CN104404154B - 浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法 - Google Patents

浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法，属于生物技术领域。本发明依据常见浮游动物rrnL基因序列设计了9条PCR扩增引物，包括5条上游引物和4条下游引物，该引物对浮游动物覆盖度广、扩增效率高，其PCR产物兼容高通量测序平台，将上游引物和下游引物两两组合可以扩增出长度为190bp至390bp的产物，这种多引物组合的方法可以降低非特异性扩增，提高PCR成功率，可广泛用作Barcode序列进行物种鉴定、生物多样性分析等研究。

Description

浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法。
背景技术
DNA条形码(DNA-barcoding)是目前最有力的物种鉴定技术之一，尤其在未知物种的鉴定中起着重要的作用。随着二代测序通量的提高和测序成本的降低，DNA条形码技术开始越来越多的应用在环境生物多样性的调查中。目前基于DNA条形码的物种鉴定都要依托PCR的放大过程，首先扩增能够区分物种的DNA片段，然后根据序列差异鉴定物种。目前用于鉴定动物的DNA条形码主要是线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因片段，经检索，中国专利申请号CN 102827839A，申请日为2012年9月4日的发明专利公开了一种鸟蛤贝类线粒体COI基因扩增引物，该发明利用通用引物扩增得到的66条鸟蛤科mtCOI序列，通过CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计5对引物，用216个鸟蛤科个体在10μL体系下重复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种鸟蛤科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，即为NGF5’-ACAAATCATAAAGATATTGG-3’和NGR5’-TTCAGGGTGTCCGAAGAATCA-3’，该发明的鸟蛤科贝类线粒体COI引物可有效地扩增出鸟蛤科贝类不同物种的目的片段，能够满足鸟蛤遗传多样性研究的需要。中国专利申请号CN101942433A，申请日为2010年8月12日的发明专利公开了一种骨螺科线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其步骤为：a、用COI通用扩增引物扩增出部分骨螺科物种的COI序列，b、将所述的COI通用扩增引物序列与已获得的部分骨螺科物种的COI序列进行比对，找出骨螺科线粒体COI序列在COI通用扩增引物序列段的所有突变碱基，重新合成不同的骨螺科COI扩增引物，c、从新合成的不同COI扩增引物中筛选出扩增骨螺科物种效果最好的一对引物，采用该发明的骨螺科线粒体COI基因扩增引物，可以有效的扩增出骨螺科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究骨螺科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护骨螺科种质资源具有重要意义。
虽然COI基因能够很好区别不同的动物，但对于甲壳动物类群有较低的扩增能力，而且通用的COI引物简并度过高，PCR反应对DNA聚合酶的要求苛刻；而且传统的COI引物扩增的片段大小是658bp，难以在高通量测序平台上进行测序，这也限制了其在环境物种多样性分析中的应用。因此需要研究一种引物，能在高通量测序平台上进行测序，适用于物种鉴定、生物多样性分析等研究。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有COI引物存在简并度过高，PCR反应条件苛刻、对甲壳动物类群扩增能力差以及难以在高通量测序平台上进行测序等问题，本发明提供一种浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法，线粒体核糖体基因rrnL是动物线粒体基因组中相对比较保守的基因，是潜在的进行物种鉴定的条形码之一，本发明依据后生浮游动物类群的rrnL基因序列设计了5条上游引物和4条下游引物，上下游引物的组合可以扩增出长度190bp到390bp不等的PCR产物，引物的简并度低，PCR成功率高，而且PCR产物的长度可以兼容二代高通量测序平台，可用于物种鉴定、生物多样性分析等研究。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
