JP2023545400A

JP2023545400A - 転写核酸の生成方法及び手段

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Publication number: JP2023545400A
Application number: JP2023520229A
Authority: JP
Inventors: サルビラマンタス; モルパメラ; ザイツアレクサンダー
Original assignee: Lexogen GmbH
Current assignee: Lexogen GmbH
Priority date: 2020-10-02
Filing date: 2021-10-01
Publication date: 2023-10-30
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Abstract

本発明は、転写核酸を生成する方法に関し、前記方法は、核酸テンプレートを提供するステップ、前記核酸テンプレートにオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズするステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記核酸テンプレートにハイブリダイズする相補部分と、前記核酸テンプレートにハイブリダイズしない相補部分の5'方向の非相補部分とを含み、および転写プロモーターの配列を含む、前記ステップ、前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする核酸テンプレートの一部分に対して、３’方向に存在する核酸テンプレートの３’部分を加水分解するステップであって、前記３’部分が前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしていないか、または前記３’部分が前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしている、または前記核酸テンプレートを前記テンプレート-プローブ二重鎖内で加水分解して、前記テンプレートの前記３’方向の部分を解離させる、前記ステップ、前記核酸テンプレートを前記オリゴヌクレオチドプローブの非相補的部分に相補的な核酸で伸長させ、前記核酸テンプレートを有する配列において、前記転写プロモーターの配列の二重鎖を生成するステップ、転写プロモーターの配列の二重鎖に結合する転写酵素で核酸テンプレートを転写して、転写された核酸を生成するステップを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、テンプレート核酸に対応する複数の核酸を生成するためのインビトロ転写の分野に関する。

近年のリボ核酸(RNA)シーケンシング、RNA-seq技術の開発の急速な進歩により、生物学において分析範囲およびスケールが再定義された。ゲノミクス、トランスクリプトミクス、およびエピゲノミクスのための次世代シーケンシング(NGS)ベースの技術は、個々の細胞の分散、およびプール後のすべての細胞の平均発現値の両方を測定するために、個々の細胞の包括的な特性評価に対する注目が高まっている(Shapiro et al., Nat. Rev. Genet. 2013; 14: 618-630)。単一細胞レベルでのトランスクリプトームワイドRNAシーケンシングは、インビトロ転写(IVT)による線形増幅およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による指数関数的増幅を用いて開拓された。この方法は当初、市販のデオキシリボ核酸(DNA)マイクロアレイチップに適用され、一方でNGSプラットフォームに基づくシングルセルトランスクリプトーム解析の最初の報告は、2009年にTangらによって発表された(Nat. Methods 2009; 6: 377-382)。

線形RNA増幅は等温核酸増幅であり、インビトロRNA転写媒介増幅としても知られ、増幅RNA(aRNA)とも呼ばれる。aRNAは、従来、バクテリオファージの成分を用いて合成される。最も頻繁に使用されるシステムは、T3、T7、およびSP6バクテリオファージに由来する。DNA依存性RNAポリメラーゼ(RNAP)は、特定のプロモーター配列に対して厳密な特異性を示す。RNAPsは、一本鎖DNA、二本鎖DNA、または同族の二本鎖プロモーターから始まる一本鎖RNAのいずれかでインビトロRNA合成を触媒する (図１３；Arnaud-Barbe et al., Nucleic Acids Res. 1998;26(15):3550-4)。aRNA生成の基本的な戦略は、プロモーター配列を、元のRNAテンプレートの３’または５’のいずれかの部位である任意の目的配列の上流に配置することである。線状アンチセンスRNA増幅法に関する概要は、J. LiおよびJ. Eberwineによる論文(Nat. Protocols 2018;13(5): 811-818)において知ることができる。

３’位のIVTプロモーター配列

Van Gelderら(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1990; 87: 1663-1667)は、逆転写による相補的DNA (cDNA)のプライム合成のために、ポリ(dT)配列とファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列の両方を含む、合成オリゴ(dT)-T7prオリゴヌクレオチドを用いた。ここで、プライマーのポリ(dT)-ストレッチはmRNA種のポリ(A)尾部を選択し、T7プロモーター領域は後にcDNAテンプレートのRNAコピーを合成するためのT7 RNAポリメラーゼの結合を開始する。しかしながら、この方法において、必要な二本鎖プロモーター配列は、第二プライミング工程を必要とする第二鎖cDNA合成後にのみ生成される。IVTは、第二鎖cDNAをテンプレートとして使用して、アンチセンス配向(逆相補体)のaRNAを生成する。文献における例としては、RNAテンプレート (Nacheva et al. Eur J Biochem. 2003, 270(7):1458-65)および二本鎖プロモーターを有する一本鎖RNAテンプレート(Arnaud-Barbe et al. Nucleic Acids Res. 1998, 26(15):3550-4)からのIVTについて見出すことができる。直接比較すると、aRNAの最高収率における最も効率的なIVTの結果は、二本鎖DNAプロモーターとそれに続くDNAからRNAへの移行がプロモーター配列の18塩基下流で起こるRNA領域からなるテンプレートから達成された。国際公開第93/22461号および国際公開第2004/044239 A1号は、RNAポリメラーゼのプロモーター、および標的RNAと複合体形成することができるプライマーを有するプロモーターのプライマー３’とを含む「プロモーター・プライマー」（国際公開第2004/044239 A1号では「オリゴヌクレオチド」と称される）を用いて標的RNAを増幅する方法を記載している。US 5 744 308 A1は、キメラオリゴヌクレオチドを用いて標的配列の転写産物または増幅産物を産生する同様の方法を記載している。EP 1 921 156 A1は、RNAポリメラーゼプロモーター、標的核酸の一部に対する相補配列を含むプロモーターオリゴヌクレオチドと標的核酸をハイブリダイズさせる、転写ベースの増幅の方法を記載している。US 2012/003651 A1は、サンプル中の生物の核酸を検出する方法、すなわち核酸にタグを付け、増幅反応においてタグ付けされたcDNAのコピーを生成するステップを含む方法を記載している。国際公開第2016/125106号A1は、マイクロチップ上の細胞のトランスクリプトームを並行して解析する方法を記載している。

５’位のIVTプロモーター配列

あるいは、T7プロモーター配列をテンプレートスイッチ(TS)オリゴヌクレオチドを介して導入することができる。ここで、逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性を介したデオキシシチジン付加は、TS-オリゴヌクレオチドの5'末端までの伸長を継続するための新しいテンプレートとして機能する、３’nG含有TS-オリゴヌクレオチドとの塩基対形成を可能にする。これらの手段により、mRNAの５’末端に二本鎖プロモーター配列が導入される。その後のIVT合成では、同じ配向を有するRNAのコピーを行う。

2012年にaRNA方法が改変され、固定されたpoly(dT)とT7プロモーター配列との間に独自の細胞バーコードおよびイルミナプラットフォーム互換シーケンシングアダプターを含むプライマーを使用してサンプルをマルチプレックスできるようになった(Hashimshony et al., Cell Reports 2012; 2:666-673)。後者の方法はCEL-seqと命名され、多くの細胞をバーコード化し、線形増幅し、配列決定することが可能になった。

これらのプロトコルは広く採用されているにもかかわらず、ほとんどは非常に非効率的であり、RNAインプット分子のごく数パーセントしかシーケンシング用のライブラリに変換しない。すべて、RNA精製、逆転写、および二本鎖DNA合成は、RNAの二本鎖DNAコピーへの変換に関して連続したボトルネックを課す。これらの最初の反応ステップで捕捉されなかったすべての配列は、後続の増幅ステップ、そして最終的にシーケンシング自体で失われる。このような障壁を取り除くことは、低インプット材料、例えば単一細胞由来のRNAだけでなく、複雑な組織サンプル由来のRNAインプットにとっても重要である。希少な転写産物には、調節、機能不全、および疾患の発症を理解するための手がかりが含まれていることが多いため、ディープシーケンシングの重要な目的の1つは、すべてのRNA配列を確実に特定することである。

シングルセルシーケンシングの現在のアプローチは、多数の細胞のRNAの標識およびシーケンシング、低い変換効率のために浅いリード深度でのシーケンシング、非常に豊富なマーカー転写物に基づく細胞のクラスタリング、クラスターのリードを組み合わせて、細胞クラスターの平均ディープシーケンシング結果を得ることに依存している。このような方法は、少量の高存在量の転写産物のみに基づく細胞分化に依存する。遺伝子発現レベルの点で、高分解能は不可能である。

したがって、RNA分子の標識および増幅における制限を克服する方法が必要である。RNAをシーケンシング用のライブラリに変換する各処理ステップは、効率のボトルネックを課すため、RNAインプット自体から始まる、RNA配列を標識および増幅する方法が必要である。

本発明は、転写核酸を生成する方法を提供し、前記方法は、ａ）核酸テンプレートを提供するステップ、ｂ）前記核酸テンプレートにオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズするステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記核酸テンプレートにハイブリダイズする相補部分と、前記核酸テンプレートにハイブリダイズしない相補部分の５’方向の非相補部分とを含み、および転写プロモーターの配列を含む、前記ステップ、ｃ）ステップｂ）における前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする核酸テンプレートの一部分に対して、３’方向に存在する核酸テンプレートの３’部分を加水分解するステップであって、前記３’部分が前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしていない、または前記３’部分が前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしている、前記ステップ、ｄ）前記核酸テンプレートを前記オリゴヌクレオチドプローブの非相補的部分に相補的な核酸で伸長させ、前記核酸テンプレートを有する配列において、前記転写プロモーターの配列の二重鎖を生成するステップ、ｅ）転写プロモーターの配列の二重鎖に結合する転写酵素で核酸テンプレートを転写して、転写された核酸を生成するステップを含む。

一実施形態において、核酸テンプレートの加水分解は、ハイブリダイズされた二本鎖領域内の1つ以上のヌクレオチド結合で行われ、1つ以上の一本鎖「ニック」を生じさせてから、核酸テンプレートを、オリゴヌクレオチドプローブの非相補的な部分に相補的な核酸で開始してニック部位から伸長し、それによって核酸テンプレートと配列中の転写プロモーターの配列の二重鎖を生成する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の方法に適した複数のオリゴヌクレオチドプローブのセットを提供し、前記オリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ、選択したテンプレート配列に相補的な配列、転写プロモーター配列、および少なくとも４ヌクレオチド長の識別配列を含む。

関連する態様において、本発明は、本発明の方法を実施するのに適したキットであって、転写プロモーター配列、３’-＞５’エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、DNAまたはRNAポリメラーゼ、および転写プロモーター配列で転写を開始できる転写酵素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含む。

本発明の全ての態様、方法、セットおよびキットは全て、本発明および本明細書に記載される特定の実施形態に共に関連し、例えば、方法は、セット、それらの構成要素、キットまたは構成要素を利用することができ；セットおよびキットは、本発明の任意の方法を実行するのに適しており、前記方法のための構成要素を含み得る。

プロモーター配列Pを有するL1オリゴヌクレオチドプローブを用いて、RNAから増幅アンチセンスRNA(aRNA)を生産するための概略反応スキーム。インプット材料としての１ngの総RNA、およびポリ(dT)相補配列を有するL1オリゴヌクレオチドプローブを用いる、合成aRNA産物のバイオアナライザートレース。逆転写によるcDNA合成の中間工程で、プロモーター配列Pを有するL1オリゴヌクレオチドプローブを用いてRNAから増幅アンチセンスRNA(aRNA)を生産するための概略反応スキーム。逆転写によるcDNA合成の中間工程で、インプット材料としての20ngの総RNA、およびポリ(dT)相補配列を有するL1オリゴヌクレオチドプローブを用いる合成aRNA産物のバイオアナライザートレース。プロモーター領域Pおよびアダプター配列A1を有するL1オリゴヌクレオチドプローブと、アダプター配列A2を有する第2プライマーとを用いて、aRNAおよびその後のNGSライブラリを生産するための概略反応スキーム。Ａ）10 pgの総UHRR、Ｂ）1 FACSソーティングHEK293細胞、Ｃ）100 pgの総UHRR、およびＤ）10 FACSソーティングHEK293細胞から生成されたaRNA-3'seq NGSライブラリのバイオアナライザートレースのデュプリケート。PCRサイクルは、シーケンシングのために2 nM インデックスNGSライブラリに到達するように適用された。 10および100 pgの精製RNA(UHRR、またはRNAだけでなくゲノムDNAを含む1および10 FACSソーティング溶解HEK293細胞のいずれかで始まる実験の、aRNA-3'seq NGSリードマッピング統計の比較。方法１(M1, NEBNext（登録商標） Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit for Illumina（登録商標）, NEB)を用いた10 pgのuniversal human reference RNA (ThermoFisher Scientific, QS0639)の６つのレプリケート、および方法２（M2, SMART-seq2, Takara Bio, www.takarabio.com/learning-centers/next-generation-sequencing/technical-notes/single-cell-rna-and-dna-seq/highest-sensitivity-for-single-cell-mrna-seq）の公開データ、並びにaRNA-3'seqから同定された遺伝子（CPM＞１）の数の箱ひげ図は、後者の検出率が高く、分散が低いことを示している。 2×4 HEK293細胞間の平均遺伝子発現値の相関プロット。 aRNA-3'seqおよびaRNA-WTS NGSライブラリ調製、並びにアノテートされたヒト遺伝子すべてにわたるマッピングリードの出発物質としてUHRRを用いた、正規化されたゲノムボディカバレッジプロット。RSeQC-2.6.4パッケージ(Wang, Wang and Li, 2012)によって算出される。 SARS-CoV-2の相補配列を含むL1オリゴヌクレオチド、およびランダム配列を有するL2オリゴヌクレオチドを使用した標的aRNA-seq NGSライブラリのバイオアナライザートレース。インプット材料は、反応ごとに名目上2,500および25,000ウイルスコピー(VC)を有するSARS-CoV-2参照RNAである。固体ビーズ表面でaRNAワークフローおよびNGSライブラリ生成を実施するための、L1オリゴヌクレオチドで共有結合的に修飾されたビーズの概略構造。 Arnaud-Barbe et al. (Nucleic Acids Res. 1998, 26(15):3550-4)からのインビトロ転写（IVT）用のテンプレートに関する概略図。上の鎖は非テンプレート鎖であり、下の鎖はテンプレート鎖である。太い線はコンセンサス二本鎖DNAプロモーター領域を表す；細い線はDNA領域である；破線はRNA領域である；＋１は転写の開始部位に対応する；＋18は、開始サイトから下流の18塩基に対応する；ss DNA、一本鎖DNAテンプレート；dsho DNA、ホモ二重鎖DNAテンプレート；ss RNA＋18、一本鎖RNA＋18テンプレート；dshe RNA＋18、ヘテロ二重鎖RNA＋18テンプレート；dsho RNA+18、ホモ二重鎖RNA＋18テンプレート；ss RNA＋１、一本鎖RNA＋１テンプレート；dshe RNA+1、ヘテロ二重鎖RNA＋１テンプレート；dsho RNA+1、ホモ二重鎖RNA＋１テンプレート。３’ポリＡ尾部オーバーハングの加水分解、末端修復、および逆転写をすぐに連続して実行する単一の反応容量を使用して、10 pgの総UHRRから生成されたaRNA-3'seq NGSライブラリのバイオアナライザートレースのデュプリケート。プロモーター配列Pを有するL1オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ニック部位を、ニック部位から二本鎖P領域の合成を開始する前に導入して、RNAから増幅アンチセンスRNA(aRNA)を生産するための概略反応スキーム。プロモーター配列Pを有するL1オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ニック部位を導入して、ニック部位から二本鎖P領域の合成を並行して開始することにより、RNAからアンチセンスRNA(aRNA)を生産するための概略反応スキーム。一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼを用いる３’ポリＡ尾部オーバーハングの加水分解、末端修復、および逆転写をすぐに連続して実行する単一の反応容量を使用して、A)と比較して2つのその後の反応であるB）、およびA)と比較してちょうど１つ組み合わされた反応であるC）において行った二本鎖P領域の合成を開始するためのニック部位を用いて、10 pgの総UHRRから生成されたaRNA-3'seq NGSライブラリのバイオアナライザートレースのデュプリケート。

転写された核酸を生成する方法。本発明方法により、RNA配列などの核酸配列を次世代シーケンシングライブラリに変換することができる。

ステップａ）において、核酸テンプレート(単に「テンプレート」とも呼ばれる)が提供される。核酸テンプレートは、転写のためのテンプレート配列を含むためにそのように命名され、テンプレートの核酸配列を含む核酸分子(転写産物)を増幅および生成するために本発明方法の中で行われる。核酸テンプレートは、RNAまたはDNAであり得る。本発明方法は、メッセンジャーRNA(mRNA)、ノンコーディングRNA(ncRNA)、リボソームRNA(rRNA)、マイクロRNA(miRNA)などのRNAテンプレートの分析に特に適しており、それゆえこれらは好ましい核酸テンプレートである。これらのいずれか1つまたはそれらの組み合わせを、核酸テンプレートとして提供してもよい。DNAとRNAの両方を含むような混合型核酸テンプレートが可能である。好ましくは、核酸テンプレートは、RNAを含むまたはRNAからなる。

本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」(並びに「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などの、含む（comprising）の任意の形態)、「有する(having)」(並びに「有する(have)」および「有する(has)」などの、有する(having)の任意の形態)、「含む(including)」(並びに「含む(includes)」および「含む(include)」などの、含む（including）の任意の形態)、または「含む(containing)」(並びに「含む(contains)」および「含む(contain)」などの、含む（containing）の任意の形態)という用語は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる述べられていない要素または方法ステップを排除するものではない。「含む(comprising)」という表現は、その要素の特定の値の数値範囲と組み合わせて要素に対して使用される場合、その要素がその範囲に限定されて、「含む(comprising)」は他の要素の任意選択の存在に関連することを意味する。例えば、ある範囲を有する要素は、その範囲外の量におけるその要素の存在を除外するという暗黙の条件の対象となり得る。本明細書で使用される場合、「本質的に、～からなっている」という語句は、指定した整数（単数または複数）またはステップ、並びに特許請求された本発明の特徴または機能に実質的に影響を及ぼさないものを必要とする。本明細書で使用される場合、閉じた用語「からなる」は、列挙された要素の存在のみを示すために使用される。

テンプレートは、他の核酸分子との混合物で提供することができ、テンプレート以外の他の核酸タイプ(例えばRNAまたはDNAなど)との混合物でも提供することができる。

好ましくは、核酸テンプレートは20～100,000ヌクレオチド、好ましくは、50～20,000ヌクレオチドの長さである。

提供されるテンプレートは、細胞から精製または単離されてもよく、または例えば細胞溶解物として、未精製で提供されてもよい。細胞溶解物を使用する場合、テンプレートを消化するヌクレアーゼは、好ましくは、例えば温度上昇などの変性によって、または消化、例えばヌクレアーゼの酵素的切断によって不活性化される。テンプレートがRNAの場合、不活性化されるヌクレアーゼはRNasesであり、テンプレートがDNAの場合、不活性化されるヌクレアーゼはDNasesである。好ましくは、このステップはプロテイアネーゼ、例えばRNasesおよび／またはDNasesを不活性化するプロテイアネーゼでの処理である。

次いで、本発明方法のステップｂ）において、オリゴヌクレオチドプローブが核酸テンプレートにハイブリダイズする。前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記核酸テンプレートにハイブリダイズする相補部分と、前記核酸テンプレートにハイブリダイズしない相補部分の５’方向の非相補部分とを含むものとする。非相補部分は、転写プロモーターの配列を含む。

オリゴヌクレオチド分子およびポリヌクレオチド分子は、分子の５’末端および３’末端に従って方向性を有する。「５’方向」は、「上流」または「３’-＞５’方向」とも呼ばれ、５’末端に向かう方向を指す。「３’方向」は、「下流」または「５’-＞３’方向」とも呼ばれ、３’末端に向かう方向を指す。この方向性は、記載されている分子または鎖に関して与えられる―これはコーディング鎖である場合とそうでない場合がある。記載されたオリゴヌクレオチド分子およびポリヌクレオチド分子に対するハイブリッド中の相補鎖は、反対の方向性を有する。

「相補部分」および「非相補部分」は、ステップａ）において、それぞれハイブリッドを形成するまたはハイブリッドを形成しない核酸ヌクレオチド間の相補的部分を指す。相補性は、後の方法ステップにおいてヌクレオチドを改変することによって変化し得る。好ましくは、相補部分は10～100ヌクレオチド長、好ましくは12～50ヌクレオチド長である。

オリゴヌクレオチドプローブをヌクレオチドテンプレートにハイブリダイズすることにより、テンプレートとのヌクレオチドハイブリッドが形成され得る。オリゴヌクレオチドプローブは、ポリメラーゼによって(プライマーとして)伸長可能であり得、またはそうでなくてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブはDNA分子であり、特にプライマーにハイブリダイズする相補部分中にDNAヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドプローブはまた、LNAヌクレオチド、２’-フルオロヌクレオチド、または２’-Ｏ-メチルヌクレオチドなどの修飾核酸を含み得る。好ましい場合のようにテンプレートがRNAである場合、ハイブリッドはRNA-DNAハイブリッドであり得る。

オリゴヌクレオチドプローブを介して、本方法は、インビトロ転写(IVT)に適した転写プロモーター配列を導入する。このプロモーターは、相補部分に対して５’方向にあり得る。この転写プロモーター配列は、例えばステップｄ）においてポリメラーゼでテンプレートを伸長させることによって、または例えばステップｄ）において相補的オリゴヌクレオチドをライゲーションすることによって、転写プロモーターの二本鎖がテンプレートと連続して生成されるように、本方法の間ステップｄ）において一本鎖であるべきである。相補的オリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドプローブ中に二本鎖として存在し得、転写プロモーターにハイブリダイズされた前記相補的オリゴヌクレオチドは、次いで、前記テンプレートに連結される。好ましくは、転写プロモーターは、ステップｂ）および／またはステップｃ）においても一本鎖として維持される。

転写プロモーター配列Pは、インビトロセットアップにおいて転写を開始することができる任意のプロモーター配列であり得る。プロモーターは、T7、T3またはSP6、もしくは転写酵素、好ましくはRNAポリメラーゼが利用可能な任意の他のプロモーターであり得る。プロモーターは、ステップｅ）における対応する転写酵素、例えばT7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼと共に使用される。好ましい実施形態において、プロモーターはT7プロモーターである。プライマー中のプロモーター配列の配向は、核酸テンプレートの５’末端に向かって転写を開始するようなものである。

本発明方法は、ｃ）ステップｂにおいてオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする核酸テンプレートの一部に対して３’方向にある核酸テンプレートの３’部分を加水分解することをさらに含む。第１の実施形態において、前記核酸テンプレートの３’部分は、３’部分としてオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされない方がよく、欠失または挿入なしに前記オリゴヌクレオチドプローブに整列される場合、前記オリゴヌクレオチドプローブの非相補的部分と停止することになる。あるいは、前記３’部分が前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。

第１の実施形態において、核酸テンプレートのこの３’部分は、一本鎖３’オーバーハングとも称される。ステップｃ）における加水分解は、本発明の全ての実施形態において、好ましくは一本鎖特異的である。好ましくは、二重鎖に達する、すなわち一本鎖特異的加水分解に利用可能なさらなる一本鎖が存在しなくなるまで、３’末端から５’方向に一度に１ヌクレオチドずつの、段階的な加水分解である。エキソヌクレアーゼはそのような反応を行うことができる。

この３’オーバーハングを加水分解することは、消化、特に酵素消化であり得る。それは、当該一本鎖３’オーバーハングに特異的でなければならず、それによりオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされるテンプレートを維持しなければならない。このような加水分解の好ましい例は、エキソヌクレアーゼ、好ましくは３’-＞５’方向のヌクレオチドの除去を触媒する一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによるものである。好ましくは、テンプレートが、少なくとも３’オーバーハングにおいてRNAである場合に、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、一本鎖RNA特異的エキソヌクレアーゼである。一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、特にエキソリボヌクレアーゼは、本発明方法のステップｃ）において３’部分がオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしない場合に好ましく用いられる。

エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方を本発明方法において使用することができるが、エンドヌクレアーゼは以下の段落においてさらに説明され、エキソヌクレアーゼが好ましい実施形態である。RNase Hのようなエンドヌクレアーゼは、加水分解によって、二本鎖、特にRNA：DNAハイブリッドを切断または「ニック」する。四量体と同じくらいの短さである二本鎖はエンドヌクレアーゼを誘発し得るため（RNase H活性について、Donis-Keller, Nucleic Acids Res. 1979, 7(1): 179-192参照）、RNA加水分解は二本鎖に沿って異なる位置で、そのような設定で起こる(RNA/DNAハイブリッド)。非常に短いハイブリッドが生じ得る。二本鎖領域の末端付近での加水分解は、ほんの数ヌクレオチド、例えば２または３ヌクレオチドによってハイブリダイズされる短い断片をもたらし得る。これらの短いハイブリッドは、一本鎖のみを残す二本鎖の解離をもたらし得る。このような一本鎖解離生成物は、本発明方法では処理できず、生成物の損失につながる。これは、相補配列の長さがいくつかの加水分解事象を許容する場合、一本鎖(RNA)断片の数の増加とともに悪化する。これにより、タグ付けされた標的テンプレートが減少し、標的の検出効率が低下する。

代替的に、核酸テンプレートを加水分解する第２の実施形態は、好ましくはエンドヌクレアーゼ、例えばテンプレートがRNAである場合にはリボエンドヌクレアーゼを用いて、ハイブリダイズした二本鎖領域における、核酸ストランド（例えば、ホスホジエステル結合）の糖リン酸骨格において行われ、一本鎖の「ニック」を生成する。この場合、短い配列間の結合が弱いと、３’オーバーハング全体が解離する可能性がある。あるいは、ニックの下流のハイブリダイズされた部分は、ハイブリダイズされた下流部分および３’オーバーハング全体を解離させるステップｄ）での伸長中に変位する。糖リン酸骨格は、通常ペントース、例えばリボースまたはデオキシリボース、およびリン酸部分などの糖鎖を含み、これらは通常エステル結合によって連結されている。上記の段落で述べたように、エンドヌクレアーゼは生成物の損失をもたらす可能性がある。一方で、エンドヌクレアーゼは、単一の加水分解イベントにより処理可能な生成物がもたらされる可能性があり、核酸テンプレートの３’部分を段階的に加水分解する必要がないという、エキソヌクレアーゼを超える利点を有する。これはより速い反応をもたらす可能性がある。

「ニック」は、二本鎖ポリ核酸分子、例えば、RNAまたはDNAにおける切れ目であり、糖リン酸骨格が破壊される、例えば、一方の鎖の隣接するヌクレオチド間にホスホジエステル結合が存在しない、または糖環が典型的には損傷または酵素作用によって切断される。ニック部位のもう一方の鎖はホスホジエステル結合を含み、ポリマーの連続性を維持し、それによってニックされた鎖の２つの隣接する部分を両方の部分とのハイブリダイゼーションによって共に保持することができる。ニック部位に連続的な糖リン酸骨格がないことは、加水分解の結果であり得る。本発明の実施形態において、核酸テンプレートは、(例えばホスホジエステル結合の加水分解を介して)ニックされることができ、それによりニックされ得る２つのポリ核酸分子を生じる。

好ましくはこの第２の実施形態において、加水分解は、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする領域における、テンプレート中のホスホジエステル結合を加水分解して、それによりテンプレートにニックを導入することを含む。加水分解は、好ましくはエンドヌクレアーゼ、例えばリボエンドヌクレアーゼによるものである。エンドヌクレアーゼは、好ましくは二本鎖特異的であり、すなわち二本鎖を特異的に加水分解するが一本鎖は加水分解しない。

この実施形態によれば、ステップｃ）は、ステップｂ）においてオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする核酸テンプレートの一部に対して３’方向に存在し、前記３’部分は、前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされる、核酸テンプレートの３’部分を加水分解することを必要とする。両方の要件は、加水分解が、テンプレートに関して５’から３’で、テンプレートの一部がオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされ、続いて1つ以上の加水分解部分（例えばニック）が続き、その後にまだハイブリダイズしているが後に除去される部分が続く部位にあることを意味する。ハイブリダイズ領域における第１のニックの５’に位置する部分は、ステップｄ）において核酸テンプレート(の残りの部分)として延長される３’末端を有する。ニック（３’部分）の３’方向に位置するテンプレート部分は、例えば核酸伸長ステップにおけるストランド置換によって除去される。

ニックが導入される、「ハイブリダイズされた二本鎖領域」とは、核酸テンプレートがオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする領域である。上記の原理に基づいて、ニックは、このハイブリダイズされた二本鎖領域の内部に導入されるが、ニックの両側に二本鎖が存在するため、末端には導入されない。

第一の実施形態において、加水分解は通常、ハイブリダイズされた二本鎖領域まで起こるが、ハイブリダイズされた二本鎖領域を除く。

したがって両実施形態によれば、「核酸テンプレートの３’部分を加水分解する」は、ニックのヌクレオチド結合を（例えばエンドヌクレアーゼによって）加水分解し、したがって例えば第１の実施形態によるエキソヌクレアーゼによって、３’部分への共有結合、または３’部分におけるいくつかのヌクレオチド結合を切断することを意味し得る。３’部分における数個のヌクレオチド結合を加水分解することは、一塩基への３’部分の加水分解を含んでもよい。

次いで、本発明方法は、オリゴヌクレオチドプローブの非相補部分に相補的な核酸(ヌクレオチド)で核酸テンプレートを伸長させるステップｄ）に続き、それにより核酸テンプレートと配列中の転写プロモーターの配列の二重鎖を生成する。核酸テンプレート（たとえばサンプルから）をその３’末端（ステップcにおいて加水分解が行われた残りの末端、またはニックされたポリ核酸分子の1つの３’末端、すなわち３’末端がニックにあるポリ核酸分子）でテンプレート特異的に（この場合、伸長のための「テンプレート」が、例外的にオリゴヌクレオチドプローブである）伸長させることにより、もともとステップｂ）では非相補的な部分にあった、核酸テンプレートと、もともとステップｂ）では非相補的な部分にあった、転写プロモーターに及んで転写プロモーターを含むオリゴヌクレオチドプローブとの間に二重鎖のより長い相補領域が生成される。

このような伸長反応は、例えばポリメラーゼを用いることにより、５’-＞３’方向への任意のプライマーベースの伸長の原理に従う。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの５’方向にオリゴヌクレオチドプローブに相補的である１つ以上の核酸とのライゲーションにより、オリゴヌクレオチドプローブのこの５’部分、および ― 核酸テンプレートへの後のライゲーション後に ― 核酸テンプレート(ここで、３’部分はステップｂにおいてオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした部分と共に３’方向に存在する)と二重鎖を生成することができる。

伸長にはＤＮＡヌクレオチドを用いることが好ましい。例えば、核酸テンプレートがＲＮＡである場合、この場合には混合ＲＮＡ-ＤＮＡ分子／ストランドが生成される。

テンプレートの伸長は、好ましくは、例えばポリメラーゼを用いることによるヌクレオチド重合によるものであり、特にＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、そして特に、ニック部位から始まる重合のためのストランド置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。これらの手段により、導入された(オリゴヌクレオチドプローブの)一本鎖プロモーター配列は二本鎖となり、好ましくは、ＤＮＡ二本鎖となる(オリゴヌクレオチドプローブもＤＮＡである場合)。ストランド置換活性を有するポリメラーゼは、ニックが二本鎖領域内にあり、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしているテンプレートの３’部分をポリメラーゼ自体によって除去することができるため、第２の実施形態において好ましい。その他の実施形態において、テンプレートの３’部分の除去は、脱ハイブリダイゼーションまたは解離、例えば核酸の融解および／または塩濃度の変化によって行うことができる。

ニックを有する実施形態において、ステップｃ）およびｄ）は、以下のように書くこともできる：
ｃ）ハイブリダイズした二本鎖領域におけるヌクレオチド結合を加水分解して、１つ以上の一本鎖「ニック」を生成すること、
ｄ）核酸テンプレートをオリゴヌクレオチドプローブの非相補部分に相補的な核酸で、ニック部位から開始して伸長させ、それにより配列中の転写プロモーターの配列と核酸テンプレートとの二重鎖を生成すること。

本発明方法は、ｅ）転写プロモーターの配列の二重鎖に結合する転写酵素を用いて核酸テンプレートを転写することを続ける。転写された核酸を、特に数コピーで、―許容される時間および転写反応のために提供されるヌクレオチドの量に依存して―、生成するこのステップは、転写酵素を使用することによるものである。生成された転写核酸は「転写産物」とも呼ばれる。反応は、好ましくは、核酸テンプレート分子(前のステップで修飾されたもの)をテンプレートとして使用する直鎖状インビトロ転写(IVT)である。転写は、好ましくは、RNA転写産物を生成するが、それらは、核酸テンプレートから転写される場合、核酸テンプレートに対してアンチセンスであり、そのcDNA由来ではないため、増幅アンチセンスRNAまたは「aRNA」とも呼ばれる。

得られた転写産物(aRNAなど)は、シーケンシング用のタグ付加ライブラリの調製などの下流の分析に使用でき、特にナノポアシーケンシングなどの第３世代シーケンシングアプローチによるダイレクトRNAシーケンシングだけでなく、次世代「ショートリード」シーケンシングにも適している。この段階では、断片化およびアダプタータグ付加反応は、すべての転写産物がすでに多数のコピーに存在するため、もはや制限ステップを課さない。

本発明方法の利点は、サンプルの核酸テンプレート分析が効率を向上させ、特により高い割合のテンプレート分子から転写産物を生成することである(背景技術のセクションで説明されている問題の説明を参照)。本発明法を用いるトランスクリプトームまたは遺伝子発現解析は、はるかに改善された感度を有する。本方法はまた、ＰＣＲ効率が配列断片ごとに異なる場合に偏りのない存在量決定を妨げる傾向があるという、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)による増幅の問題を回避することができる。本発明方法は、ほぼすべての、しかし７５％以上の核酸テンプレート分子を転写産物に変換し、シーケンシング用のライブラリにリンクすることを可能にする。この方法は、微量の総核酸テンプレート量、例えば10,000分子未満から始めることができるが、それ以上の分子から始めることもでき、例えば単一細胞中にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、または10pgで精製された総ＲＮＡ、およびそれ以下またはそれ以上として含まれる。核酸テンプレートは1,000～1,000,000,000分子、好ましくは10,000～100,000,000分子、より好ましくは50,000～10,000,000分子、特に好ましくは100,000～1,000,000分子の量で存在することが好ましい。

好適には、本発明方法は、相補部分から核酸テンプレートにハイブリダイズしたときにオリゴヌクレオチドプローブを伸長させるステップをさらに含む。この場合、オリゴヌクレオチドプローブはプライマーとして作用し、テンプレート依存的にヌクレオチドを添加することによってプローブの３’方向に伸長される(核酸テンプレートがこの反応のテンプレートとなる)。本反応に関して好ましくは、相補部分は、オリゴヌクレオチドプローブ分子の末端ヌクレオチド、すなわち伸長され得る末端を含み、好ましくは３’末端である。拡張可能にするには、アクセス可能な３’ＯＨが存在しなければならない。この伸長は、好ましくはポリメラーゼ反応である。特に好ましくは、テンプレートがRNAである場合(少なくとも伸長方向、すなわちテンプレートに対してテンプレート-プローブハイブリダイズされた部分から５’方向の部分で)、伸長は好ましくは逆転写酵素を用いた逆転写（ＲＴ）である(図５、ステップ１参照))。

このオリゴヌクレオチドプローブの伸長は、好ましくは、ステップｂ）の後、ステップｃ）の前または後、ステップｄ）の前または後、しかしステップｅ)の前に行われる。特に好ましいのは、ステップｂ）の後およびステップｃ）の前である。例えば、前記伸長は、ステップｂ）とｃ）の間、ステップｃ）とｄ）の間、またはステップｄ）とｅ）の間である。

オリゴヌクレオチドプローブを伸長させて、オリゴヌクレオチドプローブに対して相補部分の３’方向に二本鎖領域を生成するステップは、分子の安定性を増大し、並びに／もしくはテンプレート核酸の二次構造、特にＲＮＡの二次構造を公開および／または除去し、したがって、方法の効率を高める。この改善による利益を増大させるために、該ステップは、好ましくは早い段階で、例えばステップｃ）の前に実施される。

上記のようにニックを導入した第２の実施形態では、伸長を伴うステップc)およびd)は、以下のように記述することもできる。
ｃ１）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するオリゴヌクレオチドプローブを伸長すること、
ｃ２）二本鎖領域内のヌクレオチド結合を加水分解して１本以上の一本鎖「ニック」を生成すること、
ｄ）核酸テンプレートをオリゴヌクレオチドプローブの非相補部分に相補的な核酸でニック部位から開始して伸長させ、それによって核酸テンプレートと配列中の転写プロモーターの配列の二重鎖を生成すること。

好ましい実施形態において、ステップａ）で定義されるオリゴヌクレオチドプローブの非相補部分（ステップａにおいて、核酸テンプレートとハイブリダイズする相補部分の５’）は、相補部分と転写プロモーターの配列との間に、識別配列および／または第１アダプター配列を含む。

当該識別配列は、ステップa）において1つの容器内に提供されるようなサンプル、細胞または核酸テンプレートを識別することができる。識別配列は、核酸テンプレートおよび／または転写産物が後の方法ステップで共にプールされる場合に、後の多様な反応を可能にする。いくつかの核酸テンプレートおよび／または転写産物並びに／もしくはそれらの増幅コピーの混合物においても、サンプル間または細胞間もしくは核酸テンプレート間で異なる識別配列に従って、特定のサンプル、細胞または核酸テンプレートに属することを識別することができる。もちろん、任意のそのような識別子は、組み合わせることができる(例えば、核酸テンプレート特異的識別子（ＵＭＩ）および細胞特異的識別子(「Cell Index」)を含む図１２を参照されたい)。このようなサンプル特異的識別配列は、「サンプルバーコード」とも呼ばれる。その他の識別配列は、１つのサンプル中または１つの細胞からの転写産物コピーのような、同一配列の複数のコピーを識別する配列であり得る。このような識別配列は、一意分子識別子（ＵＭＩ）である。サンプル識別子は、オリゴヌクレオチドプローブで使用され得、ここで、特定のサンプルで使用される全てのオリゴヌクレオチドプローブは、同じ識別子を有するが、異なるサンプルに適用される場合には異なる識別子を有する；細胞識別子は、オリゴヌクレオチドプローブで使用され得、ここで、特定の細胞で使用される全てのオリゴヌクレオチドプローブは、同じ識別子を有するが、異なる細胞に適用される場合には異なる識別子を有する。サンプルまたは細胞は、オリゴヌクレオチドプローブでの処理のために、それぞれ他のサンプルまたは細胞から単離され得る。核酸テンプレート特異的識別子（ＵＭＩ）は通常、異なる識別子を含む各オリゴヌクレオチドプローブと共に使用される。この場合、個々の分子の単離は必要ではないが、もちろん可能である。サンプルまたは細胞もしくは核酸テンプレート特異的識別子配列は、好ましくは4～16、好ましくは6～12ヌクレオチド長の配列である。核酸テンプレートの異なる試料を同定する、異なる細胞を同定する、または異なる核酸テンプレートをそれぞれ同定する異なる識別配列は、互いに相違し、好ましくは少なくとも１、好ましくは２以上、好ましくは３以上のハミング距離であり、または好ましくは少なくとも１、好ましくは２以上、好ましくは３以上のレーベンシュタイン距離である。核酸テンプレート特異的識別子（ＵＭＩ）は、同一配列のすべての分子について異なることが好ましく、これは、ＵＭＩの数が、最も豊富な転写産物の数を超えることを意味し、ＵＭＩがランダムな配列によって作られる場合、好ましくはこの存在量を10倍超える。本発明法によって得られた転写産物は、１つの特定のテンプレートに由来するコピーであり、ＵＭＩによって１つのテンプレート分子に由来するように追跡され得る。あるいは、またはそれらに組み合わせて、例えば２つの識別配列を使用することにより、サンプルまたは細胞は、ＵＭＩがテンプレート分子を識別すると同時に、１つの識別配列で識別され得る。識別配列は、好ましくはIVT反応によりコピーされるためのオリゴヌクレオチドプローブに関して、プロモーターに対して３’方向である。

好ましい実施形態において、当該アダプターは、ナノポアシーケンシング用のシーケンシングアダプターに適合する。例えば、該アダプターは、ナノポアモータータンパク質結合のための配列、例えばＹアダプターを含み得る。

アダプター配列は、すべてのサンプル／核酸テンプレートで同一である場合とそうでない場合がある。好ましくは、すべてのサンプル／核酸テンプレートについて同一である。アダプターは、アダプター配列またはその相補配列を含む配列を有する核酸に、プライマーまたはプローブを結合するために、もしくはアダプター配列またはその相補配列を含む配列を有する核酸を、アダプター配列またはその相補配列にハイブリダイズする核酸に結合するために、使用され得る。また、該アダプター配列を含む配列を有する核酸は、転写産物またはそのさらなる増幅産物であり得る。したがって、アダプターは、それまたはその相補配列を含む任意の核酸の、さらなる取り扱いまたはさらなる増幅を可能にする。アダプター配列は、好ましくは4～30ヌクレオチド長、特に好ましくは6～25ヌクレオチド長、またはさらに好ましくは8～20ヌクレオチド長である。

アダプター配列は、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブに関して、プロモーターに対して３’方向である。

さらなる好ましい実施形態において、本発明方法は、１つ以上の転写された核酸に１つ以上の二次プライマーをハイブリダイズし、二次プライマーをテンプレート依存的に伸長させることを含む。二次プライマーを転写産物に結合させ、転写産物をテンプレートとしてプライマーを伸長させることにより、転写産物に相補的な配列を有する核酸分子が得られる(図５のステップ５を参照；二次プライマーはその中で「Oligo-L2」と称される)。当該二次プライマーは、予想される又は既知の転写産物の配列に基づき予め選択され得る、任意の配列部分又は特定の配列上で転写産物に結合し得る。転写産物の任意の部分での結合は、例えば、ランダムプライマー、例えば、ランダムオリゴマー（例、ランダムヘキサマー、プライマー）などの、様々なハイブリダイズ配列を有するプライマーの混合物によって促進することができる。好ましくは、二次プライマーは、５～３０ヌクレオチド長、好ましくは、６～２０ヌクレオチド長の配列を有する転写産物とハイブリダイズする。

好ましくは、二次プライマー（単数または複数）は第２のアダプター配列を含む。アダプター配列は、転写産物-結合配列に関係なく、すべての二次プライマーについて同じであることが好ましい。アダプターは、アダプター配列またはその相補配列を含む配列を有する核酸にプライマーまたはプローブを結合するために、またはアダプター配列またはその相補配列を含む配列を有する核酸を、アダプター配列またはその相補配列にハイブリダイズする核酸に結合するために使用され得る。第２のアダプター配列を含む配列を有する核酸は、上記のような核酸分子であり得る。アダプターは、それまたはその相補配列を含む任意の核酸の、さらなる取り扱い又はさらなる増幅を可能にする。第２のアダプター配列は、好ましくは4～30ヌクレオチド長、特に好ましくは6～25ヌクレオチド長、またはさらに好ましくは8～20ヌクレオチド長である。二次プライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーのアダプター配列とともに、１回の増幅ステップ(第１鎖合成)のみで、ＮＧＳランで直接(すなわち、さらなる増幅またはＰＣＲなしで)使用され得る２つのアダプターを有する、完全長フラグメントを生成することができる。二次プライマーのアダプターは、任意選択で、識別配列を有し得る。オリゴヌクレオチドプローブの識別子配列についての説明と同様のことが、二次プライマーのこの任意選択の識別子配列にも適用される。

非相補部分のアダプター(ステップｂに存在するような)と二次プライマーのアダプターとの組み合わせが、特に好ましい。これにより、両端またはその近くに、すなわち目的のテンプレート配列に隣接して、アダプターまたはその相補配列を有する核酸分子を生成することができる。これにより、ＰＣＲの１つ以上のサイクルにおける選択および増幅、または一方もしくは両方のアダプター配列もしくはその相補配列による、シーケンシング固相での結合が可能になる。

本発明方法には、非常に高い感度という利点がある。これにより、単一細胞またはその細胞小器官もしくはコンパートメント、例えば、ミトコンドリア（ｍｔＲＮＡなど）やエクソソームからの核酸の分析が可能になる。好ましくは、核酸テンプレートは、細胞小器官、細胞切片、もしくは細胞からのＲＮＡもしくはＤＮＡ、好ましくはＲＮＡ、好ましくは1～1000個の細胞、細胞小器官、細胞切片もしくは細胞を含む、またはそれらからなる。細胞切片は、例えば、空間的トランスクリプトミクスのワークフローにおいて樹状突起を切断する。当該細胞切片は、本発明方法のための適切なテンプレートとして、特徴的なＲＮＡを含み得る。

核酸テンプレートは、核酸の混合物中に存在してもよく、その他の種類の核酸(ＲＮＡまたはＤＮＡ)などのテンプレートでなくてもよい核酸を含む、またはオリゴヌクレオチドプローブが結合しない配列を含む。テンプレートではない核酸のさらなるカテゴリーは、さらなる処理、例えば、ステップｂ）におけるオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、ステップｃ）における３’部分の加水分解、またはステップｄ）における核酸テンプレートの伸長で除去されるか、またはアクセス不能にされた核酸であり得る。特に好ましい実施形態において、核酸テンプレートは、ＤＮＡを含む核酸のプール中にある。核酸テンプレートは、好ましくはＲＮＡである。好ましくは、ＤＮＡはステップｃ）において加水分解されないが、ＲＮＡは加水分解される。例えば、ＲＮＡ３’部分は、ＲＮＡ特異的エキソヌクレアーゼによって消化され得る。ニックを導入した実施形態において、二本鎖部分のテンプレート中のホスホスジエステル結合を加水分解することができる酵素、例えばエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡではなくＲＮＡテンプレートを加水分解し得る。そのような酵素は、リボエンドヌクレアーゼであり得る。したがって、そのようなテンプレートでない核酸は、テンプレートがＲＮＡである場合のＤＮＡと同様に、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で処理されないことにより、ステップｅ）におけるその後の転写から除外されるようになる。これは、ＲＮＡテンプレートの場合、転写された核酸の生成物の(ＤＮＡからの)ゲノム汚染が低減されるという利点を有する。

本発明方法のさらなる利点は、本発明方法を他の核酸の混合物で行うことができることである。ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）、またはステップｂ）およびｃ）、もしくはステップｃ）およびｄ）、もしくはステップｂ）～ｄ）などのそれらの任意の組み合わせ、特にはこれらのすべてのステップでの反応生成物の精製が、必要でない。

取り扱いを容易にするために、ステップは、１つの容器、例えばフラスコ、バイアル、バッグ、シリンジ、またはウェルプレート上のマイクロウェルを含むウェル、または他の任意の保持手段もしくは適切なカプセル化で行われる。好ましい実施形態において、本発明方法は、核酸テンプレートを容器内に提供して、前記容器内でステップｂ）～ｅ）を実行することを含む。テンプレートは、好ましくは、ステップｅ）まで前記容器内に留まる、および／またはステップｅ）の前に前記容器から取り出されない。ステップｂ）の前に、テンプレートの洗浄または精製を必要としなくてもよい。いくつかのステップは、組み合わせて、例えばステップｃ）およびｄ）と組み合わせて実行することもできる。したがって、ステップｃ）に適したエキソヌクレアーゼとステップｄ）に適したポリメラーゼとを、反応混合物中で組み合わせることができる。ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼが、オリゴヌクレオチドの相補部分に対するテンプレートの３’オーバーハング（平滑末端化）を取り除いたときに、活性状態になり、ポリメラーゼが活性状態になり、オリゴヌクレオチドプローブの非相補部分(ステップｂにおいて前述)に依存してテンプレートを伸長することにより、テンプレートとプローブの二重鎖の伸長を開始することができる。

好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば固相への結合によって、ステップｅ）の前に除去される。

本発明方法は、反応混合物にさらなる試薬を添加して、酵素活性および反応条件を相補するだけで、１つの単一の徐々に増加する体積で実施することができる。

細胞から核酸を提供する場合、核酸テンプレートを分解する、または方法のその後の反応の反応を妨げる酵素などの細胞含有物は、核酸テンプレートが影響を受けないように不活性化されるべきである。本発明方法は、好ましくは、1つ以上の細胞、例えば1～1,000個の細胞を提供し、細胞材料を溶解し、酵素を、好ましくはプロテイナーゼによって不活性化し、それにより前記細胞の核酸をステップａ）に記載の核酸テンプレートとして証明することを含む。好ましくは、RNasesは、特にテンプレートがRNAを含む又はRNAからなる場合に不活性化され；好ましくは、DNasesは、特にテンプレートがDNAを含む又はDNAからなる場合に不活性化される。プロテイナーゼの一例としてはプロテイナーゼkが挙げられる。核酸テンプレートを調製した後、プロテイナーゼは好ましくは不活性化、例えば熱不活性化される。その後、例えばステップｂ）～ｅ）において、熱不活性化は必要とされないが、もちろん任意選択で行うことができる。

本発明の特定の実施形態において、リボソームRNA(rRNA)の枯渇は、rRNAを区別またはそれぞれ選択する選択的プライミングによって、回避または改良することができる。

本発明はさらに、本発明方法に適した複数のオリゴヌクレオチドプローブのセットを提供する。セットにおいて、前記オリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ、選択したテンプレート配列に相補的な配列、転写プロモーター配列、および少なくとも４ヌクレオチド長の識別配列を含む。選択したテンプレート配列の相補配列は、例えば、少なくとも６つの連続するＴのポリ（ｄＴ）配列である。このようなポリ（ｄＴ）配列は、ｍＲＮＡなどのテンプレートに見出されるポリ（Ａ）配列と相補的である。

前記複数は、好ましくは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上；例えば、2～100,000,000である。「複数のオリゴヌクレオチドプローブ」は、種々のオリゴヌクレオチドプローブ分子を指す。これらのオリゴヌクレオチドプローブ分子は、それらのヌクレオチド配列において異なっていても、異なっていなくてもよい。好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブが前記複数、例えば2～1,000の異なるオリゴヌクレオチドプローブで提供される。違いは、好ましくは、識別配列に存在する。識別配列は、上述したとおりであり得、例えば、好ましくは4～12ヌクレオチド長である。好ましくは、異なる識別配列は、少なくとも、好ましくは2以上、好ましくは3以上のハミング距離、または少なくとも、好ましくは2以上、好ましくは3以上のレーベンシュタイン距離で互いに異なる。好ましくは少なくとも２つの複数のオリゴヌクレオチドプローブについて、識別配列が異なる。識別配列は、上述のようなサンプル、細胞または核酸テンプレート特異的識別配列であり得る。核酸テンプレート特異的な識別配列の場合、好ましくは、各オリゴヌクレオチドプローブは、他のオリゴヌクレオチドプローブの識別子配列と相違する、異なる識別配列を含む。細胞特異的またはサンプル特異的な識別配列の場合、セットは、グループ内でオリゴヌクレオチドプローブの他のグループの識別子配列とは異なる同じ識別子配列を有する、オリゴヌクレオチドプローブのグループを含み得る。セットは、2、3、4、5、6、またはそれ以上の、そのような異なる基を含み得る。核酸テンプレート特異的識別子配列、並びに細胞および／またはサンプル特異的識別子配列は、例えば２つ以上の識別子配列を含むプローブのセットと共に、同時に使用され得る。転写プロモーター配列は複数のオリゴヌクレオチドプローブについて同一であることが好ましい。

好ましい実施形態において、前記セットのオリゴヌクレオチドプローブの転写プロモーター配列は一本鎖である。前述の通り、それは代替的に二本鎖であってもよいが、核酸テンプレートの伸長が起こり得るように、ステップｄ）の前に一本鎖に転換されるべきである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、それらの全長において一本鎖である。

本発明はさらに、該発明方法を実施するのに適したキットを提供する。提供されるキットは、転写プロモーター配列、３’-＞５’エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、および転写プロモーター配列で転写を開始できる転写酵素を含有する、オリゴヌクレオチドプローブを含む。３’-＞５’エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼは、代替的に、すなわちそれらのうち一方として提供されても、またはそれらの両方がキットに含まれてもよい。

好ましい実施形態において、キットは、dNTPs、細胞溶解試薬、プロテイナーゼ、逆転写酵素、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。キットはまた、上記のようなセットのオリゴヌクレオチドプローブを提供してもよい。例えば転写プロモーター配列は、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼまたはSP6 RNAポリメラーゼのプロモーターであり得る。

前記オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは12～100ヌクレオチド長である。それらは、本発明方法に関して上述したとおりであり得る。

３’-＞５’エキソヌクレアーゼは、本発明方法のステップｃ）に好適なものでなければならない。一例としてはエキソリボヌクレアーゼが挙げられる。エキソリボヌクレアーゼは、ステップｃ）において３’部分がオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしない場合に好ましく用いられる(例えば、一本鎖エキソリボヌクレアーゼ)。

ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼは、本発明の方法のステップｄ）に適しているものでなければならず、核酸テンプレートを伸長して、オリゴヌクレオチドプローブの非相補部分(ステップｂにおいて前述)を有する二本鎖を生成する。

転写酵素は、本発明の方法のステップｅ）に適しているものでなければならず、機能的転写プロモーター配列の存在に依存して、すなわちステップｄ）で生成された二重鎖において転写を促進する。

キットのさらなる任意の構成要素は、ヌクレオチド、例えばdNTPsおよび／またはNTPsであり得る。ヌクレオチドは、プライマープローブまたはテンプレートにヌクレオチドを添加するためのステップｄ）における伸長またはステップｅ）における転写に適していなければならない。ヌクレオチドは、通常実験室で入手可能であることから、ヌクレオチドは豊富に入手可能であるため、発明キットに提供されない場合がある。

細胞から核酸テンプレートを提供するステップａ）のための細胞溶解試薬が存在し得る。この場合も、この化合物は他の場所で容易に入手可能であるため、キットに付属していなくてもよいが、便宜上含まれていることが好ましい。

細胞溶解物中のRNasesまたはDNasesを除去するために、プロテイナーゼがキットに含まれ得る。この構成要素も、他の場所で入手可能であるために任意選択である。

逆転写酵素は、核酸テンプレートに依存してオリゴヌクレオチドプローブを３’方向に伸長させる任意のステップのために含まれ得る。上記のように、これはテンプレートの安定性を高め、本発明方法の感度を高めることができる。

セットおよび／またはキットは、本発明方法を実行するための使用説明書をさらに含み得る。

セット／またはキットは、安定剤、担体、緩衝液、溶媒、容器、塩、張度調整剤、充填剤、抗菌剤、等張化剤、抗酸化剤、およびその他の従来の組成物剤、またはそれらの組み合わせから選択されるいずれか１つを含み得る。

キットは、当該容器を含み、ここで、容器は、例えば、箱または袋などの包装材料に共に包装される。

特に好ましい実施形態において、本発明は、ＲＮＡテンプレートからのものを含む、核酸テンプレートから直接増幅されたアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）の合成を可能にする。トランスクリプトームプロファイリング、および超低インプット材料および単一細胞からのテンプレート分子の標識および増幅に適した方法およびキットが提供される。特定の好ましい実施形態は、図１を参照して以下でより詳細に説明される：
（１）ハイブリダイゼーション(ステップｂ)：転写プロモーター配列P及び核酸テンプレートへの相補配列(ここではＲＮＡ配列)を含む、「オリゴL1」と標識されたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション(ステップｂ)、
（２）３’-＞５’エキソヌクレアーゼ消化(ステップｃ):エキソヌクレアーゼ、例えばＲＮＡテンプレートのＲＮＡエキソヌクレアーゼを介した、テンプレートオリゴヌクレオチドプローブハイブリッドにおけるハイブリダイズしていない３’-オーバーハングの酵素加水分解、
（３）ＤＮＡ合成(ステップｄ)：オリゴL1の突出５’末端を、二本鎖プロモーター領域を生成するテンプレートとして用いた、ＤＮＡポリメラーゼを介したテンプレートの伸長、および
（４）ＩＶＴ(ステップｅ)：複数のａＲＮＡコピーを合成するためのテンプレートとして、「核酸テンプレート」を用い、二本鎖プロモーター領域を起点としたＩＶＴによる線形増幅。

反応スキームは図１および図３に示され、これは、核酸テンプレートがＲＮＡである場合、ＲＮＡ-ＤＮＡ二重鎖；または核酸テンプレートがＤＮＡである場合、ＤＮＡ-ＤＮＡ二重鎖を介してＲＮＡテンプレートを安定化させるための、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の追加の合成を含む。特に長いＲＮＡ一本鎖は、高温（例えば５０℃）での安定性が低下する可能性がある。

本発明の好ましい実施形態において、初めにＲＮＡサンプルが核酸テンプレートとして提供される。ＲＮＡは、好ましくは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または精製ＲＮＡもしくは細胞溶解物の総ＲＮＡ中に存在する、異なる前駆体およびプロセシング成熟ＲＮＡの混合物である。ＲＮＡは任意の長さのものであり得るが、好ましくは20～10,000ヌクレオチドの範囲である。元のＲＮＡは、アンチセンス配向で多くのコピーを合成するためのテンプレートを提供する。

ステップ１）／ステップｂ）において、核酸テンプレートに1つの相補配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを添加して、緩衝溶液中の温度を下げる、または化合物もしくはそれらの濃度を変えることによって核酸テンプレートにアニーリングする。安定化されたワトソン-クリック塩基対形成は、テンプレート-プローブ二重鎖を生じ、好ましい実施形態において、テンプレートはRNAであり、プローブは短いRNA-DNA二本鎖を有するDNAである。プローブは、テンプレートにアニーリングしないプロモーター配列Pを含む。

アニーリング領域の相補配列は、好ましくは、高い特異性に最適化されている。相補配列は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のポリＡ尾部に結合するポリ（ｄＴ）Ｖ-３’配列、転写産物の標的グループに結合する特異的保存配列、またはランダム配列であり得る。mRNAのポリＡ尾部を標的とすることは、好ましくはオリゴ-dT8～オリゴ-dT30配列を用いて行われる。好ましいのは、他の場所でのプライミングイベント (ポリ（Ａ）尾部について他の場所での転写産物への内部プライミング) を減少させるオリゴ-dT15～オリゴ-dT25である。３’Ｖまたは代わりに３’ＮＶの任意選択の３’アンカー配列は、ポリＡ尾部の５’の最初の部分でのハイブリダイゼーションに関連する。

相補配列は、高い選択的配列であり得、１つまたはほんのわずかな配列に特異的にハイブリダイズする。当該相補配列は、好ましくは18～45の間のヌクレオチドを含む。長さは、好ましくは、少なくとも8ヌクレオチドであり、ハイブリッド結合を安定化して、ステップｃ）において、後にポリメラーゼにより認識されることを可能にする。

本発明の一実施形態において、テンプレート-プローブ二重鎖（好ましくはRNA-DNA二重鎖）は、オリゴヌクレオチドプローブを、例えば、逆転写（RNA-DNA）またはポリメラーゼ（DNA-DNA）により伸長することで安定化される。必要とする反応混合物には、逆転写酵素(またはポリメラーゼ)、好適な緩衝液、dNTPs、および任意選択でRNase阻害剤（単数または複数）が挙げられる。好ましい実施形態において、逆転写反応は、cDNAの収率を増加させるために、添加剤、例えばPEG、好ましくはPEG-8000、またはアルブミン、好ましくはウシ血清アルブミン(BSA)の存在下で行われる。加えて、またはPEGの代わりに、本発明のcDNA合成において添加され得るその他の添加剤としては、非限定的に、ジメチルスルホキシド(DMSO)、トレハロース、グルコースおよびグリセロールが挙げられる。ＲＴの実施形態において、所望の逆転写酵素活性は、MMLV関連である任意の好適な酵素によって提供され得、Superscript I、II、IIIまたはIV、Maxima H、RevertAid、SMARTScribe、EnzScript、ProtoScript II、GoScriptまたは、それらのRNase H-変異体を非限定的に含む。逆転写反応は、37～55℃で最短10分または最長12時間で実行され得る。一実施形態において、反応は、10～30分の間、または代替的に10～60分の間、または代替的に10～120分の間、または代替的に任意の反応時間が用いられ得る。

以下のRNA-DNA二重鎖の処理には、１つの複合反応セットアップで実行される２つの酵素ステップが含まれる。

ステップ２）／ステップｃ）において、テンプレート-プローブ二重鎖を一本鎖(ssRNAまたはssDNA)特異的エキソリボヌクレアーゼ(単数または複数)で処理して、テンプレートの非ハイブリダイズ部分を３’において５’方向に除去する(平滑末端化)。一実施形態において、これは、ハイブリダイズしたRNA-DNA二本鎖の部分を超えるmRNA由来の３’-ポリ(A)尾部であり得る。消化ステップにおいて、テンプレート３’オーバーハングがＲＮＡである場合、RNase R、RNase T、RNase DなどのすべてのssRNA特異的エキソリボヌクレアーゼが使用され得る。エキソリボヌクレアーゼは、基本的にすべての線状一本鎖RNAの３’オーバーハングを消化するが、二本鎖RNA、特に二本鎖RNA-DNA二重鎖は消化しない。一本鎖DNA二重鎖の場合、ＤＮＡ３’-＞５’エキソヌクレアーゼが使用され得る。

１つの特定の実施形態において、３’-＞５’エキソヌクレアーゼ消化は、RNAse H活性を有する酵素などの、RNA-DNAヘテロ二重鎖に「ニック」を導入するリボエンドヌクレアーゼ処理によって置換される。RNase Hは非特異的エンドヌクレアーゼであり、加水分解機構を介してRNAの切断を触媒する。テンプレート-オリゴヌクレオチドプローブハイブリッドにおいてハイブリダイズされていない３’-オーバーハングは、解離するか（図１５）、またはストランド置換活性を有するポリメラーゼを介して後で置換されるようになる（図１６)。鳥筋芽細胞ウイルス（ＡＭＶ）又はモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）のようないくつかの逆転写酵素は、利用され得る固有のRNase活性を有する。

１つの特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブの相補配列は、ポリ（ｄＴ）ストランドであり、mRNAのポリ（Ａ）尾部を結合する。しかしながら、当該ポリ（ｄＴ）配列は、RNA中のＴリッチ配列だけでなく、例えば、追加のRNA精製なしで溶解した単一細胞およびすべてのサンプルに存在する、広大なDNAバックグラウンドにも結合することができる。この３’-＞５’エキソヌクレアーゼ消化ステップにおいて、比較的短い一本鎖RNAオーバーハング、特に残りのポリＡ尾部は、任意の長い断片よりもはるかに効率的な完全消化を起こしやすい。さらに部分的に再ハイブリダイズされて二本鎖になる傾向がある、DNA染色体の３’に位置する断片の消化が阻害される。この場合に、本方法は、ゲノムDNA(gDNA)などのDNAバックグラウンドへの任意の潜在的なミスプライミングを識別するため、選択的mRNA濃縮法として使用され得る。

あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの相補配列は、テンプレート上の任意の事前定義された標的配列に相補的である、任意の選択的配列であり得る。このような配列のミスプライミングは一般にポリ(dT)プライミングよりも頻度が低いが、現在の染色体DNAへのプライミングもほとんど影響を及ぼさない。部分的に再ハイブリダイズされ、二本鎖となるプライミングイベントに対する、DNA染色体下流の３’に位置する部分の消化は、本質的に不可能である。したがって、この方法は、標的領域の５’上流のRNA断片に対する、非常に効率的なRNA濃縮方法を提示する。

ステップ３／ステップｄ）において、伸長反応の開始点であるテンプレート-プローブ二重鎖中のテンプレートの残りの３’-ＯＨ基を消化した後、好ましくは伸長テンプレートのヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの５’オーバーハングを使用する、DNAポリメラーゼによるDNA重合を行う。その結果、オリゴヌクレオチドプローブのプロモーター配列Ｐの二本鎖を有する二重鎖が得られた。

ステップ４／ステップｅ）において、４つの(リボ)ヌクレオチド三リン酸すべて、および適合バッファーの存在下での転写酵素(RNAポリメラーゼ)が、二本鎖プロモーター配列Ｐに結合し、伸長核酸テンプレートをテンプレートとして使用して一本鎖RNAを増幅する。RNAポリメラーゼが鎖状プロモーター配列Ｐの領域を離れると、別のRNAポリメラーゼが結合して新しい合成を開始することができる。連続プロセスにより、1つのプロセスで数十のコピーを有する増幅アンチセンスRNA(aRNA)を生成するテンプレートの線形増幅をもたらされ、通常は100～200コピーであるが、200～1,000コピー、または1,000を超えるコピーも可能である(図２および図４)。増幅は、反応成分の量、反応量、温度および反応時間によって制御される。

得られたaRNAは、任意のRNAシーケンシングライブラリ調製のためのインプットとして使用され得る。

ダイレクトNGSライブラリの準備。１つの特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、プロモーター配列Pとテンプレートへのハイブリダイズを担う相補配列との間のアダプター配列A1を含む(図５)。アダプター配列A1は、ｉ）後に続く、例えば、フローセルに結合するための異なるシーケンシング技術に必要な伸長配列の増幅のためのプライミング部位、ｉｉ）サンプル特異的、固有分子識別子（UMI）としても知られて使用されるランダム、または連続してその両方であるインデックス、ｉｉｉ)増幅なしで直接シーケンスできる完全アダプターである、異なる機能の配列を組み合わせることができる。すべてのこれらの実施形態を含むと、オリゴヌクレオチドプローブは典型的には15～75ヌクレオチドを含む。

本ワークフローにおける線形増幅は、aRNAを含む膨大な量の５’指向性アダプターA1を生成するため、ハイブリダイゼーションのための相補配列およびアダプター配列A2を含むプライマーを用いたその後の第1鎖合成は、さらなるPCR増幅を必要とせずに、シーケンシングのために一本鎖を直接使用するのに十分であり得る。あるいは、いくつかのインデックス付きライブラリをプールして濃縮し、PCR増幅を省略できるように十分な第一鎖ライブラリを組み合わせることもできる。PCR増幅を省略することにより、測定された存在比の変化をもたらす、異なる増幅効率によって引き起こされるPCR人工産物を生成する可能性が排除される。

本発明は、図面および以下の実施例において例示されるが、これらの発明の実施形態に限定されるものではない。

実施例１：RNA増幅

テンプレートRNAからaRNAを製造する反応スキームを図１に示す。実験は、T7プロモーター配列および20個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVを含むプローブL1を使用して、universal human reference RNA (UHRR、Agilent Technologies、カタログ＃740000)を使用して実施した。本実施例ではL1オリゴヌクレオチドプローブ５’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV-３’（配列番号１）を500 pmolの濃度で用いた。末端ヌクレオチドにより、L1'ｓはmRNAのポリ（Ａ）尾部の５’の最初の部分に固定され、ポリ（Ａ）尾部内の下流のプライミングを抑制する。この特定の実施例において、ハイブリダイゼーション(ステップ１)は、１ngの総UHRR、0.5 mMの遊離dNTPsおよびヌクレアーゼフリーの水を使用した。RNAテンプレートおよびプローブの混合物を72℃で３分間加熱し、直ちに氷上に移し、氷上で５分間保持した。次に、テンプレート-プローブハイブリッド分子を含む反応溶液を、一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼ（ステップ２）、およびDNAポリメラーゼで室温で30分間（ステップ３）事前処理した。このテンプレート-プローブ末端-修復反応は、20 mM酢酸トリス(25℃でpH 7.9)、10 mM酢酸マグネシウム、50 mM酢酸カリウム、100 μ/ml BSA、５ユニットの一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼ、および３ユニットのDNAポリメラーゼを用いて、50 μlで実施した。次いで、残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPsおよび小断片を、磁気精製ビーズ(AMPure Beads, Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)により除去した。インビトロ転写による線形増幅(ステップ４)は、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl₂、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPs、および10％ DMSOの存在下で、37℃で90分間、テンプレート-プローブ-dsT7prハイブリッドで実施した。得られたRNA転写産物をSPRIにより精製した。図２は、インプット総mRNAおよび総RNA＋aRNAのアウトプットの対応するトレースを示している。両方のトレースの差は、インプット材料のmRNAの14.3倍である0.43 ng aRNAを示している。

実施例２：逆転写によるRNA増幅

反応スキームは図３に示され、追加の逆転写(RT)を含む。RNA増幅実験は、20 ngのuniversal human reference RNA (UHRR、Agilent Technologies、カタログ＃740000)を用いて行った。逆転写は、0.5 mMの遊離dNTPs、T7プロモーター配列および25個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVからなる500 pmolアンカーL1プローブ(５’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV-３’-配列番号２)、50 mM Tris-HCl(25℃でpH 8.3)、75 mM KCl、3 mM MgCl₂、10 mM DTTおよび200 Uの逆転写酵素の存在下で、37℃で15分間、10 μlで行った。次いで、精製せずに、20 mM酢酸トリス(25℃でpH 7.9)、10 mM酢酸マグネシウム、50 mM酢酸カリウム、100 μg/ml BSA、５ユニットの一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼ、および３ユニットのDNAポリメラーゼを添加して、反応物を50 μlに増加させた。消化および伸長後、残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPs、および小断片を、磁気精製ビーズ(AMPureビーズ、Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去した。残りのRNA-cDNAハイブリッドについて、40 mM Tris-HCl(pH 7.9、25℃)、6 mM MgCl²、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10％ DMSOの存在下で、37℃で12時間、インビトロ転写による線形増幅を行った。図４は、インプット総RNA、および総RNA ＋ aRNAのアウトプットの対応するトレースを示している。両トレースの違いは、インプット材料のmRNAの約100倍である約60 ngのaRNAを示す。反応時間が長いため、生成物トレースには、より低い28s rRNAピークに見られる、いくつかの分解されたrRNAが含まれている。しかしながら、rRNAの大部分は依然としてインタクトであり、aRNAの定量的評価にはほとんど影響を与えない。

実施例３：ＮＧＳライブラリ生成でのＲＮＡ増幅

反応スキームを図５に示す。RNA実験は、universal human reference RNA (UHRR, Agilent Technologies, カタログ＃740000)またはFACSソーティングHEK293細胞を使用して実施され、１又は10個の細胞を５μＬの溶解バッファー(Lexogen GmbH)を含むウェルに直接並べた。細胞溶解は50℃で10分間、80℃で10分間行った。細胞溶解後、又は１及び10細胞のおおよその総RNA量に相当する10又は100 pg UHRRを直接用いる場合に、逆転写は、0.5 mMの遊離dNTPsと、T7プロモーター配列、アダプター配列A1、および25個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVからなる500 pmolアンカープローブL1(５’-CT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAC GTG TGC TCT TCC GAT CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTV-３’― 配列番号３)の存在下で実施した。RNA-cDNAハイブリッド分子を、一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼで直接処理した。RNA-cDNA処理は、20 mM酢酸トリス(25℃でpH 7.9)、10 mM酢酸マグネシウム、50 mM酢酸カリウム、100 μ/ml BSA、５ユニットの一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼ、および３ユニットのDNAポリメラーゼを用いて50 μlで実施した。残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPsおよび小断片は、磁気精製ビーズ(AMPureビーズ、Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去した。インビトロ転写による線形増幅は、残りのRNA-cDNAハイブリッドに対して、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl₂、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10％DMSOの存在下で実施した(37℃で12時間)。

A1含有aRNAを1.8倍比のSPRIビーズを用いて精製し、10 μlの溶出バッファー(EB)溶液(Lexogen GmbH)中で最終溶出を行った。次いで、精製したA1含有aRNAを、A2アダプター配列を保持する、ランダムヘキサマープライマー、5'-C ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN-3'(配列番号４)でプライミングした。aRNAへのランダムプライミングは、逆転写酵素をRTMバッファー(Lexogen GmbH)の存在下で、25℃で10分間、37℃で40分間、42℃で10分間、および25℃で１分間インキュベートすることによって達成した。反応混合物をSPRI精製して、20μlのEB(Lexogen GmbH)で溶出した。ssDNA断片の一次ライブラリは、現在、両アダプター配列、A1およびA2、またはそれらの相補部分を含み、DNAポリメラーゼ、PCRバッファーおよびインデックスプライマー(Lexogen GmbH)を用いたPCR反応で増幅した。PCRは、98℃で30秒間、続いて98℃で10秒間、68℃で20秒間、72℃で30秒間のサイクルを9～13サイクル適用することにより実行した。

図６は、最終的なNGSライブラリのバイオアナライザートレースを示す。一次ライブラリの初期量は、0.9の測定PCR効率を用いて、最終収率およびPCRサイクルの適用数から算出できる。一次ライブラリの初期量は、10 pg UHRRと1 HEK293細胞、または100 pg と10 HEK293細胞を比較すると非常に類似している。これは、現在のaRNAプロトコルおよびNGSライブラリの調製が、ゲノムDNAバックグラウンドを含む精製RNAおよび細胞ライセートでも、同様にうまく開始できることを証明している。

デュプリケートは非常に一貫性がある。ネガティブテンプレートコントロール(NTC)は、同一のPCRサイクルで平坦な線を示すが、約28～30回のPCRサイクルを適用すると、いくつかのバックグラウンドが生じる。

図７は、アノテーションされたヒトゲノムGRCh38.p13にマッピングした後のリード分布統計を示す。マッピングされたリードは、アノテーションされた遺伝子のエクソンおよびイントロン領域、または遺伝子間領域に属する、それらの想定される起源に分類した。該分布は非常に保存されており、初期および成熟コーディングRNAの良好な表現を示している。遺伝子間領域に分類されるリードは、基礎転写、マルチマッピングリードの誤ったカウント、および不十分なアノテーションによって引き起こされる可能性がある。

表１は、１つのHEK293細胞のクアドルプリケートそれぞれについてのリードマッピング統計量を、緩衝液溶媒で正確に同じ容量の不活性ビーズと共にサンプリングしたバックグラウンド対照と共に示している。一次ライブラリは、必須である、ＰＢＳ培地での３回の洗浄後に疑似バックグラウンドを分析するためのシーケンシングに十分な材料に達するように増幅した。バックグラウンドでは、250未満の遺伝子を検出したが、リードの35～88％はゲノムにまったくマッピングされておらず、未確認のアーティファクトが原因であった。aRNA-3'seqプロトコルは細胞およびmRNA特異的であり、3'seqプロトコルについて75％以上のユニークマッピングリードに達する。rRNAの量は0.1～0.2％の範囲であるが、余剰rRNAの除去は適用されていない。aRNAプロトコルは、mRNAテンプレート増幅にこの方法を適用するときに、rRNA及びゲノムバックグラウンドを非常に効率的に識別する。

表１１つのFACSソーティング溶解HEK293細胞、または細胞外バックグラウンドRNAを定量するために非インプット対照として同じバッファー量で提供される1つのFACSソーティング不活性ビーズで開始する、クアドルプリケートでの実験のaRNA-3'seq NGSリードマッピング統計。

感度におけるすぐれた性能は、現在の最先端の技術を代表する、超低インプットおよび単一細胞用の他の２つのプロトコル、方法１(M1, NEBNext（登録商標） Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit for Illumina（登録商標）, NEB)、および方法２(M2, SMART-seq2, Takara Bio)との直接比較で実証される。図８では、典型的な細胞で見られるRNAの量を代表したものである10 pg universal human reference RNA (ThermoFisher Scientific, QS0639)の超低インプット総RNAを用いた実験からのNGSデータセットを用いて、比較可能な遺伝子検出率を算出した。方法M1は、６つのサンプルから平均5,288個の遺伝子を検出する一方で、M2はすでに8,510個の遺伝子を検出できた。しかしながら、aRNA-3'seqで検出した12,797遺伝子には、どちらもほど遠い。検出された遺伝子の数にとって重要なことは、aRNA-3'seqが典型的に10％未満である遺伝子および遺伝子間リードのクラスへのリード分布で常に見られなければならない。図８の箱ひげ図は、M1とM2の分散よりもはるかに優れた６個体サンプルの優れて低い分散も示している。

良好な再現性と広いダイナミックレンジの存在量を図９に示す。４つの個体細胞の2つの発現値中央値を比較するR²値は、0.97である。

実施例４：PCRフリーNGSライブラリ調製によるRNA増幅

PCRフリーのライブラリ調製は、オリゴヌクレオチドプローブL1中にイルミナアダプター配列全体を含む、インデックス付きL1オリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーL2を使用して行われる。それゆえ、アダプター配列を追加する必要はなく、転写産物のPCRは省略され得る。IVTによる高度な線形増幅により、標準的な方法（Qbit又はRT-PCRアッセイなど）でライブラリ濃度を定量することにより、イルミナのNextSeq 500などでの標準的なシーケンシングワークフローに入る準備ができている、2 nMの濃度にプールおよび濃縮物が達する、十分な材料が生成される。シングルセルライブラリの調製には通常13回のPCRサイクルが必要であるが、1.9¹³回、すなわち4,205シングルセルライブラリ調製のプールは、任意のPCRを省略するのに十分である。高感度定量法では、プールされた濃縮ライブラリをシーケンシングワークフローでの必要なバッファーに直接移すときに、後続の希釈ステップを部分的にスキップできるため、少量のNGSライブラリを使用することも可能である。ライブラリの定量には、RT-PCRを推奨する。

実施例５：全トランスクリプトームライブラリ調製でのRNA増幅

全トランスクリプトームシーケンシング(WTS)ライブラリ調製では、インプット材料としてuniversal human reference RNA (UHRR, Agilent Technologies, カタログ＃740000)を使用した。逆転写は、0.5 mMの遊離dNTPs、T7プロモーター配列および18個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVを含む、500 pmolアンカーT7pr-oligo(dT)₁₈プローブ、5’-C TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAT TTT TTT TTT TTT TTT TTV-3'（配列番号５）の存在下で実施した。RNA-cDNAハイブリッド分子を、一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼで直接処理した。RNA-cDNAの末端修復反応は、20 mM酢酸トリス (25℃でpH 7.9)、10 mM酢酸マグネシウム、50 mM酢酸カリウム、100 μ/ml BSA、5ユニットの一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼ、および3ユニットのDNAポリメラーゼを用いて50 μlで実施した。残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPsおよび小断片は、磁気精製ビーズ(AMPureビーズ、Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去した。インビトロ転写による線形増幅は、RNA-cDNAハイブリッドに対して、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl2、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10 % DMSO(37℃で12時間)の存在下で行った。

aRNAを1.8倍比のSPRIビーズを用いて精製し、10 μlのEB溶液(Lexogen GmbH)中で最終溶出を行った。次に、RTMバッファー(Lexogen GmbH)の存在下で逆転写酵素を用いて、プライマーL2をaRNAと共に25℃で10分間、37℃で40分間、42℃で10分間、および25℃で1分間インキュベートすることにより、精製したaRNAをランダムヘキサマープライマーL2、5'-CACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN-3'(配列番号６)でプライミングした。次に、aRNAとcDNA断片とのハイブリッドをSPRIで精製して、20 μl EB(Lexogen GmbH)で溶出した後、A2を含むアダプターをCorall全トランスクリプトーム(WTS)ライブラリ調製(Lexogen GmbH)のワークフローを使用してライゲーションした。

アダプター配列A1およびA2の両方、またはその相補配列を含むssDNA断片の一次ライブラリを、DNAポリメラーゼ、PCRバッファー、およびインデックスプライマー(Lexogen GmbH)を使用したPCR反応で増幅した。PCRは、98℃で30秒間、続いて98℃で10秒間、68℃で20秒間、72℃で30秒間のサイクルで実行した。PCRサイクルの最適な数はRNAインプット量に依存し、エンドポイントPCRを開始する前にRT-PCRによって決定される。

カバレッジが3'末端に集中していたaRNA-3'seqとは対照的に(図10)、本発明方法(「aRNA-WTS」)は、図10の平均概要カバレッジに示されている転写産物間でより均等に分布したリードを生成する。

実施例６：ターゲットプライミングおよびNGSライブラリ調製でのRNA増幅

提示した方法により、相補配列としてポリ(dT)を有するL1オリゴヌクレオチドプローブを使用するときにはmRNA、またはL1もしくはL2のいずれか、もしくはその両方において特定の相補配列を使用するときには特異的転写産物のいずれかである特定の配列を、標的に適用することができる。特定の相補配列をランダム配列と組み合わせて、スプライスバリアントのグループのような転写産物のクラスを標的にすることができる。

ターゲットRNAseq実験は、universal human reference RNA (UHRR, Agilent Technologies, カタログ＃740000)および合成RNA SARS-CoV-2対照(Twist Biosciences, カタログ＃SKU:102024)を使用して実施した。合成SARS RNAは、サンプルあたり2,000～20,000コピーに達するウイルスコピー(VC)数で、10および100 ngのUHRRのバックグラウンドに添加した。RNAサンプルを溶解バッファー(Lexogen GmbH)に移し、熱失活(50℃で10分、80℃で10分)した後、0.5 mMの遊離dNTPs、T7プロモーター配列、アダプターA1、配列、およびSARS-CoV-2特異的配列を含む500 pmolのSARS-CoV-2特異的オリゴヌクレオチドプローブL1、5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA ACG TGT GCT CTT CCG ATC TGT CAT TCT CCT AAG AAG CTA-3'(配列番号７)の存在下でさらに逆転写した。作製したRNA-cDNAハイブリッド分子を、20 mM酢酸トリス(25°CでpH 7.9)、10 mM酢酸マグネシウム、50 mM酢酸カリウム、100 μ/ml BSA、5ユニットの一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼ、および3ユニットのDNAポリメラーゼを用いて50 ml中で、一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼで直接処理した。残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPs、および小断片は、磁気精製ビーズ(AMPure Beads, Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去した。残りのRNA-cDNAハイブリッドに対して、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl2、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10 % DMSOの存在下で、インビトロ転写による線形増幅を37℃で24時間行った。aRNAは、1.8倍の比率のSPRIビーズを用いて精製した。10 μlのEB溶液(Lexogen GmbH)で最終溶出を行った。精製したaRNAを、イルミナA2アダプター配列を保持するランダムヘキサマープライマー、5'-C ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN-3'(配列番号８)でプライミングした。aRNAランダムプライミング反応を、RTMバッファー(Lexogen GmbH)の存在下で逆転写酵素を用いて25℃で10分間、37℃で40分間、42℃で10分間、25℃で1分間インキュベートした後、最終溶出20 μl EB(Lexogen GmbH)のSPRIビーズで精製した。得られた一次ライブラリを、ハイフィデリティポリメラーゼおよびインデックスプライマー(lexogen GmbH)を用いたPCR反応で増幅した。最終的な増幅は、98℃で30秒間適用し、その後、ウイルス量に応じて、98℃で10秒間、68℃で20秒間、72℃を30秒間のサイクルを16および12サイクル適用することによって実行した。図11は、10および100 ngの総UHRRにおいて添加した2,500および25,000のウイルスコピーから生成した最終cDNAの対応するトレースを示している。

実施例７：インデックス付きビーズでのaRNA合成

あるいは、溶液中に存在するL1オリゴヌクレオチドプローブに対して、ビーズに固定化したL1オリゴヌクレオチドプローブを用いて反応を開始することもできる。プール-分割合成では、インデックス付きオリゴヌクレオチドプローブを含むビーズを合成することができ、それぞれ1つの固有のサンプルインデックスを含む単一ビーズとランダムに単一細胞を組み合わせることができる。このような機能化ビーズの設計を図12に示す。L1修飾ビーズは、細胞と単一ビーズを、高度に並列化された方法で制御されたまたはランダムな方法で、少量または液滴で組み合わせる任意のドロップシーケンス分析法で使用できる。

シングルセルシーケンシング法では、マイクロ流体デバイスを使用して、単一細胞、溶解バッファー、および図12に示されるようなインデックス付きプローブL1で覆われたマイクロビーズを含む液滴を区画化する。各L1オリゴヌクレオチドプローブは、１）mRNAに結合するための相補的なポリ(dT)V配列、２）各mRNA鎖を一意に同定するための8～12 bpの固有分子指数(UMI)、３）各細胞に固有の8～12 bpのインデックス、および４）アダプター配列A1を含む。任意選択で、個々のサンプルに固有であり、それゆえ1回の実験で使用されるすべてのビーズで同一である、追加のインデックスが含まれ得る。区画化に続いて、液滴中の細胞が溶解されて、放出されたmRNAはオリゴヌクレオチドプローブL1ビーズのオリゴ(dT)V相補配列にハイブリダイズする。次に、すべての液滴がプールされ、分解されてビーズが放出される。次に、ビーズを単離し、適切なRTバッファー(Lexogen GmbH)に入れる。結合したmRNAは、逆転写酵素を用いて逆転写される。生成物を、20 mM酢酸トリス(25℃でpH 7.9)、10 mM酢酸マグネシウム、50 mM酢酸カリウム、100 μ/ml BSA、５ユニットの一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼおよび３ユニットのDNAポリメラーゼを用いて、50 μｌ中で、一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼで直接処理した。ビーズを洗浄してdNTPsを除去し、バッファーを交換して、残りのビーズ結合RNA-cDNAハイブリッド上で、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl2、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10％ DMSOの存在下で、37℃で24時間、インビトロ転写による線形増幅を行った。得られたaRNAを1.8倍比のSPRIビーズを用いて精製し、10 μlのEB溶液(Lexogen GmbH)で最終溶出を行う。次に、精製したaRNAを、イルミナA2リンカー配列を保持するランダムヘキサマープライマー5'-CACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN-3'(配列番号９)でプライミングする。aRNAランダムプライミング反応を、RTMバッファー(Lexogen GmbH)の存在下で逆転写酵素を用いて、25℃で10分間、37℃で40分間、42℃で10分間、25℃で1分間インキュベートした後、最終溶出20 μl EB(Lexogen GmbH)のSPRIビーズで精製した。得られた一次ライブラリは、ハイフィデリティポリメラーゼおよびインデックスプライマー(lexogen GmbH)を用いたPCR反応で増幅される。最終的な増幅は、98℃を30秒間適用し、その後、ウイルス量に応じて、10秒間で98℃、20秒間で68℃、30秒間で72℃のサイクルを16および12サイクルを適用することによって実行される。

NGSライブラリ内の複数のインデックス付きmRNAフラグメントは、シーケンシングの準備ができている。

実施例８：ロングリード直接RNAシーケンシング用のライブラリ

ダイレクトRNAシーケンシングキット(SQK-RNA002, Oxford Nanopore Technologies Ltd, UK)などを使用することで、ロングリード直接RNAシーケンシングが可能である。このプロセスにおいて、アダプター修飾RNAは、cDNA合成およびPCR増幅なしで直接配列決定される。必要な高RNAインプット量に到達するために、ライブラリ調製は本発明法によって生成したaRNAを使用する。次に、オリゴdTオーバーハングを有するアダプターがライゲーションされる。2番目のライゲーションステップは、3'-poly-A尾部から5'-キャップへのシーケンシングを直接駆動するモータータンパク質がプリロードされたシーケンシングアダプターを組み込む。現在、ロングリード直接シーケンス法の主な制限は、スループット(リードカウント)が低く、インプット量の要件が高いことである。以前は、直接RNAシーケンシングには 500 ngのポリA RNA が必要であった。本発明により、超低インプット材料も可能である。

本発明方法は、L1オリゴヌクレオチドを含むポリ(dT)を使用して、細胞からまたは超低インプット総RNAから直接mRNAを、ロングリードシーケンシングに適した量に増幅させる。生じたaRNAは、得られたポリ(A)aRNAを直接RNAシーケンシングのインプット材料として使用する前に、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびポリ(dA)を含むバッファーを使用して3'末端でポリアデニル化する。

実施例９：二本鎖L1プロモーター領域の単一反応容量での合成(ワンポット反応)、およびNGSライブラリの調製

RNA実験は、universal human reference RNA (UHRR, Agilent Technologies, カタログ＃740000)を用いて行った。10 pgの総UHR RNAは、逆転写、一本鎖3'オーバーハングの加水分解、およびオリゴヌクレオチドプローブの非相補部分へのRNAテンプレートの伸長を1つの容量で部分的に同時に(RTおよび加水分解)および即時連続的に(加水分解および伸長)行うことによって処理した。10 μlの反応容量は、0.5 mMの遊離dNTPs、T7プロモーター配列、アダプター配列A1、および25個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVからなる500 pmolのアンカープローブL1(5'- CT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAC GTG TGC TCT TCC GAT CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV -3' ― 配列番号３)、50 mM Tris-HCl(25℃でpH 8.3)、3 mM塩化マグネシウム、75 mM塩化カリウム、10 mMジチオスレイトール、100ユニットの逆転写酵素、１ユニットの一本鎖特異的エキソリボヌクレアーゼおよび１ユニットのDNAポリメラーゼの存在下でRNAを含んでいた。反応は37℃で30分間進行した。次に、残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPsおよび小断片を、磁気精製ビーズ(AMPure Beads, Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)により除去した。インビトロ転写による線形増幅は、残りのRNA-cDNAハイブリッドに対して、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl2、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10％ DMSO(37℃で12時間)の存在下で実施した。

A1含有aRNAを1.8倍比のSPRIビーズを用いて精製し、10 μlの溶出バッファー(EB)溶液(Lexogen GmbH)中で最終溶出を行った。次いで、精製したA1含有aRNAを、A2アダプター配列を保持するランダムヘキサマープライマー、5'-CACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN-3'(配列番号４)でプライミングした。aRNAへのランダムプライミングは、逆転写酵素をRTMバッファー(Lexogen GmbH)の存在下で、25℃で10分間、37℃で40分間、42℃で10分間、および25℃で１分間インキュベートすることによって達成した。反応混合物は、SPRI精製であり、20 μl EB(Lexogen GmbH)で溶出した。ssDNA断片の一次ライブラリは、現在、両方のアダプター配列、A1およびA2またはその相補部分を含み、DNAポリメラーゼ、PCRバッファーおよびインデックスプライマー(Lexogen GmbH)を用いたPCR反応で増幅した。PCRは、98℃で30秒間、続いて98℃で15秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間のサイクルを12サイクル適用して実行した。図14および図17Ａ）は、最終的なNGSライブラリのバイオアナライザートレースを示す。

実施例１０：ニック部位からの二本鎖L1プロモーター領域の合成およびNGSライブラリ調製

オリゴ-L1をテンプレートとしてハイブリダイズRNAにニック部位を導入し、ニック部位RNAから伸長して二本鎖プロモーター領域Pを生成する反応スキームを図15に示す。

RNAseqライブラリの調製は、universal human reference RNA (UHRR, Agilent Technologies, カタログ＃740000)を用いて行った。T7プロモーター配列、アダプター配列A1、および25個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVからなる500 pmolアンカープローブL1、5'-CT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAC GTG TGC TCT TCC GAT CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTV-3'―配列番号３)、50 mM トリス塩酸塩(25℃でpH 8.3)、3 mM 塩化マグネシウム、75 mM 塩化カリウム、10 mM ジチオスレイトールの存在下でDNAにハイブリダイズしたときに、RNAのホスホジエステル結合を特異的に加水分解する1ユニットのリボエンドヌクレアーゼで10 pgの総UHR RNAを37℃で30分間処理した後、温度を80°Cに10分間上昇させてリボエンドヌクレアーゼを不活性化した。次に、鎖置換活性を有し、導入した切断部位からRNAテンプレートを伸長できる１ユニットのDNAポリメラーゼを0.5 mMの遊離dNTPsとともに添加し、37℃で５分間反応を進行させた後、残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPs、および小断片を磁気精製ビーズ(AMPure Beads, Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去した。

インビトロ転写による線形増幅は、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl₂、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10％DMSO(37℃で12時間)の存在下でRNA-cDNAハイブリッドに対して実施されました。残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPs、および小断片は、磁気精製ビーズ(AMPure Beads, Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去されました。

A1含有aRNAは、1.8倍比のSPR1ビーズを用いて精製され、10 μlの溶出バッファー（EB）溶液(Lexogen GmbH)において最終溶出が行った。次いで、精製したA1含有aRNAを、A2アダプター配列を保持するランダムヘキサマープライマー、5'-C ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN-3'(配列番号４)でプライミングした。aRNAへのランダムプライミングは、逆転写酵素をRTMバッファー(Lexogen GmbH)の存在下で、25℃で10分間、37℃で40分間、42℃で10分間、および25℃で１分間インキュベートすることによって達成した。反応混合物をSPRI精製し、20 μlのEB(Lexogen GmbH)で溶出した。ssDNA断片の一次ライブラリは、現在、両方のアダプター配列、A1およびA2またはその相補部分を含み、DNAポリメラーゼ、PCRバッファーおよびインデックスプライマー(Lexogen GmbH)を用いたPCR反応で増幅した。PCRは、98℃で30秒間、続いて98℃で15秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間のサイクルを14サイクル適用して実行した。図17 B)は、2つの最終的なNGSライブラリのバイオアナライザートレースを示している。

実施例１１：単一反応容量でニック部位から二本鎖L1プロモーター領域を合成する(ワンポット反応)およびNGSライブラリ調製

同時反応において、オリゴ-L1をテンプレートとしてハイブリダイゼーションRNAにニック部位を導入し、ニック部位RNAから伸長する反応スキームを図16に示す。

RNA実験は、universal human reference RNA (UHRR, Agilent Technologies, カタログ＃740000)を用いて行った。10 pgの総UHR RNAを37°Cで30分間処理した後、DNAにハイブリダイズするとRNAのホスホジエステル結合を特異的に加水分解する1ユニットのリボエンドヌクレアーゼ、および鎖置換活性を持ち、0.5 mMの遊離dNTPs、T7プロモーター配列、アダプター配列A1、および25個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVからなる500 pmolアンカープローブL1、5'-CT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAC GTG TGC TCT TCC GAT TTT TTTTV-3' ― 配列番号３)、50 mM トリス塩酸塩(25℃でpH 8.3)、3 mM 塩化マグネシウム、75 mM 塩化カリウム、10 mM ジチオスレイトールの存在下で、導入したニックおよび3'RNAからテンプレートを伸長できる１ユニットのDNAポリメラーゼで処理した。残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPsおよび小断片は、磁気精製ビーズ(AMPure Beads, Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去した。

インビトロ転写による線形増幅は、残りのRNA-cDNAハイブリッドに対して、40 mM Tris-HCl(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl2、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10％DMSO(37℃で12時間)の存在下で実施した。残りのオリゴヌクレオチドプローブ、dNTPsおよび小断片は、磁気精製ビーズ(AMPure Beads, Agencourt)による固相逆固定化(SPRI)によって除去した。インビトロ転写による線形増幅は、40 mM トリス塩酸塩(25℃でpH 7.9)、6 mM MgCl2、10 mM DTT、10 mM NaCl、2 mM スペルミジン、200 U T7 RNAポリメラーゼ、3.5 mM rNTPsおよび10%DMSO(37℃で12時間)の存在下で、残りのRNA-cDNAハイブリッドで行った。

A1含有aRNAを1.8倍比のSPRIビーズを用いて精製し、10 μlの溶出バッファー(EB)溶液(Lexogen GmbH)中で最終溶出を行った。次いで、精製したA1含有aRNAを、A2アダプター配列を有する、ランダムヘキサマープライマー5'-C ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN-3'(配列番号４)でプライミングした。aRNAへのランダムプライミングは、逆転写酵素をRTMバッファー(Lexogen GmbH)の存在下で、25℃で10分間、37℃で40分間、42℃で10分間、および25℃で１分間インキュベートすることによって達成した。反応混合物をSPRI精製し、20 μlのEB(Lexogen社)で溶出した。ssDNA断片の一次ライブラリは、現在、両方のアダプター配列、A1およびA2またはその相補部分を含み、DNAポリメラーゼ、PCRバッファーおよびインデックスプライマー(Lexogen GmbH)を用いたPCR反応で増幅した。PCRは、98℃で30秒間、続いて98℃で15秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間のサイクルを9～13サイクルを適用して実行した。図17C)は、２つの最終的なNGSライブラリのバイオアナライザートレースを示している。

実施例１２：、３’-＞５’エキソリボヌクレアーゼ消化を用いたNGSライブラリ調製物、および２本鎖L1プロモーター領域を合成する前のニック部位の比較

単一反応容量で行われ、実施例9の記載に従って作製した二本鎖L1プロモーター領域を合成する前に3'-＞5'エキソリボヌクレアーゼ消化を用いたライブラリ調製物を図17A)に示し、ニック部位を用いて実施例10の記載に従って作製したライブラリを図17B)に示し、およびニック部位を用いて実施例11の記載に従って作製した単一反応容量を用いたライブラリを図17C)に示す。すべての一次ライブラリについて同じPCR増幅反応を使用し、最終ライブラリは、バイオアナライザートレースで分析する前に、SPRI精製後に同じ容量の20 μlで溶出した。PCR効率は、リアルタイムPCR希釈シリーズを使用した別の実験で以前に0.9と決定されており、これは各PCRサイクルがライブラリの量を1.9倍に増加させることを意味する。PCRサイクル番号を使用して、さまざまなライブラリ調製方法の効率を正確に比較するために、一次ライブラリの量を算出した。一次ライブラリには、配列フラグメントとアダプターA1およびA2が含まれていますが、インデックスは含まれていない。インデックスは、増幅した一次ライブラリを生成するPCRとともに追加される。一次ライブラリの収量と平均長、およびNGS読み取り統計を表２に示す。

表２３’-＞５’エキソリボヌクレアーゼ消化(実施例9)を用いたNGSライブラリ調製物、および二本鎖L1プロモーター領域を合成する前のニック部位(実施例10および11)の比較。マップしたリードは、生のリードの数を参照する。マップしたリードの数に対する一意にマップした参照、および他のすべての読み取りクラスは、一意にマップしたリードを参照する。

図17のNGSライブラリトレースの比較、および表２に示すそれらの定量は、3'-＞5'エキソリボヌクレアーゼ消化を使用したNGSライブラリ調製法が、平均して約20～35 ntである、わずかに長いライブラリを生成することを示している。単一反応容量で実施した両方法を比較すると、収率は約30％高くなる。中間体SPRI精製を用いた実施例10に記載の方法は、単一反応量で実施した方法によって得られる収率の約10％にしか達しない。両方の単一反応量法を比較すると、名目上の増加は比較的小さいようである。ただし、NGSリードクラス分布と遺伝子検出率には、大きなパフォーマンスの違いが見られる。「ニック」を作成するエンドリボヌクレアーゼ消化を用いる方法は、アーティファクトによって支配されるかなりの量の非常に短いインサートを作成する。長いフラグメントの肩部にのみ、インプットサンプルに由来するフラグメントが含まれている。読み取り統計は、それに応じて不良である。より少ないリードをマッピングでき、より少ないリードを一意にマッピングでき、ごく一部のmRNAのエクソンにマッピングされる。3'-＞5'エキソリボヌクレアーゼ消化を使用する方法は、高品質のNGSライブラリへのサンプルRNAのはるかに高い変換率を生み出す。

実施例１３：HEK293細胞およびユニークな分子インデックスを有するL1プライマーを用いたNGSライブラリ生成の効率の決定

ベンチマーク実験の出発点は、非常によく特徴付けられたHEK293細胞である。QuickGene RNA Cultured Cell Kit S (Kurabo Industries Ltd., User application for Total RNA Extraction from Cultured Cells, Chapter 3-XVII, RG-4 to -6)を用いて、2.1E6ペレット細胞、5E6接着細胞、および1.2E7培養細胞からトータルRNAを単離した。平均総RNA含有物は、14.25±1.7 pg/HEK293細胞に見出した。この全RNAの３％がmRNAであると予想される(RNAクラスはUHRR、Agilent Technologies、カタログ＃740000と非常に類似していると仮定される)。バイオアナライザートレースを使用して、ポリAが豊富な高品質の総HEK293 RNAを分析し、1.6 kbの平均mRNA長を得た。当該RNA中の320.6 g/molのリボヌクレオチドの近似値を使用すると、転写産物の数は501.9±59.6kと推定される。このベンチマーク実験のために、T7プロモーター配列、アダプター配列A1、N₁₂ Unique Molecular Indices (UMI's)、および25個のデオキシチミジル酸残基のストリングとそれに続くdVからなるアンカープローブL1を用いて、FACSでソートした4つのHEK293細胞を使用して、実施例３に従ってNGSライブラリ調製を実施した。ライブラリは、1 Mioリードのシーケンシング深度でシーケンスした。マッピング後、UMIツールを使用してUMIに従って遺伝子ごとにリードを折りたたんだが、同一の配列だけでなく、レーベンシュタイン距離の小さい配列も崩壊させることによるUMI配列のエラーも考慮した(詳細は https://github.com/CGATOxford/UMI-tools 参照)。平均して、この方法では細胞当たり13.9±0.125k遺伝子が検出され、ワークフロー効率を結論付けることはできない。しかしながら、測定した転写産物の数は、細胞あたり347.0±38.7kの異なる転写産物をもたらし、エキソンリードを一意にマッピングすることによって識別することができた。統計モデリングでは、細胞あたり1 Mioリードの所与のリード深度では、すべての転写産物の79.4％のみが配列決定され、NGSライブラリの潜在的な複雑さが1.26倍増加することが示された。さらに、mRNAバックグラウンド(非スプライシング、基礎転写など)から生じるマルチマッピング、イントロニックおよびインタージェニックリードの量を含み、現在のバイオインフォマティクスアルゴリズムによってのみ正しく割り当てることができないリードであり、総数は1.31の別の係数で増加する。したがって、提示した方法で調製したシングルセルNGSライブラリの転写物の総数は、上記のHEK293の推定値を約15％上回る576.5±64.3k転写物に達し、細胞周期段階の違い、およびマルチマッピングリードおよび現在のアノテーションのエクソンに整列しないリードを割り当てる際の曖昧さを引き起こす可能性がある。この例は、この方法が転写産物３’末端の大部分をNGSライブラリフラグメントに変換できるため、NGSライブラリの生成は100％に近い効率に達するが、少なくとも75％以上の効率に達する。

Claims

ａ）核酸テンプレートを提供するステップ、
ｂ）前記核酸テンプレートにオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズするステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記核酸テンプレートにハイブリダイズする相補部分と、前記核酸テンプレートにハイブリダイズしない相補部分の5'方向の非相補部分とを含み、および転写プロモーターの配列を含む、前記ステップ、
ｃ）ステップｂ）において、前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする核酸テンプレートの一部分に対して、３’方向に存在する核酸テンプレートの３’部分を加水分解するステップであって、前記３’部分が前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしていないか、または前記３’部分が前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしている、前記ステップ、
ｄ）前記核酸テンプレートを前記オリゴヌクレオチドプローブの非相補的部分に相補的な核酸で伸長させ、前記核酸テンプレートを有する配列において、前記転写プロモーターの配列の二重鎖を生成するステップ、
ｅ）転写プロモーターの配列の二重鎖に結合する転写酵素で核酸テンプレートを転写して、転写された核酸を生成するステップ、
を含む、転写核酸を生成する方法。
前記核酸テンプレートは、RNAを含む又はRNAからなる、請求項1に記載の方法。
前記加水分解は、エキソヌクレアーゼ、好ましくは３’-＞５’方向のヌクレオチドの除去を触媒する、一本鎖RNA特異的エキソヌクレアーゼを用いたものである、請求項１または２に記載の方法。
前記加水分解は、前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする領域のテンプレートにおいて、糖リン酸骨格、好ましくはホスホジエステル結合を加水分解して、テンプレートにニックを導入することを含み、好ましくは前記加水分解がエンドヌクレアーゼによるものである、請求項１または２に記載の方法。
前記核酸テンプレートの伸長は、ヌクレオチド重合、好ましくはDNAポリメラーゼによるものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記相補部分から前記核酸テンプレートにハイブリダイズしたときに、前記オリゴヌクレオチドプローブを伸長させるステップをさらに含み、好ましくは、前記伸長は、ステップｂ）とｃ）の間、ステップｃ）とｄ）の間、またはステップｄ）とｅ）の間である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドプローブの非相補部分が、前記相補部分と前記転写プロモーターの配列との間に識別配列および／または第１のアダプター配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
転写された１つ以上の核酸に、任意選択で第２のアダプター配列を有する１つ以上の二次プライマーをハイブリダイズして、前記二次プライマーをテンプレート依存的に伸長させることをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸テンプレートは、細胞小器官、細胞切片、または細胞由来の、好ましくは1～1000個の細胞、細胞小器官、または細胞切片由来のRNAである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸テンプレートは、DNAを含む核酸のプール中にあり、好ましくは請求項３または４と組み合わせて、前記DNAは請求項３に記載のエキソヌクレアーゼ、または請求項４に記載のホスホスジエステル結合の加水分解が可能な酵素、好ましくはエンドヌクレアーゼによって消化され得なく、その後の任意の転写から排除されることになる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸テンプレートを容器内に提供し、前記容器内でステップｂ）～ｅ）を実行することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
１つ以上の細胞を提供すること、該細胞の細胞材料を溶解すること、酵素を、好ましくはプロテイナーゼによって不活性化し、前記細胞の核酸を、ステップａ）に記載の核酸テンプレートとして証明することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に適した、複数のオリゴヌクレオチドプローブのセットであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、選択したテンプレート配列に相補的な配列、好ましくは少なくとも6個の連続するTのポリ(T)配列、転写プロモーター配列、および少なくとも4ヌクレオチド長の識別配列を含み、好ましくは、前記転写プロモーター配列は、複数のオリゴヌクレオチドプローブについて同一であり、および／または、好ましくは、前記識別配列は、少なくとも２つの前記複数のオリゴヌクレオチドプローブについて異なり；および／または好ましくは、転写プロモーター配列は一本鎖である、前記セット。
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を実施するのに適したキットであって、転写プロモーター配列、３’-＞５’エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、DNAまたはRNAポリメラーゼ、および転写プロモーター配列での転写を阻害することが可能な転写酵素を含むオリゴヌクレオチドプローブを含む、前記キット。
dNTPs、細胞溶解試薬、プロテイナーゼ、逆転写酵素、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１４に記載のキット。