CN101215606A - 分析浮游生物群落dna多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分析浮游生物群落DNA多态性的方法，其步骤是：A.样品采集；B.浮游生物群落DNA提取；C.随机扩增多态性DNA分析；D.浮游生物群落核糖体RNA基因的PCR扩增及变性梯度凝胶电泳分析；E.利用Quantity One软件对图谱进行定性、定量分析，计算各样点浮游生物群落DNA多态性的相似性。本发明具有技术路线程序化、比较分析规范化的特点，并且操作简便，能够快速、有效地对多个样品平行进行分析。因此，克服了人为因素的影响、增强了不同时空研究间的可比性，这能为探求生态学机理提供可靠的前提。

Description

分析浮游生物群落DNA多态性的方法

技术领域

本发明涉及宏基因组领域微生物群落结构研究，更具体涉及一种分析浮游生物群落DNA多态性的方法，即通过RAPD、PCR-DGGE分析浮游生物群落DNA多态性以反映其群落结构及其时空变化。

背景技术

生物多样性是生物及其与环境所组成系统的多样性和变异性，它本质上是一种具有多重价值、高度综合的资源形式，是人类生存和社会发展的物质基础。它在维持生态系统稳定、提高生态系统生产力、实现生态系统可持续发展等方面均起着重要的作用。因此，自人类文明以来生物多样性就被广泛关注与研究。其中以形态分类为基础的物种多样性研究是最早涉及的，可追溯至列文虎克。现已定名或描述的物种约140万(或170万)种，而这与地球上可能存在的物种数相比，还只是很少的一部分。遗传多样性作为生物多样性的基础，同样也受到了广泛的关注，尤其是在个体和种群层面(即狭义的遗传多样性)。生物多样性的各层次间是相互依赖的有机体，对高层次结构与功能的认识需要以对低层次结构的了解为前提。因此，对生态系统多样性的全面认识是以物种及遗传多样性为基础的。

随着分子生物学和分子生态学的快速发展，分子技术在分类学和生态学研究中逐渐开始担当起重要角色，并有可能成为跨越形态鉴定而连接群落遗传结构与物种构成的桥梁。近20年来，群落层面遗传多样性(即广义的遗传多样性)的研究取得了重要进展。其中，1998年宏基因组(metagenome)概念的提出是一个重要的里程碑。通过宏基因组技术直接对环境样品的研究使我们逐渐认识到环境中存在着众多“新的”微生物，它们不论是在数量上还是在种类上都使得那些可培养的微生物相形见绌。很显然，那些现有技术无法培养生物的生态功能是相当重要的，但它们的不可培养性极大地制约了我们对生态规律的认识。宏基因组学(Metagenomics)的发展突破了这一制约而使得通过现代分子生物学直接对自然群落的研究成为可能。事实上，特定物种基因组研究实现了从单一基因到基因集合认识的转变，宏基因组研究则摆脱了物种的界限，它包含了远比那些可培养类群更海量的信息。这为研究复杂微生物群落及其功能提供了很好的策略，进而有可能揭示更高、更复杂层次生命系统运行的内在规律。

随机引物扩增多态性DNA(RAPD)由于操作简便、可供选择的引物多、且不需预知模板序列信息，已被广泛应用于遗传多样性研究。变性梯度凝胶电泳(DGGE)作为指纹分析技术的重要代表，自1993年被应用到细菌多样性研究以来，它在生物多样性和系统进化研究中备受青睐，尤其是在原核微生物群落研究方面，关于真核微生物群落方面的报道相对较少。而浮游生物作为悬浮于水中的微小生物，其数量大、分布广、种类组成复杂，是生物多样性的重要组成部分，同时也由于它在水体生态系统中司重要的生态功能而被普遍认为是水环境监测的重要生物类群。但由于其个体小、形态分类特征不明显这一瓶颈制约大大限制了人类对它们的认识，有些甚至还无法通过形态来鉴定。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种分析浮游生物群落DNA多态性的方法，方法易行，操作简便，能够快速，有效地对多个样品平行进行分析，该方法不受形态分类的瓶颈制约，利用RAPD、PCR-DGGE技术直接对浮游生物群落DNA(宏基因组)进行分析。以浮游生物群落总DNA指纹结构表征生物群落组成，使不同时空间研究数据处理方便快捷且便于进行比较分析，有效地提高了工作效率。