浮游动物rrnL基因扩增引物，包括5条上游引物和4条下游引物，所述的5条上游引物分别为ZoorrnL_80F1：GACTGTGCTAAGGTAGCATAAT、ZoorrnL_80F2：GACTGTGCTAAGGTAGCGTGAT、ZoorrnL_200F1：GACGATAAGACCCTATGAAGCT、ZoorrnL_200F2：GACGATCAGACCCTTTGGAGCT、ZoorrnL_200F3：GACGAGAAGACCCCATAAAACT；所述的4条下游引物序列分别为ZoorrnL_320R1：GCTGTTATCCCTAGGGTAACTT、ZoorrnL_320R2：CCTGTTATCCCCAAAGTAGCTT、ZoorrnL_400R1：TAATCCAACATCGAGGTCGCA、ZoorrnL_400R2：TAATCCAACATCGAGGT AGTA。
上述的浮游动物rrnL基因扩增引物的筛选方法，其步骤为：
(a)从NCBI数据库和BLOD数据库中获取所有浮游动物的rrnL基因序列，将其分为轮虫组、枝角组和桡足组；
(b)用生物信息学软件去除步骤(a)中轮虫组/枝角组/桡足组中重复的序列；
(c)用mafft-win软件将步骤(b)中得到的轮虫组/枝角组/桡足组中的序列进行序列比对，然后以最短的序列为准，去除其它序列两端不齐的部分使所有的序列等长，接着删除序列每个位点上出现频率小于8-12％的碱基，最后输出轮虫组/枝角组/桡足组的保守序列；
(d)将步骤(c)中获得的轮虫组、枝角组和桡足组的保守序列放在一起再次进行序列对比，根据对比结果得到2个相对保守的上游引物设计区域和2个相对保守的下游引物设计区域；
(e)根据步骤(d)中得到的2个相对保守的上游引物设计区域和2个相对保守的下游引物设计区域的序列设计权上述的引物。
优选地，所述的步骤(c)中删除每个位点上出现频率小于10％的碱基。
优选地，所述的步骤(d)中所述的2个相对保守的上游引物设计区域2个相对保守的下游引物设计区域分别位于桡足类rrnL基因序列的80-105、210-235、350-375和410-432位置。
上述的浮游动物rrnL基因扩增引物的应用方法，其步骤为：
(1)将上述的上游引物ZoorrnL_80F1和ZoorrnL_80F2按照摩尔比2:1的比例混合为ZoorrnL_80F，上游引物ZoorrnL_200F1、ZoorrnL_200F2和ZoorrnL_200F3按照等摩尔混合为ZoorrnL_200F，下游引物ZoorrnL_320R1和ZoorrnL_320R2按照摩尔比2:1的比例混合为ZoorrnL_320R，ZoorrnL_400R1和ZoorrnL_400R2按照摩尔比2:1的比例混合为ZoorrnL_400R；
(2)将步骤(1)中得到的ZoorrnL_80F、ZoorrnL_200F、ZoorrnL_320R和ZoorrnL_400R分别置于55℃条件下进行PCR反应退火；
(3)将步骤(2)中的ZoorrnL_80F、ZoorrnL_200F、ZoorrnL_320R和ZoorrnL_400R两两组合进行PCR扩增得到长度为190bp至390bp的PCR产物；
(4)将步骤(3)中得到的PCR产物进行高通量测序，依据序列差异进行物种鉴定和生物多样性分析。
优选地，所述的步骤(3)中PCR扩增时采用的Touchdown反应程序。
上述的浮游动物rrnL基因扩增引物在物种鉴定和生物多样性分析中的应用。
上述的浮游动物rrnL基因扩增引物在浮游动物物种鉴定和生物多样性分析中的应用。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明中没有使用传统的简并碱基，取而代之的是将序列ZoorrnL_80F、ZoorrnL_200F、ZoorrnL_320R和ZoorrnL_400R两两组合进行PCR扩增，这种多引物组合的方法可以降低非特异性扩增，提高PCR成功率；
(2)本发明中设计的引物长度适合高通量测序，传统的引物扩增的片段过长(大于500bp)，不能在二代测序平台上测序，而本发明中设计得到的引物扩增长度在190bp至390bp之间，长度合适，可以在高通量测序平台上测序；
(3)本发明将序列ZoorrnL_80F、ZoorrnL_200F、ZoorrnL_320R和ZoorrnL_400R两两组合进行PCR扩增得到的产物可用于物种鉴定和生物多样性分析，特别是能够满足浮游动物物种鉴定和生物多样性分析研究的需要，对于研究浮游动物的物种分类、系统发育、系统地理学和保护浮游动物种质资源具有重要意义；
