CN112230001A - 一种检测黄曲霉m1的可视化免疫分析方法 - Google Patents

一种检测黄曲霉m1的可视化免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种基于磁性石墨烯的可视化免疫分析方法，用于检测牛奶中的黄曲霉M1。其通过如下步骤：采用“一锅法”合成磁性石墨烯；采用化学方法将磁性石墨烯与黄曲霉M1的单克隆抗体偶联，牛血清白蛋白封闭；制备荧光探针黄曲霉B1‑EDF；采用直接竞争法，目标化合物黄曲霉M1与荧光探针黄曲霉B1‑EDF同时竞争磁性石墨烯上的黄曲霉M1单克隆抗体，根据石墨烯猝灭荧光探针的荧光信号，紫外灯下定性分析；根据石墨烯猝灭荧光探针的荧光信号多少，计算目标化合物黄曲霉M1的含量，进行定量分析。与现有技术相比，本发明可视化免疫分析方法，可以将样品富集净化与可视化检测集成化，具有简便、快速、灵敏、准确等优点。

Description

一种检测黄曲霉M1的可视化免疫分析方法
技术领域
本发明属于化学性危害因子的残留分析和免疫学技术领域。具体涉及一种基于磁性石墨烯的可视化免疫分析方法，采用黄曲霉M1作为检测靶标，检测食品中黄曲霉M1。
背景技术
荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是指发生在距离足够近(10nm左右)的供体与受体之间的非辐射能量转移，常常作为均相免疫分析应用于化学性危害因子的检测，具有分析快速，不需要繁琐的洗涤步骤等优点。可是，常见的FRET往往选择斯诺克位移较小的荧光基团作为能量供体或者受体，使光谱分辨困难，并且能量转移效率较低。在最近的文献报道中，发现还原氧化石墨烯(reduced grapheneoxide，rGO)具有超强的荧光猝灭性能，它猝灭有机染料的猝灭效率几乎可达100％，因此，猝灭型荧光能量共振转移(Quenching fluorescence resonance energy transfer，qFRET)越来越受广大研究者的关注。虽然qFRET本身的灵敏度高，可是方法本身缺乏样品富集和净化步骤，对样品基质耐受较差。样品的富集净化仍然是qFRET必不可少的步骤，增加了检测的总时间和复杂程度，限制了它的广泛应用性。因此，探索新型样品富集净化一体化qFRET，满足快速筛选的需求十分迫切。
目前，磁性石墨烯(graphene-based magnetic composites，GMC)作为磁性固相萃取材料，已经用于农药、兽药、真菌毒素、生物大分子化合物的提取。它主要是通过π-π堆积力，静电吸附，氢键等作用力，吸附目标化合物，缺乏特异性。此外，GMC往往只用于样品的富集和净化，而缺乏信号传输机制，使样品富集净化与检测信号的获得在时空上隔开，增加了检测的总时间和检测的复杂程度。
基于磁性分离在样品处理中的优势，石墨烯良好的生物相容性和超强的荧光猝灭功能，本发明提出基于GMC样品富集净化和可视化检测两位一体的新型FRET猝灭体系，以提高qFRET的实用性。
发明内容
为此，本发明的目的在于克服现有qFRET技术存在的缺陷，研发一种样品富集净化一体化的新型qFRET，实现样品富集净化与可视化，应用于食品中黄曲霉M1的检测。
为实现本发明目的，本发明集合GMC的磁性分离功能和良好的猝灭效率，以其作为载体，偶联抗体作为能量受体，采用荧光素标记的目标化合物作为能量供体，构建qFRET。
具体通过以下技术方案实现：
步骤1，采用“一锅法”合成磁性石墨烯：将氧化石墨烯在超声条件下分散到去离子水中，将FeCl3和FeCl2的混合溶液，缓慢滴入到氧化石墨烯中。之后，加入L-半胱氨酸，氨水，超声分散，将反应液置于水浴锅中静止反应。反应结束后，离心，获得磁性石墨烯，对磁性石墨烯进行预处理；
步骤2，将抗体负载到磁性石墨烯表面：在预处理过的磁性石墨烯中加入吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)搅拌均匀，室温下，加入黄曲霉M1抗体搅拌反应；之后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，封闭。经分离，洗涤，磷酸盐缓冲溶液重悬，得到偶联抗体的磁性石墨烯。
步骤3，合成荧光探针黄曲霉B1-荧光素：
