CN110564816B - 基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品安全检测免疫分析技术领域，涉及一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法。该试剂盒包括：(1)包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条；(2)双标记胶体金探针；所述双标记胶体金探针由巯基标记的单链扩增引发探针与抗单增李斯特菌多克隆抗体包被胶体金得到；(3)DNA扩增探针；(4)反应缓冲液；所述反应缓冲液为含有链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的三羟基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；(5)单增李斯特菌标准品；(6)微孔洗涤液；(7)化学发光底物液。本发明的试剂盒采用单多抗夹心目标物的方法，与竞争检测方法相比，灵敏度更高、检测线性范围更宽、检测成本较低。

Description

基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特 菌的试剂盒和应用及检测方法
技术领域
本发明属于食品安全检测免疫分析技术领域，更具体地，涉及一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒及应用和一种基于双标记免疫胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(单增李斯特菌)是一种具有强大致死能力的食源性致病菌，在感染者中有25％-30％的致死率。单增李斯特菌广泛存在自然环境、家禽及肉制品中，90％的感染病例是通过食用单增李斯特菌污染的饮水或食品致病的，由于其分布的广泛性及高致病性，对公众健康构成严重威胁。因此，开发简易、灵敏、高效的检测技术及试剂盒，对于食品中单增李斯特菌的快速鉴定及食品安全事件毒物的精准快速筛查具有重要意义。
基于免疫技术的检测方法是利用抗原抗体作为识别元件，从而特异性识别目标物，运用抗体识别靶细菌的技术具有条件简单、可靶向筛查、特异性强、稳定性高等特点。目前应用免疫技术的检测方法用途最广泛的是酶联免疫吸附法，该方法已经成为大部分目标物检测的“金标准”，除此之外，化学发光免疫法，荧光免疫法、免疫生物条形码法等方法都是基于免疫技术建立起来的。
双标记胶体金探针运用单多抗夹心目标物的原理，以抗原抗体识别作为分离载体，以胶体金探针上标记的大量相同单链DNA为信号输出工具，通过单抗富集目标物、多抗识别目标物与单链DNA建立数量关系，形成一个目标物对应数百条单链DNA，最后通过检测DNA的含量间接测定目标物浓度，其检测限比传统的ELISA方法高出好几个数量级，甚至检测核酸的灵敏度可以与PCR技术相当；杂交链式扩增技术是恒温扩增技术的一种，最早于2004年提出，经典杂交链式扩增最显著的特征是在于运用了两种DNA杂交形成的“发卡”状DNA，通过引发序列与发卡探针的粘性末端互补，使其杂交状态的自由能显著低于维持正常发卡结构的自由能，从而使得发卡探针解链，暴露出另一组发卡探针的识别位点，发卡相互杂交形成带缺口的DNA长链。运用这种性质结合分离手段通过标记信号(如荧光基团、辣根过氧化物酶等)可以完成对检测核酸序列的信号放大。
目前尚未发现基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒及应用和一种基于双标记免疫胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法。使用本发明的试剂盒可以特异地定量检测饮水及食品中单增李斯特菌菌落浓度。本发明的检测方法在原有的ELISA方法上创新了恒温扩增形成信号的级联放大，形成了灵敏度更高的检测体系。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒，该试剂盒包括盒体以及置于盒体内的：
(1)包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条；
(2)双标记胶体金探针；所述双标记胶体金探针由巯基标记的单链扩增引发探针与抗单增李斯特菌多克隆抗体包被胶体金得到；
(3)DNA扩增探针；包括3’端具有生物素标记的第一发卡DNA和5’端具有生物素标记的第二发卡DNA；所述第一发卡DNA包括5’端突出的第一识别序列和茎环结构，所述第二发卡DNA包括3’端突出的第二识别序列和茎环结构，所述第一发卡DNA的茎部配对部分(即stem部分)与第二发卡DNA的茎部配对部分(即stem部分)的序列相同，所述第一发卡DNA的第一识别序列与第二发卡DNA的环部序列(即loop部分)完全互补，所述第二发卡DNA的第二识别序列与第一发卡DNA的环部序列(即loop部分)完全互补，并且，所述第一发卡DNA的5’端碱基序列与单链扩增引发探针中至少一部分互补配对；
