CN111676279A - 一种空间转录组构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种空间转录组构建方法，首先，采用微区采样技术在样品的局部空间位置进行单细胞采样并进行转录组测序；然后，通过单细胞测序方法获得样品每个细胞的转录组信息；最后，根据临近细胞基因表达相似的特点，基于上述局部细胞空间位置的转录组测序数据，以它为参考系，利用转录组信息和空间位置信息的嵌入优化算法，构建样品中所有细胞的空间位置，从而获得整个组织的空间转录组信息；该方法不仅适用细胞质转录组数据，也适用细胞核转录组数据，能有效降低空间转录组的构建成本，本发明空间转录组构建方法可以广泛应用于空间细胞图谱绘制，从而为肿瘤微环境异质性分析、脑空间神经网络图谱构建等研究提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明提出一种利用组织样本细胞转录组信息构建单细胞空间位置和单细胞转录谱的方法，所属领域为单细胞空间组学分析领域，可应用于肿瘤微环境、神经网络识别等研究。
背景技术
组织中单细胞的空间位置信息和转录组信息，对于分析癌症微环境，构建神经网络回路等研究至关重要。但是目前单细胞分析方法在获取细胞转录组信息的同时，会丢失细胞的空间位置信息；而且，要求样本必须是新鲜样本，只能测定细胞质RNA分子。开发一种能既适用于细胞质量，也适用于细胞核转录组单细胞转录组分析方法，且同时获得组织中每个细胞的空间位置信息，将极大扩展我们对细胞相互作用、肿瘤微环境、神经回路分析的深度和广度。
有研究者试图通过在进行单细胞测序前，用寡核苷酸(barcode)标记细胞位置的策略，解决此问题。其关键思想是使用“地标基因”的表达信息，假定地标基因的表达在空间依次递增或者递减。通过其它基因表达水平和地标基因表达水平之间的关联，确定细胞的位置将空间坐标分配给测序细胞。此类方法在很大程度上依赖于用于地标基因的信息，不同组织中，地标基因是不同的，而且实验操作相对复杂。
特定组织中，细胞间作用(通讯网络)与细胞的空间位置密切相关，细胞的位置很大程度决定细胞能获得的营养物质、信号分子以及细胞间的物理接触。因此，一些特定基因的表达水平与细胞的位置有关，一般地，相邻细胞的基因表达水平具有一定的相似性。我们称此为临近相似原理。基于此原理，可以利用基因表达水平计算细胞的空间位置。
发明内容
本发明旨在提供一种可以更精确地确定组织中单细胞空间位置和转录组的方法和技术，可复原同一组织类型的细胞群体、细胞位置、基因表达等信息。
本发明涉及一种微区采样技术和一种基于“临近相似原理”的细胞位置分配算法。该方法不仅适用于细胞质基因表达数据，同时适用于细胞核基因表达数据。
本发明提出了基于微区采样确定少量细胞的空间位置作为参考，基于临近相似原理，从单细胞转录组数据，确定每个细胞空间位置的方法。优势在于，有参考位置，结果唯一确定，实验流程简单；可适用的样本范围广泛。本发明将提升单细胞空间组学的研究方法和技术。
本发明提出一种空间转录组构建方法，步骤如下：采用微区采样技术在样品的局部空间位置进行单细胞采样，并对采样细胞进行转录组测序；然后，通过单细胞测序方法获得整个样品中每个细胞的转录组信息；最后，根据临近细胞基因表达相似的特点，基于上述局部细胞空间位置的转录组测序数据，利用转录组信息和空间位置信息的嵌入优化算法，构建样品中所有细胞的空间位置，从而获得整个组织的空间转录组信息。
一种空间转录组构建方法，具体包括以下步骤：
（1）对样品形貌进行成像，确定组织轮廓；
（2）利用微区采样技术对局部区域单细胞进行采样，获取采样细胞的位置信息，并对采集样品进行转录组测序以获得该位置单细胞的转录组信息，并以它们作为位置信息和转录组参考点；
（3）利用单细胞测序技术对整个样品中每个细胞进行单细胞转录组测序，获取整个单细胞转录组信息；