(a)称取黄曲霉B1(AFB1)，氧羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，溶于吡啶溶液中，加热搅拌反应获得AFB1-CMO；(b)分别取乙二胺、异硫氰酸荧光素(FITC)，加入甲醇，滴入三乙胺，搅拌溶解；将异硫氰酸荧光素(FITC)溶液缓慢滴入乙二胺溶液中，搅拌反应，沉淀经洗涤，离心，避光干燥，即获得EDF。(c)取AFB1-CMO，EDC(二氯乙烷)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于二甲亚砜(DMF)中，室温搅拌反应过夜；离心，去除沉淀，取上清，得活化的半抗原溶液。(d)取EDF溶于二甲亚砜(DMF)中，将其加入到活化的半抗原溶液中，室温搅拌反应。采用薄层色谱进行纯化，取上清，即为荧光探针黄曲霉B1-荧光素。
步骤4，以抗体负载的石墨烯作为能量受体，荧光探针黄曲霉B1-荧光素作为能量供体，构建qFRET；样品不需要处理，与能量受体直接孵育，经过磁分离，进行定性或定量检测。
本发明原理：采用化学方法将磁性石墨烯与黄曲霉M1的单克隆抗体偶联，牛血清白蛋白封闭；采用直接竞争法，目标化合物黄曲霉M1与荧光探针黄曲霉B1-EDF同时竞争磁性石墨烯上的黄曲霉M1单克隆抗体，紫外灯下定性分析，当样本中不含有目标化合物，荧光素标记的目标化合物与抗体偶联的磁性石墨烯结合，拉近了供体(荧光素)和受体(石墨烯)的距离，荧光信号猝灭；反之，样本中目标化合物与抗体偶联的磁性石墨烯结合，经过磁性富集和净化，加入荧光素标记的目标化合物不能与抗体偶联的磁性石墨烯结合，在紫外灯下，显现出肉眼可见的荧光信号。根据石墨烯猝灭荧光探针的荧光信号多少，计算目标化合物黄曲霉M1的含量，进行定量分析。
本发明优点：将抗体偶联的磁性石墨烯既作为样品富集净化中的捕获探针，又作为能量受体，还综合了磁性分离的特性，有效的将样品富集净化和样品信号的获得进行了整合，缩短了检测总时间(本发明检测总时间为8min)，提高了qFRET的实用性和检测效率，具有潜在的经济价值和良好的应用前景。与现有技术相比，本发明分析方法可以将样品富集净化与可视化检测集成化，具有简便、快速、灵敏(检出限为3.8ng/L)、准确等优点，能更好地实现牛奶中的黄曲霉M1检测的定量或定性分析。
附图说明
图1为本发明制得的磁性石墨烯的表征结果。(A)透射电镜表征结果；(B)纳米四氧化三铁粒子尺寸分布；(C)高分辨透射电镜结果；(D)能量色散X射线结果；(E)磁化曲线结果，插图:磁性分离前后的变化；(F)磁性石墨烯的紫外吸收图谱和荧光标记物的发射图谱。
图2为本发明制得的磁性石墨烯偶联抗体的表征图谱。(A)偶联前磁性石墨烯透射电镜图片；(B)偶联后磁性石墨烯透射电镜表征结果；(C)偶联前磁性石墨烯原子力显微镜表征结果；(D)偶联后磁性石墨烯原子力显微镜表征结果。
图3为本发明制得的荧光标记物的高效液相色谱(荧光检测器)和薄层色谱图。
图4为本发明荧光优化结果。
图5为本发明反应时间的优化。
图6为本发明标准曲线。
图7为本发明特异性实验。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
实施例1磁性石墨烯的合成
准确称取FeCl3 0.144g和FeCl2 0.056g溶液2.22mL去离子水；准确称取氧化石墨烯15mg，使之在超声条件下分散到10mL去离子水中。将FeCl3和FeCl2的混合溶液，缓慢滴入到氧化石墨烯中。之后，准确称取L-半胱氨酸100mg，25％氨水溶液0.4mL加入到上述反应液中，超声分散5min，将反应液置于90℃的水浴锅，静止反应10h。之后，10000g离心，获得磁性石墨烯。经过透射电镜、高分辨透射电镜、能量色散X射线、磁性及紫外吸收图谱表征，结果见图1，Fe3O4均匀分布在石墨烯片层上，纳米直径是5.2nm.能量色散X射线表明存在C、Fe和O元素，磁性曲线表明，合成的磁性石墨烯饱和磁化强度是5.37emu/g，磁性分离具有较好的效果，在200—700nm范围内，具有良好的紫外吸收性质。
实施例2磁性石墨烯与抗体的偶联
2.1溶液配制
吗啉乙磺酸缓冲液(0.05M MES)：准确称取吗啉乙磺酸9.7g，定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液(0.01MPBS，pH 7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH2PO4 0.20g，Na2HPO4212H2O2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。
洗涤液(0.01M PBST，pH 7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH2PO4 0.20g，Na2HPO4212H2O2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加0.50mL Tween 20，定容至1000mL。
封闭液：准确称取牛血清白蛋白(BSA)10.00g，加入去离子水100mL，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。
2.2磁性石墨烯与抗体的偶联
准确称取上述制备的磁性石墨烯2mg，加入0.8mL 0.05MES溶液，涡旋使之溶解；准确称取EDC2HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)10mg，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)10mg，用1mL 0.05M MES溶液使之溶解；准确取0.2mL 0.05EDC溶液加入上述磁性石墨烯溶液中，涡旋使之溶解；超声30min；
磁力架吸取磁性石墨烯，PBST洗涤3遍，弃掉磁性不强的石墨烯材料，之后加入1mL0.05M MES溶液使之分散，加入黄曲霉M1抗体0.3mg；室温，缓慢搅拌反应2h；之后加入0.02mL 2％BSA溶液，封闭2h。磁力架分离抗体负载的石墨烯，PBST洗涤5遍。1mL 0.01M PBS(含有1％BSA)溶液重悬。对偶联抗体的磁性石墨烯进行表征，结果见图2，经过偶联和封闭之后，磁性石墨烯表面变成模糊的丛簇状，偶联抗体前后，石墨烯片层的厚度增加，说明偶联成功。
实施例3荧光探针的合成
称取AFB1 4mg，氧羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)3.8mg，溶于5mL吡啶溶液中，随后转移到带有冷凝装置的圆底烧瓶中，70℃磁力搅拌反应6h，反应液在水浴氮气仪下吹干(70℃)，即获得AFB1-CMO。
取AFB1-CMO2 mg，溶于0.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入6mg EDC和2mgNHS，室温搅拌反应12h，3,000rmp/min离心5min，取上清即为活化的半抗原溶液。
异硫氰酸荧光素(FITC)与乙二胺反应获得EDF：取乙二胺100mg，加入50mL甲醇，滴入200μL的三乙胺，磁力搅拌使之充分溶解；取FITC 60mg，溶于10mL甲醇，滴入100μL的三乙胺，磁力搅拌使之充分溶解；将FITC溶液缓慢滴入乙二胺溶液中，磁力搅拌反应30min，10,000rpm/min离心10min，沉淀用10mL甲醇溶液洗涤一次，离心，收集沉淀，避光干燥，不需要进一步纯化，即获得EDF。
取2mg EDF溶于50μL DMF，加入到上述活化的AFB1-CMO中，室温搅拌反应12h。采用薄层色谱进行纯化，展开剂三氯甲烷:甲醇＝4:1，收集Rf为0.3的组分，溶于100μL甲醇，10,000rpm/min离心10min，去除沉淀，取上清，即为荧光标记物。经过薄层色谱分离，和HPLC-FD鉴定，发现荧光标记物的纯度较高，适用于后续试验。
实施例4测定程序及优化
4.1检测步骤
⑴取磁性石墨烯与黄曲霉M1的偶联物20μL到1.5mL的EP管中。
⑵加标准液或样品液500μL到上述EP管中，室温条件下孵育4min。
⑶经过磁性分离，弃上清。
⑷加入500μL荧光标记物，温条件下孵育4min。
⑸紫外等下观察结果，或者采用荧光分光光度计测定荧光值。
4.2最佳荧光标记物稀释倍数的选择
取磁性石墨烯与黄曲霉M1的偶联物20μL到1.5mL的EP管中，将荧光标记物稀释100倍，200倍，400倍，800倍，1600倍，进行测定，其荧光猝灭效率与“阴性”对照结果见图4。当荧光标记物稀释800倍的时候，荧光值是1607.5，荧光猝灭效率为97.1％，灵敏度最好，因此选择荧光标记物的稀释倍数为800为最佳稀释倍数。
4.3最佳反应时间的选择
取磁性石墨烯与黄曲霉M1的偶联物20μL到1.5mL的EP管中，取稀释800倍的荧光标记物0.5mL，加入到上述EP管中，按照测定程序，在0min,1min,2min,3min,4min,5min,6min进行测定。取直接采用BSA进行封闭的磁性石墨烯作为阴性对照，其荧光猝灭效率与“阴性”对照结果见图5。可知，当反应5min的时候，猝灭效率达到了95.7％，选择时间为5min作为最佳的反应时间。
4.4标准曲线的建立
将黄曲霉M1标准品配制成0、10、50、100、500、2000ng/L等6个浓度梯度，每个浓度3个平行，紫外等下观察结果，或者采用荧光分光光度计测定荧光值，结果见图6，图6A可知，紫外灯下，当标准品浓度为50ng/L时，有明显的荧光，肉眼判读线为50ng/L，经过荧光分光光度计测定荧光值，建立标准曲线，线性范围为10～20000ng/L，IC50值为103.5ng/L，定量限是3.8ng/L。
4.5交叉反应实验
分别将黄曲霉B1，呕吐毒素，T2毒素，伏马菌素B1，玉米赤霉烯酮，和赭曲霉毒素A稀释成5μg/L,100μg/L,100μg/L,100μg/L,100μg/L,100μg/L，进行测定，结果见图7，本发明建立的qFRET仅与黄曲霉B1有一定的交叉反应性，其IC50值为1016.8ng/L，交叉反应率为10.2％。与其他毒素均无交叉反应，特异性较好。
实施例6本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性实验
将牛奶样本添加一定的浓度黄曲霉M1，每个浓度5个平行样，经过上述方法测定黄曲霉M1的浓度。MQCA的浓度，重复3批，按公式1计算回收率，同时计算变异系数，结果见表1，回收率在94.4-104.5％之间，变异系数小于6.2％。说明此方法的准确性和重复性较好。
Figure BDA0002717004820000051
表1牛奶中黄曲霉M1添加回收率与变异系数
Figure BDA0002717004820000061

Claims (3)

1.一种磁性石墨烯猝灭型荧光检测体系，其特征在于，通过如下步骤制备而成：
步骤1，采用“一锅法”合成磁性石墨烯：将氧化石墨烯在超声条件下分散到去离子水中，将FeCl3和FeCl2的混合溶液，缓慢滴入到氧化石墨烯中；之后，加入L-半胱氨酸，氨水，超声分散，将反应液置于水浴锅中静止反应，反应结束后，离心，获得磁性石墨烯；对磁性石墨烯进行预处理；
步骤2，将抗体负载到磁性石墨烯表面：在预处理过的磁性石墨烯中加入吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)搅拌均匀，室温下，加入黄曲霉M1抗体搅拌反应；之后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，封闭；经分离，洗涤，磷酸盐缓冲溶液重悬，得到偶联抗体的磁性石墨烯；
步骤3，合成荧光探针黄曲霉B1-荧光素：(a)称取黄曲霉B1(AFB1)，氧羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，溶于吡啶溶液中，加热搅拌反应获得AFB1-CMO；(b)分别取乙二胺、异硫氰酸荧光素(FITC)，加入甲醇，滴入三乙胺，搅拌溶解；将异硫氰酸荧光素(FITC)溶液缓慢滴入乙二胺溶液中，搅拌反应，沉淀经洗涤，离心，避光干燥，即获得EDF；(c)取AFB1-CMO，EDC(二氯乙烷)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于二甲亚砜(DMF)中，室温搅拌反应过夜；离心，去除沉淀，取上清，得活化的半抗原溶液；(d)取EDF溶于二甲亚砜(DMF)中，将其加入到活化的半抗原溶液中，室温搅拌反应；采用薄层色谱进行纯化，取上清，即为荧光探针黄曲霉B1-荧光素；
步骤4，以偶联抗体的磁性石墨烯作为能量受体，荧光探针黄曲霉B1-荧光素作为能量供体，构建猝灭型荧光检测体系。
2.如权利要求1所述的磁性石墨烯猝灭型荧光检测体系的应用，其特征在于，待测样品加入磁性石墨烯猝灭型荧光检测体系中，直接孵育，经过磁分离，在紫外灯下，显现出肉眼可见的荧光信号进行定性检测或者采用荧光分光光度计测定荧光值，根据标准曲线定量检测。
3.如权利要求2所述的所述的磁性石墨烯猝灭型荧光检测体系的应用，其特征在于，体系中，黄曲霉B1-荧光素的稀释倍数为800，反应时间为5min。
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