(4)反应缓冲液；所述反应缓冲液为含有链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的三羟基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；
(6)微孔洗涤液；
(7)化学发光底物液。
根据本发明，所述包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条可采用本领域常规的包被方法，优选地，所述包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条由包括以下步骤的方法制得：抗单增李斯特菌单克隆抗体经碳酸盐缓冲液包被到聚苯乙烯微孔条上，包被完成洗涤后抽真空封装。
进一步地，该方法还包括：在包被完成后经惰性蛋白封闭孔；惰性蛋白在微孔板的包被及双标记胶体金探针的制备上均有采用，目的是吸附到微孔板或胶体金表面吸附抗体及单链扩增引发探针之后暴露的表面，从而降低非特异性的吸附，降低背景值。所述惰性蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)和脱脂乳粉(Milk Powder)中的至少一种。
根据本发明一种具体实施方式，抗单增李斯特菌单克隆抗体的包被浓度为0.5μg/mL-1μg/mL。
根据本发明一种具体实施方式，所述单抗包被的微孔板采用黑色聚苯乙烯材质，抗单增李斯特菌单克隆抗体经碱性的碳酸盐缓冲液稀释后吸附在微孔底板上，经牛血清白蛋白封闭孔底板后，洗涤抽真空封袋。
根据本发明，优选地，所述胶体金的粒径为10-20nm。
根据本发明，所述双标记胶体金探针中，各组分的相对用量可根据需要确定，优选地，巯基标记的单链扩增引发探针、抗单增李斯特菌多克隆抗体与胶体金的重量比为1：1：6.05×10-6。
本发明中，双标记胶体金探针是单链扩增引发探针与被检物的多克隆抗体共同包被而成，单链扩增引发探针与胶体金通过Au-S键结合，多抗则在碱性环境下吸附到胶体金表面上，形成的双标记胶体金探针上会标记数百倍于胶体金数量的单链扩增引发探针，起到放大信号的作用。
具体地，所述双标记胶体金探针由包括以下步骤的方法得到：取新制备的胶体金使用0.08-0.12M Na2CO3调pH至8.5-9.5，向其中加入多克隆抗体，混匀在室温条件下震荡混匀持续20-40min；取巯基标记的单链扩增引发探针，加入到多抗标记胶体金溶液中，混匀2-6℃静置1-3h；加入8-12％PEG20000，使其终浓度为0.8-1.2％，加入盐化缓冲液使其终浓度为0.1-0.2M，混匀后置于2-6℃陈化1-3h；加入4-6％BSA使其终浓度为0.8-1.2％，混匀后置于2-6℃封闭0.5-2h，最后进行离心：1500-2500rpm离心5-15min，除去沉淀；12000-14000rpm离心10-30min，小心除掉上清液，加入储备缓冲液(1g PEG20000,1g BSA溶于100mL 0.1M PBS)吹打使沉淀溶解，重复12000-14000离心，最后加入储备缓冲液溶解金探针，得到所述双标记胶体金探针。
本发明通过免疫双标记胶体金探针的双抗夹心模式，通过包被在微孔板的单抗富集目标物，与双标记胶体金探针结合，形成单抗-目标物-多抗-胶体金-单链扩增引发探针的复合结构固定在材质上，经洗涤微孔后，加入经变性复性完成的生物素标记发卡探针，探针被单链扩增引发探针引发打开发卡结构，继而自组装形成生物素标记的长链；HRP-SA与DNA长链上的生物素结合后洗涤微孔，除去未结合的HRP-SA及发卡；最后混合化学发光底物液加入微孔内，置于化学发光分析仪器上检测发光值，从而实现对单增李斯特菌的超灵敏检测。
因此，所述单链扩增引发探针、第一发卡DNA和第二发卡DNA的具体序列满足上述目标即可。
优选地，所述单链扩增引发探针的长度为30-50nt，其中巯基标记的一端具有polyA连接结构；
所述第一发卡DNA和第二发卡DNA的长度为45-60nt，所述第一识别序列和第二识别序列的长度为6-8nt；
所述第一发卡DNA的5’端碱基序列与单链扩增引发探针中除polyA连接结构以外的序列完全互补。
更优选地，所述单链扩增引发探针的碱基序列如SEQ ID NO：1所示(5’-TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGTAAAAAAAAAA-SH-3’)；所述第一发卡DNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示(5’-ACCTCACTTCCGCGTATGGAGAAAGGTTAATTTCTCCATACGCGGAAG-Biotin-3’)；所述第二发卡DNA的碱基序列如SEQ ID NO：3所示(5’-Biotin-TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGTCTTCCGCGTATGGAGAAATTAACC-3’)。
本发明的试剂盒中，所述第一发卡DNA和第二发卡DNA均优选以溶液的形式提供，所述溶液的溶剂可以为Tris缓冲液。
根据本发明，优选地，所述反应缓冲液(亦称杂交缓冲液)以Tris-HCl为缓冲物，同时还含有NaCl和/或MgCl2，以促进DNA探针杂交和维持DNA构象稳定，所述NaCl的浓度为300-500mM，所述MgCl2的浓度为2-8mM。
根据本发明，优选地，所述反应缓冲液的pH为7-8。
根据本发明，优选地，所述链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的浓度为0.1-1.0μg/mL。
根据本发明，优选地，所述微孔洗涤液能够起到洗涤微孔，不影响反应的目的即可。优选地，所述微孔洗涤液为PBST洗液，优选地，所述PBST洗液的组成为0.008-0.012MPBS和0.04％-0.06％Tween 20v/v％，例如为0.01M PBS和0.05％Tween 20v/v％。
根据本发明，化学发光底物液为本领域技术人员公知，可采用市售的化学发光底物液。
本发明的试剂盒中，使用的抗单增李斯特菌抗体为单克隆抗体与多克隆抗体，两种抗体可以结合同一目标物的不同位点形成复合夹心。其中，单克隆抗体可通过细胞株进行制备，多克隆抗体可通过动物免疫制备，均可采用本领域常规的方法实现。
本发明第二方面提供上述试剂盒在单增李斯特菌定量分析中的应用。
本发明的第三方面提供一种基于双标记免疫胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，该方法采用上述试剂盒进行，包括以下步骤：
a)将待测样品加入包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔内，同时加入等体积的双标记胶体金探针混合孵育；
b)洗涤微孔去除未结合产物，加入复性完成的DNA扩增探针，同时加入反应缓冲液进行扩增；
c)洗涤微孔，去除未反应的DNA扩增探针，洗涤完成后加入等体积的化学发光底物液，并用化学发光分析仪测定发光值；
d)根据测得的发光值，基于单增李斯特菌标准品的标准曲线，计算待测样品的单增李斯特菌菌落浓度。
优选地，所述检测方法还包括同时制备单增李斯特菌标准品的标准曲线，具体地，该方法包括以下步骤：
a)将单增李斯特菌标准品和待测样品分别加入包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的不同微孔内孵育，同时加入等体积的双标记胶体金探针混合孵育；
b)洗涤微孔去除未结合产物，加入复性完成的DNA扩增探针，同时加入反应缓冲液进行扩增；
c)洗涤微孔，去除未反应的DNA扩增探针，洗涤完成后加入等体积混合的化学发光底物液，并用化学发光分析仪测定各孔的发光值；
d)以单增李斯特菌标准品菌落浓度为横坐标，以化学发光强度为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算待测样品的单增李斯特菌菌落浓度。
根据本发明，优选地，步骤a)中的孵育时间为1-2h；步骤b)中的扩增时间为1-2h。
在上述优选的试剂盒和检测条件下，可构建效果更好的双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌方法。
本发明基于双标记胶体金探针识别单增李斯特菌，标记生物素的发卡DNA杂交形成DNA长链后与HRP-SA结合使化学发光底物液发光，即通过杂交链式扩增形成检测信号的二次放大，超灵敏检测目标物。本发明的试剂盒及检测方法可以定量检测单增李斯特菌，通过胶体金标记结合杂交链式扩增技术，在恒温的状态下即可放大检测信号，与传统的酶联免疫技术比较，本发明的方法灵敏度高、特异性好、稳定性高、检测时间短，为食源性致病菌危害的防控与靶向精准筛查提供了强有力的手段。
本发明的试剂盒采用单多抗夹心目标物的方法，与竞争检测方法相比，灵敏度更高，且检测线性范围更宽，同时采用HRP-SA与化学发光底物液反映检测信号，检测成本较低。
本发明的试剂盒简化了常规实验需要不断洗涤的操作，仅需要3次洗涤步骤即可上机检测，具有操作简便，检测快速、效果稳定等优势，可普及广大质检部门使用。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为以单增李斯特菌标准品浓度为横坐标，各标准品浓度所测得的荧光值为纵坐标建立的标准曲线。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例用于说明双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌试剂盒的制备方法。
1)预包被微孔板的制备
微孔板选用黑色聚苯乙烯材质并与96孔板底片构成可拆卸模块，使用碳酸盐缓冲液(1.59g Na2CO3+2.93g Na2CO3，pH 9.6定容至1L)将抗单增李斯特菌单抗稀释1000倍，混匀后，每个孔内加入100μL单抗稀释液，将微孔板置于37℃的环境中孵育包被2h或4℃过夜孵育。包被完成取出后，每孔注入200μL的PBST洗液(0.01M PBS+0.05％Tween 20v/v％)，静置3min，一次性拍出或吸干孔内液体，洗涤步骤重复3次。最后用锡纸袋包装抽真空，置于4℃保存。抗单增李斯特菌单克隆抗体的包被浓度为1μg/mL。
2)双标记胶体金探针的制备
2-1)胶体金的制备
采用柠檬酸钠还原法制备15nm的胶体金，制备前三颈圆底烧瓶及容量瓶需王水浸泡过夜除去杂质，双蒸水彻底清洗后吹干备用。组装好蒸馏装置后加入1％的氯金酸溶液及99mL的超纯水，放入转子盖好瓶塞加热搅拌，待沸腾后冷却回流速度为1滴/s时，迅速加入1％的柠檬酸三钠2mL，溶液由黄变为澄清，接着变黑变紫，最后变为酒红色。继续加热15min后，撤掉热源自然冷却至室温。最后使用0.45μm醋酸纤维素滤膜过滤，保存在4℃下，该方法制备的胶体金粒径在15nm左右。
2-2)胶体金的标记
取胶体金溶液5mL，加入浓度为0.1M Na2CO3调整胶体金的pH值在9.0左右。加入抗单增李斯特菌多克隆抗体5μg，常温震荡吸附30min。将1OD巯基标记的单链引发探针(序列见表1)干粉状态下4000rpm离心30s，加入100μL杂交缓冲液，与标记多抗的胶体金溶液混匀置于4℃连接2h。加入10％PEG20000，使其终浓度为1％，加入盐化缓冲液使其终浓度为0.137M，混匀后置于4℃陈化2h。加入5％BSA使其终浓度为1％，混匀后置于4℃封闭1h，离心除杂：2000rpm离心10min，除去沉淀；13000rpm离心20min，小心除掉上清液，加入储备缓冲液(1g PEG20000,1g BSA溶于100mL 0.1M PBS)吹打使沉淀溶解，重复13000rpm离心2次，最后加入储备缓冲液20mL溶解金探针，得到所述单增李斯特菌双标记胶体金探针。
3)杂交-结合缓冲液的配制
杂交缓冲液的配制以Tris-HCl为缓冲物，同时加入NaCl及MgCl2促进DNA探针杂交和维持DNA构象稳定，加入的HRP-SA会与发卡探针标记的生物素结合用以信号。缓冲液中Tris-HCl的浓度为20mM；NaCl的浓度为400mM；MgCl2的浓度为5mM；HRP-SA的浓度为0.5μg/mL；调整溶液的pH至7.5。
4)化学发光底物液的配制
化学发光底物液采用市售的化学发光底物液，购自美国Thermo公司。
上述步骤所得部分分装即为半成品，抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格分装试剂盒。
实施例2
本实施例用于说明本发明的检测方法。加标回收实验采用将不同浓度的单增李斯特菌加入到灭菌牛奶与灭菌牛肉膏溶液中模拟被单增李斯特菌污染的样品，测定样品中的目标物浓度。
采用实施例1制备的双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌试剂盒，具体操作如下：
(1)在4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡10min。
(2)在微孔内分别加入不同浓度的单增李斯特菌标准品(104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、)阴性对照组(PBS溶液)和前处理完成后的待测样品各50μL，每孔再加入双标记胶体金探针50μL，轻微震荡混匀后置于37℃条件下孵育1h。
样品前处理步骤：依据国标GB4789.30-2010的方法，以无菌操作取样品25g(mL)加入到含有225mL LB1增菌液的均质袋中，连续均质1min-2min；或放入盛有225mL LB1增菌液的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min。于30℃±1℃培养24h，移取0.1mL，转种于10mL LB2增菌液内，于30℃±1℃培养18h～24h，备用。
其中LB1增菌液的配方为：胰胨5.0g，多价胨5.0g，酵母膏5.0g，氯化钠20.0g，磷酸二氢钾1.4g，磷酸氢二钠12.0g，七叶苷1.0g，蒸馏水1000mL，调整pH 7.2～7.4。分装121℃高压灭菌15min，备用。取用前每225mL加入1％萘啶酮酸(0.05M氢氧化钠溶液配制)0.5mL，1％吖啶黄0.3mL。
