CN105506747A - 富集原始转录本信息的rna文库的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用RNase？H有选择性地去除大量rRNA以及血液球蛋白以获得高质量的富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法及其应用。用本发明方法构建的RNA文库不仅具有极低rRNA残余量(仅为常规oligo(dT)方法残留量约1/500)，而且具有极高的基因覆盖率。

Description

富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法及其应用。

背景技术

随着高通量测序技术的应用和发展，RNA测序技术也日趋成熟。通常，我们在构建RNA文库，尤其是RNA-seq文库、转录组文库、链特异性转录谱文库时候，需要对TotalRNA进行mRNA纯化处理。由于人体细胞中含量最多的RNA是rRNA,约占RNA总量的82％，而mRNA占的比例仅为4％；目前采用oligod(T)方法捕获mRNA，依赖oligo(dT)分离出poly(A)+RNA,以达到筛选掉大量rRNA以获得纯化的mRNA的目的。但是使用这种方法，获得的mRNA中不包含许多其它可用于转录分析的poly(A)-转录本。而且，原始转录本信息的损耗，对于微量RNA投入量，经常需要额外增加扩增反应循环数，即使如此，也导致某些原始转录本信息缺失及次优的测序信息结果。另外针对血液样本，还能去除球蛋白RNA，从而使得能得到更好的高纯化且富集原始转录本信息的RNA。

为了有效地解决这些问题，本领域迫切需要开发一种既能提供高质量纯化的totalmRNA同时其中富集非编码mRNA的技术。因此本发明提供了一种利用RNaseH以替代传统使用oligod(T)方法捕获mRNA的方法有选择性地去除大量rRNA以及血液球蛋白RNA的方法，以获得高纯化且富集原始转录本信息的RNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种高效制备高质量的、富集原始转录本信息并适用于多种测序平台的RNA文库的方法以及用该方法制备的高质量的RNA文库。

在本发明的第一方面，提供了一种富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法，包括步骤：

(i)提供分离的总RNA样本；

(ii)用针对目标RNA的反义DNA探针对所述的总RNA样本进行退火处理，从而获得含RNA:DNA退火产物的混合物；

其中，所述的目标RNA选自下组：核糖体RNA、线粒体mtrRNA、球蛋白RNA；

(iii)对上一步骤中的所述的混合物，用专一性降解RNA:DNA退火产物的核酸酶进行消化，从而获得经消化的混合物；

(iv)将上一步骤获得的所述经消化的混合物作为RNA文库构建材料，构建获得RNA文库。

在另一优选例中，所述步骤(iv)包括：将经核酸酶处理后用纯化方法去除核糖体RNA和线粒体RNA片段和剩余的DNA探针，获得富集原始转录本信息的RNA，继而通过切胶回收的方法，纯化和PCR扩增以提供足够的产物进行下一步的反应；得到富集原始转录本信息的RNA文库。

在另一优选例中，所述经消化的混合物中，与DNA探针形成复合物的目标RNA被降解。

在另一优选例中，在消化过程中，所释放的DNA探针(其中至少一部分)可再次结合于待清除的目标RNA，形成RNA:DNA退火产物(即RNA-DNA复合物)，进而导致待清除的目标RNA被核酸酶消化降解。

在另一优选例中，所述的rRNA为真核细胞中的5S,5.8S,28S、18S和/或其组合；

在另一优选例中，所述的rRNA为线粒体mtrRNA；

在另一优选例中，所述的mtrRNA为哺乳动物线粒体mtrRNA的12S、16S和/或其组合；

在另一优选例中，所述的血液球蛋白RNA为Alpha1.3RNA，Alpha2.3RNA和Beta.3RNA。

在另一优选例中，所述的核酸酶为RNaseH。

在另一优选例中，所述的反义DNA探针是长度为45-60bp，较佳地45-55bp的寡核苷酸单链片段。

在另一优选例中，所述的反义DNA探针包括了针对以下目标RNA的探针：核糖体rRNA、线粒体mtrRNA和球蛋白RNA。

在另一优选例中，所述的反义DNA探针包括了选自下组的探针：

(a)SEQIDNO.:1-198所示的198种寡核苷酸；

(b)SEQIDNO.:1-195所示的195种寡核苷酸。

在另一优选例中，所述的总RNA样本选自下组：来自血液的RNA样本、来自组织的RNA样本、来自细胞的RNA样本。

在另一优选例中，步骤(i)-(iv)包括以下步骤：

(a)提供分离的总RNA样本；

(b)用针对目标RNA的反义DNA探针对所述的总RNA样本进行退火处理，从而获得RNA:DNA退火产物；

(c)对上一步骤(b)中获得的所述RNA:DNA退火产物进行RNaseH处理，去除反义DNA探针对应的目标RNA序列部分；从而获得经消化的混合物；

(d)将上述步骤(c)中获得的所述含有单链DNA探针的混合物用RNAcleanXP磁珠进行纯化，从而获得纯化的RNA；

(e)把从上一步骤(d)中获得的所述纯化的RNA打碎，从而获得RNA片段混合物；

(f)在上一步骤(e)中获得的所述RNA片段混合物中加入引物，进行反转录第一链的合成反应，从而获得合成的一链cDNA产物；

(g)对上一步骤(f)中获得的所述一链cDNA产物进行反转录PCR扩增，从而获得双链DNA扩增产物混合物；

(h)对上一步骤(g)中得到的所述双链DNA扩增产物混合物，用AmpureXP磁珠进行纯化，从而获得纯化的双链DNA扩增产物；

(i)对上一步骤(h)中获得的纯化的双链DNA扩增产物进行末端修复反应，从而获得末端修复的双链DNA产物混合物；

(j)在上一步骤(i)中获得的所述末端修复的双链DNA产物混合物再用Ampure磁珠纯化，从而获得纯化的末端修复的双链DNA产物；

(k)对上一步骤(j)中获得的所述末端修复的双链DNA产物，加接头和连接酶,从而获得带有接头的双链DNA产物混合物；

(l)对上一步骤(k)中的所述带有接头的双链DNA产物混合物再次用Ampure磁珠进行纯化，从而获得纯化的带有接头的双链DNA产物；

(m)对上一步骤(l)中的所述纯化的带有接头的双链DNA产物作凝胶电泳，分离片段为230-250bp范围的含有cDNA产物并作回收，获得该范围的回收cDNA片段；

(n)对上一步骤(m)中的所述回收DNA片段加入引物对进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；

(o)对上一步骤(n)中所述的PCR扩增产物，再用Ampure磁珠纯化，从而获得纯化的PCR扩增产物；

(p)对上一步骤(o)中所述的纯化的PCR扩增产物用来制备文库，从而获得制备的RNA文库；

(q)对上一步骤(p)中获得的所述制备的RNA文库用高敏芯片Agilent2100进行质量检测；

(r)对上一步骤(q)中获得的所述制备的RNA文库进行浓度标准化处理，从而获得预定浓度的RNA测序文库；

(s)对步骤(r)中所述的预定浓度的RNA文库上机，用IonProton平台进行测序。

在另一优选例中，所述的末端修复反应使用Klenow片段(Klenowfragement)。

在另一优选例中，所述的分离片段为210-230bp范围的含有cDNA产物。

在另一优选例中，所述的分离片段为250-270bp范围的含有cDNA产物。

本发明的第二方面提供了一种用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库,其特征在于，所述的富集原始转录本信息的RNA文库是用本发明的第一方面提供的构建方法制备的。

在另一优选例中，所述的文库具有选自下组的一个或多个特征：

(1)包含polyA(+)和polyA(-)的RNA；

(2)去除大量的核糖体rRNA，mtrRNA(即核糖体rRNA和mtrRNA的总残留量≤1％，较佳地≤0.1％，更佳地≤0.05％，按RNA文库中的总RNA数量计)；

(3)去除了血液球蛋白RNA(即针对血液样品还能去除血液球蛋白RNA)。

在另一优选例中，所述的用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库用于IonProton测序平台。

在另一优选例中，所述的用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库用于Illumina测序平台。

在另一优选例中，所述的用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库用于CompleteGenomics测序平台。

在另一优选例中，所述的用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库包括生物体的总RNA测序。

在另一优选例中，所述的动物包括小鼠。

在另一优选例中，所述的总RNA测序包括生物体细胞的总RNA测序

在另一优选例中，所述的总RNA测序包括人细胞的总RNA测序。

在另一优选例中，所述的细胞至少包括体细胞、生殖细胞、胚胎细胞、干细胞、肿瘤细胞。

在另一优选例中，针对植物和细菌的样品，可以采用类似的方法设计相关的引物序列用于去除植物和细菌中的核糖体RNA。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了提取富集原始转录本信息的RNA的方法流程图。

图2显示了未经任何方法处理的总RNA样品(universalhumanreferenceRNA)用Aligent2100质检的结果。

图3显示了用RNaseH方法处理总RNA后用Aligent2100质检的结果。

图4显示了用oligo(dT)方法处理总RNA后用Aligent2100质检的结果。

图5显示了用RNaseH方法(A)和oligo(dT)方法(B)分别处理过的总RNA中用IonProton平台测序随机性分析序列片段数目的对比结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种高效制备高质量的富集原始转录本信息的RNA文库构建的新技术。本发明所设计的实验方案包括：最佳反应试剂比例的摸索、最佳反应条件的摸索、与其他技术所得结果的比较、验证该发明的稳定性和可重复性。

实验结果证明，用本发明所述建库方法所构建的RNA测序文库，其文库质量非常高，使之能用于IonProton，Illumina和CompleteGenomics多个测序平台，所得到的数据准确度高、可信度佳，对信息分析没有影响。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过设计使用大量短片段(50nt)反义DNA探针通过与目的RNA全长序列互补从而进行筛除。这些探针通过RNA：DNA杂交形式覆盖目标RNA样本的全长序列，也适用已片段化的样品。然后经RNaseH处理后用纯化方法有效去除目标RNA片段和剩余的DNA探针，获得富集原始转录本信息的RNA，继而通过切胶回收的方法，纯化和PCR扩增以提供足够的产物进行下一步的反应；开发了高质量的富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法，使之能用于多种测序的平台。

IonProton测序平台

IonTorrent技术是基于半导体芯片的二代测序技术，其核心技术是使用IS-FET半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入ACGT。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H⁺的检测，实时判读碱基。

IonTorrent技术流程包括4个主要的步骤：文库制备、模板制备、测序及数据分析。IonTorrent由于硬件设备无需光学检测和扫描系统，并且使用天然核苷酸和聚合酶、无需焦磷酸酶化学级联，无需标记荧光染料和化学发光的配套试剂，因此测序成本低，其应用范围涵盖Sanger方法和已有高通量测序技术的应用，如基因组DNA序列测定(微生物基因组测序、线粒体测序、靶向测序)、DNA扩增子测序等。

构建文库的方法

本发明人通过用大约200个短片段(50nt)反义oligoDNA探针分别与18SrRNA、28SrRNA、12SmtrRNA、16SmtrRNA和5.8SRNA杂交。另外针对全血样品，本发明人还设计3种DNAoligo与血液中的球蛋白RNA杂交。将这些DNAoligo寡核苷酸按等量的分子比例混合在一起。为了去除大量rRNA,加入混合的DNAoligo到总RNA中，孵育杂交后，加入RNaseH酶到RNA和DNAoligo混合反应液中，去除杂交上的rRNA,获得富集富集原始转录本信息的RNA。继而通过切胶回收的方法，纯化和PCR扩增以提供足够的产物进行下一步的反应；开发了高质量的富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法，然后用IonProton测序平台对富集原始转录本信息的RNA进行测序，获得高质量极低rRNA，mtrRNA和血液球蛋白RNA污染的RNA文库。

为了验证此发明的可行性及效果，本发明人对人RNA标准品universalhumanreferenceRNA进行此方法处理，通过检测RNA2100结果，比较未处理前和处理后的效果；然后再将此标准品采用oligo(dT)和RNaseH方法，构建RNA-seq文库上机，从数据结果比较两者的差异性，验证RNaseH方法的优势。

本发明的主要优点在于：

(1)首次开发了高质量的富集原始转录本信息的RNA用以高效建立高质量RNA文库。该文库不仅具有极低rRNA残余量(仅为常规oligo(dT)方法残留量约1/500)，而且具有极高的基因覆盖率。