本发明通过以下技术方案实现，其具体步骤是：

1.样品采集

用有机玻璃采水器(中科院水生生物研究所玻璃仪器厂)分别采集等体积的表、底层水混合，水样经充分混匀后用GF/C滤膜(Whatman，英国)过滤0.2-0.5L水样。

2.浮游生物群落DNA提取

将过滤后的GF/C滤膜在无菌的条件下剪碎(约1×1mm碎片)，并浸没于装有3mL裂解缓冲液(0.5％SDS，10mM Tris-Cl，100mM EDTA，0.1mg/mL蛋白酶K)的离心管中，55℃水浴裂解10h。10000r/min离心5min(20℃)后将上清转入一新的离心管，同样条件下再次离心取上清经等体积的酚→酚∶氯仿(1∶1)→氯仿三次抽提后用预冷的无水乙醇(含0.3M的NaCl)于-20℃沉淀3h。13000r/min离心10min(-4℃)后去上清并用70％的乙醇清洗3次，每次清洗完于13000r/min离心10min(-4℃)、弃上清，自然干燥后加入20-50μLTE溶解，DNA存于-20℃备用。

3.随机扩增多态性DNA(RAPD)分析，其特点如下：

首先对PCR反应体系中的DNA、Mg²⁺、dNTP、Taq酶及引物浓度和循环参数进行优化，进而用优化好的条件从2-5组随机引物(每组20条)筛选出扩增结果稳定、谱带清晰、多态性好的7-10条随机引物对浮游生物群落总DNA进行PCR扩增。在25μL体系中包含约50-100ng DNA，1×Buffer，2mM Mg²⁺，80μMdNTP，0.8μM 10个碱基长度的随机引物，1.5U Taq酶，混匀后稍离心将反应液集中于管底进行以下扩增：94℃预变性5min，后接45个循环(每个循环依次包含94℃45s，36℃60s，72℃120s)，最后于72℃延伸5min，反应终止于4℃。PCR产物(7-10μL)用1.4％-2.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)进行电泳分离、UVP成像分析系统拍照。

4.浮游生物群落核糖体RNA基因(rDNA)的PCR扩增及变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，其特点如下：

分别采用针对16S rDNA的引物(正向引物P1：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物P2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和18S rDNA的引物(正向引物P3：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3’；反向引物P4：5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’)对浮游生物群落DNA进行PCR扩增。50μL体系中含有约40-100ng DNA，1×PCRBuffer，2mM Mg²⁺，80μM dNTP，3.0U Taq酶，正、反向引物各0.3μM。反应物混匀后稍离心将反应液集中于管底进行如下扩增：94℃变性5min后进行递减(touchdown)PCR，每个循环94℃变性30s，退火30s(P1+P2引物：67℃-58℃10个递减循环，然后于57℃进行20个循环；P3+P4引物：69℃-60℃10个递减循环，然后于59℃进行18个循环)，72℃延伸60s，最后于72℃延伸10min，反应终止于4℃。通过1.4％-2.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)电泳确认目的片段并确定后续变性梯度凝胶电泳(DGGE)的上样量(15-30μL)。等量的PCR产物用9％的丙稀酰胺通过INGENYphorU-2系统进行变性梯度凝胶电泳，变性剂梯度范围为40％-60％。60℃恒定温度以50-60mA的恒定电流电泳12-16h，经1×SYBRGold染色后用UVP成像分析系统拍照。

