℃，向以上溶液加入HCl(0.2M,100mL)，继续加热1h。之后将溶液冷却至室温，并用超纯水清洗2-3次，即得二氧化锰纳米花溶液，所得二氧化锰纳米花电镜图如图1所示，并置于4℃中保存备用。
2.3免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体的制备
(a)取14mg的二氧化锰纳米花离心(10000rmp,10min)，加入2mL纯酒精复溶。再加入1mL的APTES，在37℃恒温箱过夜反应。反应完成后，分别用乙醇和超纯水清洗两次。最后用14mL超纯水重悬得到氨基化二氧化锰纳米花溶液。
(b)向1mL的PB溶液中加入0.05nmol的荧光材料、48μg的EDC、10.86μg的NHSS，孵育1h；之后加入氨基化二氧化锰纳米花溶液(700μL，1mg/mL)继续孵育2h；离心(10000rmp,10min)除去未反应的荧光材料，再用超纯水洗涤离心一次，并用700μL的PB溶液复溶获得二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，其电镜图如图2所示，并置于4℃中备用。
(c)向1mL的PB溶液中加入二氧化锰纳米花-荧光材料复合体(500μL，1mg/mL)和34μg的鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体孵育30min，然后加入10μg的EDC再次孵育30min，重复3次以上操作；随后加入20mg的10％的BSA孵育30min；再加入10μg的EDC反应30min。最后用超纯水离心洗涤2次(7000rmp,10min)，并用500μL的PB溶液复溶，并置于4℃中备用。
3、对鼠伤寒沙门氏菌进行检测，检测原理如图3所示，具体步骤如下：
(a)免疫磁分离目标菌：分别取1mL不同浓度(101-106CFU/mL)鼠伤寒沙门氏菌样品，加入20μg免疫磁珠，37℃下混匀孵育45min，免疫磁珠上的抗体特异性捕获目标菌，形成磁珠-鼠伤寒沙门氏菌复合体。磁分离2min，吸除上清，即除去未结合的细菌及其他杂质，并用PBS缓冲液清洗一次，最后用PBS复溶磁珠-鼠伤寒沙门氏菌复合体。
(b)结合免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体：将含有0.05mg二氧化锰纳米花的免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体加入到磁珠-鼠伤寒沙门氏菌复合体溶液中，孵育45min，通过抗原抗体结合形成磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体。磁分离2min，吸除上清，即除去未与目标菌结合的二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，并用PBS缓冲液清洗一次，得到磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体。
(c)谷胱甘肽还原溶解二氧化锰纳米花：向磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体中加入100μL的20mM谷胱甘肽溶液，在谷胱甘肽和二氧化锰之间的氧化还原反应作用下，磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体上的二氧化锰纳米花被溶解，荧光材料被释放到溶液中并可在适当的激发条件下重新发射荧光。
(d)荧光强度分析测定：反应完成后，通过磁分离取上清液并转移至透明玻璃管中用光谱仪测定荧光强度。通过标准曲线(利用已知浓度的鼠伤寒沙门氏菌标准样品及对应的荧光强度所建立的)进而得到鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
图4为本实施例中合成二氧化锰纳米花-荧光材料复合体时，对荧光材料加入量的优化结果，从图中可以看出，荧光材料投入量为0.07nmol时，荧光强度与0.05nmol相差不大；且荧光材料加入量为0.05nmol时，荧光强度已经足够做为细菌检测的输出信号。由此，荧光材料最优投入量为0.05nmol。
图5为本实施例检测步骤(b)中对投入细菌样品中免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体的量的优化结果(投入量以二氧化锰含量为标准)。从图中可以看出，二氧化锰含量为0.05mg时信号荧光为最优。
在优化参数以后，图6显示为本实施例中免疫磁珠、免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体与鼠伤寒沙门氏菌的结合情况，可以看出两者都成功与鼠伤寒沙门氏菌结合。
图7为按照实施例1的方法对不同浓度(1.0×101-1.0×106CFU/mL)的鼠伤寒沙门氏菌的光谱检测结果。可以看出，当鼠伤寒沙门氏菌浓度增加时，荧光强度值也相应增加，且呈现较好的线性关系。
图8为按照实施例1的方法对不同浓度(101-106CFU/mL)纯细菌样本及人工添加鸡肉样本中鼠伤寒沙门氏菌的检测结果。可以看出，采用本实施例的方法检测真实样品，检测结果也较为准确，与纯样品偏差较小。
图9为按照实施例1的方法对相同浓度(105CFU/mL)的鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌(除了鼠伤寒沙门氏菌，其余均作为干扰细菌)的检测结果，可以看出：鼠伤寒沙门氏菌的荧光信号较强，而单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌仅有微弱荧光信号，表明所述方法具有较好的特异性。
依据图8纯样品与真实样品的荧光信号结果以及回收率公式得出按实施例1方法检测的回收率，结果见表1。
表1按实施例1方法进行检测的回收率
细菌浓度(CFU/mL) 回收率
1.0×10<sup>1</sup> 111.50％
1.0×10<sup>2</sup> 104.04％
1.0×10<sup>3</sup> 90.57％
1.0×10<sup>4</sup> 94.70％
1.0×10<sup>5</sup> 105％
1.0×10<sup>6</sup> 92.62％
平均 99.74％
可以看出回收率控制在90.57％～111.50％之间，平均回收率为99.74％，进一步说明该检测方法具有较好的实用性。
实施例2
本实施例提供一种同时检测大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的方法，原理与材料准备方法同实施例1，具体操作步骤如下：
(a)将抗大肠杆菌O157:H7和抗鼠伤寒沙门氏菌的免疫磁珠同时加入到含有大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的样品中，混匀孵育45min，免疫磁珠上的抗体分别特异性捕获目标菌，形成磁珠-细菌复合体。磁分离2min，吸除上清，即除去未结合的细菌及其他杂质，并用PBS缓冲液清洗一次，最后用PBS复溶磁珠-细菌复合体。
