CN115975974A - 适合体外合成rna的t7-rna聚合酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合体外合成RNA的T7‑RNA聚合酶突变体及其应用，涉及核酸工具酶与核酸生物领域。本发明提供的T7‑RNA聚合酶突变体是将野生型T7RNA聚合酶从N端开始第173位氨基酸(精氨酸)用丙氨酸或组氨酸替代后得到的，即R173A和R173H。上述T7RNA聚合酶突变体适用于序列内部含Ⅱ类转录终止信号(核心序列为5’‑AUCUGUU‑3’)的RNA的合成，其在体外转录、RNA合成、RNA药物合成、RNA疫苗制造、基因编辑、体内蛋白质表达或无细胞蛋白表达体外翻译系统、转录终止子研究、生物学转录调控元件合成等方面均具有强大的应用潜力。

Description

适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及核酸工具酶与核酸生物领域，特别涉及适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体及其应用。

背景技术

RNA(核糖核酸)作为遗传信息传递过程中一类极其重要的生物大分子，在自然界中广泛存在。除最初鉴定的三大类RNA：mRNA、rRNA以及tRNA外，近些年陆续发现的几类新颖RNA也迅速成为RNA研究中的热点，如microRNA(miRNA)(Cheng et al.,2005)、long non-coding RNA(lncRNA)(Dey et al.,2014)、Circular RNAs(circRNA)(Memczak et al.,2013)等。此外，随着RNA相关研究的逐步深入，RNA在疾病治疗方面的价值也慢慢凸显出来，例如体外合成的mRNA有望成为蛋白质药物的绝佳替代品，而siRNA则有望成为靶向治疗领域的重要药物(Sahin et al.,2014；Wittrup et al.,2015)。一些大型制药公司如Merck、Shire等都已经着手研发RNA药物。体外合成的mRNA因具有可在体内瞬时表达蛋白、生产方便等优点，也已被作为一类全新的疫苗——mRNA疫苗被推广应用(Pardiet al.,2018)。

伴随着RNA相关研究的大量开展以及应用的迅速推广，业内迎来了供给高质量RNA的巨大挑战。RNA体外合成主要依赖化学合成和酶法合成两种方法。化学合成仅适用于合成短链RNA，其合成成本会随着RNA长度的增加急剧上升；当需要合成的RNA长度超过100个核苷酸时，由于生产成本的限制，化学合成法已不适用。然而，编码蛋白质的mRNA常常有几千个核苷酸，因此，酶法合成是目前制备长链mRNA的最佳方案。

癞子短尾噬菌体编码的单亚基RNA聚合酶具有结构简单、体外转录效率高等显著优点，现已被广泛应用于体外转录合成RNA，其中应用最广泛的是来自大肠杆菌噬菌体T7的单亚基RNA聚合酶。T7RNA聚合酶于上世纪70年代被鉴定，此后广泛应用于RNA的体外合成、体内蛋白表达(细菌高表达系统)等(Davanloo et al.,1984)，近年来T7RNA聚合酶转录系统在合成生物学中也发挥了重要作用(Wang et al.,2018)。然而，T7RNA聚合酶虽然优点显著，但其作为体外RNA合成工具也存在一些无法忽略的缺点，它在合成RNA的过程中会产生很多的副产物，包括转录起始过程中产生的寡核苷酸、遇到终止信号产生的中断RNA产物、RdRp活性造成的3’末端延伸产物等(Katalin et al.,2011)。

研究发现，两类终止信号可造成T7RNA聚合酶转录终止，第一类终止信号是由RNA形成的茎环结构，第二类终止信号是特定的碱基序列—5’-HAUCUGUU-3’(Macdonald etal.,1994)。尽管存在一些纯化方法，比如高效液相色谱(HPLC)，能够去除转录终止造成的副产物，但在大规模生产中使用这种纯化方法会大大增加生产成本，而且纯化流程的增加也会降低RNA药物的稳定性。因而开发新的RNA合成工具酶使其在维持高效转录的同时减少RNA转录终止副产物具有非常重要的应用价值。

现有技术中，美国专利申请US20190309337A1公开了多种RNA聚合酶突变体，其主要针对double-strand RNA(双链RNA)和run-on RNA(末端超长延伸产生的双链RNA)两种杂质问题，先采用alanine screen(丙氨酸突变筛选)，把蛋白质一定区域的每个氨基酸逐一突变成丙氨酸，然后用双链RNA特异性的抗体筛选产物中双链RNA最少的T7-RNA聚合酶突变体，结果发现S43A和G47A两个突变体即43位丝氨酸变为丙氨酸及47位甘氨酸变为丙氨酸的突变体，具有减少两种双链RNA的特征。

国际专利申请WO2004053089A3公开了第172和173位氨基酸同时缺失(Δ172-173)的T7RNA聚合酶，第140-143位氨基酸同时缺失的SP6RNA聚合酶，以及第173和174位氨基酸同时缺失的T3RNA聚合酶的。与野生型T7RNA聚合酶相比，突变型Δ172-173T7RNA聚合酶在富含G:C的模板上显示出显着提高的合成速率和产物产率。

中国授权专利CN102177236B提供了功能改善的RNA聚合酶突变体，通过将构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺、179位的赖氨酸以及685位的缬氨酸中的至少1个位置的氨基酸残基被其它氨基酸取代，提高了这种T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性。又例如中国专利申请CN107460177A提供了可利用化学修饰核苷酸的RNA聚合酶突变体，通过将构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体，转录活力提高，并可以掺入2’修饰三磷酸核苷。

然而，这些技术依然不能使其在维持高效转录的同时减少RNA转录终止副产物。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体及其应用，具体通过以下技术实现。

适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体，是将SEQ ID NO.1所示的野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列的第173位的精氨酸，被丙氨酸或组氨酸替代后形成。

申请人通过噬菌体辅助的定向进化(PACE)系统对Syn5RNA聚合酶转录跨过二类终止信号(5’-HAUCUGUU-3’)的能力进行了筛选(Esvelt et al.,2010,Bin Zhu et al,.2014)，最终我们发现Syn5RNA聚合酶的H145和T148氨基酸位点对其跨过二类终止信号的能力影响很大。

由于Syn5RNA聚合酶和T7RNA聚合酶同属短尾噬菌体单亚基RNA聚合酶，我们将二者的三级结构进行了对比，发现在T7RNA聚合酶上有与之对应的氨基酸位点，即L170和R173氨基酸位点。于是我们将这两个氨基酸位点及其中间的氨基酸位点分别突变成丙氨酸(L170A、N171A、K172A和R173A)，同时把R173氨基酸位点突变成组氨酸(R173H)，然后通过分子克隆的方法，将突变体基因插入到原核表达载体pQE82L中，在大肠杆菌中进行蛋白表达并纯化。最后申请人通过体外转录的方法检测了T7RNA聚合酶突变体的终止效果，发现突变体L170A、R173A和R173H的终止效率显著降低，因此申请人推断L170和R173位点很可能是影响终止的关键位点，并对这一突变点及突变体L170A进行后续研究，最终确认R173A和R173H这两种突变体能够使终止效率大大降低，而L170A降低终止效率不如R173A和R173H显著。

上述适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在体外转录中的应用。

上述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的非编码RNA或mRNA合成中的应用。

优选地，所述非编码RNA为sgRNA、tRNA、siRNA、snoRNA或寡核苷酸。。

上述适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的基因编辑中的应用。

上述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在RNA药物合成中的应用。

上述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的体内蛋白质表达或无细胞蛋白表达体外翻译系统中的应用。

上述适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的生物学转录调控元件合成中的应用。

需要强调的是，本发明提供的T7-RNA聚合酶突变体除了能用于上述非治疗目的的各个研究领域以外，还能用于其他各项与RNA转录、翻译有关的研究中。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明发现并鉴定了影响T7RNA聚合酶响应第二类终止信号的关键氨基酸位点，开发出在产量和纯度上更适用于体外合成RNA工具酶，即本发明的T7RNA聚合酶突变体。

附图说明

图1为Syn5RNA聚合酶和T7RNA聚合酶的三级结构对比图；

图2为实施例1制备的5种T7RNA聚合酶突变体对Ⅱ类终止信号的终止效果；

图3为T7RNA聚合酶突变体L170A、R173A、R173H对增强型Ⅱ类终止信号的终止效果。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：利用T7--RNA聚合酶突变体进行体外终止效率检测

1、T7-RNA聚合酶突变体表达及纯化

通过分子克隆的方法分别构建T7RNA聚合酶突变体L170A、N171A、K172A、R173A、R173H，然后将含有这些突变位点的原核表达载体pQE82L转化进E.coli BL21表达菌株，挑菌，在含有100μg/ml氨苄的LB培养基中于37℃、220rpm摇床培养至OD₆₀₀值接近1.2；然后加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)于30℃、200rpm摇床诱导表达4h，随后于4℃、5000rpm离心10min收集菌体沉淀，再将菌体充分重悬于含有300mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH值＝7.5)、0.5mg/ml溶菌酶、0.5mM DTT的裂解液中，冻于-80℃，半小时后取出置于冰上融化1h再反复冻融两次。

将经过三次冻融的蛋白裂解液于4℃，14000rpm离心1h，随后将分离出的上清用0.22μm孔径的滤膜进行过滤以去除杂质，把过滤后的上清加入用10倍体积的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH值＝7.5)、300mM NaCl、0.5mM DTT)平衡好的镍柱，待所有的蛋白液流过镍柱后，用不同梯度的咪唑溶液(20mM-50mM-100mM)洗脱，并用EP管收集流出液。上述所有操作均需在冰上或4℃条件下进行。

最后用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测所有收集到的蛋白流出液，综合选择浓度更高、纯度更优的蛋白加入透析袋中，并于1L透析液(100mM NaCl、50mM Tris–HCl(pH值＝7.5)、1mM DTT、0.1mM EDTA、50％glycerol和0.1％Triton X-100)中进行透析，6h后更换新鲜干净透析液，经过三次透析后收集蛋白并保存于-20℃。

2、转录反应模板的获取及终止效率检测

设计通用引物，引物序列为：

pET28nsp8-F：5’-TCGAGATCTCGATCCCGCGAAATT-3’

pET28nsp8-R：5’-ATAAGCTTCTTGAGCAGTAGCAAAA-3’

利用上述通用引物扩增质粒pET28nsp8(见序列表SEQ ID NO.2)中含有T7启动子以及T7的经典Ⅱ类终止子5’-ATCTGTTT-3’的DNA片段，并用纯化试剂盒DNA Clean&Concentrator^TM-5(ZYMO RESEARCH)对PCR产物进行纯化。

体外转录反应体系为40mM Tris-HCl(pH值＝8.0)，15mM MgCl₂，2mM亚精胺，10mMDTT，4mM ATP、GTP、CTP、UTP，0.3μL RNA酶抑制剂，0.2μL焦磷酸酶，50nM RNA聚合酶和14nMPCR模板，补DEPC水至10μL。将反应体系置于37℃孵育1h，用DNaseⅠ去除模板后用RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化RNA产物，并测定RNA产物浓度，然后每个实验组取200ngRNA，加入2μl 3xRNA上样缓冲液及补至6μl的水，混合后于75℃加热4min，随后用1.5％的琼脂糖凝胶于100V电泳30min，EB染色后用凝胶成像仪进行分析。

成像结果如图2所示，其中run off代表全长转录的RNA产物，terminated代表中断的RNA产物，M代表GeneRuler DNA Ladder(Thermo Scientific)，WT代表T7RNA聚合酶野生型。从图2可以看到，突变体R173A及R173H对终止效率的影响十分显著，使终止效率降为0。突变体L170A也可显著降低终止效率，N171A和K172A则对终止效率没有降低，甚至引入了新的副产物。

实施例2：T7RNA聚合酶突变体S43Y和野生型对增强型II类终止信号的终止效率对比

1、转录反应模板的获取及纯化

通过分子克隆的方法将增强型Ⅱ类终止信号序列(即5’-ATCTGTTTTT-3’和5’-ATCTGTTTTTT-3’)替换载体pET28nsp12中已有的终止序列(如SEQ ID NO.3所示，5’-ATCTGTTT-3’)。同样将构建好的载体用实施例1所述的通用引物进行PCR扩增，然后利用DNA纯化试剂盒DNA Clean&Concentrator^TM-5(ZYMO RESEARCH)对PCR产物进行纯化及浓度测定。

2、体外转录终止效率检测

体外转录反应体系为40mM Tris-HCl(pH值＝8.0)，15mM MgCl₂，2mM亚精胺，5mMDTT，4mM ATP、GTP、CTP、UTP，0.3μL RNA酶抑制剂，0.2μL焦磷酸酶，50nM RNA聚合酶和14nMPCR模板，补DEPC水至10μL。将反应体系置于37℃孵育1h，用DNaseⅠ去除模板后用RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化RNA产物，并测定RNA产物进浓度，然后每个实验组取200ng RNA和2μl 3xRNA上样缓冲液及补至6μl的水，混合后于75℃加热4min，随后用1.5％的琼脂糖凝胶于100V电泳30min，EB染色后用凝胶成像仪进行分析。

结果如图3所示，其中run off代表全长转录的RNA产物，terminated代表中断的RNA产物，M代表GeneRuler DNA Ladder(Thermo Scientific)。通过与野生型T7RNAP进行比较，在DNA模板含有增强型II类终止信号时，突变体R173A、R173H仍然能够使终止效率大大降低，而此时L170A则无法降低终止效率。

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体，其特征在于，是将SEQ ID NO.1所示的野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列的第173位的精氨酸，被丙氨酸或组氨酸替代后形成。

2.权利要求1所述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在体外转录中的应用。

3.权利要求1所述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的非编码RNA或mRNA合成中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述非编码RNA为sgRNA、tRNA、siRNA、snoRNA或寡核苷酸。

5.权利要求1所述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的基因编辑中的应用。

6.权利要求1所述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在RNA药物合成中的应用。

7.权利要求1所述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的体内蛋白质表达或无细胞蛋白表达体外翻译系统中的应用。

8.权利要求1所述的适合体外合成RNA的T7-RNA聚合酶突变体在非治疗目的的生物学转录调控元件合成中的应用。

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