(4)本发明中筛选得到的rrnL引物简并度低，进行PCR扩增时条件温和，PCR成功率高，对DNA聚合酶的要求没有COI引物那么苛刻，扩增得到的片段长度小于500bp(190bp 至390bp之间)，可以用高通量测序平台测序，一次性可以获得很多序列，成本低，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为2个相对保守的上游引物设计区域图，标“*”的碱基为变异位点；
图2为2个相对保守的下游引物设计区域图，标“*”的碱基为变异位点；
图3为轮虫类rrnL和COI引物PCR扩增效果对比图；
图4为枝角、桡足类rrnL和COI引物PCR扩增效果对比图；
图5为环境样品PCR扩增产物片段大小分布图；
图6为环境样品PCR产物高通量测序图，其中内插的小图为Ion PGM 318V2测序芯片中有效序列的分布。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例中所说的引物都由上海捷瑞生物工程有限公司合成，使用前溶解于去离子水中，实施例2中的浮游动物为2014年6月份采集于江苏太湖竺山湾和庙港等位点，进行物种鉴定后提取其DNA，PCR试剂为Platinum Taq试剂盒(Invitrogen)，PCR仪器为bio-rad热循环仪。
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
(1)后生浮游动物rrnL基因序列处理
从NCBI数据库和BLOD数据库中下载所有浮游动物rrnL基因序列，共计1558条序列，其中包括轮虫序列176条，桡足类序列642条，枝角类序列740条，通过生物信息软件去除其中的重复序列，使得每个物种的序列不超过3条，经过筛选，最终得到轮虫序列44条，桡足类序列132条，枝角类序列109条。利用软件mafft-win分别将以上序列进行序列比对，以最短的序列为准，去除其它序列两端不齐的部分使所有的序列等长，然后删除每个位点上出现频率小于10％的碱基，然后分别将轮虫，枝角类，桡足类的保守序列输出，将轮虫组、枝角组和桡足组的保守序列放在一起再次进行多重序列比对，然后进行引物设计。
(2)引物设计
根据上述(1)中多重序列比对的结果，找出2个相对保守的上游引物设计区域(见图1)和2个相对保守的下游引物设计区域(见图2)，这4个保守区分布在rrnL基因的80-105、210-235、350-375和410-432位置左右(碱基序号以桡足类序列为例)。为避免使用简并碱基，我们采用多引物混合的方式来降低引物的简并度(简并度过高会增加PCR难度)，共在4个序列保守区设计了9条引物，包括5条上游引物ZoorrnL_80F1、ZoorrnL_80F2、ZoorrnL_200F1、ZoorrnL_200F2、ZoorrnL_200F3和4条下游引物ZoorrnL_320R1、ZoorrnL_320R2、ZoorrnL_400R1、ZoorrnL_400R2。涵盖了常见后生浮游动物类群中可能出现的序列情况。
在进行PCR前，将上游引物ZoorrnL_80F1和ZoorrnL_80F2按照2:1的比例混合为ZoorrnL_80F，上游引物ZoorrnL_200F1、ZoorrnL_200F2和ZoorrnL_200F3按照等摩尔混合为ZoorrnL_200F；下游引物ZoorrnL_320R1和ZoorrnL_320R2按照2:1比例混合为ZoorrnL_320R，ZoorrnL_400R1和ZoorrnL_400R2按照2:1比例混合为ZoorrnL_400R。
将混合后的上游引物ZoorrnL_80F、ZoorrnL_200F和下游引物ZoorrnL_320R、ZoorrnL_400R置于55℃条件下退火进行PCR扩增(采用Touchdown反应程序)得到长度在190bp到390bp不等的PCR产物(如表1所示)。将得到的PCR产物进行高通量测序，依据序列差异即可进行物种鉴定和生物多样性分析。
表1上下游引物组合扩增片段大小
本实施例中设计引物时用到的所有浮游动物rrnL基因序列均可从NCBI数据库和BLOD数据库中下载，基因序列表中只给出了最具代表性的蚤状溞(Daphnia pulex)的rrnL基因序列表。
实施例2