5.利用Quantity One软件对图谱进行定性、定量分析RAPD/DGGE指纹图谱通过凝胶专业分析软件Quantity One(Bio-Rad，美国)进行定性(谱带的有、无分别记为1、0)和定量分析(各谱带光密度值所代表分类单元(OTU)的生物量)。进而对不同时空样品浮游生物群落DNA多态性进行对比分析，获得不同环境条件浮游生物群落DNA指纹结构的相似性矩阵。本发明与基于形态分类方法对浮游生物群落的研究相比，具有技术路线程序化、比较分析规范化的特点，并且操作简便，克服了形态分类特征不明显的瓶颈制约。而且能够快速、有效地平行分析多个样品浮游生物群落DNA指纹结构。因此，克服了人为因素的影响、增强了不同时空尺度研究之间的可比性，这不但可大大加深人类对其多样性的认识，还将有可能使我们从分子角度解读生态系统的结构和功能，为探求生态学机理提供可靠前提。

附图说明

图1为一种分析浮游生物种群DNA多态性的方法的流程示意图从所采集的水样中提取浮游生物群落总DNA，进而分别通过RAPD和PCR-DGGE方法进行指纹分析，获得的DNA指纹图谱通过凝胶专业分析软件Quantity One对谱带的有、无和谱带的光密度值进行定性、定量分析。

图2为浮游生物群落经随机引物OPG-19(5’-GTCAGGGCAA-3’)扩增后的琼脂糖凝胶电泳图谱。M-分子量Marker，1-红旗渡口，2-哨口，3-松原，4-肇源，5-哈尔滨，6-佳木斯。

图3为基于RAPD指纹图谱相似性的UPGMA聚类结果。

图4为生态模拟箱浮游生物群落PCR-DGGE指纹图谱。(a)16S rDNA指纹图谱；(b)18S rDNA指纹图谱。1，2，3，4分别指经4个不同处理的生态模拟试验箱。

图5为基于PCR-DGGE指纹图谱相似性的UPGMA聚类结果。(a)基于16SrDNA指纹图谱；(b)基于18S rDNA指纹图谱。1，2，3，4分别指经4个不同处理的生态模拟试验箱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

1.样品采集A

用有机玻璃采水器分别从松花江6个样点(红旗渡口、哨口、松原，肇源、哈尔滨、佳木斯)采集等体积的表、底层水混合，水样经充分混匀后用GF/C滤膜过滤500mL水样。

2.浮游生物群落DNA提取B

将过滤后的GF/C滤膜在无菌的条件下剪碎(约1×1mm碎片)，并浸没于装有3mL裂解缓冲液(0.5％SDS，10mM Tris-Cl，100mM EDTA，0.1mg/mL蛋白酶K)的离心管中，55℃水浴裂解10h。10000r/min离心5min(20℃)后将上清转入一新的离心管，同样条件下再次离心取上清经等体积的酚→酚∶氯仿(1∶1)→氯仿三次抽提后用预冷的无水乙醇(含0.3M的NaCl)于-20℃沉淀3h。13000r/min离心10min(-4℃)后去上清并用70％的乙醇清洗3次，每次清洗完于13000r/min离心10min(-4℃)、弃上清，自然干燥后加入30μLTE溶解，DNA存于-20℃备用。

3.随机扩增多态性DNA(RAPD)分析C

首先对PCR反应体系中的DNA、Mg²⁺、dNTP、Taq酶及引物浓度和循环参数(退火温度、循环数、各温度持续时间)进行优化，进而用优化好的条件从两组随机引物(40条)中筛选出扩增结果稳定、谱带清晰、多态性好的8条随机引物(碱基序列如表1所示)对浮游生物群落DNA进行PCR扩增。25μL体系中包含约50ng DNA，1×Buffer，2mM Mg²⁺，80μM dNTP，0.8μM引物，1.5UTaq酶，混匀后稍离心将反应液集中于管底进行以下扩增：94℃预变性5min，后接45个循环(每个循环依次包含94℃ 45s，36℃ 60s，72℃ 120s)，最后于72℃延伸5min。用1.8％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)进行电泳分离、UVP成像分析系统获得如图2所示的图谱。

