CN115807048B - 一种制备双链rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸技术领域，为解决现有方法中RNA与转录模板过多结合导致聚合酶的聚合反应受阻、核糖核酸酶H与转录模板的结合影响聚合酶延伸速率的问题，本发明提供一种制备双链RNA的方法。首先，针对要制备的双链RNA，设计含有错配且序列完全对称的泡状结构的环状双链DNA模板；然后设计短链DNA作为辅助链；接着，在体系中同时加入环状双链DNA模板、RNA聚合酶、RNase H、辅助链、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶进行转录。转录出的RNA与泡状结构处的单链DNA结合非常弱，降低了对RNA聚合酶的聚合反应的阻碍；RNase H的酶切位点不在环状双链DNA模板的泡状结构处，避免了对聚合酶延伸的影响。

Description

一种制备双链RNA的方法
技术领域
本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链RNA的方法。
背景技术
用酶法合成双链RNA(dsRNA)时，既可以用线性转录，也可以用滚环转录(按照模板为线性还是环状来划分)。线性转录时，要么是用两种双链DNA模板分别转录出sense链和antisense链再退火杂交(Nucleic Acids Res,2003,31,e38.)；要么是用含回文序列的线性双链DNA模板制备得到同时含有sense链和antisense链的发卡型RNA，由Dicer酶进一步加工处理得到最终的siRNA单体(Mol Biotechnol,2017,59,73-83.)。相较线性转录而言，滚环转录的效率有了很大提升。跟线性转录类似，现有做法要么是用一种环状单链DNA模板来同时满足sense链和antisense链的生产(Oligonucleotides,2006,16,353-363；NanoLett,2018,18,4279-4284.)；要么就是用两种环状单链DNA模板分别转录出sense链和antisense链，再经退火杂交得到目的dsRNA(Sci Rep,2017,7,10005；Adv Sci(Weinh),2017,4,1600523.)。
上述酶法制备方法中所用到的模板里几乎都有启动子序列，且为了高效转录，启动子编码链下游的最初两个碱基须为GG，若想得到精确产物，后续需去除(Nucleic AcidsRes,2003,31,e38.)。用一种模板实现sense链和antisense链同时制备的方法会引入较多多余序列。用两种模板分别制备出sense链和antisense链的方法一方面较繁琐；另一方面，因聚合酶本身有较强的序列和结构偏好性(Nucl Acids Res,2014,42,10596-10604；Science Advance Today,2015,25226.)，很难保证sense链和antisense链被等量生产出来，这样dsRNA产物中常混杂有单链RNA(ssRNA)副产物，其会引起免疫反应，在后期的产物纯化过程中需去除。并且滚环转录产生的串联重复产物仅是“半成品”，需进行“截断”处理才能得到最终的产物单体，但尚未开发出高效的产物截断方法，因此该方法尚不能实现dsRNA的大量、高效合成。
申请号为CN202111557772.1的专利公开了一种制备双链RNA的方法，该方法中采用的环状双链DNA模板含有不互补的泡状结构部分和互补部分，不含启动子序列，所述互补部分与要制备的双链RNA长度相同且序列相同，序列中T对应U，所述泡状结构处于环状双链DNA模板中互补部分的两端，泡状结构的长度为5-15bp，泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个；该方法是将环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，在转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处单链DNA的辅助下及时实现对含有重复序列的转录产物的酶切，获得满足要求的目的双链RNA单体。使用该方法时，由于转录出的RNA会和泡状结构处的单链DNA部分结合，这会导致RNA聚合酶的聚合反应受阻；并且核糖核酸酶H在泡状结构处单链DNA的辅助下对转录产物进行截断时，核糖核酸酶H的结合会影响聚合酶的延伸速率。上述两方面因素共同作用使得整体的双链RNA制备效率较低，换言之，该方法的效率还有很大的提升空间。
发明内容
为解决现有方法转录出的RNA与泡状结构处的单链DNA结合较为稳定，使RNA聚合酶的聚合反应受阻；核糖核酸酶H在环状双链DNA模板的泡状结构处对转录产物酶切，核糖核酸酶H的结合影响聚合酶的延伸速率的问题，本发明提供了一种制备双链RNA的方法。首先，针对要制备的双链RNA，设计一个含有错配且序列完全对称(即错配回文序列)的泡状结构(MBDB)的环状双链DNA模板；然后，设计一条短链DNA(Aid-DNA)作为辅助链；接着，在体系中同时加入上述环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H(RNase H)、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶进行转录。在转录过程中RNA聚合酶进行无方向偏好性的滚环转录，即50％的聚合酶分子以模板链1为模板转录，另外50％的聚合酶分子以模板链2为模板转录，转录出的RNA与泡状结构处的单链DNA结合非常弱，降低了对RNA聚合酶的聚合反应的阻碍；RNase H则在Aid-DNA的辅助下及时实现对模板链1和模板链2的转录产物的截断，RNase H的酶切位点不在环状双链DNA模板的泡状结构处，避免了对聚合酶的延伸速率的影响。在RNA聚合酶、核糖核酸酶H和Aid-DNA三者之间的协作下实现了目的双链RNA产物的一步、高效、大量制备。该方法非常简便高效，成本低，实操性强，产物中几乎不含单链RNA副产物，特别适用于双链RNA的工业化大规模生产。
本发明采用的技术方案如下：
一种制备双链RNA的方法，包括以下步骤：
步骤一，设计、制备并纯化环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板由对称泡状结构部分和完全互补部分组成，所述对称泡状结构部分是一段含有部分错配碱基对的回文序列，即错配回文序列，作为转录起始部分，所述对称泡状结构长度为10-30bp；所述完全互补部分与要制备的双链RNA的长度和序列均相同，序列中T对应U，所述对称泡状结构的两端同完全互补部分的两端分别相连形成环状双链DNA模板；构成环状双链DNA模板的两条链分别为模板链1和模板链2；
步骤二，设计并制备Aid-DNA，所述Aid-DNA为单链DNA，其可互补结合所述模板链1和模板链2在对称泡状结构处的转录产物，以形成核糖核酸酶H的作用区域，即DNA/RNA杂交双链，从而同时实现核糖核酸酶H对模板链1和模板链2转录产物的高效截断，所述Aid-DNA的长度为6-30nt；
步骤三，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的双向滚环转录，核糖核酸酶H则在Aid-DNA的辅助下对含有重复序列的转录产物进行截断，同时获得模板链1和模板链2的转录产物单体；这两种互补的RNA转录产物单体在反应体系中自发、快速杂交，最终获得目的双链RNA。
对称泡状结构部分下文有时称之为MBDB(Mismatched Bi-Direction Bubble)。MBDB相当于启动子，起到转录起始的作用。
MBDB中的序列完全对称，错配处也是对称的，即对称位置的错配情形也是完全对称的(即错配回文序列)，以使聚合酶在转录起始时丧失偏好性，能等效率地转录模板链1和模板链2(等量地获得双链RNA的sense链和antisense链)，从根本上抑制单链RNA副产物的产生。
MBDB中的错配数不宜过多(如完全错配的情况，即专利CN202111557772.1中所描述的情况：泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个)，以避免RNA产物与MBDB这个区域过于稳定地结合(会影响聚合酶的延伸效率)。
MBDB中的连续互补的碱基可以为1、2、3个或更多个，可以存在1、2、3、4或更多个错配的碱基，但应该避免MBDB的完全错配。
MBDB的尺寸应在10-30bp之间，否则会导致双链RNA的产量降低，或使产物中混杂有单链RNA副产物。进一步优选，泡状结构长度为13-21bp。
Aid-DNA的长度为6-30nt。在保证核糖核酸酶H对串联重复产物的截断效率的前提下，Aid-DNA的长度应尽量短，优选6-16nt，更优选6-12nt，以使核糖核酸酶H仅酶切产物一下就解离(允许不定点切)。必要时尝试强化条件，如提高Aid-DNA的浓度、提高核糖核酸酶H的浓度，以及终止反应后补加RNase H延长时间充分酶切等。Aid-DNA可为天然DNA，亦可为修饰DNA。
模板链1和模板链2是称泡状结构的上链和下链，在步骤三的转录过程中，两条链都被转录了，因此称其为模板链。模板链1和模板链2的转录产物为长串联重复序列。
不考虑环状双链DNA模板制备的难易程度，所述本发明可制备的双链RNA产物单体的长度为50bp以上；优选50-1000bp，再优选为59-109bp。
进一步地，当所述环状双链DNA模板长度小于70bp时，采用一段法设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
当所述环状双链DNA模板长度大于70bp时，采用一锅法或分段法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离泡状结构的边缘大于10nt。设计成环前体线性链时，需避免将断点设计在MBDB处，否则在制备环状双链DNA模板的退火杂交过程中无法形成Nick(双链连接酶发挥连接作用所必需的结构)。
进一步地，制备所述环状双链DNA模板过程中，退火杂交条件为：先在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min。
进一步地，所述步骤一需在高温条件(60-80℃)下用Taq DNA连接酶制备双链环状DNA模板，以保证MBDB处的错配处于打开状态，从而保证高效转录。
进一步地，制备所述环状双链DNA模板过程中，当使用T4 DNA连接酶和相应的T4DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃温度范围内保温2-24h进行连接；当使用Taq DNA连接酶和相应的Taq DNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。
进一步地，当使用T4 DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2,10mM DTT，500μM ATP，pH 7.8@25℃；当使用Taq DNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl，25mM KAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1.0mM NAD，0.1％Triton X-100，pH 7.6@25℃。
进一步地，所述双链环状DNA模板的纯化是指用核酸外切酶酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA。
