CN110354268A - 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用 - Google Patents

一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110354268A
CN110354268A CN201811638574.6A CN201811638574A CN110354268A CN 110354268 A CN110354268 A CN 110354268A CN 201811638574 A CN201811638574 A CN 201811638574A CN 110354268 A CN110354268 A CN 110354268A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
drug
annular
divalent
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811638574.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110354268B (zh
Inventor
赵子龙
周芳
王鹏
张朋歌
谭蔚泓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan University
Original Assignee
Hunan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan University filed Critical Hunan University
Priority to CN201811638574.6A priority Critical patent/CN110354268B/zh
Publication of CN110354268A publication Critical patent/CN110354268A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110354268B publication Critical patent/CN110354268B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明的目的是公开一种一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体‑药物的偶联系统与应用，包括如下的核苷酸序列：X‑GCTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC其中：X不存在(SEQ ID NO：1)，或者为TGACTGATTTACG(SEQ ID NO：2)、CGTAAATCAGTCA(SEQ ID NO：3)序列中的一种。本发明的核酸适配体对多种癌细胞具有很好的亲和力，其通过修饰后，可与多种抗癌药物结合，使药物具有靶向性，从而提高药物的利用率，而且修饰后连接药物的单体还可制备成核酸适体‑药物偶联物系统，使其负载多种药物，通过药物之间的协同增效作用，进一步提高药效本发明中环形二价核酸适体‑药物偶联物系统合成简单高效，不需要经过复杂的反应，为多药联合治疗提供了一种新方法。

Description

一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统 与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用。
背景技术
化疗目前仍然恶性肿瘤治疗的主要手段。然而，恶性肿瘤的发生发展、侵袭、转移与多种信号通路的改变有关。由于通路冗余，当一条信号通路被阻断时，肿瘤细胞仍可通过其他通路或开启另一条替代性通路，维持生长。因此，针对恶性肿瘤细胞单一信号通路的单药治疗的效果有限并且容易诱导肿瘤细胞产生耐药性。与单药治疗相比，针对肿瘤细胞发生发展相关的多种信号通路的药物联合治疗能有效降低单个药物的剂量，通过协同作用提高治疗效果，并克服耐药性机制。目前，药物联合治疗已经成为一种个性化癌症治疗新策略。
然而，由于在精准调控药物比率、协调药物药代动力学及生物分布、靶向肿瘤细胞投递确定计量比的药物等方面仍存在极大挑战，传统的药物联合治疗策略难以取得最佳治疗效果。为解决这些问题，多种基于纳米颗粒包裹的药物联合治疗策略相继被开发。这些策略能有效的协调多种药物药代动力学及生物分布。但是基于物理包裹，药物分子在投递过程中容易从纳米颗粒泄漏，这些策略很难控制药物计量比。最近，Jonoson等人通过共价键将聚合物与药物连接，构建了三种不同聚合物-药物单体，然后通过调整单体比率，构建了一种药物比率可调的药物联合治疗策略，有效解决了物理包埋易导致药物泄露的难题。然而，该策略中药物组成和比例的准确控制仍难以实现，这在药物开发中非常重要。
核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的一条能特异性识别靶标的寡聚核苷酸(DNA/RNA)，为恶性肿瘤细胞识别提供了高亲和力特异性识别的分子识别工具。目前，已有一些恶性肿瘤细胞的核酸适体相继被报道，但是目前核酸适配体的种类较少，而且其与抗癌药物缀合之前都需要对特定的碱基进行化学修饰，可用于化学修饰的基团，目前种类也比较少，因而开发新的核酸适配体，实现癌症药物的精准、靶向释放，对恶性肿瘤药物联合治疗有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可实现癌症药物精准、靶向释放的核酸适配体及其核酸适配体-药物的偶联系统与应用。
本发明这种核酸适配体XQ-2d，包括如下的核苷酸序列：
X-GCTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC
其中：X不存在(SEQ ID NO：1)，或者为TGACTGATTTACG(SEQ ID NO：2)、CGTAAATCAGTCA(SEQ ID NO：3)序列中的一种。
对所述的核酸适配体的碱基进行修饰，修饰1-3个二苯并环辛炔官能团(DBCO)。
一种环形二价核酸适配体-药物的偶联系统的制备方法，包括以下步骤：
1)药物的叠氮化：将药物在溶解于溶剂中，然后加入叠氮-PEG3-羧基，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲基氨基吡啶，在氮气保护下，进行反应，反应完毕后，过柱分离得到叠氮-药物。
2)核酸适配体的修饰：通过固相合成仪在XQ-2d上修饰二苯并环辛炔官能团，得到DBCO-核酸适配体；
3)核酸适体-药物偶联物单体的制备：将步骤1)中的叠氮-药物与DBCO-核酸适配体置于含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲体系，进行反应，反应完毕后，通过高效液相色谱纯化后，冷冻干燥法进行浓缩，得到核酸适体-药物偶联物单体；
4)将步骤3)中的2种连接不同药物核酸适体-药物偶联物单体溶解于DNA连接酶缓冲液，加入DNA连接酶进行反应，得到环形二价核酸适体-药物偶联系统。
所述步骤1)中的药物为喜树碱(Camptothecin)，紫杉醇(Paclitaxel)，康普立停A-4(Combretastatin A4)和达沙替尼(Dasatinib)中的一种或多种；溶剂为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种；药物与溶剂的质量体积比为(50～86):10mg/mL；药物、叠氮-PEG3-羧基，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲基氨基吡啶的质量比为(50～86):(25～86):(38～71):(24～45)；反应时间为7～9h。
所述步骤2)中，核酸适配体上修饰的二苯并环辛炔官能团的个数为1～3个。
所述步骤3)中，所述的磷酸盐缓冲体系中DBCO-核酸适配体的浓度为0.5～1.5OD，叠氮-药物浓度为0.5～1.5mM，二甲基亚砜占总体积的8～12％；反应时间为7～9h，反应温度为25～40℃；所述的核酸适体-药物偶联物单体应保存于-20℃下。
所述步骤4)中，核酸适体-药物偶联物单体在DNA连接酶缓冲液中的浓度为3～7uM，DNA连接酶缓冲液由66mM Tris-HCl，pH 7.6，6.6mM MgCl 2,10mM DTT和0.1mM ATP组成，DNA连接酶的加入量15-20U/μL。根据所述的制备方法制备得到核酸适体-药物偶联物单体(ApDC)。
根据所述的制备方法制备得到环形二价核酸适体-药物偶联系统(cb-ApDC)。
所述的核酸适体-药物偶联物单体和环形二价核酸适体-药物偶联系统在靶向治疗癌症中的应用。
本发明的有益效果：1)本发明的核酸适配体对多种癌细胞具有很好的亲和力，其通过修饰后，可与多种抗癌药物结合，使药物具有靶向性，从而提高药物的利用率，而且修饰后连接药物的单体还可制备成核酸适体-药物偶联物系统，使其负载多种药物，通过药物之间的协同增效作用，进一步提高药效。2)本发明中环形二价核酸适体-药物偶联物系统合成简单高效，不需要经过复杂的反应，为多药联合治疗提供了一种新方法。3)本发明中由于药物分子与细胞膜疏水性区域的相互作用，与未经任何修饰的核酸适体XQ-2d相比，缀合不同数量的药物分子后的核酸适体-药物偶联物单体具有更强的亲和能力，并降低了对二价金属离子的依赖性。4)与核酸适体-药物偶联物单体相比，环形二价核酸适体-药物偶联物具有好的稳定性，能有效抵抗血清中的核酸酶的降解，能增加药物分子对肿瘤细胞的亲和能力，降低对正常细胞的伤害，能增加了细胞对药物內吞，增加药物分子在肿瘤细胞中的富集。5)本发明中的环形二价核酸适体-药物偶联系统通过靶向作用进入肿瘤细胞后，溶酶体中的酯酶能有效引发环形二价核酸适体-药物偶联物连接酯键断裂，实现治疗效果。6)本发明中通过改变不同单体，环形二价核酸适体-药物偶联物能精准调控药物组合和药物比例，改变药物组成和比例，促进药物之间的协同作用，增加癌症治疗效果。
附图说明
图1实施例1中叠氮-药物合成路线图。
图2实施例3中核酸适体-药物偶联物单体(ApDC)高效液相色谱纯化图。
图3实施例3中核酸适体-紫杉醇(XQ-2d-PTX)偶联物单体药物释放分析。
图4实施例3中缀合不同紫杉醇分子的核酸适体偶联物单体在完全培养基中与K562细胞的结合能力分析；(a)核酸适体XQ-2d；(b)缀合一个紫杉醇分子的核酸适体-紫杉醇偶联物单体(XQ-2d-PTX)；(c)缀合两个紫杉醇分子的核酸适体-紫杉醇偶联物单体(XQ-2d-2PTX)；(d)缀合不同紫杉醇分子的核酸适体偶联物单体亲和力。
图5实施例3和对比例中不同核酸适体-药物偶联物单体、药物分子和不同对照核酸-药物偶联物单体对靶细胞DU145和非靶细胞HEK293的毒性分析。
图6实施例5中环形二价核酸适体-药物偶联物(cb-ApDC)合成示意图。
图7实施例6中不同药物比例的环形二价核酸适体-药物偶联物与K562细胞的亲和力分析。(a)cb-XQ-2d-CPT-PTX；(b)cb-XQ-2d-2CPT-PTX；(c)cb-XQ-2d-3CPT-PTX。
图8实施例6中环形二价核酸适体-药物偶联物和核酸适体-药物偶联物单体在10％血清中稳定性分析和降解速率分析。
图9实施例6中不同药物比例的环形二价核酸适体-药物偶联物对DU145细胞和HEK293细胞的毒性和联合指数分析。(a)不同cb-ApDC对DU145细胞和HEK293细胞的毒性分析；(b)不同cb-ApDC的IC50和联合指数统计。
图10实施例6中环形二价核酸适体-药物偶联物cb-XQ-2d-CPT-PTX在肿瘤细胞DU145和正常细胞HEK293中的內吞分析。
图11实施例6中环形二价核酸适体-药物偶联物cb-XQ-2d-CPT-PTX对靶细胞DU145的定位分析。
具体实施方式
实施例1叠氮-药物的制备
所述叠氮-药物的合成路线，如图1所示，具体包括以下几种叠氮-药物的合成。
叠氮-喜树碱的合成
将喜树碱(64mg，0.18mmol)，叠氮-PEG3-羧基(86mg，0.37mmol)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，71mg，0.37mmol)和4-二甲基氨基吡啶的混合物(DMAP，45mg，0.37mmol)的DCM(10mL)溶液在室温下在N2下搅拌过夜。然后将反应混合物真空浓缩，产物经快速色谱纯化，得到黄色固体，得到叠氮-喜树碱(CPT)。
叠氮-紫杉醇的合成
将紫杉醇(86mg)，叠氮-PEG3-羧基(25mg)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，38mg)和4-二甲基氨基吡啶的混合物(DMAP，24mg，0.37mmol)的DCM(10mL)溶液在室温下在N2下搅拌过夜。然后将反应混合物真空浓缩，产物经快速色谱纯化，得到白色固体，得到叠氮-紫杉醇(PTX)。通过质谱分析(ESI-MS)表征所制备的加合物。
叠氮-康普立停A-4的合成
将康普立停A-4(64mg)，叠氮-PEG3-羧基(62mg)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，38mg)和4-二甲基氨基吡啶的混合物(DMAP，24mg，0.37mmol)的DCM(10mL)溶液在室温下在N2下搅拌过夜。然后将反应混合物真空浓缩，产物经快速色谱纯化，得到白色固体，得到叠氮-康普立停A-4(CA4)。通过质谱分析(ESI-MS)表征所制备的加合物。
叠氮-达沙替尼的合成
将达沙替尼(50mg)，叠氮-PEG3-羧基(50mg)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，38mg)和4-二甲基氨基吡啶的混合物(DMAP，24mg，0.37mmol)的DCM(10mL)溶液在室温下在N2下搅拌过夜。然后将反应混合物真空浓缩，产物经快速色谱纯化，得到白色固体，得到叠氮-达沙替尼(DAS)。通过质谱分析(ESI-MS)表征所制备的加合物。
实施例2核酸适配体的修饰
将核酸序列如SEQ ID NO：2所示的适配体，通过相合成仪修饰1个二苯并环辛炔官能团(DBCO)，修饰后的序列XQ-2d-1如下所示：TGACTGATTTACGGCTCATAG GGT(DBCO)TAGGGGCTGCTGGCCAGA TAC TCA GATGGTAGG GTTACTATGAGC。
将核酸序列如SEQ ID NO：3所示的适配体，通过相合成仪修饰2个二苯并环辛炔官能团(DBCO)，修饰后的序列XQ-2d-2如下所示：CGTAAATCAGTCAGCTCATAGGGT(DBCO)TAGGGGCTGCT(DBCO)GGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTT ACTATGAGC
将核酸序列如SEQ ID NO：2所示的适配体，通过相合成仪修饰3个二苯并环辛炔官能团(DBCO)，修饰后的序列XQ-2d-3如下所示：TGACTGATTT(DBCO)ACGGCTCATAGGGT(DBCO)TAGGGGCTGCT(DBCO)G GCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC。
实施例4核酸适体-药物偶联物单体(ApDC)的制备
XQ-2d-CPT的制备：在杜氏磷酸盐缓冲液中配成以下反应体系：核酸适体XQ-2d-1(实施例2)1OD，叠氮-喜树碱(实施例1)1mM，二甲基亚砜体积百分比10％。将上述反应体系置于37℃，反应8h。产物经HPLC纯化后冷冻干燥浓缩，得到单体XQ-2d-CPT。将所得溶液保存于-20℃，以备使用。
XQ-2d-2CPT的制备：制备方法与XQ-2d-CPT一样，仅将XQ-2d-1换成XQ-2d-2。
XQ-2d-3CPT的制备：制备方法与XQ-2d-CPT一样，仅将XQ-2d-1换成XQ-2d-3。
XQ-2d-PTX的制备：制备方法与XQ-2d-CPT一样，仅将叠氮-喜树碱换成叠氮-紫杉醇。
XQ-2d-2PTX的制备：制备方法与XQ-2d-PTX一样，仅将XQ-2d-1换成XQ-2d-2。
XQ-2d-CA4的制备：制备方法与XQ-2d-CPT一样，仅将叠氮-喜树碱换成叠氮-康普立停A-4。
XQ-2d-2CA4的制备：制备方法与XQ-2d-2CA4一样，仅将XQ-2d-1换成XQ-2d-2。
XQ-2d-DAS的制备：制备方法与XQ-2d-CPT一样，仅将叠氮-喜树碱换成叠氮-达沙替尼。
将本实施例制备的核酸适体-药物偶联物单体液相色谱纯化图如图2所示。
将本实施例制备的XQ-2d-PTX分别在猪肝酯酶(PLE)溶液(30U/mL)、10％人血清(FBS)和PBS(pH＝5.5)中进行孵育释放实验，并于5、10、20、30、60、90和120min时，用HPLC分析溶液中PTX的浓度。(其中使用猪肝酯酶或10％人血清处理的使用前，需要在75℃加热10分钟以使酶变性，随后储存在-20℃，备用。)测得其在三种溶液中的释放曲线如图3所示，从图3可知，XQ-2d-PTX在10％人血清(FBS)和PBS(pH＝5.5)中的整个测试时间释放量非常少，而在猪肝酯酶中的释放量随着时间的延长而增加，说明XQ-2d-PTX单体中药物的释放依赖酯酶。
将本实施例制备的XQ-2d-PTX和XQ-2d-2PTX以及XQ-2d(SEQ ID NO：1所示)，用不同浓度异硫氰酸荧光素(FITC)标记，接着分别与30万个K562细胞于37℃在完全培养基中孵育1h，然后用200微升杜氏磷酸盐缓冲溶液洗去非特异性吸附在细胞上的偶联物，并将所得细胞重悬在杜氏磷酸盐缓冲溶液中进行流式细胞术分析。其结果如图4所示，单体(XQ-2d-PTX和XQ-2d-2PTX)比单独的核酸适体(XQ-2d)对靶细胞K562有更强的亲和力。
对比例
ConDNA-CPT的制备：在杜氏磷酸盐缓冲液中配成以下反应体系：control DNA(SEQID NO：4所示)1OD，叠氮-喜树碱(实施例1)1mM，二甲基亚砜体积百分比10％。将上述反应体系置于37℃，反应8h。产物经HPLC纯化后冷冻干燥浓缩，得到单体XQ-2d-CPT。将所得溶液保存于-20℃，以备使用。
ConDNA-PTX的制备：制备方法与ConDNA-CPT一样，仅将叠氮-喜树碱换成叠氮-紫杉醇。
ConDNA-CA4的制备：制备方法与ConDNA-CPT一样，仅将叠氮-喜树碱换成叠氮-康普立停A-4。
ConDNA-DAS的制备：制备方法与ConDNA-CPT一样，仅将叠氮-喜树碱换成叠氮-达沙替尼。
将实施例3中制备的不同核酸适体-药物偶联物单体、药物分子和对比例中的对照单体分别对靶细胞DU145和非靶细胞HEK293的毒性分析，其具体操作步骤为：将培养好的细胞(靶细胞:DU145；非靶细胞：HEK293)以每孔5×103个细胞的密度接种在96孔板中。孵育过夜后，分别用含有不同浓度的核酸适体-药物偶联物单体(实施例3)、药物分子和对比例中的对照单体(对比例制备)200微升完全RPMI-1640细胞培养基处理细胞，孵育2小时后，除去细胞培养基，用200微升DPBS洗涤后加入200μL新鲜的完全细胞培养基孵育72小时。用100微升预热的新鲜完全细胞培养基替换细胞培养基，然后向每个孔中加入20微升MTS溶液测试细胞增殖速率。其结果如图5所示：游离药物对靶细胞和非靶细胞均具有较强的细胞毒性，对比单体对两种细胞的毒性均比较小，相比之下，核酸适体-药物偶联物只有在靶细胞中对细胞有抑制作用，而在非靶细胞中的抑制作用很小，证明核酸适体-药物偶联物细胞毒性的靶向性。
实施例5环形二价核酸适体-药物偶联系统(cb-ApDC)的制备
本实施例中的环形二价核酸适体-药物偶联系统的制备流程图，如图6所示，具体包括以下几种环形二价核酸适体-药物偶联系统的制备：
cb-XQ-2d-CPT-PTX的制备：将实施例3中制备单体的XQ-2d-CPT(5μM)和XQ-2d-PTX(5μM)溶解在T4DNA连接酶缓冲液中(66mM Tris-HCl，pH7.6，6.6mM MgCl 2,10mM DTT和0.1mM ATP)，在95℃加热5分钟，然后快速冷却至16℃，形成具有两个缺口的环形二价核酸适体-药物偶联物。然后，与T4DNA连接酶(加入17U/μL)在16℃孵育12小时以形成完整的环形二价核酸适体-药物偶联物。通过在75℃温育10分钟使连接酶变性后，通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀获得环形二价核酸适体-药物偶联系统cb-XQ-2d-CPT-PTX，储存于-20℃。
cb-XQ-2d-2CPT-PTX的制备：制备方法与cb-XQ-2d-CPT-PTX一样，仅将单体XQ-2d-CPT换成XQ-2d-2CPT。
cb-XQ-2d-3CPT-PTX的制备：制备方法与cb-XQ-2d-CPT-PTX一样，仅将单体XQ-2d-CPT换成XQ-2d-3CPT。
实施例6环形二价核酸适体-药物偶联系统的性能测试测试
1)环形二价酸适体-药物偶联物亲和力分析
通过流式细胞术研究环形二价酸适体-药物偶联物系统(实施例5制备)对靶细胞K562的亲和力。将不同浓度异硫氰酸荧光素(FITC)标记的环形二价酸适体-药物偶联物系统与30万个细胞于37℃在完全培养基中孵育1h，用200微升杜氏磷酸盐缓冲溶液洗去非特异性吸附在细胞上的偶联物，并将所得细胞重悬在杜氏磷酸盐缓冲溶液中进行流式细胞术分析。其结果如图7所示：修饰不同药物比率的环形二价核酸适体-药物偶联物都对靶细胞K562具有强亲和力，且证明修饰的药物分子的数量与亲和力呈正相关关系。
2)环形二价核酸适体-药物偶联物的稳定性分析
将XQ-2d-CPT(1μM)或cb-XQ-2d-CPT-PTX(500nM)与含10％FBS和1％青霉素-链霉素的完全RPMI-1640细胞培养基在37℃温育。在指定的时间点，将样品在95℃加热5分钟使酶变性，随后储存在-20℃直至收集所有样品。将样品在冰上解冻用于聚丙烯凝胶电泳分析。如图8所示，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图和软件分析条带强度，XQ-2d-CPT和cb-XQ-2d-CPT-PTX的降解速率分别为1.42h-1和3.73h-1,说明环形二价核酸适体-药物偶联物显示出更好的稳定性，能有效抵抗血清中蛋白引起的降解。
3)环形二价核酸适体-药物偶联物的毒性分析
将培养好的细胞(靶细胞:DU145；非靶细胞：HEK293)以每孔5×103个细胞的密度接种在96孔板中。孵育过夜后，用含有不同浓度的游离药物和环形二价核酸适体-药物偶联物(实施例5制备)的200微升完全RPMI-1640细胞培养基处理细胞，孵育2小时后，除去细胞培养基，用200微升DPBS洗涤后加入200μL新鲜的完全细胞培养基孵育72小时。用100微升预热的新鲜完全细胞培养基替换细胞培养基，然后向每个孔中加入20微升MTS溶液测试细胞增殖速率。用GraphPad软件分析数据以获得IC 50值。联合指数(CI)计算如下：
其中(Dx)1和(Dx)2代表核酸适体-药物偶联物抑制细胞生长50％的浓度(IC50)，(D)1和(D)2代表同时抑制细胞50％生长的联合治疗中的环形二价核酸适体-药物偶联物浓度。如图9所示，环形二价核酸适体-药物偶联物除了具备靶向性以外，还可以将确定的药物比率传递到细胞中并获得药物组合的协同效应。
4)环形二价核酸适体-药物偶联物內吞与定位
将培养好的细胞(靶细胞:DU145；非靶细胞：HEK293)置于35-mm细胞培养皿中(1mL,4×104个)，并在实验前生长至80-90％。用DPBS缓冲液洗涤细胞。然后将细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体-药物偶联物，环形二价核酸适体-药物偶联物在37℃温育1小时。用DAPI染料(0.1μg/mL)染色并洗涤后，用4％多聚甲醛将细胞固定用于荧光成像。为了研究环形二价核酸适体-药物偶联物在细胞内的定位，细胞在用环形二价核酸适体-药物偶联物孵育后，将LysoTracker Red(50nM)与细胞再孵育30分钟。然后用DPBS洗涤细胞，并通过在配备有60x油物镜的FV1000共聚焦激光扫描显微镜上进行荧光成像。如图10所示，由于环形二价核酸适体-药物偶联物更强的靶向性能，环形二价核酸适体-药物偶联物比单独的核酸适体与核酸适体-药物偶联物具有更强的內吞能力；如图11所示，证明通过內吞进入细胞的环形二价核酸适体-药物偶联物定位于溶酶体细胞器。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gctcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgactgattt acggctcata gggttagggg ctgctggcca gatactcaga tggtagggtt 60
actatgagc 69
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cgtaaatcag tcagctcata gggttagggg ctgctggcca gatactcaga tggtagggtt 60
actatgagc 69
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
agctcatagg gtttattatt attattatta ttattaatga gc 42

Claims (10)

1.一种核酸适配体XQ-2d，包括如下的核苷酸序列：
X-GCTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTA TGA GC
其中：X不存在如SEQ ID NO：1所示，或X为TGACTGATTTACG如SEQ ID NO：2所示，或X为CGTAAATCA GTCA如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，对所述的核酸适配体的碱基进行修饰，修饰1-3个二苯并环辛炔官能团。
3.根据权利要求1所述的一种环形二价核酸适配体-药物的偶联系统的制备方法，包括以下步骤：
1)药物的叠氮化：将药物在溶解于溶剂中，然后加入叠氮-PEG3-羧基，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲基氨基吡啶，在氮气保护下，进行反应，反应完毕后，过柱分离得到叠氮-药物；
2)核酸适配体的修饰：通过固相合成仪在XQ-2d上修饰二苯并环辛炔官能团，得到DBCO-核酸适配体；
3)核酸适体-药物偶联物单体的制备：将步骤1)中的叠氮-药物与DBCO-核酸适配体置于含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲体系，进行反应，反应完毕后，通过高效液相色谱纯化后，冷冻干燥法进行浓缩，得到核酸适体-药物偶联物单体；
4)将步骤3)中的2种连接不同药物核酸适体-药物偶联物单体溶解于DNA连接酶缓冲液，加入DNA连接酶进行反应，得到环形二价核酸适体-药物偶联系统。
4.根据权利要求3所述的环形二价核酸适配体-药物的偶联系统的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的药物为喜树碱，紫杉醇，康普立停A-4和达沙替尼中的一种或多种；溶剂为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种；药物与溶剂的质量体积比为(50～86):10mg/mL；药物、叠氮-PEG3-羧基，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲基氨基吡啶的质量比为(50～86):(25～86):(38～71):(24～45)；反应时间为7～9h。
5.根据权利要求3所述的环形二价核酸适配体-药物的偶联系统的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，核酸适配体上修饰的二苯并环辛炔官能团的个数为1～3个。
6.根据权利要求3所述的环形二价核酸适配体-药物的偶联系统的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述的磷酸盐缓冲体系中DBCO-核酸适配体的浓度为0.5～1.5OD，叠氮-药物浓度为0.5～1.5mM，二甲基亚砜占总体积的8～12％；反应时间为7～9h，反应温度为25～40℃；所述的核酸适体-药物偶联物单体应保存于-20℃下。
7.根据权利要求3所述的环形二价核酸适配体-药物的偶联系统的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，核酸适体-药物偶联物单体在DNA连接酶缓冲液中的浓度为3～7uM，DNA连接酶缓冲液由66mM Tris-HCl，pH 7.6，6.6mM MgCl2,10mM DTT和0.1mM ATP组成，DNA连接酶的加入量15-20U/μL。
8.根据权利要求3所述的制备方法制备得到核酸适体-药物偶联物单体。
9.根据权利要求3所述的所述的制备方法制备得到环形二价核酸适体-药物偶联系统。
10.根据权利要求8或9所述的核酸适体-药物偶联物单体和环形二价核酸适体-药物偶联系统在靶向治疗癌症中的应用。
CN201811638574.6A 2018-12-29 2018-12-29 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用 Active CN110354268B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811638574.6A CN110354268B (zh) 2018-12-29 2018-12-29 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811638574.6A CN110354268B (zh) 2018-12-29 2018-12-29 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110354268A true CN110354268A (zh) 2019-10-22
CN110354268B CN110354268B (zh) 2021-11-16

Family

ID=68215092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811638574.6A Active CN110354268B (zh) 2018-12-29 2018-12-29 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110354268B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111529714A (zh) * 2020-06-12 2020-08-14 湖南大学 一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
CN111643675A (zh) * 2020-05-26 2020-09-11 湖南大学 一种多肽-核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
CN113499761A (zh) * 2021-06-15 2021-10-15 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法
CN113913419A (zh) * 2021-06-16 2022-01-11 湖南大学 二价环状dna链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用
CN114480401A (zh) * 2020-10-28 2022-05-13 湖南大学 一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸
CN113913419B (zh) * 2021-06-16 2024-05-28 湖南大学 二价环状dna链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593372A (zh) * 2015-02-09 2015-05-06 湖南大学 一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593372A (zh) * 2015-02-09 2015-05-06 湖南大学 一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAILAN KUAI ET AL.: "Circular Bivalent Aptamers Enable in Vivo Stability and Recognition", 《 J. AM. CHEM. SOC.》 *
YING JIANG ET AL.: "Supramolecularly Engineered Circular Bivalent Aptamer for Enhanced Function al Protein Delivery", 《J. AM. CHEM. SOC.》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111643675A (zh) * 2020-05-26 2020-09-11 湖南大学 一种多肽-核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
CN111643675B (zh) * 2020-05-26 2022-11-01 湖南大学 一种多肽-核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
CN111529714A (zh) * 2020-06-12 2020-08-14 湖南大学 一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
CN111529714B (zh) * 2020-06-12 2022-11-15 湖南大学 一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
CN114480401A (zh) * 2020-10-28 2022-05-13 湖南大学 一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸
CN114480401B (zh) * 2020-10-28 2024-04-02 湖南大学 一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸
CN113499761A (zh) * 2021-06-15 2021-10-15 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法
CN113499761B (zh) * 2021-06-15 2022-03-15 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法
CN113913419A (zh) * 2021-06-16 2022-01-11 湖南大学 二价环状dna链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用
CN113913419B (zh) * 2021-06-16 2024-05-28 湖南大学 二价环状dna链的制备方法、二价环状核酸适体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110354268B (zh) 2021-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110354268A (zh) 一种核酸适配体及其环形二价核酸适配体-药物的偶联系统与应用
Yuan et al. Dendrimer-triglycine-EGF nanoparticles for tumor imaging and targeted nucleic acid and drug delivery
Kolhatkar et al. Potential oral delivery of 7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin (SN-38) using poly (amidoamine) dendrimers
Li et al. Polyvalent mesoporous silica nanoparticle‐aptamer bioconjugates target breast cancer cells
Thiagarajan et al. PAMAM-camptothecin conjugate inhibits proliferation and induces nuclear fragmentation in colorectal carcinoma cells
Majoros et al. Methotrexate delivery via folate targeted dendrimer‐based nanotherapeutic platform
Song et al. Design and synthesis of novel PEG-conjugated 20 (S)-camptothecin sulfonylamidine derivatives with potent in vitro antitumor activity via Cu-catalyzed three-component reaction
Thomas et al. Dendrimer-based tumor cell targeting of fibroblast growth factor-1
Zhang et al. DNA tetrahedron delivery enhances doxorubicin-induced apoptosis of HT-29 colon cancer cells
CN101942445B (zh) 核酸适体衍生物及其在制备药物载体中的应用
Huang et al. The facile synthesis of multifunctional PAMAM dendrimer conjugates through copper-free click chemistry
Juliano et al. Integrin targeted delivery of gene therapeutics
Ma et al. A dual functional fluorescent probe for glioma imaging mediated by blood-brain barrier penetration and glioma cell targeting
Cai et al. Aptamer-functionalized molybdenum disulfide nanosheets for tumor cell targeting and lysosomal acidic environment/NIR laser responsive drug delivery to realize synergetic chemo-photothermal therapeutic effects
Xie et al. Mitochondrial-targeted prodrug cancer therapy using a rhodamine B labeled fluorinated docetaxel
Liu et al. Targeted delivery of Rab26 siRNA with precisely tailored DNA prism for lung cancer therapy
Williams et al. RAFT‐Derived Polymer–Drug Conjugates: Poly (hydroxypropyl methacrylamide)(HPMA)–7‐Ethyl‐10‐hydroxycamptothecin (SN‐38) Conjugates
Scott et al. Semi‐synthetic mithramycin SA derivatives with improved anticancer activity
Gao et al. Preparation, characterization and in vitro activity of a docetaxel–albumin conjugate
Wang et al. Anti-HER2 functionalized graphene oxide as survivin-siRNA delivery carrier inhibits breast carcinoma growth in vitro and in vivo
Fuentes-Paniagua et al. Fluorescein labelled cationic carbosilane dendritic systems for biological studies
Hovorka et al. HPMA based macromolecular therapeutics: internalization, intracellular pathway and cell death depend on the character of covalent bond between the drug and the peptidic spacer and also on spacer composition
Wang et al. Activity-based proteomic profiling: application of releasable linker in photoaffinity probes
Liang et al. Inhibition of cell proliferation and migration by chondroitin sulfate-g-polyethylenimine-mediated miR-34a delivery
Jiang et al. An oligonucleotide transfection vector based on HSA and PDMAEMA conjugation: effect of polymer molecular weight on cell proliferation and on multicellular tumor spheroids

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant