CN107119043B - 一种去除rna样本中非目标rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种去除RNA样本中非目标RNA的方法，包括：反转录引物对RNA样本进行反转录，去除RNA模板，得到非目标第一链cDNA和目标第一链cDNA；非目标第一链cDNA与特异性探针杂交，得到非目标第一链cDNA‑探针复合物；双链特异性核酸酶消化非目标第一链cDNA‑探针复合物，得到目标第一链cDNA。本发明还可以将所述非目标第一链cDNA‑探针复合物延伸，获得能完全被双链特异性核酸酶消化的双链DNA区域，再加双链特异性核酸酶加以消化。本发明方法简便、灵活、成本低廉，可彻底去除非目标DNA对下游试验的影响，对转录组学、RNA测序领域研究具有重大而深远的意义。

Description

一种去除RNA样本中非目标RNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学与转录组学、RNA测序领域。更具体地，涉及一种去除RNA样本中非目标RNA的方法。
背景技术
随着后基因组时代的来临，转录组学研究作为一种强有力的工具，在现今的生命科学研究中占有日益重要的地位。它可以帮助人们深入了解基因结构，揭示特定条件下的基因表达情况，以及生物体应对外界环境变化的调控机制。而二代测序技术的蓬勃发展，特别是RNA测序技术的进步，也迅速推进了转录组学研究的广泛应用。但是目前RNA测序技术面临的最大挑战，便是目标RNA在总RNA中的低丰度。以mRNA为例，通常仅占总RNA的1～5％，总RNA中的大部分，则是核糖体RNA(rRNA)与转运RNA(tRNA)，而这些往往是不为研究人员所需要的。如不将其去除，则会消耗巨量的测序资源。因此，学者们需要在研究时，从总RNA样品中去除非目标RNA，然后再进行测序与下游的生物信息学分析工作。
近年来，科研工作者们已经开发出多种方法以去除以rRNA为代表的非目标的RNA。这些方法使用不同RNA之间的方方面面区别设计去除手段，如大小、序列特点、5’磷酸基、二级结构、丰度等，都可作为去除方法的依据；同时，也有若干商业化的试剂盒可用于去除非目标RNA。首先要说明的是，对于真核生物，因其mRNA具有poly(A)尾的结构，因此很容易用poly(T)加以富集纯化进而去除其它RNA，或是直接用poly(T)引物进行合成cDNA；而原核生物的mRNA并不具备这样的结构，因此去除原核生物总RNA中非目标RNA，具有更高的技术难度。因此下文要详述的RNA去除方法，均是针对包括原核生物与真核生物在内的，普遍适用的方法。
从技术角度对这些方法加以区分，可以分为三大类：RNA去除步骤在cDNA合成之前，RNA去除与cDNA合成同步进行，RNA去除步骤在cDNA合成之后。如何在这些方法中加以抉择，最重要的两点便是去除效率，以及去除过程中对RNA携带信息的偏好性选择。最理想的方法，自然是在最大限度保留所需RNA的同时，尽可能去除其余非目标RNA。然而，任何方法都有其优点与局限，以及可能存在的偏好性，下面将对这些方法逐一加以介绍：
1、利用凝胶电泳选择不同大小的RNA
完整的rRNA在凝胶电泳时呈现单一条带，因此，可以在电泳后回收位于rRNA条带之间的非核糖体RNA(McGrath KC,Thomas-Hall SR,Cheng CT,Leo L,Alexa A,Schmidt S,et al.Isolation and analysis of mRNA from environmental microbialcommunities.J Microbiol Methods2008；75(2):172–6.)。尽管该回收方法确可获得相对富集的mRNA，但其缺点也显而易见：断裂的rRNA、rRNA前体因其与成熟rRNA的大小不一致而未被去除；而与rRNA大小相近的目的RNA则被一并除掉了。此外，较大的初始RNA样品量、操作过程中易发生Rnase污染，也都是该方法的局限。
2、变性高效液相色谱技术分离RNA
RNA的物理分离亦可通过色谱技术实现，RNA大小、与基质的结合强度、洗脱液的离子条件，是分离的重要依据。已有学者用此原理实现了对棒状杆菌属RNA样品中rRNA与mRNA的快速分离(Castro TLP,Seyffert N,Ramos RTJ,Barbosa S,Carvalho R,Pinto AC,etal.Ion Torrent-based transcriptional assessment of a Corynebacteriumpseudotuberculosis equi strain reveals denaturing high-performance liquidchromatography a promising rRNA depletion method.Microbial Biotechnol 2013；6(2):168–77.)。但该方法同样需要较大的初始RNA样品量，其广泛适用性亦有待更多测试。
3、依赖5’磷酸基的核酸外切酶降解技术
Epicentre公司已研发出利用特定酶解反应降解rRNA的试剂盒(mRNA-ONLYProkaryotic mRNA Isolation kit)，该试剂盒利用的核酸外切酶可选择性降解具有5’端单磷酸基的RNA，而不会降解具有5’端三磷酸或羟基的RNA。成熟rRNA来自单一的前体rRNA转录，均有5’端单磷酸，因而可被该酶选择性降解；而mRNA带有5’端三磷酸帽子结构，可抵御该酶的降解。该方法利用不同RNA分子结构的一般性特征加以区分，适用范围较广泛。然而，该方法的去除效率和保真性会明显受到样品中mRNA部分降解的影响(He S,Wurtzel O,Singh K,Froula JL,Yilmaz S,Tringe SG,et al.Validation of two ribosomal RNAremoval methods for microbial metatranscriptomics.Nat Methods 2010；7(10):807–12.)，特别是在细菌与古生菌中，mRNA半寿期极短，往往转录起始数分钟后便开始降解(Rauhut R,Klug G.mRNA degradation in bacteria.FEMS Microbiol Rev 1999；23(3):353–70.)，因此如使用此试剂盒，这些部分降解后的、具有5’端单磷酸的mRNA片段，则会被损失掉。
4、RNaseH，DNaseI消化技术
另一种rRNA酶解技术则是利用了RNaseH特异性降解DNA:RNA杂交分子中RNA、而不降解RNA单链的能力(Hausen P,Stein H,Ribonuclease H.An enzyme degrading the RNAmoiety of DNA-RNA hybrids.Eur J Biochem/FEBS 1970；14(2):278–83)。该方法中，总RNA首先使用一系列针对rRNA的特异性引物混合物进行杂交或反转录，然后加入RNaseH以降解DNA：RNA杂交双链中的rRNA，继而再加入DNaseI以降解残留的DNA。John Morlan利用此原理设计是针对人/大鼠/小鼠的5S、18S、28S rRNA的短的反义DNA探针(50-80bp)。将这些探针与人体RNA杂交后用RNase H和DNase I处理，该方法可去除98％的rRNA(JohnD.Morlan,Kunbin Qu,Dominick V.Sinicropi.Selective Depletion of rRNA EnableWhole Transcriptome Profiling of Archival Fixed Tissue.PLOS One,2012vol7,e42882)。
上述基于RNaseH，DNaseI消化技术的缺点是十分显著的：第一，由于利用的引物是针对目标RNA设计的，要达到这些引物不与非目标RNA杂交的可能性是极低的，所以极有可能在最终的目标RNA中存在部分非目标RNA；第二，目标RNA是在经过Rnase H，DNase等一系列处理后得到的，而RNA是极易被污染、被降解，目标RNA去除步骤越多，其被降解的可能性越大。
5、利用特异性探针的消减杂交技术
消减杂交利用rRNA的反义序列作为特异性探针，因而rRNA与结合在微球或磁珠上的探针杂交后，杂交分子可以从溶液中去除(Pang X,Zhou DS,Song YJ,Pei D,Wang J,GuoZ,et al.Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridizationmethod.Microbiol Immunol 2004；48(2):91–6.)。该方法是目前使用最为广泛的技术，或许是由于多种商业化试剂盒均使用本技术的缘故。如Ambion公司的MICROBExpress kit，使用两部连续杂交将rRNA捕获于磁珠上。但该试剂盒使用上有明确的物种局限，所有古生菌样本均不适用；且受限于所用探针种类与数量，该试剂盒对RNA样品的完整性要求很高——降解的rRNA往往会丢失杂交位点而无法被有效去除。另有较为晚近的Epicentre公司研发的Ribo-Zero kit，使用的则是偶联生物素的特异探针，因而rRNA与之杂交后可用相应的链霉亲和素包被的亲和层析磁珠去除(Sooknanan R,Pease J,Doyle K.Novel methods forrRNA removal and directional,ligation-free RNA-seq library preparation.NatMethods Appl Notes2010；7(10).)。与MICROBExpress kit相比，该试剂盒可提供更为宽广的rRNA去除范围，这或与其使用了较多的专利性探针有关。然而，该方法要求较高的初始RNA样品量，否则去除效率便会显著受限。
无论使用以上何种试剂盒，均会受到探针选择的限制。因而亦有针对样品进行特异性去除的探针设计方法，实际上，该方法甚至早于商业化试剂盒而发明。近期，有学者开发了物种特异性的rRNA消除系统(Li S-K,Zhou J-W,Yim AK-Y,Leung AKY,Tsui SKW,ChanTF,et al.Organism-Specific rRNA capture system for application in next-generation sequencing.PLoS One2013；8(9):e74286.)，该方法适用于单一物种或简单群落；对于复杂群落，也有学者开发了相应的rRNA去除方案(Stewart FJ,Ottesen EA,DeLongEF.Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtractionprotocol for microbial metatranscriptomics.ISME J 2010；4(7):896–907.)。尽管这些方法都在一定范围内获得了较成功的结果，但仍未得到广泛推广，主要是因其与商业化试剂盒相比，程序耗时较长，需要更加熟练的设计与优化技巧。
6、基于mRNA相对rRNA的3’端聚腺苷酸化偏好之去除方法
有学者发现使用酵母来源的poly(A)聚合酶，可对大肠杆菌的mRNA而非rRNA进行选择性聚腺苷酸化，进而推测rRNA与核糖体蛋白结合时，3’端聚腺苷酸化受到空间位阻(Amara RR,Vijaya S.Specific polyadenylation and purification of totalmessenger RNA from Escherichia coli.Nucleic Acids Res1997；25(17):3465–70.)。基于此现象，有学者以此方法结合Oligo(dT)亲和层析纯化技术，实现对mRNA的富集(Wendisch VF,Zimmer DP,Khodursky A,Peter B,Cozzarelli N,Kustu S.Isolation ofEscherichia coli mRNA and comparison of expression using mRNA and total RNAon DNA microarrays.Anal Biochem 2001；290(2):205–13.)。另有学者用此方法对mRNA添加poly(A)后，使用Oligo(dT)引物特异性合成cDNA(Frias-Lopez J,Shi Y,Tyson GW,Coleman ML,Schuster SC,Chisholm SW,et al.Microbial community gene expressionin ocean surface waters.Proc Natl Acad Sci USA2008；105(10):3805–10.)，据作者介绍，此方法对mRNA的富集作用不仅源于聚腺苷酸化的偏好性，也可能与rRNA的二级结构阻碍合成有关。但同时也有学者指出了使用该方法时，Oligo(dT)引物与随机引物相比，对于5’端、特别是长转录子的局限性(Wilhelm BT,Landry JR.RNA-Seq-quantitativemeasurement of expression through massively parallel RNA-sequencing.Methods2009；48(3):249–57.)。
7、cDNA合成时的选择性引物结合
以上方法均为在cDNA合成之前去除非目标RNA，而在合成时使用随机引物实现无偏好性的转录组覆盖。实际上，在完全随机的引物中选择一部分序列不完全随机的子集以区别对待不同的RNA分子，则可实现对特定RNA的选择性合成cDNA(Gonzalez JM,RobbFT.Counterselection of prokaryotic ribosomal RNA during reverse transcriptionusing non-random hexameric oligonucleotides.J Microbiol Methods 2007；71(3):288–91.)。本方法易于在实验室内操作，且无须较高的初始RNA样品量。为了获得高特异性的选择引物，基于计算机的设计必不可少，已有学者在此方面做出了探索性的工作(ArmourCD,Castle JC,Chen R,Babak T,Loerch P,Jackson S,et al.Digital transcriptomeprofiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.Nat Methods2009；6(9):647–9.)。另外NuGEN公司也研发了针对不同种属的选择性引物的试剂盒(Ovation Prokaryotic RNA-Seq System)，然而其实战表现并未尽如人意，针对不同物种有极大的差异；与前文介绍的基于其它原理研发的若干种试剂盒相比，其特异性仅位于下游。
8、cDNA文库标准化
rRNA还可以在cDNA合成后被去除(Ko MSH.An“equalized cDNA library”by thereassociation of short double-stranded cDNAs.Nucleic Acids Res1990；18(19):5705–11.)，该方法首先高温变性双链cDNA后再低温重退火，因为cDNA重新退火速率与其浓度平方成比例，因而源自高浓度RNA(如rRNA、tRNA)转录的cDNA会先于源自低浓度RNA(如mRNA)所转录cDNA而退火，即更早形成双链。因此控制合适的时间点终止退火，即可使不同来源的RNA形成的cDNA分别主要处于单链或双链的不同状态；此时再用双链特异性核酸酶(DSN)进行消化或通过色谱手段物理分离，即可去除非目标RNA。因该方法在cDNA文库构建之后加以操作，所需起始RNA样品量可降至微克级以下。但该方法亦有显著局限，受浓度、GC含量、mRNA丰度的影响明显，且针对群落RNA样品，其中不同物种的RNA本身浓度差异也是严重影响因素之一，使得不同RNA无法被有效分离。
上文介绍的各种方法，都各自有其局限性，因此有学者尝试组合不同的方法以提高去除效率(Poretsky RS,Hewson I,Sun S,Allen AE,Zehr JP,Moran MA.Comparativeday/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the NorthPacific subtropical gyre.Environ Microbiol2009；11(6):1358–75.Peano C,Pietrelli A,Consolandi C,Rossi E,Petiti L,Tagliabue L,et al.An efficient rRNAremoval method for RNA sequencing in GC-rich bacteria.Microbial InformExperiment 2013；3(1):1.)。但这些方法可能在某些情况下，能够提升去除效率的同时却产生更高的偏好性；且增加的处理、纯化等步骤会带来更多的材料损失与污染概率。因此选择多种方法的组合时，仍需慎重。
综上，从总RNA样品中富集所需RNA、去除非目标RNA，是转录组学与RNA测序研究中至关重要的步骤。现有的各种去除方法均有其局限，表现在对样品的要求、去除效率、偏好性等方面。针对这些方法的评估测试，以及新方法的开发，也是目前备受关注的研究内容。就现有方法来看，没有一种技术可以完全除净非目标RNA，而这些未除净的RNA在后续的文库构建、扩增过程中，是能够被扩增的，进而产生无用的信息，影响后续分析工作。因此，急需一种技术，可将非目标RNA在文库构建完成之前全部去除，而无需担心其残留对下游工作的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种去除RNA样本中非目标RNA的方法，该方法可彻底去除的非目标RNA，避免其对下游试验的影响。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种去除RNA样本中非目标RNA的方法，包括以下步骤：(1)反转录引物对RNA样本进行反转录，去除RNA模板，得到非目标第一链cDNA和目标第一链cDNA；(2)非目标第一链cDNA与特异性探针杂交，得到非目标第一链cDNA-探针复合物；(3)双链特异性核酸酶消化非目标第一链cDNA-探针复合物，得到目标第一链cDNA。
在本发明优选的实施方式中，将步骤(2)中得到的非目标第一链cDNA-探针复合物进一步延伸，获得能完全被双链特异性核酸酶(DSN酶)消化的足够长度的完全互补的非目标第一链cDNA-探针复合物，再利用双链特异性核酸酶消化(见图1)。
进一步，本发明中合成第一链cDNA时使用的反转录引物为5’端带有或不带有第一接头序列的随机引物，所述随机引物可与RNA样本中任意RNA组分结合启动反转录。
本发明中当使用5’端带有第一接头序列的随机引物时，可在合成的第一链cDNA的5’端引入第一接头，用RNase H去除RNA模板后，用RNA连接酶在第一链cDNA3’端加上第二接头，具体包括以下步骤：(1)5’端带有第一接头的随机引物对RNA样本进行反转录，去除RNA模板，在第一链cDNA的3’端加第二接头，得到两端带有接头序列的非目标和目标第一链cDNA；(2)两端带有接头序列的非目标第一链cDNA与特异性探针杂交，得到两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物；(3)双链特异性核酸酶消化非目标第一链cDNA-探针复合物，得到两端带有接头序列的目标第一链cDNA。
进一步，也可以先用RNA连接酶在第一链cDNA3’端加上第二接头后，再用RNase H去除RNA模板，具体包括以下步骤：(1)5’端带有第一接头的随机引物对RNA样本进行反转录，在第一链cDNA的3’端加第二接头，去除RNA模板，得到两端带有接头序列的非目标和目标第一链cDNA；(2)两端带有接头序列的非目标第一链cDNA与特异性探针杂交，得到两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物；(3)双链特异性核酸酶消化非目标第一链cDNA-探针复合物，得到两端带有接头序列的目标第一链cDNA。
在本发明优选的实施方式中，将步骤(2)中得到的两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物进一步延伸，获得能完全被双链特异性核酸酶(DSN酶)消化的足够长度的完全互补的两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物，再利用双链特异性核酸酶消化。
本发明上述通过使用5’端带有第一接头序列的随机引物得到两端带有接头序列的目标第一链cDNA序列，无需PCR，直接将两端带接头的cDNA用作RNA二代测序的文库。也可使用PCR方法合成第二链cDNA，此时所用PCR引物与第一链cDNA两端的第一、第二接头互补。还可在PCR引物5’端带有其它序列，以便在PCR扩增之后在cDNA两端加上所需的序列，满足下游实验需求，如用于RNA测序的文库构建(见图2)。
本发明中所述cDNA两端的接头序列可以相同也可以不同，具体根据下游试验目的进行选择。
进一步，本发明中降解非目标第一链cDNA后，也可用PCR方法扩增剩余的目标第一链cDNA，进行下游试验，PCR引物可以是根据下游试验需求设计的待扩增基因的特异引物。
在本发明优选的实施方式中，所述特异性探针是根据非目标RNA序列设计的特异性探针，可以通过化学合成或其它分子生物学方法获得。特异性探针既可以是与非目标RNA反转录得到的第一链cDNA序列100％互补的，也可以是部分互补的简并碱基，只要这些碱基能够作为双链cDNA合成的引物就能够满足要求。具体的，本发明中特异性探针与非目标RNA反转录得到的第一链cDNA序列互补碱基的比例由DSN酶决定，不同DSN酶要求的长度不一样，只要能与非目标RNA反转录得到的第一链cDNA序列杂交的特异性探针均在本发明的保护范围之内。
进一步，本发明中所述RNA样本可以是任意RNA样本，包括但不限于直接提取后的RNA、片段化打断处理之后的RNA、使用现有技术富集的mRNA、使用现有技术去除rRNA之后的RNA，等等。
其中，所述非目标RNA可以是RNA样本中的任意RNA组分，包括但不限于rRNA、tRNA、mRNA，等等；优选的，非目标RNA为rRNA；所述目标RNA可以是RNA样本中的任意RNA组分，包括但不限于编码RNA、非编码RNA，等等。
进一步，本发明所述非目标第一链cDNA是通过非目标RNA反转录得到的第一链cDNA；所述目标第一链cDNA是通过目标RNA反转录得到的第一链cDNA。
进一步，本发明所述的双链特异性核酸酶，可以是任何能够特异性降解双链DNA，而不会降解单链DNA的核酸酶。
传统任何一种RNA去除方法，无论步骤是在cDNA合成之前、之中还是之后，都有自身的局限性，无法实现对非目标RNA的100％去除，且在去除过程中存在不同程度的偏爱性。且这些方法多针对rRNA、tRNA而设计，对于某些情况下需要去除其它RNA则无能为力。商品化rRNA去除试剂盒，往往只针对特定物种的部分样品，对样本量也有较高要求，且未除净的RNA或其降解产物依然会对下游实验产生影响，可以被扩增放大，污染后续实验数据。本发明是一种利用特异性探针与非目标RNA合成的第一链cDNA相结合形成非目标第一链cDNA-探针复合物，并用双链特异性核酸酶酶解该复合物，使得非目标第一链cDNA无法被作为模板进行PCR扩增，从而从总RNA样本中去除这部分非目标RNA对下游实验所产生影响的技术。通过生物信息学手段合理设计探针的序列、长度与数量，在了解待处理RNA样本信息的前提下，可以针对任意RNA样本，从中有选择地去除任何非目标RNA，保留所需研究的RNA。
本发明的有益效果如下：
本发明利用特异性探针与非目标RNA合成的第一链cDNA相结合，形成局部的双链DNA区域；再用双链特异性核酸酶(DSN)对cDNA进行直接消化或延伸后再消化，使这些cDNA断裂，无法作为模板进行PCR扩增，从而彻底去除非目标RNA对下游实验所产生的影响。与传统方法相比，本发明无需完全降解非目标RNA或其产生的第一链cDNA，只要使cDNA发生断裂，则其无法作为模板被扩增，因此可以实现远超任何现有方法的特异性去除效率，并且去除能力更加强大，对所需序列的保真性更高，且不受物种或样品的制约，可针对任何RNA样品中的任何组分加以特异性去除或保留。
本发明方法还可在第一链cDNA合成时，在第一链cDNA两端引入接头序列，可直接在cDNA的末端灵活添加任何所需序列，或是利用PCR方法合成第二链cDNA时在cDNA的末端灵活添加任何所需序列，便于实现不同的下游实验目的，如用于RNA二代测序的文库构建等。
本发明方法操作简便、灵活、成本低廉，对转录组学、RNA测序领域研究具有重大而深远的意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明的原理示意图。
图2示出利用本发明构建RNA二代测序文库示意图。
图3示出实施例1中不同处理后RNA的qPCR验证结果。
图4示出实施例2中不同处理后RNA的qPCR验证结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例中所用的材料及来源：
Figure BDA0001281894120000091
RNA Kit、
Figure BDA0001281894120000092
First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、
Figure BDA0001281894120000093
Tip Green qPCRSuperMix、
Figure BDA0001281894120000094
DNA Polymerase，北京全式金生物技术有限公司。
RNase H、T4RNA Ligase I，NEB公司。
dsDNase，Thermo Fisher Scientific公司。
引物合成，Life technologies公司。
实施例1验证本发明可有效去除总RNA中的18SrRNA并保留所需的mRNA
1.制备人总RNA
以HeLa细胞为材料，用
Figure BDA0001281894120000101
RNA Kit提取人总RNA。
2.合成引物、探针
根据人18S rRNA、GAPDH基因序列，设计如下引物、探针：
18S rRNA F：
5’-GGCCCTGTAATTGGAATGAGTC-3’(见序列表SEQ ID No.1)
18S rRNA R：
5’-CCAAGATCCAACTACGAGCTT-3’(见序列表SEQ ID No.2)
GAPDH F：
5’-TCCTGCACCACCAACTGCTTA-3’(见序列表SEQ ID No.3)
GAPDH R：
5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3’(见序列表SEQ ID No.4)
以上4条引物均用ddH2O溶解至10μM。
18S rRNA Probe 1：
5’-TAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTAC-3’(见序列表SEQID No.5)
18S rRNA Probe 2：
5’-TTCCTCTAGATAGTCAAGTTCGACCGTCTTCTCAGCGCTCCGCCAGGGCC-3’(见序列表SEQID No.6)
18S rRNA Probe 3：
5’-GTGGGCCGACCCCGGCGGGGCCGATCCGAGGGCCTCACTAAACCATCCAA-3’(见序列表SEQID No.7)
18S rRNA Probe 4：
5’-TCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACTTAATCAACG-3’(见序列表SEQID No.8)
18S rRNA Probe 5：
5’-CAAGCTTATGACCCGCACTTACTCGGGAATTCCCTCGTTCATGGGGAATA-3’(见序列表SEQID No.9)
18S rRNA Probe 6：
5’-ATTGCAATCCCCGATCCCCATCACGAATGGGGTTCAACGGGTTACCCGCG-3’(见序列表SEQID No.10)
以上6条探针均用ddH2O溶解至1μg/μl，然后配制探针组合1/2/3：
探针组合1：即18S rRNA Probe 1
探针组合2：将18S rRNA Probe 2、18S rRNA Probe 3等比例混合
探针组合3：将18S rRNA Probe 4、18S rRNA Probe 5、18S rRNA Probe 6等比例混合。
Adapter 1-Random Primer：
5’-GTCTCGTGGGCTCGGNNNNNN-3’(见序列表SEQ ID No.11)
这条引物用ddH2O溶解至0.1μg/μl。
3.合成第一链cDNA
用Adapter 1-Random Primer，使用
Figure BDA0001281894120000111
First-Strand cDNASynthesis SuperMix反转录步骤1中提取的总RNA。反应体系如下：
Figure BDA0001281894120000112
反应条件为：25℃孵育10分钟，42℃孵育30分钟，85℃加热5秒钟失活
Figure BDA0001281894120000113
RT/RI。
4.消化RNA模板
用RNase H消化与第一链cDNA结合的RNA模板。反应体系如下：
Figure BDA0001281894120000114
反应条件为：37℃孵育30分钟，65℃孵育20分钟失活E.coli RNase H。
5.探针杂交
配制3个探针杂交体系与一个对照反应体系(用dd H2O代替探针)：
Figure BDA0001281894120000115
Figure BDA0001281894120000121
反应条件为：
95℃ 变性 2分钟
95℃→22℃ 杂交 0.1℃/秒，约12分钟
22℃ 孵育 5分钟。
6.双链特异性核酸酶消化
对上一步骤中的4个杂交反应体系均用dsDNase消化，反应体系如下：
杂交反应体系 8μl
10×dsDNase Buffer 1μl
dsDNase 1μl
反应条件为：
37℃孵育2分钟，然后向体系中加入0.1μl的1M DTT，55℃孵育5分钟以失活dsDNase。
7.qPCR检测18S rRNA去除效率
以上一步骤中的4个消化反应体系为模板，并以步骤4得到的等量第一链cDNA为对照模板，用18S rRNA F/R、GAPDH F/R两对引物扩增，设置qPCR反应体系如下：
Figure BDA0001281894120000122
qPCR反应条件为：
Figure BDA0001281894120000123
溶解曲线阶段
qPCR全Ct值数据详见下方表1，步骤5～6中不同方法处理的模板与未处理模板Ct值之差如图3所示。从表1与图3中可以看出：
用3种探针组合杂交并用dsDNase消化后的cDNA扩增18S rRNA基因时，相对未做任何处理的cDNA模板，其Ct值均滞后10个循环以上，即超过99.9％的18S rRNA未被扩增；而扩增GAPDH基因时，相对未做处理的cDNA模板，Ct值变化均极微小。同时，用水代替探针与cDNA模板杂交并消化后，无论是18S rRNA还是GAPDH基因，其Ct值相对未做处理的cDNA模板而言变化均极微小。因此，证明了本发明有效地对总RNA中非目标18S rRNA进行了成功去除。
另外，3种不同的探针组合去除效果相当，结果均十分理想，说明设计杂交探针时，探针的序列、长度与数量十分灵活，只要能够与非目标第一链cDNA结合使之随后发生酶解断裂，即可成功实现去除目的。
表1实施例1中qPCR全Ct值
Figure BDA0001281894120000131
实施例2验证杂交后形成的完全匹配双链DNA区域的有效长度对DSN降解效率的影响。
1.制备人总RNA
以HeLa细胞为材料，用
Figure BDA0001281894120000132
RNA Kit提取人总RNA。
2.合成引物、探针
设计如下引物、探针：
18S rRNA Probe 7：
5’-GGTTCACC-3’(见序列表SEQ ID No.12)
18S rRNA Probe 8：
5’-GGTTCGTCTACG-3’(见序列表SEQ ID No.13)
18S rRNA Probe 9：
5’-GGTTCACCTACG-3’(见序列表SEQ ID No.14)
以上3条探针均用ddH2O溶解至1μg/μl。这3条探针的区别与联系如下：
探针7：长度8nt，与18S rRNA完全互补。
探针8：长度12nt，与18S rRNA不完全互补，有两个碱基的错配。
探针9：长度12nt，与18S rRNA完全互补。
3.合成第一链cDNA
同实施例1中步骤3。
4.消化RNA模板
同实施例1中步骤4。
5.探针杂交
配制3个探针杂交体系与一个对照反应体系(用dd H2O代替探针)：
Figure BDA0001281894120000141
反应条件为：
95℃ 变性 2分钟
95℃→22℃ 杂交 0.1℃/秒，约12分钟
22℃ 孵育 5分钟。
6.探针延伸
将步骤5中获得的4个杂交反应体系均一分为二，一半直接用于后续步骤7的消化反应，另一半按照如下反应体系进行探针延伸：
杂交反应体系 5μl
Figure BDA0001281894120000142
DNA Polymerase 0.1μl
反应条件为：
72℃孵育1分钟。
7.双链特异性核酸酶消化
对步骤5中获得的4个杂交反应体系与步骤6中获得的4个对应的延伸反应体系均用dsDNase消化，反应体系如下：
Figure BDA0001281894120000143
反应条件为：
37℃孵育2分钟，然后向体系中加入0.1μl的1M DTT，55℃孵育5分钟以失活dsDNase。
8.qPCR检测18S rRNA去除效率
以上一步骤中的8个消化反应体系为模板，并以步骤4得到的等量第一链cDNA为对照模板，用18S rRNA F/R、GAPDH F/R两对引物扩增，设置qPCR反应体系如下：
Figure BDA0001281894120000151
qPCR反应条件为：
Figure BDA0001281894120000152
溶解曲线阶段
qPCR全Ct值数据详见下方表2、表3，步骤5～7中不同方法处理的模板与未处理模板Ct值之差如图4所示。从表2、表3与图4中我们可以看出：
杂交产物直接用dsDNase消化时，对于18S rRNA基因的扩增，探针7、探针8杂交产物相对未做任何处理的cDNA模板，其Ct值变化不大，仅与阴性对照相当或稍滞后；而探针9杂交产物的Ct值有明显滞后，即绝大部分18S rRNA未被扩增。而对于GAPDH基因的扩增，无论不同的探针杂交还是阴性对照，Ct值相对未做处理的cDNA模板而言均无明显变化。
如对杂交产物先进行延伸再消化，则对于18S rRNA基因的扩增，3种探针的杂交，延伸产物相对未做任何处理的cDNA模板，其Ct值均滞后10个循环以上，即超过99.9％的18SrRNA未被扩增。而对于GAPDH基因的扩增，相对未做处理的cDNA模板，Ct值变化均极微小。
因此，以上结论证明了，双链特异性核酸酶的有效消化，需要足够长度的完全互补的双链DNA区域。本实施例中的探针7，其长度太短；探针8，虽然比探针7长，但与cDNA序列不完全互补，因此杂交后直接消化的效果均不理想。唯有探针9，拥有足够长度且与cDNA完全互补，因此其杂交产物可直接被dsDNase有效降解。
然而，以上3条探针经过一步合成延伸后，均产生了足够长度的完全互补的双链DNA，因此延伸后的杂交产物，均被dsDNase有效降解。因此，本实施例证明了发明可使用较短的或与待去除RNA的序列部分匹配的探针进行杂交，再辅以延伸步骤后，同样可用DSN实现对非目标RNA的成功去除。该结论进一步证实并增强了杂交探针设计时的灵活性，使得本发明更为实用，应用范围更加宽广。
表2实施例2中探针杂交后直接消化的模板qPCR全Ct值
Figure BDA0001281894120000161
表3实施例2中探针杂交后先延伸再消化的模板qPCR全Ct值
Figure BDA0001281894120000162
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京全式金生物技术有限公司
<120> 一种去除RNA样本中非目标RNA的方法
<130> JLC17I0176E
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成18S rRNA F
<400> 1
ggccctgtaa ttggaatgag tc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成18S rRNA R
<400> 2
ccaagatcca actacgagct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成 GAPDH F
<400> 3
tcctgcacca ccaactgctt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成GAPDH R
<400> 4
aggggccatc cacagtcttc t 21
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成 18S rRNA Probe 1
<400> 5
taatgatcct tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgacttttac 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成18S rRNA Probe 2
<400> 6
ttcctctaga tagtcaagtt cgaccgtctt ctcagcgctc cgccagggcc 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成18S rRNA Probe 3
<400> 7
gtgggccgac cccggcgggg ccgatccgag ggcctcacta aaccatccaa 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成18S rRNA Probe 4
<400> 8
tcggtagtag cgacgggcgg tgtgtacaaa gggcagggac ttaatcaacg 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成 18S rRNA Probe 5
<400> 9
caagcttatg acccgcactt actcgggaat tccctcgttc atggggaata 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成 18S rRNA Probe 6
<400> 10
attgcaatcc ccgatcccca tcacgaatgg ggttcaacgg gttacccgcg 50
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成 Adapter 1-Random Primer
<400> 11
gtctcgtggg ctcggnnnnn n 21
<210> 12
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工合成 18S rRNA Probe 7
<400> 12
ggttcacc 8
<210> 13
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工合成 18S rRNA Probe 8
<400> 13
ggttcgtcta cg 12
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工合成 18S rRNA Probe 9
<400> 14
ggttcaccta cg 12

Claims (5)

1.一种去除RNA样本中非目标RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）反转录引物对RNA样本进行反转录，去除RNA模板，得到非目标第一链cDNA和目标第一链cDNA；（2）非目标第一链cDNA与特异性探针杂交，得到非目标第一链cDNA-探针复合物；将所述非目标第一链cDNA-探针复合物进一步延伸，获得能完全被双链特异性核酸酶消化的非目标第一链cDNA-探针复合物；（3）双链特异性核酸酶消化非目标第一链cDNA-探针复合物，得到目标第一链cDNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反转录引物为5’端带有或不带有接头序列的随机引物。
3.一种去除RNA样本中非目标RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）5’端带有第一接头的随机引物对RNA样本进行反转录，去除RNA模板，在第一链cDNA的 3’端加第二接头，得到两端带有接头序列的非目标和目标第一链cDNA；（2）非目标第一链cDNA与特异性探针杂交，得到两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物；将所述两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物进一步延伸，获得能完全被双链特异性核酸酶消化的两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物；（3）双链特异性核酸酶消化非目标第一链cDNA-探针复合物，得到两端带有接头序列的目标第一链cDNA。
4.一种去除RNA样本中非目标RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）5’端带有第一接头的随机引物对RNA样本进行反转录，在第一链cDNA的 3’端加第二接头，去除RNA模板，得到两端带有接头序列的非目标和目标第一链cDNA；（2）非目标第一链cDNA与特异性探针杂交，得到两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物；将所述两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物进一步延伸，获得能完全被双链特异性核酸酶消化的两端带有接头序列的非目标第一链cDNA-探针复合物；（3）双链特异性核酸酶消化非目标第一链cDNA-探针复合物，得到两端带有接头的目标第一链cDNA。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述特异性探针是根据非目标RNA序列设计的特异性探针，与非目标第一链cDNA 序列100%互补或部分互补。
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