4.利用Quantity One软件对RAPD图谱进行定性分析D

通过Quantity One软件对各随机引物的电泳图谱谱带的有、无(分别记为1、0)进行定性分析，计算得浮游生物群落DNA指纹图谱的Dice相似性(表2)，进而采用UPGMA法对相似系数矩阵进行聚类分析。结果显示哨口、哈尔滨和红旗渡口的最先聚在一起(图3)，表示其浮游生物群落比较相似；而肇源和佳木斯比较相近，松原与其它样点的差异较大。

表1筛选出的随机引物及其碱基序列

随机引物	碱基序列(5’-3’)	随机引物	碱基序列(5’-3’)
				OPM-03OPM-04OPM-07OPM-13	GGGGGATGAGGGCGGTTGTCCCGTGACTCAGGTGGTCAAG	OPG-02OPG-06OPG-14OPG-19	GGCACTGAGGGTGCCTAACCGGATGAGACCGTCAGGGCAA

表2基于浮游生物群落RAPD指纹图谱的相似性比较

	红旗渡口	哨口	松原	肇源	哈尔滨	佳木斯
							红旗渡口哨口松原肇源哈尔滨佳木斯	100.046.330.342.547.443.2	100.027.038.647.631.7	100.016.723.530.3	100.046.342.5	100.036.8	100.0

实施例2

1.样品采集A

用有机玻璃采水器分别从室内4个生态模拟箱(1×1×1m)采集等体积的表、底层水混合，水样经充分混匀后用GF/C滤膜过滤250mL水样。

2.浮游生物群落DNA提取B

将过滤后的GF/C滤膜在无菌的条件下剪碎(约1×1mm碎片)，并浸没于装有3mL裂解缓冲液(0.5％SDS，10mM Tris-Cl，100mM EDTA，0.1mg/mL蛋白酶K)的离心管中，55℃水浴裂解10h。10000r/min离心5min(20℃)后将上清转入一新的离心管，同样条件下再次离心取上清经等体积的酚→酚∶氯仿(1∶1)→氯仿三次抽提后用预冷的无水乙醇(含0.3M的NaCl)于-20℃沉淀3h。13000r/min离心10min(-4℃)后去上清并用70％的乙醇清洗3次，每次清洗完于13000r/min离心10min(-4℃)、弃上清，自然干燥后加入40μLTE溶解，DNA存于-20℃备用。

3.浮游生物群落PCR-DGGE指纹分析C

分别采用针对16SrDNA的引物(正向引物P1：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物P2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和18S rDNA的引物(正向引物P3：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3’；反向引物P4：5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’)进行PCR扩增。在50μL反应体系中含有约40ng DNA，1×PCR Buffer，2mM Mg²⁺，80μM dNTP，3.0U Taq酶，正、反向引物各0.3μM。反应物混匀后稍离心将反应液集中于管底进行如下扩增：94℃变性5min后进行递减(touchdown)PCR，每个循环94℃变性30s，退火30s(P1+P2引物：67℃-58℃10个递减循环，然后于57℃进行20个循环；P3+P4引物：69℃-60℃10个递减循环，然后于59℃进行18个循环)，72℃延伸60s，最后于72℃延伸10min，反应终止于4℃。经1.5％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)电泳确认目的片段和后续变性梯度凝胶电泳(DGGE)的上样量后进行变性剂梯度为40％-60％的DGGE，在1×TAE缓冲液中以50mA的恒定电流电泳14h(60℃)，经1×SYBR Gold染色后用UVP成像分析系统拍照获得DGGE指纹图谱(图4)。

4.利用Quantity One软件对DGGE图谱进行定量分析D

DGGE指纹图谱通过凝胶专业分析软件Quantity One(Bio-Rad，美国)通过以下公式计算指纹图谱的相似性，获得如表3所示的浮游生物群落DNA指纹结构相似性矩阵。

$S_i=200\×\frac{\underset{i=1}{\overset{B}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{Min}\left(S_{i,}{t}_i\right)}{\underset{i=1}{\overset{B}{\mathrm{\Σ}}}(S_i+t_i)}$