LB2增菌液的配方为：胰胨5.0g，多价胨5.0g，酵母膏5.0g，氯化钠20.0g，磷酸二氢钾1.4g，磷酸氢二钠12.0g，七叶苷1.0g，蒸馏水1000mL，调整pH 7.2～7.4。分装121℃高压灭菌15min，备用。取用前每200mL加入1％萘啶酮酸(0.05M氢氧化钠溶液配制)0.4mL，1％吖啶黄0.5mL。
(3)用PBST溶液洗涤微孔：每孔200μL，静置3min，一次性拍出孔内液体，洗涤步骤重复3次。
(4)取发卡DNA探针H1和H2(序列见表1)，放置在水浴锅或金属浴内95℃保持5min使其变性，再缓慢退火恢复到室温状态，退火时间大约持续1h。
发卡DNA探针H1和H2预先按照等体积混合均匀，每个微孔内加入探针混合液10μL(H1和H2的终浓度均为1μM)，再加入杂交-结合缓冲液40μL，混合均匀后置于37℃环境下杂交结合1h。
(5)PBST洗涤微孔3次，等体积混合化学发光底物液，每孔加入化学发光底物混合液100μL，立即放到化学发光分析仪检测发光值。
(6)以单增李斯特菌标准品的浓度为横坐标，各标准品所测得的发光值为纵坐标，建立标准曲线，如图1所示。根据标准曲线计算各待测样品的浓度，结果如下表2所示。
表1本发明所使用的寡核苷酸序列
Figure BDA0002211937240000111
表2
Figure BDA0002211937240000121
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 天津一安生物技术有限公司
<120> 基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法
<130> BJI1901011TJYA
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttctccata cgcggaagtg aggtaaaaaa aaaa 34
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acctcacttc cgcgtatgga gaaaggttaa tttctccata cgcggaag 48
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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Claims (12)

1.一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括盒体以及置于盒体内的：
（1）包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条；
（2）双标记胶体金探针；所述双标记胶体金探针由巯基标记的单链扩增引发探针与抗单增李斯特菌多克隆抗体包被胶体金得到；
（3）DNA扩增探针；包括3’端具有生物素标记的第一发卡DNA和5’端具有生物素标记的第二发卡DNA；所述第一发卡DNA包括5’端突出的第一识别序列和茎环结构，所述第二发卡DNA包括3’端突出的第二识别序列和茎环结构，所述第一发卡DNA的茎部配对部分与第二发卡DNA的茎部配对部分的序列相同，所述第一发卡DNA的第一识别序列与第二发卡DNA的环部序列完全互补，所述第二发卡DNA的第二识别序列与第一发卡DNA的环部序列完全互补，并且，所述第一发卡DNA的5’端碱基序列与单链扩增引发探针中至少一部分互补配对；
（4）反应缓冲液；所述反应缓冲液为含有链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的三羟基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；
（5）单增李斯特菌标准品；
（6）微孔洗涤液；
（7）化学发光底物液；
所述单链扩增引发探针的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；所述第一发卡DNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述第二发卡DNA的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条由包括以下步骤的方法制得：抗单增李斯特菌单克隆抗体经碳酸盐缓冲液包被到聚苯乙烯微孔条上，包被完成洗涤后抽真空封装。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，该方法还包括：在包被完成后经惰性蛋白封闭孔；所述惰性蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白和脱脂乳粉中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，抗单增李斯特菌单克隆抗体的包被浓度为0.5μg/mL-1μg/mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述胶体金的粒径为10-20 nm；