(b)结合免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体：将含有0.05mg二氧化锰纳米花的修饰有抗大肠杆菌O157:H7多抗的免疫二氧化锰纳米花-绿色荧光材料复合体和含有0.05mg二氧化锰纳米花的修饰有抗鼠伤寒沙门氏菌的免疫二氧化锰纳米花-红色荧光材料复合体同时加入到磁珠-细菌复合体溶液中，孵育45min，通过抗原抗体结合分别形成磁珠-细菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体。磁分离2min，吸除上清，即除去未与目标菌结合的二氧化锰纳米花-荧光材料，并用PBS缓冲液清洗一次，得到磁珠-大肠杆菌O157:H7-二氧化锰纳米花-绿色荧光材料复合体和磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-二氧化锰纳米花-红色荧光材料复合体。
(c)谷胱甘肽还原溶解二氧化锰纳米花：向磁珠-细菌-二氧化锰纳米花-荧光材料中加入100μL的20mM谷胱甘肽溶液，在谷胱甘肽和二氧化锰之间的氧化还原反应作用下，磁珠-细菌-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体上的二氧化锰纳米花被溶解成Mn2+，荧光材料被释放到溶液中。
(d)荧光强度分析测定：反应完成后，通过磁分离取上清液并转移至透明玻璃管中用光谱仪测定两种荧光的强度。再通过各自标准曲线进而分别得到大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
图10为同时检测不同浓度(1.0×101-1.0×106CFU/mL)的大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的光谱检测结果。可以看出，利用两种不同发射波长的量子点，可以同时检测两种不同的细菌。说明利用多种不同发射波长的荧光材料，可以同时检测多种微生物，减少操作次数，节约成本。
最后，本发明的实施例仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.利用修饰有所述目标微生物的第一生物识别元件的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的和富集的磁性元件-目标微生物复合体；
S2.将修饰有所述目标微生物的第二生物识别元件的免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体和所述磁性元件-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体；
S3.利用二氧化锰还原剂还原所述磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体上的二氧化锰纳米花，使荧光材料在适当激发条件下可重新发射荧光；
S4.利用光谱仪检测重新释放的荧光强度，并根据荧光强度与目标微生物浓度间的关系曲线，计算得到所述目标微生物的浓度；
所述步骤S2具体包括以下步骤：
S21.利用表面活性剂辅助法制备所述二氧化锰纳米花；
S22.先对所述二氧化锰纳米花进行氨基功能化，再对氨基化的二氧化锰纳米花与所述荧光材料通过缩合反应得到二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，然后对其修饰第二生物识别元件，形成所述免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，复溶于超纯水中备用；
其中，利用3-氨丙基三乙氧基硅烷和溶于99％乙醇的二氧化锰纳米花混匀在37℃过夜孵育，反应完成生成所述氨基化的二氧化锰纳米花；
S23.将所述免疫二氧化锰纳米花-荧光材料复合体与所述磁性元件-目标微生物复合体进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体，并利用磁场分离得到。
2.根据权利要求1所述的微生物检测方法，其特征在于，所述步骤S3中利用谷胱甘肽或双氧水还原所述磁性元件-目标微生物-二氧化锰纳米花-荧光材料复合体上的二氧化锰纳米花。
3.根据权利要求2所述的微生物检测方法，其特征在于，使用谷胱甘肽时，谷胱甘肽的加入量为100μL，浓度为20mM。
4.根据权利要求1～3任一项所述的微生物检测方法，其特征在于，步骤S4中所述荧光强度与目标微生物浓度间的关系曲线的建立包括：将多组含有已知浓度目标微生物的样品经过所述步骤S1-S3后得到相应的多组荧光强度，基于多组已知目标微生物浓度和所得多组荧光强度通过线性拟合获得。
5.根据权利要求1～3任一项所述的微生物检测方法，其特征在于，所述第一生物识别元件和所述第二生物识别元件与所述目标微生物的结合位点不同。
6.根据权利要求5所述的微生物检测方法，其特征在于，所述目标微生物为一种或多种，当为多种时，针对不同目标微生物，所述荧光材料应具有不同发射波长。
CN201910641973.6A 2019-07-16 2019-07-16 一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法 Active CN110501494B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910641973.6A CN110501494B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910641973.6A CN110501494B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110501494A CN110501494A (zh) 2019-11-26
CN110501494B true CN110501494B (zh) 2020-10-09

Family

ID=68585513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910641973.6A Active CN110501494B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110501494B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111273002A (zh) * 2020-02-13 2020-06-12 中国农业大学 一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法及其应用
CN113295660B (zh) * 2021-04-09 2023-11-24 宁波大学 一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009045177A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Agency For Science, Technology And Research Methods of forming a nanocrystal
CN104597019A (zh) * 2015-01-26 2015-05-06 郑州大学 一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其用于检测谷胱甘肽含量的使用方法
CN104730055A (zh) * 2015-04-15 2015-06-24 安徽师范大学 一种荧光传感器,及其制备方法和用途
CN105861629A (zh) * 2016-03-28 2016-08-17 中国农业大学 基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法
CN107290311A (zh) * 2017-06-09 2017-10-24 江苏大学 一种荧光传感器“关‑开”检测维生素c的方法
CN108139391A (zh) * 2015-10-02 2018-06-08 雷莫内克斯生物制药有限公司 含有水溶性聚合物缀合的纳米材料的猝灭剂和其用途
CN109520980A (zh) * 2018-11-14 2019-03-26 大连工业大学 荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009045177A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 Agency For Science, Technology And Research Methods of forming a nanocrystal
CN104597019A (zh) * 2015-01-26 2015-05-06 郑州大学 一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其用于检测谷胱甘肽含量的使用方法
CN104730055A (zh) * 2015-04-15 2015-06-24 安徽师范大学 一种荧光传感器,及其制备方法和用途
CN108139391A (zh) * 2015-10-02 2018-06-08 雷莫内克斯生物制药有限公司 含有水溶性聚合物缀合的纳米材料的猝灭剂和其用途
CN105861629A (zh) * 2016-03-28 2016-08-17 中国农业大学 基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法
CN107290311A (zh) * 2017-06-09 2017-10-24 江苏大学 一种荧光传感器“关‑开”检测维生素c的方法
CN109520980A (zh) * 2018-11-14 2019-03-26 大连工业大学 荧光/核磁双功能探针检测食品中维生素c的方法

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A MnO2 nanosheet-assisted GSH detection platform using an iridium(iii) complex as a switch-on luminescent probe;Zhen-Zhen Dong等;《Nanoscale》;20170414;第9卷(第14期);全文 *
An enzyme-free biosensor for sensitive detection of Salmonella using curcumin as signal reporter and click chemistry for signal amplification;Fengchun Huang等;《Theranostics》;20181129;第8卷(第22期);第6265页右栏第1段，第6266页左栏第3段-右栏第1段 *
Biodegradable nanoprobe based on MnO2 nanoflowers and graphene quantum dots for near infrared fluorescence imaging of glutathione in living cells;Zhi-Ling Song等;《Microchimica Acta》;20181001;全文 *
Graphene Quantum Dot–MnO2 Nanosheet Based Optical Sensing Platform A Sensitive Fluorescence "Turn Off–On" Nanosensor for Glutathione Detection and Intracellular Imaging;Xu Yan等;《ACS Appl. Mater. Interfaces》;20160805;第8卷;全文 *
Hierarchical manganese dioxide nanoflowers enable accurate ratiometric fluorescence enzyme-linked immunosorbent assay;Lei Jiao等;《Nanoscale》;20181023;第10卷;第21895页左栏第2段-右栏第1段，附加材料 *
Intracellular Glutathione Detection Using MnO2-Nanosheet-Modified Upconversion Nanoparticles;Renren Deng等;《J. Am. Chem.Soc.》;20111122;第133卷;全文 *
Lei Jiao等.Hierarchical manganese dioxide nanoflowers enable accurate ratiometric fluorescence enzyme-linked immunosorbent assay.《Nanoscale》.2018,第10卷第21895页左栏第2段-右栏第1段，附加材料. *
MnO2 Nanosheet-Carbon Dots Sensing Platform for Sensitive Detection of Organophosphorus Pesticides;Xu Yan等;《Anal. Chem.》;20171214;第90卷;全文 *
Point-of-care assay to detect foodborne pathogenic bacteria using a low-cost disposable medical infusion extension line as readout and MnO2 nanoflowers;Shengjun Bu等;《Food Control》;20181204;第98卷;全文 *
Surfactant-Assisted Synthesis of Birnessite-Type MnO2 Nanoflowers;Xinli Hao等;《Journal of Nano Research》;20180604;第53卷;第2页第2段 *