（4）根据临近细胞基因表达相似的特点，以微区采样所获得的单细胞的转录组和位置信息作为参考点，计算样品单细胞测序获得的转录组之间的相似程度、单细胞测序获得的转录组与参考点转录组的相似程度，从而确定样品剩余单细胞与参考点之间的相对位置关系，获得所有细胞的转录组信息与对应的空间位置；
（5）构建样品的空间单细胞转录组信息并输出以及进行可视化展示。
进一步的，所述样品可以是冰冻组织切片、石蜡组织切片，也可以是一块组织，还可以是培养的细胞聚集体。
进一步的，所述步骤（1）对整个组织进行拍照，用线条将组织的轮廓描绘下来并将轮廓里（含轮廓）的位置信息提取出来。
进一步的，所述的微区采样方法可以是激光纤维切割方法（LDM），可以是基于微针的机械采样方法，还可以是基于微流控芯片的微区采样方法；采得的样品进行细胞质mRNA或者单核RNA测序。
进一步的，利用单细胞测序技术对微区采样之后样品的剩余细胞进行单细胞转录组测序，单细胞测序方法可以是基于液滴的单细胞测序方法，可以是基于微孔阵列的单细胞测序方法，可以是基于流式细胞仪分选的单细胞测序方法，还可以是基于微流控芯片的单细胞测序方法；所述的单细胞测序可以是单核RNA测序，也可以是单细胞细胞质mRNA测序。
进一步的，根据临近细胞基因表达相似的原理对基于部分细胞空间位置和所有细胞基因表达水平进行整个样品的空间转录组构建。
进一步的，单细胞空间位置计算过程为：从组织轮廓信息中确定拟分析的细胞总数；构建细胞位置信息和基因表达信息的成本矩阵；以均匀分布初始化细胞位置；基于临近相似原理，基于嵌入优化算法和最优运输算法，得到所有细胞单细胞分辨的空间位置；最后进行结果输出及可视化。
进一步的，构建方法可以对一个样品进行基于微区采样方法和单细胞测序方法相结合的空间转录组构建，也可以将一个样品划分为几个分区，对每个分区进行基于微区采样方法和单细胞测序方法相结合的空间转录组构建，然后再将分区拼装成为整个样品的空间转录组。
本发明技术方案如下：
1. 生物组织形貌轮廓构建
步骤包括：对组织切片拍照，对图像进行二值化处理，将组织图案内部颜色填充完整，形成组织轮廓；获取每个像素点的位置信息，该信息作为构建组织形貌轮廓框架。
2. 微区采样确定少量细胞位置
将采集细胞的位置信息与形貌轮廓框架对应。测定被采样细胞的基因表达数据，并将此基因表达数据作为还原组织的参考点。
3. 单细胞RNA测序
对组织切片上所有细胞进行单细胞RNA测序，获取单细胞转录组数据，数据作为基因表达矩阵，同时记录总的细胞个数和基因总数。识别高变基因。获取高变基因的表达数据。
4. 构建单细胞位置图谱
利用少量细胞的位置信息，以及所有细胞的表达数据，基于临近相似原理，计算所有细胞的位置信息，构建单细胞空间转录组，并可视化。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
1、本发明采用了单细胞微区采样和单细胞测序，因此可以真正实现单细胞水平的空间转录组测序；
2、本发明没有采用基于原位mRNA捕获的空间转录组测序，因此可以大大降低空间转录组测序的成本和操作复杂度，加快分析速度；
3、本发明适用于细胞质mRNA测序，也适用于单核RNA测序，从而可以适用于不同的样品形式如冰冻组织切片、石蜡组织切片、组织、培养的细胞聚集体等，应用范围广。
附图说明
图1为单细胞空间转录组构建流程图。
图2为成人心脏组织切片照片。
图3为成人心脏组织空间转录组构建结果图，基于成人心脏组织细胞质基因表达数据的单细胞空间转录组图谱；第一行从左到右依次为基因DPM1、CFH和FUCA2的空间表达，第二行从左到右依次为基因WASH9P、AC090498.1和FP565260.6的空间表达，即这些基因在每个细胞中的表达，每个细胞的位置为本发明计算获得的结果。
图4为小鼠海马组织空间转录组构建结果；基于小鼠海马体单核细胞细胞核基因表达数据的单细胞空间转录组图谱，第一行从左到右依次为基因Itm2a、 Sergef和Chil5的单细胞空间表达，第二行从左到右依次为基因4930455C13Rik、Reg4和Prss39的单细胞空间表达。
实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例1
构建成人心脏组织的空间位置图谱。
1.获得成人心脏组织切片图片
确定组织样本，挑选出轮廓清晰的组织样品进行拍照，生成组织切片图片（见图2）。
2.微区采样细胞
从组织切片中的不同区域中采取单个细胞，并对采样细胞进行单细胞RNA测序（即单细胞细胞质mRNA测序），记录采样点的基因表达数据和位置信息。
3.测定成人心脏组织的单细胞表达数据
利用单细胞RNA测序技术（即单细胞细胞质mRNA测序）测定成人心脏组织样本所有细胞的转录组数据，原始数据经过比对，获得每个细胞的所有基因的表达量。
4.数据预处理
表达数据提取原始基因表达数据，导入文件，生成一个二维矩阵，行和列分别代表基因和细胞。计算细胞总数和高变基因，高变基因用于计算细胞位置。
5.获得组织形貌轮廓
对组织切片图片进行二值化处理，截取整个组织轮廓，将轮廓提取放置于白板上，图片大小为800×600。用黑色将其中心填充，将所获取图片导入像素点提取算法，获取每个像素点的位置信息，该信息作为构建组织形貌轮廓。
6.参考系确定
从位置矩阵随机提取总细胞数的点集，点集之间的距离不得低于1微米，作为组织细胞整体框架。再将采样细胞的基因表达数据和位置信息录入，作为重建组织的参考系。
通过临近相似原理计算细胞位置，计算成本矩阵来准备构建细胞位置。首先，计算空间位置信息和基因表达信息上的最短路径矩阵。此步骤需要设定目标最近邻图的邻域数(该实验设定为5)和设置最短路径的阈值。然后，将最短路径矩阵进行归一化处理，得到空间位置信息和基因表达信息的成本矩阵。选择均匀分布作为位置构建起点，这意味着测序的细胞可能以相同的概率起源于每个组织部位。最后，基于临近相似原理构建和最优运输算法生成GW矩阵，GW矩阵是基于Gromov-Wasserstein度量空间之间距离的概念，合并未定距离矩阵或核矩阵的集合而形成的矩阵，这里的GW距离表示2个矩阵之间的差异性。通过该矩阵作用在基因表达矩阵上从而计算出每个细胞的坐标位置。
7.成人心脏组织空间转录组构建结果
图4为成人心脏组织空间转录组结果。将组织按照不同基因表达值从大到小填充颜色得到可视化的空间转录组图谱(见图3)。
实施例2
构建小鼠海马组织空间位置图谱。
1.获得小鼠海马组织切片图片
确定组织样本，挑选出轮廓清晰的组织样品进行拍照，生成组织切片图片。
2.微区采样细胞
从组织切片中的不同区域中采取细胞，并对采样细胞进行单核RNA测序，记录采样点的细胞核基因表达数据和位置信息。
3.测定小鼠海马组织的单细胞核基因表达数据
利用单核RNA测序技术测定小鼠海马组织样本所有细胞的细胞核单细胞转录组数据，原始数据经过比对，获得每个细胞核的所有基因的表达量。
4.数据预处理
表达数据提取原始基因表达数据，导入文件，生成一个二维矩阵，行和列分别代表基因和细胞。计算细胞总数和高变基因，高变基因用于计算细胞位置。
5.获得组织形貌轮廓
对组织切片图片进行二值化处理，截取整个组织轮廓，将轮廓提取放置于白板上，图片大小为800×600。用黑色将其中心填充，将所获取图片导入像素点提取算法，获取每个像素点的位置信息, 该信息作为构建组织形貌轮廓。
6.参考系确定
从位置矩阵随机提取总细胞数的点集，点集之间的距离不得低于1微米，作为组织细胞整体框架。再将采样细胞的基因表达数据和位置信息录入，作为重建组织的参考系。
通过临近相似原理计算细胞位置，计算成本矩阵来准备构建细胞位置。首先，计算空间位置信息和基因表达信息上的最短路径矩阵。此步骤需要设定目标最近邻图的邻域数(该实验设定为5)和设置最短路径的阈值。然后，将最短路径矩阵进行归一化处理，得到空间位置信息和基因表达信息的成本矩阵。选择均匀分布作为位置构建起点，这意味着测序的细胞可能以相同的概率起源于每个组织部位。最后，基于临近相似原理构建和最优运输算法生成GW矩阵，GW矩阵是基于Gromov-Wasserstein度量空间之间距离的概念，合并未定距离矩阵或核矩阵的集合而形成的矩阵，这里的GW距离表示2个矩阵之间的差异性。通过该矩阵作用在基因表达矩阵上从而计算出每个细胞的坐标位置。