其中S，T代表泳道，B表示带型数，s_i，t_i表示泳道带型i的光密度值，无该条带则赋值为0。进而采用UPGMA法对相似系数矩阵进行聚类分析，结果显示2和3都是最先聚在一起，而1和4在16Sr DNA和18Sr DNA图谱的聚类中存在一定的差异(图5)，表明试验箱2和3中的浮游生物群落结构比较相似，试验箱1中的原核性浮游生物(通过16S rDNA来反映)与其它箱的差异较大，而试验箱4中的真核性浮游生物(通过18S rDNA来反映)与其它箱的差异较大。

表3基于浮游生物群落16S rDNA(上三角)、

18 SrDNA DGGE指纹图谱(下三角)的相似性比较

	1	2	3	4
					1234	100.045.742.024.5	24.4100.064.831.9	39.378.4100.039.1	22.860.649.3100.0

Claims (1)

1.一种分析浮游生物群落DNA多态性的方法，其步骤是：

A、样品采集：

用有机玻璃采水器分别采集等体积的表、底层水混合，水样混匀后用GF/C滤膜过滤0.2-0.5L水样；

B、浮游生物群落DNA提取：

将过滤后的GF/C滤膜在无菌的条件下剪碎，并浸没于装有3mL裂解缓冲液的离心管中，裂解缓冲液成分为0.5％SDS，10mM Tris-Cl，100mM EDTA及0.1mg/mL蛋白酶K；55℃水浴裂解10h，10000r/min离心5min后将上清转入一新的离心管，再次离心取上清经等体积的酚→酚∶氯仿(1∶1)→氯仿三次抽提后用预冷的无水乙醇于-20℃沉淀3h，13000r/min离心10min后去上清并用70％的乙醇清洗3次，每次清洗完于13000r/min离心10min、弃上清，干燥后加入20-50μL TE溶解，DNA存于-20℃备用；

C、随机扩增多态性DNA分析：

首先对PCR反应体系中的DNA、Mg²⁺、dNTP、Taq酶及引物浓度和循环参数进行优化，其次是从2-5组随机引物筛选出扩增结果稳定、谱带清晰、多态性好的7-10条随机引物对浮游生物群落DNA进行PCR扩增；在25μL体系中包含50-100ng DNA，1×Buffer，2mM Mg²⁺，80μM dNTP，0.8μM 10个碱基长度的随机引物，1.5U Taq酶，混匀后离心将反应液集中于管底进行以下扩增：94℃预变性5min，后接45个循环，最后于72℃延伸5min，反应终止于4℃，PCR产物用1.4％-2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分离、UVP成像分析系统拍照；

D、浮游生物群落核糖体RNA基因的PCR扩增及变性梯度凝胶电泳分析：

分别采用针对16S rDNA的引物和18S rDNA的引物对浮游生物群落DNA进行PCR扩增，50μL体系中含有40-100ng DNA，1×PCRBuffer，2mM Mg²⁺，80μMdNTP，3.0U Taq酶，正、反向引物各0.3μM，反应物混匀后离心将反应液集中于管底进行如下扩增：94℃变性5min后进行递减PCR，每个循环94℃变性30s，低温退火30s，72℃延伸60s，最后于72℃延伸10min，反应终止于4℃，通过1.4％-2.0％琼脂糖凝胶电泳确认目的片段并确定后续变性梯度凝胶电泳的上样量，等量的PCR产物用9％的丙稀酰胺通过INGENYphorU-2系统进行变性梯度凝胶电泳，变性剂梯度范围为40％-60％，60℃恒定温度以50-60mA的恒定电流电泳12-16h，经1×SYBR Gold染色后用UVP成像分析系统拍照；

扩增16S rDNA的引物：

正向引物P1：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

反向引物P2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

扩增18S rDNA的引物：

正向引物P3：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3’；

反向引物P4：5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’；

E、利用Quantity One软件对图谱进行定性、定量分析：

RAPD/DGGE指纹图谱通过凝胶专业分析软件Quantity One进行定性和定量分析，进而对不同时空样品浮游生物群落DNA多态性进行对比分析，获得不同环境条件浮游生物群落DNA指纹结构的相似性矩阵。

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