所述双标记胶体金探针由包括以下步骤的方法得到：取新制备的胶体金使用0.08-0.12M Na2CO3调pH至8.5-9.5，向其中加入多克隆抗体，混匀在室温条件下震荡混匀持续20-40 min；取巯基标记的单链扩增引发探针，加入到多抗标记胶体金溶液中，混匀2-6℃静置1-3h；加入8-12% PEG20000，使其终浓度为0.8-1.2%，加入盐化缓冲液使其终浓度为0.1-0.2M，混匀后置于2-6℃陈化1-3h；加入4-6% BSA使其终浓度为0.8-1.2%，混匀后置于2-6℃封闭0.5-2h，最后进行离心：1500-2500rpm离心5-15min，除去沉淀；12000-14000rpm离心10-30min，小心除掉上清液，加入储备缓冲液吹打使沉淀溶解，重复12000-14000rpm离心，最后加入储备缓冲液溶解金探针，得到所述双标记胶体金探针。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述单链扩增引发探针的长度为30-50nt，其中巯基标记的一端具有polyA连接结构；
所述第一发卡DNA和第二发卡DNA的长度为45-60nt，所述第一识别序列和第二识别序列的长度为6-8nt；
所述第一发卡DNA的5’端碱基序列与单链扩增引发探针中除polyA连接结构以外的序列完全互补。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述反应缓冲液还含有NaCl和/或MgCl2，所述NaCl的浓度为300-500mM，所述MgCl2的浓度为2-8 mM；所述反应缓冲液的pH为7-8；所述链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的浓度为0.1-1.0 μg/mL；
所述微孔洗涤液为PBST洗液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述PBST洗液的组成为0.008-0.012M PBS和0.04%-0.06%Tween 20 v/v%。
9.权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒在单增李斯特菌定量分析中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
10.一种基于双标记免疫胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，该方法采用权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒进行，包括以下步骤：
a）将待测样品加入包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔内，同时加入等体积的双标记胶体金探针混合孵育；
b）洗涤微孔去除未结合产物，加入复性完成的DNA扩增探针，同时加入反应缓冲液进行扩增；
c）洗涤微孔，去除未反应的DNA扩增探针，洗涤完成后加入等体积的化学发光底物液，并用化学发光分析仪测定发光值；
d）根据测得的发光值，基于单增李斯特菌标准品的标准曲线，计算待测样品的单增李斯特菌菌落浓度；
所述方法用于非疾病诊断目的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，该方法包括以下步骤：
a)将单增李斯特菌标准品和待测样品分别加入包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的不同微孔内孵育，同时加入等体积的双标记胶体金探针混合孵育；
b)洗涤微孔去除未结合产物，加入复性完成的DNA扩增探针，同时加入反应缓冲液进行扩增；
c)洗涤微孔，去除未反应的DNA扩增探针，洗涤完成后加入等体积混合的化学发光底物液，并用化学发光分析仪测定各孔的发光值；
d)以单增李斯特菌标准品菌落浓度为横坐标，以化学发光强度为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算待测样品的单增李斯特菌菌落浓度。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，步骤a）中的孵育时间为1h-2h；步骤b）中的扩增时间为1h-2h。
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