浮游动物样本采集于江苏太湖的竺山湾(东经120.036°，北纬31.373°)和庙港(东经 120.461°，北纬31.002°)，采集到的样本现场储存于90％的酒精中，然后拿到实验室进行物种鉴定和分离，共采集到7种轮虫(萼花臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫、长三肢轮虫、裂足臂尾轮虫、前节晶囊轮虫、尾突臂尾轮虫和轮虫sp.)4种枝角类(模糊秀体溞、透明薄皮溞、直额裸腹溞和直额弯尾溞)和5种桡足类(球状许水蚤、指状许水蚤、右突新镖水蚤、哲水蚤sp.和猛水蚤sp.)，分别提取单只浮游动物DNA。分别用rrnL引物和COI引物对提取得到的浮游动物DNA进行PCR扩增，用rrnL引物扩增时选择扩增产物最长的ZoorrnL_80F和ZoorrnL_400R引物组合，用COI引物扩增时选择mlCOlinF(5’-GGWACWGG WTGAACWGTWTAYCCYCC-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAARAAY CA-3’)。采用Invitrogen公司的Platinum Taq酶进行PCR扩增，扩增反应体系的体积为50μL，反应体系中包含以下物质：1μL的10μM的上述rrnL引物或COI引物；37.8μL的去离子水；5μL的10×PCR Hifi buffer；2μL的MgSO4(50mM)；1μL的dNTP Mix(10mM)；0.2μL的 Taq DNA polymerase；2μL的DNA template(待扩增的物种样本或环境样本DNA)。得到的PCR产物用浓度为1.5％的琼脂糖胶检测。结果表明：ZoorrnL_80F和ZoorrnL_400R引物对个体较小的轮虫有很好的扩增能力，从图3中可以看出，在部分样本中，仅rrnL引物能够扩增出条带(标“*”的样本)，说明rrnL引物比传统的COI引物有更高的扩增成功率；从图4中可以看出，在个体较大的枝角、桡足类中，ZoorrnL_80F和ZoorrnL_400R引物和传统的COI引物的扩增成功率相当，但是rrnL引物的扩增条带明亮均一，没有出现明显的弥散、拖尾，而传统的COI引物扩增条带则有明显的弥散、拖尾，说明rrnL引物有更好的特异性。
实施例3
用浮游动物网(160μm孔径)过滤30L湖水，将湖水浓缩至50mL后用孔径为50μm的滤膜过滤，除去水分，按照The E.Z.N.A.Water DNA Kit(OMEGA,CHINA)试剂盒标准操作提取滤膜DNA，用实例2中的rrnL引物和试剂对滤膜DNA进行PCR扩增。PCR扩增产物用MinEluteGel Extraction Kit(Qiagen,USA)试剂盒进行割胶回收，用QubitTM dsDNA HS Assay Kits进行定量，纯化后的PCR产物用Bioanalyser 2100(Agilent Technologies,USA)进行片段大小分析分析结果如图5所示。从图中可以看出，用ZoorrnL_80F和ZoorrnL_400R组合的引物扩增环境DNA会出现不同的片段大小，大小分布在321bp到401bp之间，符合多物种共扩增的结果，显示rrnL通用引物对环境样品有很好的扩增能力，可以用于环境生物多样性等研究中。
实施例4
采用Ion Torrent PGM测序仪对实例3中的环境样品PCR产物进行高通量测序，测序前用测序仪专用的试剂盒Ion XpressTM Plus Region Library Kit(LifeTechnologies,USA)构建测序 文库，用Ion PGM Sequencing 400Kit测序试剂盒按照标准仪器操作选用318v2芯片进行测序，测序的结果见图6(其中内插的小图为Ion PGM 318V2测序芯片中有效序列的分布情况)。本次测序共获得3.4M的有效reads数，大部分片段大小都在320bp到390bp之间，和实例3中片段分布结果一致，说明大部分片段已经测通。
测序结果以Fastq格式输出，在基于Ubuntu系统的QIIME软件平台上进行序列前处理(代码如下)，过滤测序质量值低、序列长度短于200bp的序列，依据相应的Barcode(测序建库时加上的，属于测序试剂盒自带试剂)将测序结果按照不同的样品分类，分类后的序列分别用UCHIME软件除去嵌合子序列，然后用USEARCH软件根据序列间的相似性进行OTU分型，提取每个OTU的代表序列并进行BLAST注释，筛选BLAST序列相似性大于等于97％的序列，最终确定物种信息和进行物种多样性的分析，本实例表明rrnL通用引物能很好用于高通量测序分析。
本领域普通技术人员根据前面的描述已经能再现，也都知晓了作用原理，为了更加的便于对本专利感兴趣的人员更快的掌握本发明的操作，将以上操作涉及的公知代码列明如下：
1)序列前处理：
fastx_reverse_complement-i XXX.fastq-o XXX.rc.fastq-Q33
2)依据barcode分类：
split_libraries.py-m map-f*.fasta-q*.qual-s 20-w 50-z truncate_only-llow_length-H highlength-b variable_length–H 8–M 3–e 2-o split_lib1
3)除去嵌合子：
identity_chimeric_seq.py-m usearch61-i total_length_filter.fasta--suppress_usearch61_ref-o usearch61_chimer_checking/
3)OTU分型：
pick_otus.py-i total.fasta-m usearch--db_filepath＝/home/bio/gold.fa-o usearch_otus_0.97--word_length 64--minsize 20-s 0.97
pick_rep_set.py-i usearch_otus/total_otus.txt-f total.fasta-ousearch_otus/rep_set.fasta
make_otu_table.py-i usearch_otus/total_otus.txt-o otu_table.biom
4)BLAST注释OTU：
blastn–query test.txt–db database–out ouput.txt
5)物种多样性分析：
alpha_rarefaction.py-i usearch_otus/otu_table.biom-m yangjh_COI_map.txt-o usearch_otus/alpha_deversity-p alpha_params.txt-t usearch_otus/rep_set.tre-n 20-aO 6-f
beta_diversity_through_plots.py-i usearch_otus/otu_table.biom-myangjh_COI_map.txt-o usearch_otus/beta_deversity-f-t usearch_otus/rep_set.tre。

Claims (4)

1.浮游动物rrnL基因扩增引物，其特征在于：包括5条上游引物和4条下游引物，所述的5条上游引物分别为ZoorrnL_80F1：GACTGTGCTAAGGTAGCATAAT、ZoorrnL_80F2：GACTGTGCTAAGGTAGCGTGAT、ZoorrnL_200F1：GACGATAAGACCCTATGAAGCT、ZoorrnL_200F2：GACGATCAGACCCTTTGGAGCT、ZoorrnL_200F3：GACGAGAAGACCCCA TAAAACT；所述的4条下游引物分别为ZoorrnL_320R1：GCTGTTATCCCTAGGG TAACTT、ZoorrnL_320R2：CCTGTTATCCCCAAAGTAGCTT、ZoorrnL_400R1：TAATCCAACATCGAG GTCGCA、ZoorrnL_400R2：TAATCCAACATCGAGGT AGTA。
2.权利要求1所述的浮游动物rrnL基因扩增引物的应用方法，其步骤为：
(1)将权利要求1中所述的上游引物ZoorrnL_80F1和ZoorrnL_80F2按照摩尔比2:1的比例混合为ZoorrnL_80F，上游引物ZoorrnL_200F1、ZoorrnL_200F2和ZoorrnL_200F3按照等摩尔混合为ZoorrnL_200F，下游引物ZoorrnL_320R1和ZoorrnL_320R2按照摩尔比2:1的比例混合为ZoorrnL_320R，ZoorrnL_400R1和ZoorrnL_400R2按照摩尔比2:1的比例混合为ZoorrnL_400R；
(2)将步骤(1)中得到的ZoorrnL_80F、ZoorrnL_200F、ZoorrnL_320R和ZoorrnL_400R分别置于55℃条件下PCR反应退火；
(3)将步骤(2)中ZoorrnL_80F、ZoorrnL_200F、ZoorrnL_320R和ZoorrnL_400R两两组合进行PCR扩增得到长度为190bp至390bp的PCR产物；
(4)将步骤(3)中得到的PCR产物进行高通量测序，依据序列差异进行物种鉴定和生物多样性分析。
3.根据权利要求2所述的浮游动物rrnL基因扩增引物的应用方法，其特征在于：所述的步骤(3)中PCR扩增时采用的是Touchdown反应程序。
4.权利要求1所述的浮游动物rrnL基因扩增引物在浮游动物物种鉴定和生物多样性分析中的应用。
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