进一步地，采用的核酸外切酶为Exo I和Exo III，Exo I的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33.5mM glycine-KOH，pH 9.5@25℃，3.35mM MgCl2，0.5mM DTT；Exo III的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33mM Tris-HCl，pH 8.0@30℃，0.33mM MgCl2。
进一步地，所述步骤三在1×RNA聚合酶缓冲液中进行，成分为：40mM Tris-HCl，pH7.9@25℃，6.0mM MgCl2，10mM DTT，10mM NaCl和2mM spermidine，在37℃下恒温反应0.5-72h制备双链RNA。
进一步地，所述步骤三的环状双链DNA模板的纯化过程中，用Exo I和Exo III共同酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的所有线性单链DNA，Exo I的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33.5mM glycine-KOH(pH 9.5@25℃)，3.35mM MgCl2，0.5mMDTT；Exo III的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33mM Tris-HCl(pH 8.0@30℃)，0.33mM MgCl2。
进一步地，双链RNA的制备过程中，RNA聚合酶的转录反应采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：40mM Tris-HCl(pH 7.9@25℃)，6.0mM MgCl2，10mM DTT，10mM NaCl和2mMspermidine。
有益效果：
本发明的一种合成双链RNA的方法，与申请号为CN202111557772.1的专利中所提供的方法相比效率有了大幅提升，且设计原理具有很大不同。本专利的方法可为高效、低成本、工业化的双链RNA生产提供更多选择。
本发明制备双链RNA的方法中所用到的转录模板中引入了对称性极强的错配回文序列，来保证聚合酶在起始阶段就丧失了偏好性，可等效率地转录模板链1和模板链2，这样双链RNA中的sense链和antisense链几乎被等量地生产出来。从根本上保证了产物的高纯度(产物中几乎无单链RNA副产物)。
MBDB处错配的存在以及双环模板的高温制备条件使得聚合酶能在MBDB处高效起始转录，并且负超螺旋的存在会在一定程度上缓冲解链所造成的应力，从而有利于聚合酶的延伸(相当于增强了聚合酶的持续合成能力，使其不易从模板上掉落)。
方法通用性强。在设计MBDB时只要保证转录产物单体两端的多余序列(由MBDB编码)不会与sense链(或antisense链)本身形成过于稳定的二级结构，从而干扰sense链和antisense链的杂交即可。
“转录”和“产物截断”过程的同时进行极大提高了双链RNA的制备效率(产物与模板及时分离，对后续的转录影响小)。
双链环状DNA模板的使用保证了长串联重复产物只能与Aid-DNA杂交，从而实现了RNase H对产物的高效、精确截断。
双链环状DNA模板几乎不会与产物杂交，因而可以重复利用。
相较于现有的双链RNA制备方法，本发明所涉及的制备双链RNA的方法非常简便、易操作，无需严苛条件，仅需扩大反应体系、延长转录时间、供给转录体系充足的NTPs即可实现目的双链RNA产物的大量制备。
利用本方法制备得到的双链RNA本身纯度较高(仅首尾两端含少量多余核糖核苷酸)，几乎不影响双链RNA的功能，可满足一般应用场合。若对产物纯度要求较高，后期可用DNase I等DNA酶去除环状双链DNA模板，也可用抽提醇沉、HPLC等方式对产物进行进一步纯化。
综上，本发明大大简化了双链RNA的制备流程，从根本上保证了产物的高纯度，具有良好的应用潜力。
附图说明
图1实施例1双链RNA的制备方法示意图；
图2实施例1环状单链DNA的制备方法示意图；
图3实施例1环状双链DNA模板的制备方法示意图；
图4实施例1用B15回制备双链RNA的结果；
图5实施例2用59回制备双链RNA的结果；
图6实施例3用90回制备双链RNA的结果；
图7实施例4用90回-1制备双链RNA的结果；
图8实施例5用90回-2制备双链RNA的结果；
图9实施例6用B13回制备双链RNA的结果；
图10实施例7用B13回-1制备双链RNA的结果；
图11实施例8用B13回-2制备双链RNA的结果；
图12实施例9用T4 Rnl1环化用B15回制备的双链RNA得到稳定的哑铃环的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
下述实施例中用于制备环状双链DNA模板的成环前体线性链以及Aid-DNA均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，为人工合成；核糖核酸酶H(RNase H)、10×RNase Hbuffer、Taq DNA连接酶(Taq Dnl)、10×Taq Dnl buffer、无机焦磷酸酶(InorganicPyrophosphatase,E.coli)、ShortCut RNase III、T4 RNA连接酶1(T4 Rnl或T4 Rnl1)及其对应的10×buffer购自安诺伦(北京)生物科技有限公司(NEW ENGLAND BioLabs)；T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)、5×RNAP buffer、核酸酶抑制剂(RiboLock RNase Inhibitor)、T4多聚磷酸激酶(T4 PNK)、10×T4 PNK buffer A、ATP(100mM)、T4 DNA连接酶(T4 Dnl)、10×T4Dnl buffer、Exo I、Exo I对应的10×buffer、Exo III、Exo III对应的10×buffer、NTPs(ATP、UTP、CTP和GTP的统称，100mM)均购自美国赛默飞世尔生物科技有限公司；核酸染液(Ultra GelRed)购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司；其他化学用品购自美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
以下实施例是为了证明本发明的方法具有可行性和实用性。
以下实施例出现的序列名称中，“回”指的是回文序列，“内”指的是内环，“外”指的是外环，均是为了区分序列。
实施例1
(1)原料
LA-a链(5′→3′)：
TCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：1)；
LA-b链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAACATAGACTGTATATCTGTAGAACCGAATTTGTGCAGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：2)；
C1回-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：3)；
C1回-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACATAGACTGTATATCTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：4)；
Splint C1回-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，SEQ ID NO：5)；
Splint C1回-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，SEQ ID NO：6)；
Aid-DNA-B15回(5′→3′)：
CATAGACTGTATATC(长度为15nt，SEQ ID NO：7)。
(2)制备环状单链DNA(C1回)
将成环前体线性链(C1回-a和C1回-b，终浓度为1μM)、splint(Splint C1回-ab和Splint C1回-ba，终浓度为2μM)、T4 DNA连接酶(T4 Dnl，终浓度为0.125U/μL)和对应的T4DNA连接酶缓冲液(终浓度为1×)混合，37℃下反应12h，得到环状单链C1回。
1×T4 Dnl Buffer的组成：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，500μM ATP(pH7.8@25℃)
(3)制备环状双链DNA模板B15回(MBDB长度为15bp，其中含5个错配碱基)
先将C1回(终浓度为1μM)、LA-a和LA-b(终浓度为1.5μM)以及Taq Dnl buffer(终浓度为1×)的混合物在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至60℃，再以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min，使得C1回和LA-a、LA-b充分杂交形成nick。将PCR调到65℃下运行，然后在样品中加入Taq Dnl(终浓度为4U/μL)在65℃下连接2h。
1×Taq Dnl Buffer的组成：20mM Tris-HCl,25mM KAc,10mM Mg(Ac)2,10mM DTT,1mM NAD,0.1％Triton X-100(pH 7.6@25℃)。
(4)纯化B15回
在(3)中制备得到的B15回中加入Exo I(终浓度约为1U/μL)、Exo III(终浓度约为4U/μL)及其对应的buffer(各自终浓度均为0.5×)。颠倒混匀并离心后在37℃下酶切2h，以去除体系中剩余的LA-a、LA-b以及splint。
0.5×Exo I buffer的组成为：33.5mM glycine-KOH(pH 9.5@25℃),3.35mMMgCl2,0.5mM DTT；
0.5×Exo III buffer的组成为：33mM Tris-HCl(pH 8.0@30℃),0.33mM MgCl2。
(5)用B15回转录制备双链RNA
转录体系及反应条件：[B15回]＝50nM，[each NTP]＝0.5mM，[T7 RNAP]＝2U/μL，[RNase Inhibitor]＝2U/μL，[RNAP buffer]＝1×，[RNase H]＝0.25U/μL，[Aid-DNA-B15回]＝1μM。在37℃下转录4h，再在70℃下处理10min终止反应。
1×RNAP buffer的组成为：40mM Tris-HCl(pH 7.9@25℃),6mM MgCl2,10mM DTT,10mM NaCl and2mM spermidine。
(6)用ShortCut RNase III酶切转录产物以确认转录产物为双链RNA：
取出一半转录产物，然后在体系中加入ShortCut RNase III(终浓度为0.2U/μL)、ShortCut Reaction buffer(终浓度为1×)和MnCl2(终浓度为1×)。在37℃下酶切40min，然后取出部分酶切产物与loading buffer混合(loading buffer中有EDTA，可以螯合掉金属离子，从而终止反应)。
(7)在转录产物中加入A链(A链指的是双环模板B15回中外面的那条链，C1回链指的是里面那条链)或C1回链(的一部分)与之杂交以明确转录产物为双链RNA的体系及反应条件：
在7μL转录产物中加入LA-a/C1回-a(终浓度为1μM)和RNase H buffer(终浓度为0.5×)，然后在65℃下处理10min，再以0.1℃/s的速度降温至37℃，再在37℃下保持5min。
(8)电泳检测
用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶表征实验结果，用Image Lab软件分析电泳结果。
图4为实验结果。图4A为B15回的序列设计示意图，其含一个里面有5个错配、对称性极强的MBDB(错配回文序列)，模板总长为109bp；图4B为B15回的转录结果、ShortCutRNase III对转录产物的酶切验证结果以及转录产物与短DNA链的杂交结果。图中的标注“T”指转录体系中只有T7 RNAP；“RT”指转录体系中T7 RNAP、RNase H和Aid-DNA-B15回共存；“S”指ShortCut RNase III酶切。结果表明当转录体系中仅有T7 RNAP时，转录产物为堵在胶孔处的多聚串联重复序列；当T7 RNAP、RNase H和Aid-DNA-B15回共存于转录体系时，泳道中出现了大量固定长度的短产物；ShortCut RNase III的酶切产物聚集在很小的一个区域(10-25bp之间)。根据该酶的酶切特性(其可将长双链RNA酶切成18-25bp的短双链RNA)，B15回的转录产物就是我们想要的双链RNA。将转录产物与LA或LC1回的一部分杂交时，转录产物在泳道中的分布状态均没有发生变化，短DNA链也没有被消耗，这进一步说明转录产物就是呈双链状态。
实施例2
1)原料
S链(5′→3′)：
GTATATCCTCAATGCGATCTGGTTCTACACCAACAGCATCTTTGGGAAAGCCATAGACT(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：8)；
Splint S链(5′→3′)：
GGATATACAGTCTATG(长度为16nt，SEQ ID NO：9)；
A15链(5′→3′)：
TGTTGGTGTAGAACCAGATCGCATTGAGCATAGACTGTATATCGCTTTCCCAAAGATGC(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：10)；
Aid-DNA-59回(同Aid-DNA-B15回，5′→3′)：
CATAGACTGTATATC(长度为15nt，SEQ ID NO：7)。
环状单链DNA(C-S)的制备是将成环前体线性链S链、Splint S链、T4 DNA连接酶和对应的T4 DNA连接酶缓冲液混合，37℃下反应12h。
环状双链DNA模板59回(MBDB长度为15bp，其中含5个错配碱基)的制备及纯化，以及用环状双链DNA模板59回制备双链RNA的反应体系及条件、ShortCut RNase III酶切转录产物以判断转录产物为双链，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图5B为实验结果。由结果可知，在短Aid-DNA(Aid-DNA-59回)的辅助下，RNase H对模板链1和模板链2的串联重复产物均进行了高效截断(生成了固定长度的产物单元)；再由ShortCut RNase III的酶切结果可知转录产物就是我们想要的双链RNA。综上，本专利所提出的“转录-产物截断”一步进行的双链RNA生产方法实操性强，可用于实际生产。
实施例3
1)原料
90外-A链(5′→3′)：
AGCTGGGATCCCTCAGAACATAGACTGTATATCTGACCAACTATGTGGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：11)；
90外-B链(5′→3′)：
TCAATGCGATCTGGTTCTACACCAACAGCATCTTTGGGAA(5′-磷酸化，长度为40nt，SEQ IDNO：12)；
Splint 90外-AB(5′→3′)：
CGCATTGAGTCCACAT(长度为16nt，SEQ ID NO：13)；
Splint 90外-BA(5′→3′)：
TCCCAGCTTTCCCAAA(长度为16nt，SEQ ID NO：14)；
90内-A链(5′→3′)：
GTCCACATAGTTGGTCACATAGACTGTATATCTTCTGAGGGATCCCAGCT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：15)；
90内-B链(5′→3′)：
TTCCCAAAGATGCTGTTGGTGTAGAACCAGATCGCATTGA(5′-磷酸化，长度为40nt，SEQ IDNO：16)；
Splint 90内-AB(5′→3′)：
TTTGGGAAAGCTGGGA(长度为16nt，SEQ ID NO：17)；
Splint 90内-BA(5′→3′)：
ATGTGGACTCAATGCG(长度为16nt，SEQ ID NO：18)；
Aid-DNA-90回(同Aid-DNA-B15回，5′→3′)：
CATAGACTGTATATC(长度为15nt，SEQ ID NO：7)。
环状单链DNA(C-90内)的制备、环状双链DNA模板90回(MBDB长度为15bp，其中含5个错配碱基)的制备及纯化、用环状双链DNA模板90回制备双链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图6B为实验结果，由结果可知环状双链DNA模板90回的转录产物也是我们想要的双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例4
1)原料
90外-A1链(5′→3′)：
AGCTGGGATCCCTCACCTAATACGACTCACTATAGGCCAACTATGTGGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：19)；
90外-B链(5′→3′)：
TCAATGCGATCTGGTTCTACACCAACAGCATCTTTGGGAA(5′-磷酸化，长度为40nt，SEQ IDNO：12)；
Splint 90外-AB(5′→3′)：
CGCATTGAGTCCACAT(长度为16nt，SEQ ID NO：13)；
Splint 90外-BA(5′→3′)：
TCCCAGCTTTCCCAAA(长度为16nt，SEQ ID NO：14)；
90内-A1链(5′→3′)：
GTCCACATAGTTGGCCTAATACGACTCACTATAGGTGAGGGATCCCAGCT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：20)；
90内-B链(5′→3′)：
TTCCCAAAGATGCTGTTGGTGTAGAACCAGATCGCATTGA(5′-磷酸化，长度为40nt，SEQ IDNO：16)；
Splint 90内-AB(5′→3′)：
TTTGGGAAAGCTGGGA(长度为16nt，SEQ ID NO：17)；
Splint 90内-BA(5′→3′)：
ATGTGGACTCAATGCG(长度为16nt，SEQ ID NO：18)；
Aid-DNA-90回-1(5′→3′)：
ATACGACTCACT(长度为12nt，SEQ ID NO：21)。
环状单链DNA(C-90内-1)的制备、环状双链DNA模板90回-1(MBDB长度为21bp，其中含9个错配)的制备及纯化、用环状双链DNA模板90回-1制备双链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图7B为实验结果，由结果可知环状双链DNA模板90回-1的转录产物也是我们想要的双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例5
1)原料
90外-A2链(5′→3′)：
AGCTGGGATCCCTCAGGATTATGCTGAGTGATATCCCCAACTATGTGGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：22)；
90外-B链(5′→3′)：
TCAATGCGATCTGGTTCTACACCAACAGCATCTTTGGGAA(5′-磷酸化，长度为40nt，SEQ IDNO：12)；
Splint 90外-AB(5′→3′)：
CGCATTGAGTCCACAT(长度为16nt，SEQ ID NO：13)；
Splint 90外-BA(5′→3′)：
TCCCAGCTTTCCCAAA(长度为16nt，SEQ ID NO：14)；
90内-A2链(5′→3′)：
GTCCACATAGTTGGGGATTATGCTGAGTGATATCCTGAGGGATCCCAGCT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：23)；
90内-B链(5′→3′)：
TTCCCAAAGATGCTGTTGGTGTAGAACCAGATCGCATTGA(5′-磷酸化，长度为40nt，SEQ IDNO：16)；
Splint 90内-AB(5′→3′)：
TTTGGGAAAGCTGGGA(长度为16nt，SEQ ID NO：17)；
Splint 90内-BA(5′→3′)：
ATGTGGACTCAATGCG(长度为16nt，SEQ ID NO：18)；
Aid-DNA-90回-2(5′→3′)：
TATGCTGAGTGA(长度为12nt，SEQ ID NO：24)。
环状单链DNA(C-90内-2)的制备、环状双链DNA模板90回-2(MBDB长度为21bp，其中含9个错配碱基)的制备及纯化、用环状双链DNA模板90回-2制备双链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图8B为实验结果，由结果可知环状双链DNA模板90回-2的转录产物也是我们想要的双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例6
1)原料
A-a链(5′→3′)：
TCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：1)；
A-b1链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAACCTGTACTGAACACGTGTAGAACCGAATTTGTGCAGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：25)；
C2回-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C1回-a链，SEQ ID NO：3)；
C2回-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCTGTACTGAACACGTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：26)；
Splint C1回-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，SEQ ID NO：5)；
Splint C1回-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，SEQ ID NO：6)；
Aid-DNA-B13回(5′→3′)：
CTGTACTGAACAC(长度为13nt，SEQ ID NO：27)。
环状单链DNA(C2回)的制备、环状双链DNA模板B13回(MBDB长度为13bp，其中含5个错配碱基)的制备及纯化、用环状双链DNA模板B13回制备双链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图9B为实验结果，由结果可知环状双链DNA模板B13回的转录产物也是我们想要的双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例7
1)原料
A-a链(5′→3′)：
TCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：1)；
A-b2链(5′→3′)：
ACAACCACTACACCTGTACTGAACACGTGTAGAACCGAATTTGTGCAGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：28)；
C3回-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C1回-a链，SEQ ID NO：3)；
C3回-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTCTACACCTGTACTGAACACGTGTAGTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：29)；
Splint C1回-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，SEQ ID NO：5)；
Splint C1回-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，SEQ ID NO：6)；
Aid-DNA-B13回-1(5′→3′)：
CTGTACTGAACAC(长度为13nt，同Aid-DNA-B13回，SEQ ID NO：27)。
环状单链DNA(C3回)的制备、环状双链DNA模板B13回-1(MBDB长度为13bp，其中含5个错配碱基)的制备及纯化、用环状双链DNA模板B13回-1制备双链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图10B为实验结果，由结果可知环状双链DNA模板B13回-1的转录产物也是我们想要的双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例8
1)原料
A-a链(5′→3′)：
TCCGGTGGAATGAAGGACCAAGTCTGTCATGCACTGAAATCAGTCTCATTGCTTTATAA(5′-磷酸化，长度为59nt，SEQ ID NO：1)；
A-b3链(5′→3′)：
ACAACCAGCTAACCTGTACTGAACACGTTAGCAACCGAATTTGTGCAGAC(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：30)；
C4回-a链(5′→3′)：
TTATAAAGCAATGAGACTGATTTCAGTGCATGACAGACTTGGTCCTTCATTCCACCGGA
(5′-磷酸化，长度为59nt，同C1回-a链，SEQ ID NO：3)；
C4回-b链(5′→3′)：
GTCTGCACAAATTCGGTTGCTAACCTGTACTGAACACGTTAGCTGGTTGT(5′-磷酸化，长度为50nt，SEQ ID NO：31)；
Splint C1回-ab(5′→3′)：
GTGCAGACTCCGGTGG(长度为16nt，SEQ ID NO：5)；
Splint C1回-ba(5′→3′)：
CTTTATAAACAACCAG(长度为16nt，SEQ ID NO：6)；
Aid-DNA-B13回-2(5′→3′)：
CTGTACTGAACAC(长度为13nt，同Aid-DNA-B13回，SEQ ID NO：27)。
环状单链DNA(C4回)的制备、环状双链DNA模板B13回-2(MBDB长度为13bp，其中含5个错配碱基)的制备及纯化、用环状双链DNA模板B13回-2制备双链RNA的反应体系及条件，以及电泳检测制备结果的条件同实施例1，此处不再赘述。
图11B为实验结果，由结果可知环状双链DNA模板B13回-2的转录产物也是我们想要的双链RNA，表明本方法具有良好的通用性。
实施例9
用单链RNA连接酶T4 RNA连接酶1(T4 Rnl1或T4 Rnl)连接实施例1中制备得到的末端带有少量单链RNA的dsRNA(封闭两个‘Nick’)的结果。
dsRNA的制备条件同实施例1，此处不再赘述。
T4 Rnl1环化dsRNA的条件：
10μL转录产物，[T4 Rnl1]＝0.5U/μL，[T4 Rnl1 buffer]＝0.5×，[ATP]＝1mM，[RNase Inhibitor]＝2U/μL，环化总体系为20μL。在37℃下环化6h，然后在70℃下处理10min灭活T4 Rnl1。
环化结果如图12B所示，用T4 Rnl1连接6h后dsRNA大部分都环化成功了，只有少量剩余(绝大部分转录产物被环化后在凝胶中的迁移速率变快了)。这可能是因为dsRNA末端的单链处存在的少量互补使得T4 Rnl1(单链RNA连接酶)的环化速率较低，延长时间应能100％环化。说明用本方法所制备的dsRNA是T4 Rnl1的理想作用底物，在其作用下生成的哑铃环(dumbbell-shaped dsRNA)会显著增强dsRNA的稳定性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种制备双链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，设计、制备并纯化环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板由对称泡状结构部分和完全互补部分组成，所述对称泡状结构部分是一段含有部分错配碱基对的回文序列，作为转录起始部分，所述对称泡状结构长度为10-30bp；所述完全互补部分与要制备的双链RNA的长度和序列均相同，序列中T对应U，所述对称泡状结构的两端同完全互补部分的两端分别相连形成环状双链DNA模板，所述双链DNA模板的两条链分别为模板链1和模板链2；
步骤二，设计并制备Aid-DNA，所述Aid-DNA为单链DNA，其可互补结合所述模板链1和模板链2在对称泡状结构处的转录产物，以形成核糖核酸酶H的作用区域，从而同时实现核糖核酸酶H对模板链1和模板链2转录产物的高效截断，所述模板链1和模板链2杂交后含有完全互补部分和错配的泡状结构，所述Aid-DNA的长度为6-30nt；
步骤三，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、Aid-DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行无偏好性的双向滚环转录，核糖核酸酶H则在Aid-DNA的辅助下对含有重复序列的转录产物进行截断，同时获得模板链1和模板链2的转录产物单体；这两种互补的RNA转录产物单体在反应体系中自发、快速杂交，最终获得目的双链RNA。
2.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为50-1000bp。
3.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为59-109bp。
4.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于70bp时，采用一段法设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
当所述环状双链DNA模板长度大于70bp时，采用一锅法或分段法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶进行连接反应；
所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离泡状结构的边缘大于10nt。
5.根据权利要求4所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板过程中，退火杂交条件为：先在90℃下保温1～3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20～25℃并保温10min。
6.根据权利要求4所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，制备所述环状双链DNA模板过程中，当使用T4 DNA连接酶和相应的T4 DNA连接酶缓冲液时，在4-37℃温度范围内保温2-24h进行连接；当使用Taq DNA连接酶和相应的Taq DNA连接酶缓冲液时，在45-80℃范围内保温2-24h进行连接。
7.根据权利要求6所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当使用T4 DNA连接酶时，采用终浓度为0.05-1×的缓冲液，当缓冲液浓度为1×时，其组成为：40mM Tris-HCl,10mMMgCl2,10mM DTT,500μM ATP，pH 7.8@25℃；当使用Taq DNA连接酶时，采用终浓度为1×的缓冲液，其组成为：20mM Tris-HCl,25mM KAc,10mM Mg(Ac)2,10mM DTT,1.0mM NAD,0.1％Triton X-100，pH 7.6@25℃。
8.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链环状DNA模板的纯化是指用核酸外切酶酶切去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA。
9.根据权利要求8所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，采用的核酸外切酶为Exo I和Exo III，Exo I的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33.5mM glycine-KOH，pH 9.5@25℃，3.35mM MgCl2，0.5mM DTT；Exo III的酶切反应采用终浓度为0.5×的缓冲液，其组成为：33mM Tris-HCl，pH 8.0@30℃，0.33mM MgCl2。
10.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述步骤三在1×RNA聚合酶缓冲液中进行，成分为：40mM Tris-HCl，pH 7.9@25℃,6.0mM MgCl2,10mM DTT,10mMNaCl和2mM spermidine，在37℃下恒温反应0.5-72h制备双链RNA。
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