Turn-on fluorescent sensor for the detection of glucose using manganese dioxide−phenol formaldehyde resin nanocomposite;Zhong Feng Gao等;《Talanta》;20171205;第180卷;全文 *
稀土上转换纳米材料的生物医学应用;葛雪莹等;《武汉大学学报（理学版）》;20150228;第61卷(第1期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110501494A (zh) 2019-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Abdelhamid et al. Selective biosensing of Staphylococcus aureus using chitosan quantum dots
Li et al. Rapid detection of trace Salmonella in milk and chicken by immunomagnetic separation in combination with a chemiluminescence microparticle immunoassay
Xing et al. Novel immunochromatographic assay based on Eu (III)-doped polystyrene nanoparticle-linker-monoclonal antibody for sensitive detection of Escherichia coli O157: H7
CN110501494B (zh) 一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法
Yu et al. CdTe/CdS quantum dot-labeled fluorescent immunochromatography test strips for rapid detection of Escherichia coli O157: H7
CN111235233A (zh) 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用
CN111139288B (zh) 基于适配体识别-杂交链式反应同时检测金黄色葡萄球菌肠毒素a、b的荧光传感器
CN110927372A (zh) 基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用
CN105950471B (zh) 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用
Al-Awwal et al. Nanoparticle immuno-fluorescent probes as a method for detection of viable E. coli O157: H7
Li et al. Fluorescence signal amplification assay for the detection of B. melitensis 16M, based on peptide-mediated magnetic separation technology and a AuNP-mediated bio-barcode assembled by quantum dot technology
Cheng et al. Simultaneous detection of foodborne pathogenic bacteria in milk by fluorescence immunoassay
US7220596B2 (en) Real time detection of antigens
Hang et al. Development of a rapid and sensitive immunoassay for detection and subsequent recovery of Bacillus anthracis spores in environmental samples
CN113912123A (zh) 基于磁性二硫化钼催化和光热效应的鼠伤寒沙门氏菌多模试纸条及其检测方法和应用
CN113514435A (zh) 一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器
Stroot et al. Capture antibody targeted fluorescence in situ hybridization (CAT-FISH): Dual labeling allows for increased specificity in complex samples
CN110564816B (zh) 基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法
Jia et al. Detection of Escherichia coli O157: H7 and Salmonella enterica serotype Typhimurium based on cell elongation induced by beta-lactam antibiotics
Kim et al. A rapid and sensitive immunoassay for detection of E. coli O157: H7 using multienzyme—Au nanoparticle complex
CN110702662B (zh) 基于标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法
Jaakohuhta et al. Sensitive Listeria spp. immunoassay based on europium (III) nanoparticulate labels using time-resolved fluorescence
Ye et al. An ultrasensitive sandwich immunoassay with a glucometer readout for portable and quantitative detection of Cronobacter sakazakii
CN116338171A (zh) 一种免洗均相检测方法
US20170328900A1 (en) Methods and materials for capture antibody targeted fluorescent in-situ hybridization (cat-fish)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant