CN115976173A - 一种用于扩增cDNA 5’末端的通用接头引物及5’RACE方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于扩增cDNA 5’末端的通用接头引物及5’RACE方法，涉及cDNA末端扩增的技术领域。本发明提供的接头引物序列，经扩增cDNA 5’末端后，非特异性扩增条带明显减少，目的产物更多。本发明提供的试剂盒以及5’RACE方法操作简便，尤其是可通过提前预混PCR反应体系明显减少了实验操作步骤，大幅缩短了cDNA扩增周期。本发明提供的5’RACE方法对未知片段的克隆效率高。通过两轮PCR、几个简单的步骤操作，即可完成5’端未知序列的扩增，获得完整的编码区5’端序列信息。

Description

一种用于扩增cDNA 5’末端的通用接头引物及5’RACE方法

技术领域

本发明涉及cDNA末端扩增的技术领域，具体而言，涉及一种用于扩增cDNA 5’末端的通用接头引物及5’RACE方法。

背景技术

RACE(rapid-amplification of cDNA ends)称为cDNA末端快速扩增技术，是一种快速克隆目的mRNA的3’或5’末端以获得mRNA全长的分子生物学技术。RACE技术以其独特的优势被应用于多个领域，如cDNA文库的建立、目的基因克隆、病毒基因组功能的研究、新的表达序列标签研发(expressed sequence tag,ESTs)等。随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE技术进行了改进，从而丰富了RACE技术的类型。目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM RACE、Capswitching RACE、环形RACE和T-RACE等。

5’RACE基本原理：5’RACE是对基因未知5’末端进行扩增的技术。本发明先利用mRNA中的一段特异序列作为结合位点，以特异性的反转录引物在反转录酶作用下，合成第一链cDNA。在TdT酶作用下加上(dC)残基，退火后，(dC)残基与含有寡核苷酸序列的通用接头引物5’adaptor Primer配对，以特异引物R1作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增。然后用一个含有部分接头序列的通用引物5’RACE Outer Primer作为上游引物，以另一个特异引物R2作为下游引物，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。

目前常用的5’RACE实验方法有三种：接头连接法(adaptor ligation)、去帽法(oligo caping method)和末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyl transferasemethod，TdT method)。

接头连接法以SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Code:634923)为代表。该方法原理是先利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为逆转录引物的结合位点，以Oligo(dT)作为逆转录引物，在逆转录酶作用下，合成第一链cDNA，该逆转录酶具有末端转移酶活性，在逆转录达到5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物5’adaptor Primer配对进行PCR扩增反应，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。该方法的优点是操作简便，一次逆转录可以获得全部基因模板用于多个基因的5’RACE实验，RNA质量较高的前提下，获得全长分子比例高。cDNA第一链合成和加尾一步完成，最大限度降低了mRNA的降解风险；该方法的缺点是逆转录特异性低，无法精确获得感兴趣的基因，常呈现连续的模糊带或较短的产物背景。

去帽法以5'-full RACE Kit(TaKaRa Code:D315)为代表。该方法原理是先利用mRNA的5’末端帽子结构特异性的对基因全长进行扩增。降解的mRNA 5’端有一个磷酸基团，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基团。再用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则mRNA 分子的5’末端会暴露出磷酸基团，随后的连接步骤中，锚定引物5’Outer Primer特异性地加在mRNA 分子的5’末端而不会和降解的mRNA连接。该方法的优点是全长分子比例高，非特异性PCR产物较少；该方法的缺点是实验操作复杂，针对mRNA分子操作，增加了mRNA降解的风险，对于mRNA 5’末端结构复杂或二级结构较多的基因，会导致实验失败，无法获得目的条带。

末端转移酶法以5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen Code:18374-058)为代表。该方法原理是利用基因特异性逆转录引物，在逆转录酶作用下合成第一链cDNA，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，在末端转移酶的作用下将poly(C)尾巴加在cDNA链的3’端，然后分别用接头引物5’adaptor Primer和基因特异性引物使用巢式PCR扩增目的基因。该方法的优点是经济实惠，无需特殊仪器设备，通常实验室可以自行完成，只需要设计一或两条特异性的逆转录引物及两条特异性的基因扩增引物，该方法使用的是特异性的逆转录引物，大大提高目的基因的扩增成功率。目前，末端转移酶法存在操作步骤多，扩增周期长，非特异性扩增产物多，而且由于扩增产物无法涵盖目的基因编码区5’端的完整信息，往往需要重复进行RACE过程。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于扩增cDNA5’末端的通用接头引物及5’RACE方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于扩增cDNA5’末端的通用接头引物，5’末端的接头引物序列为：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGIIGGIIGGII GGIIG，通用接头引物与3’端添加有poly(C)的单链cDNA片段的模板配对。

发明人提供了一种新的适用于扩增多物种的cDNA5’末端的通用接头引物，与原有的接头引物相比，改进后的接头引物在鸟嘌呤(G)中间插入两个脱氧次黄嘌呤(I)，使合成的接头序列长度增加；脱氧次黄苷(I)与四个碱基均能互补配对，但它与不同碱基具有不同的亲和力。稳定性顺序从高到低如下：I：C>I：A>I：T>I：G，选择性地在通用接头引物的3’端插入脱氧次黄苷(I)残基保持了引物3’端的低稳定性，并使引物锚定区域Tm值在65℃以上。提高了通用接头引物与cDNA3’端oligo d(C)特异性，减少与cDNA内部富含C序列非特异性扩增。在一些实施方式中，可以设置通用接头引物的Tm与扩增特异性引物(巢式PCR引物组)保持一致，方便设计PCR扩增程序。

发明人发现：本发明提供的接头引物序列，经扩增cDNA5’末端后，非特异性扩增条带明显减少，目的产物更多，说明优化效果较明显。

第二方面，本发明提供了一种扩增cDNA末端的试剂盒，试剂盒包括上述的用于扩增cDNA5’末端的通用接头引物。

发明人基于末端转移酶法，缩短了原有的扩增cDNA末端的操作步骤，优化了逆转录过程、接头引物，从而提高实验成功率。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括扩增cDNA5’末端的锚定引物，锚定引物的序列为：GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括逆转录酶、逆转录引物和巢式引物组；

在一种可选的实施方式中，巢式引物组包括第一巢式引物和第二巢式引物，且第一巢式引物用于与通用接头引物组合进行第一轮巢式PCR，第二巢式引物与锚定引物进行第二轮巢式PCR。

在一种可选的实施方式中，第一巢式引物和第二巢式引物的引物序列长度为23-28nt，且第一巢式引物所在的位置和第二巢式引物所在的位置大于20nt。第一巢式引物的引物序列长度为23-28nt，例如23nt、24nt、25nt、26nt、27nt或28nt。第二巢式引物的引物序列长度为23-28nt。例如23nt、24nt、25nt、26nt、27nt或28nt。使用长度超过30nt会导致引物合成成本上升，引物中有重叠片段会导致非特异性扩增产物增多。

在一种可选的实施方式中，引物的GC含量应为50-70％，Tm应高于65℃。通常退火温度高于70℃的引物会在RACE中更稳定的扩增。

在一种可选的实施方式中，第一巢式引物与第二巢式引物之间的Tm值相差小于1℃。这样设置有利于保持较高的扩增效率。

逆转录酶为降低或去除了RNase活性的M-MLV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、AMV逆转录酶或端粒酶逆转录酶。

在本发明应用较佳的实施方式中，RNA模板选自：mRNA、非编码RNA、miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA或核糖体RNA。

在一种可选的实施方式中，RNA模板选自：miRNA。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括反应Buffer；反应Buffer包括1-1.1M的二甲胂酸钾，1-1.1M的KCl，200-205mM Tris-HCl，78-80mM MgCl₂，10-12mMDTT，5-6mM CoCl₂，0.05％-0.06％(v/v)Triton X-100，其中Tris-HCl的pH为7.8-8.0。

本发明提供的试剂盒以及5’RACE方法操作简便，提前预混PCR反应体系，明显减少了实验操作步骤，大幅缩短了cDNA扩增周期。发明人特提供了能同时满足反转录扩增反应、RNase H酶消化和加尾反应的反应Buffer，可兼顾上述反转录体系、RNase H酶消化和加尾体系在同一反应Buffer完成。

第三方面，本发明还提供了一种采用上述的试剂盒或权利要求1的用于扩增cDNA5’末端的通用接头引物获得完整5’末端序列的5’RACE方法，该方法的原理图参照图1所示，该方法包括以下步骤：

采用5’末端的通用接头引物扩增3’端添加有poly(C)的单链cDNA片段，得到5'末端的RACE产物。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述5’RACE方法包括如下步骤：

逆转录：通过逆转录引物和逆转录酶对目的基因逆转录，获得第一链cDNA片段；

RNA降解反应；

在3’端加poly(C)；

第一轮巢式PCR：以通用接头引物和第一巢式引物进行第一轮巢式PCR；

第二轮巢式PCR：以第二巢式引物与锚定引物进行第二轮巢式PCR。

本发明提供的5’RACE方法对未知片段的克隆效率高。通过两轮PCR、几个简单的步骤操作，即可完成5’端未知序列的扩增，获得完整的编码区5’端序列信息。特别适用于多个基因的5’端未知片段的扩增。由于5’RACE接头引物具有通用性，且巢式PCR引物的设计搭配灵活，因此PCR条件也容易筛选获得；而且扩增产物包括目的基因编码区5’端的完整信息，不需要重复进行RACE过程。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一轮巢式PCR的扩增程序包括：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环(此为降落PCR扩增阶段)；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸1-5min(此为特异性扩增阶段)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述第二轮巢式PCR的扩增程序包括：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环(此为降落PCR扩增阶段)；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸1-5min(此为特异性扩增阶段)。

第四方面，本发明还提供了采用上述的试剂盒或上述的用于扩增cDNA5’末端的通用接头引物在扩增cDNA中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的适用于扩增多物种的cDNA 5’末端的通用接头引物，与原有的接头引物相比，改进后的通用接头引物在鸟嘌呤(G)中间插入两个脱氧次黄嘌呤(I)，使合成的接头序列长度增加；脱氧次黄苷(I)与四个碱基均能互补配对，但它与不同碱基具有不同的亲和力。稳定性顺序从高到低如下：I：C>I：A>I：T>I：G，选择性地在通用接头引物的3’端插入脱氧次黄苷(I)残基保持了引物3’端的低稳定性，并使得引物锚定区域Tm值在65℃以上。提高了通用接头引物与cDNA 3’端oligo d(C)特异性，减少与cDNA内部富含C序列非特异性扩增。因此，本发明提供的接头引物序列，经扩增cDNA5’末端后，非特异性扩增条带明显减少，目的产物更多。

本发明提供的试剂盒以及5’RACE方法操作简便，尤其是可通过提前预混PCR反应体系明显减少了实验操作步骤，大幅缩短了cDNA扩增周期。此外，发明人还提供了能同时满足反转录扩增反应、RNase H酶消化和加尾反应的反应Buffer，可兼顾上述反转录体系、RNase H酶消化和加尾体系在同一反应Buffer完成。

本发明提供的5’RACE方法对未知片段的克隆效率高。通过两轮PCR、几个简单的步骤操作，即可完成5’端未知序列的扩增，获得完整的编码区5’端序列信息。特别适用于多个基因的5’端未知片段的扩增。由于5’RACE接头引物具有通用性，且巢式PCR引物的设计搭配灵活，因此PCR条件也容易筛选获得；而且扩增产物包括目的基因编码区5’端的完整信息，不需要重复进行RACE过程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为是本发明5’RACE实验方法原理图；

图2是实施例1中为以5’Outer Primer和H-R2为引物的PCR扩增产物电泳结果图，“M”泳道标样为Marker，“1”为采用对照试剂盒进行扩增后的扩增产物的电泳图，“2”泳道标样为以5’Outer Primer和H-R2为引物进行PCR扩增后的扩增产物的电泳图；

图3是扩增所得的人GAPDH基因序列的NCBI比对结果图；

图4是实施例2中为以5’Outer Primer和RC927-NR2为引物的PCR扩增产物电泳结果图，“M”泳道标样为Marker，“1”为采用对照试剂盒进行扩增后的扩增产物的电泳图，“2”泳道标样为以5’Outer Primer和RC927-NR2为引物进行PCR扩增后的扩增产物的电泳图；

图5为实施例1和实施例2中的阳性克隆的测序序列。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例根据人GAPDH基因，同时使用5’RACE System for Rapid Amplificationof cDNA Ends(Invitrogen Code:18374-058)试剂盒作为对照实验(按照说明书操作)。具体步骤如下：

1.1模板制备：

取Hela细胞，采用TRIzol法提取总RNA。对照试剂盒与本方案使用同一份RNA。

1.2合成引物

5’末端的接头引物序列(adaptor Primer)为：

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGIIGGII GGIIGGIIG；

对照试剂盒接头引物为：

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGGGIIG GGIIGGGIIG；

锚定引物5’RACE Outer Primer:GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC；

逆转录引物5’RACE RT Primer1:AGGGGTGCTAAGCAGTTGGT和5’RACE RT Primer2:ATGAGTCCTTCCACGATACCAA；

巢式引物H-R1:CAGCAGAGGGGGCAGAGATGATGA；

巢式引物H-R2:CATGGTGGTGAAGACGCCAGTGGA。

1.3合成cDNA

使用的试剂盒为：Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒(含dsDNase)(ThermoScientific Code:K1681)在反应体系中加入1μg的总RNA，逆转录引物(5’RACE RT Primer110μM 0.5μL和5’RACE RT Primer2 10μM 0.5μL)，完成逆转录PCR，得到第一链cDNA。

1.4RNase H消化多余的mRNA(Thermo Scientific Code:EN0201)。在第一链cDNA中加入1μL RNase H，1μL 100μM的dCTP溶液，10μL 5×Buffer和16μL RNase-free water。5×Buffer：1M potassium cacodylate,1M KCl,200mM Tris-HCl(pH 7.8)，80mM MgCl₂，10mM DTT，5mM CoCl₂，0.05％(v/v)Triton X-100。

1.5将步骤1.4配制的反应体系，放入PCR仪中，37℃孵育20分钟，94℃孵育3分钟，然后冰浴5分钟。

1.6末端脱氧核苷酸转移酶在cDNA3'末端加上poly(C)尾，加入2μL末端脱氧核苷转移酶TdT(Thermo Scientific Code:EP0161)，37℃孵育15分钟，70℃反应10分钟，-20℃保存备用。

1.7第一轮PCR扩增：

第一轮PCR扩增反应中，分为两部分：a.降落PCR扩增阶段，该阶段的退火温度从70℃开始，每个循环降低1℃，共10个循环；b.特异性扩增阶段，退火温度为60℃，共25个循环。

反应体系为：步骤1.6中的cDNA 0.5μL，5’adaptor Primer(10μM)0.5μL，H-R1(10μM)0.5μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.2μL，2×GC Buffer I 10μL，dNTP Mixture(2.5mMeach)3.2μL，RNase-free water补足至20μL。扩增试剂盒为：TaKaRa LA Taq with GCBuffer(TaKaRa Code:RR02AG)

扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸5min。

1.8第二轮PCR扩增：

将步骤1.7获得的PCR产物稀释100倍为模板.

反应体系为：步骤1.7中的PCR产物0.5μL，5’Outer Primer(10μM)0.5μL，H-R2(10μM)0.5μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.2μL，2×GC Buffer I 10μL，dNTP Mixture(2.5mMeach)3.2μL，RNase-free water补足至20μL。扩增试剂盒为：TaKaRa LA Taq with GCBuffer(TaKaRa Code:RR02AG)。

扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸5min。

对照试剂盒的扩增步骤：94℃预变性1min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸120s，共35个循环，72℃延伸5min。

1.9将步骤1.8的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图见图2。目标条带位于300-400bp之间。对照试剂盒目的条带标记1，本实施例目的条带标记2，Marker(生工Code:B500347-0050)标记M。

结果显示：本发明优化后的通用接头引物序列，经扩增后，非特异性扩增条带明显减少，目的产物更多，说明优化效果较明显。而且对照试剂盒消化后需要纯化后加尾，纯化步骤需要30分钟，而本发明消化加尾一步完成，省去了纯化步骤，工序更简单。

1.10PCR产物的回收

将步骤1.9中本实施例的PCR产物加入100μL的异丙醇和300μL Buffer B2混合后加入纯化柱中，按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工Code:B518131-0050)操作。

1.11连接转化

使用pMD^TM18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa Code:6011)试剂盒，进行连接转化，挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

菌落PCR鉴定引物：

PUC-M13F:acatttcgtaaaacgacggc

PUC-M13R:tatggaaaaacgccagcaac

将目标条带大小正确的PCR产物，进行测序验证。

(注：该阳性克隆的测序引物也是PUC-M13F和PUC-M13R)

测序的序列见图5所示的序列1所示。

经NCBI比对，见图3，扩增序列为人的GAPDH基因，序列一致性100％，表明5’RACE扩增成功。

实施例2

本实施例根据黑松LRK41830基因，同时使用5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends(Invitrogen Code:18374-058)试剂盒作为对照实验(按照说明书操作)。具体步骤如下：

2.1模板制备：

取黑松松针，采用TRIzol法提取总RNA。对照试剂盒与本方案使用同一份RNA。

2.2合成引物

5’末端的接头引物序列(adaptor Primer)为：

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGIIGGII GGIIGGIIG

锚定引物5’RACE Outer Primer为:GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC

逆转录引物RC927-NRT1 GTCTCTTGACAATTCACAGGCTG和

RC927-NRT2 CACTTGGAGGAAGTTCTGTGGTAT

巢式引物RC927-NR1 CAGCAATCTGCCAGAGCTAACC

巢式引物RC927-NR2 TTTATCTGAGACCGCTACGTTTCC

2.3合成cDNA

使用的试剂盒为：Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒(含dsDNase)(ThermoScientific Code:K1681)在反应体系中加入1μg的总RNA，逆转录引物(RC927-NRT1 10μM0.5μL和RC927-NRT2 10μM 0.5μL)，完成逆转录PCR，得到第一链cDNA。

2.4RNase H消化多余的mRNA(Thermo Scientific Code:EN0201)。在第一链cDNA中加入1μL RNase H，1μL 100μM的dCTP溶液，10μL 5×Buffer和16μL RNase-free water。5×Buffer：1M potassium cacodylate,1M KCl,200mM Tris-HCl(pH 7.8)，80mM MgCl₂，10mM DTT，5mM CoCl₂，0.05％(v/v)Triton X-100。

2.5将步骤2.4配制的反应体系，放入PCR仪中，37℃孵育20分钟，94℃孵育3分钟，然后冰浴5分钟。

2.6末端脱氧核苷酸转移酶在cDNA 3'末端加上poly(C)尾，加入2μL末端脱氧核苷转移酶TdT(Thermo Scientific Code:EP0161)，37℃孵育15分钟，70℃反应10分钟，-20℃保存备用。

2.7第一轮PCR扩增：

第一轮PCR扩增反应中，分为两部分：a.降落PCR扩增阶段，该阶段的退火温度从70℃开始，每个循环降低1℃，共10个循环；b.特异性扩增阶段，退火温度为60℃，共25个循环。

反应体系为：步骤2.6中的cDNA 0.5μL，5’adaptor Primer(10μM)0.5μL，RC927-NR1(10μM)0.5μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.2μL，2×GC Buffer I 10μL，dNTP Mixture(2.5mM each)3.2μL，RNase-free water补足至20μL。扩增试剂盒为：TaKaRa LA Taq withGC Buffer(TaKaRa Code:RR02AG)

扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸5min。

2.8第二轮PCR扩增：

将步骤2.7获得的PCR产物稀释100倍为模板.

反应体系为：步骤2.7中的PCR产物0.5μL，5’OuterPrimer(10μM)0.5μL，RC927-NR2(10μM)0.5μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.2μL，2×GC Buffer I 10μL，dNTP Mixture(2.5mMeach)3.2μL，RNase-free water补足至20μL。扩增试剂盒为：TaKaRa LA Taq with GCBuffer(TaKaRa Code:RR02AG)

扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸5min。

对照试剂盒的扩增步骤：94℃预变性1min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸120s，共35个循环，72℃延伸5min。

2.9将步骤2.8的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图见图4。目标条带位于300-400bp之间。对照试剂盒目的条带标记1，本实施例目的条带标记2，Marker(生工Code:B500347-0050)标记M。

结果显示：本发明提供的5’接头引物序列，经扩增后，非特异性扩增条带明显减少，目的产物更多，说明优化效果较明显。而且对照试剂盒消化后需要纯化后加尾，纯化步骤需要30分钟，而本发明消化加尾一步完成，省去了纯化步骤，工序更简单。

2.10PCR产物的回收

将步骤2.9中本实施例的PCR产物加入100μL的异丙醇和300μL Buffer B2混合后加入纯化柱中，按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工Code:B518131-0050)操作。

2.11连接转化

使用pMD^TM18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa Code:6011)试剂盒，进行连接转化，挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

菌落PCR鉴定引物：

PUC-M13F:acatttcgtaaaacgacggc

PUC-M13R:tatggaaaaacgccagcaac

将目标条带大小正确的PCR产物，进行测序验证。

(注：该阳性克隆的测序引物也是PUC-M13F和PUC-M13R)

测序的序列见图5所示的序列2。经比对，扩增序列与已知CDS序列成功拼接，实验成功。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于扩增cDNA 5’末端的通用接头引物，其特征在于，所述5’末端的接头引物序列为：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGIIGGIIGGII GGIIG，所述通用接头引物与3’端添加有poly(C)的单链cDNA片段的模板配对。

2.一种扩增cDNA末端的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于扩增cDNA5’末端的通用接头引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增cDNA 5’末端的锚定引物，所述锚定引物的序列为：GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶、逆转录引物和巢式引物组；

优选地，所述巢式引物组包括第一巢式引物和第二巢式引物，且所述第一巢式引物用于与所述通用接头引物组合进行第一轮巢式PCR，所述第二巢式引物与所述锚定引物进行第二轮巢式PCR；

优选地，所述第一巢式引物和第二巢式引物的引物序列长度为23-28nt，且所述第一巢式引物所在的位置和第二巢式引物所在的位置大于20nt。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应Buffer；所述反应Buffer包括1-1.1M的二甲胂酸钾，1-1.1M的KCl，200-205mM Tris-HCl，78-80mM MgCl₂，10-12mM DTT，5-6mM CoCl₂，0.05％-0.06％(v/v)Triton X-100，其中Tris-HCl的pH为7.8-8.0。

6.一种采用如权利要求2-5任一项所述的试剂盒或权利要求1所述的用于扩增cDNA 5’末端的通用接头引物获得完整5’末端序列的5’RACE方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

采用所述5’末端的通用接头引物扩增3’端添加有poly(C)的单链cDNA片段，得到5'末端的RACE产物。

7.根据权利要求6所述的5’RACE方法，其特征在于，所述5’RACE方法包括如下步骤：

逆转录：通过逆转录引物和逆转录酶对目的基因逆转录，获得第一链cDNA片段；

RNA降解反应；

在3’端加poly(C)；

第一轮巢式PCR：以所述通用接头引物和第一巢式引物进行第一轮巢式PCR；

第二轮巢式PCR：以第二巢式引物与锚定引物进行第二轮巢式PCR。

8.根据权利要求7所述的5’RACE方法，其特征在于，所述第一轮巢式PCR的扩增程序包括：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸1-5min。

9.根据权利要求7所述的5’RACE方法，其特征在于，所述第二轮巢式PCR的扩增程序包括：94℃预变性1min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火温度每个循环降低1℃，共10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25个循环，72℃延伸1-5min。

10.采用如权利要求2-5任一项所述的试剂盒或权利要求1所述的用于扩增cDNA5’末端的通用接头引物在扩增cDNA中的应用。

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