7.小鼠组织空间转录组构建结果
图4为小鼠海马组织空间转录组结果。将组织按照不同基因表达值从大到小填充颜色得到可视化的空间转录组图谱(见图4)。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种空间转录组构建方法，其特征在于，步骤如下：通过微区采样方法对样品的局部空间位置进行单细胞采样，并对采样细胞进行转录组测序；然后，通过单细胞测序方法获得整个样品中每个细胞的转录组信息；最后，以局部细胞空间位置的转录组测序数据作为参考系，通过转录组信息和空间位置信息的嵌入优化算法，构建样品中所有细胞的空间位置，从而获得整个组织的空间转录组信息。
2.根据权利要求1所述的一种空间转录组构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对样品形貌进行成像，确定组织轮廓；
（2）通过微区采样方法对局部区域单细胞进行采样，获取采样细胞的位置信息，并对采集样品进行转录组测序以获得该位置单细胞的转录组信息，并作为位置信息和转录组参考点；
（3）通过单细胞测序方法对整个样品中每个细胞进行单细胞转录组测序，获取整个单细胞转录组信息；
（4）用微区采样方法所获得的单细胞的转录组和位置信息作为参考点，计算样品单细胞测序获得的转录组之间的相似程度、单细胞测序获得的转录组与参考点转录组的相似程度，从而确定样品中剩余单细胞与参考点之间的相对位置关系，获得所有细胞的转录组信息与对应的空间位置；
（5）构建样品的空间单细胞转录组信息并输出，进行可视化展示。
3.根据权利要求2所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中样品为冰冻组织切片、石蜡组织切片、组织、培养的细胞聚集体中任意一种。
4.根据权利要求2所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中微区采样方法为激光纤维切割方法、基于微针的机械采样方法、基于微流控芯片的采样方法中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中微区采样方法为对采集的样品进行单细胞细胞质mRNA或单核RNA测序。
6.根据权利要求2所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中单细胞测序方法为基于液滴的单细胞测序方法、基于微孔阵列的单细胞测序方法、基于流式细胞仪分选的单细胞测序方法、基于微流控芯片的单细胞测序方法中任意一种。
7.根据权利要求6所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中单细胞测序方法为对单细胞进行单核RNA测序或单细胞细胞质mRNA测序。
8.根据权利要求2所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述步骤（4）中单细胞空间位置计算的步骤如下：从组织轮廓信息中确定拟分析的细胞总数；构建细胞位置信息和转录组信息的成本矩阵，均匀分布初始化细胞位置；通过基于嵌入优化算法和最优运输算法，得到所有细胞单细胞分辨的空间位置；最后进行结果输出及可视化。
9.根据权利要求1或2所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述构建方法的步骤如下：通过微区采样方法和单细胞测序方法对一个样品进行空间转录组构建。
10.根据权利要求1或2所述的空间转录组构建方法，其特征在于：所述构建方法的步骤如下：将一个样品划分为几个分区，通过微区采样方法和单细胞测序方法对每个分区进行空间转录组构建，然后再将分区拼装成为整个样品的空间转录组。
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