(2)本发明的RNA文库可用于IonProton，Illumina和CompleteGenomics多种测序平台。

(3)本发明提供的方法具有测序通量高，覆盖率高，准确度高和操作简便。

(4)本发明提供的方法不但具有耗材耗时少且稳定性，可重复性和可靠性高的特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和方法

本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，人细胞的RNA标准品(UniversalHumanReferenceRNA)购自AgilentTechnologies,接头和引物购自lifetechnologies公司。

实施例1RNA文库的构建

具体实验步骤(见图1中所示流程步骤)：

1.RNaseH纯化总RNA

1.1取1ug或3ug总RNA与oligoDNA退火

1.2在PCR仪上95℃反应2min；梯度降温，每隔1s降0.1℃至22℃；22℃反应5min，迅速置于冰上。

1.3RNaseH酶消化

在37℃反应30min

1.4DNaseI酶消化

1.5反应结束后用RNAcleanXP磁珠纯化，溶于10ul无核酸酶水。

2.RNA片段化

向上一步中的洗脱液中加入3μL5×第一链缓冲液，94℃，10min，立即置于冰上。

3.反转录第一链的合成

3.1向上一步得到的RNA中加入0.5μLN6primer(0.1μg/μL)。

3.2在65℃反应5min，立即置于冰上。

3.3在0.2mLPCR管中按照下列的配比准备反应混合物：

3.4混匀后在PCR仪上按照以下程序进行反应：

4.反转录第二链的合成

4.1将合成的一链cDNA置于冰上共16μL

4.2加入以下试剂：

4.3混合均匀后，置于16℃Thermomixer上2h(350rpm间歇振动15s，静止2min)。

4.4反应结束后，用AmpureXP磁珠纯化，溶于42ulEB溶液。

5.末端修复

按照下列的配比准备反应混合物：

在thermomixer20℃条件下反应30min，然后用90ulAmpureXP磁珠(1.8x)对修复产物进行纯化，最后将样品溶于23ulEB溶液。

6.Adapter连接

接头在使用前稀释到12.854pmol/ul。

按照下列的配比准备反应混合物

在thermomixer20℃条件下反应20min，然后用90ulAmpureXP磁珠(1.8x)对连接产物进行纯化，最后将样品溶于32ulEB溶液。

7.片段选择

7.1回收胶浓度2％，6孔梳子，电压100V，电泳时间120min，使用NEB50bpLadder。

文库切胶范围210-230bp，230-250bp，250-270bp。回收胶块230-250bp，备份胶块210-230bp和250-270bp。

小柱子回收，最后将样品溶于18ulEB溶液。

8.PCR反应

配制引物混合物：取等体积的10uMprotonT-PCR-A和10uMprotonP1amp混匀

PCR体系和反应条件：

扩增体系：

反应程序：

反应结束后，用AmpureXP磁珠纯化，最后溶于17ulEB溶液。

9.文库检测

文库制备完成后，用Agilent2100检测RNA质量。

10.文库上机测序。测序使用IonProton测序平台。

对步骤1-9中制备的RNA文库，采用IonProton测序平台进行测序。

对测序所产生的数据，用IonProton测序平台自带的程序进行信息分析，主要以下步骤：

(1)过滤测序序列；

过滤不合格序列包括：测序质量低于某一阀值的碱基个数超过整条序列碱基个数的50％则认为是不合格序列。低质量阀值由具体测序技术及测序环境而定；序列中测序结果不确定的碱基(如cPAL测序平台测序结果中的N)个数超过整条序列碱基个数的10％则认为是不合格序列；除样本接头序列外，与其它实验引入的外源序列比对，如各种接头序列。若序列中存在外源序列则认为是不合格序列。原始的序列数据经过去除不合格序列处理后得到的序列数据称为干净的序列片段(cleanreads)，作为后续分析的基础。

(2)干净的序列片段与参考序列比对；

将高通量测序技术得到的干净的序列片段分别比对到参考基因组和参考基因序列上。参考基因组序列和参考基因序列可取于公共数据库。

结果

未经处理的总RNA标准品universalhumanreferenceRNA(UHRR)用Agilent2100来检测RNA质量及rRNA含量。结果如图2所示未经处理的总RNA标准品虽然RNAIntegrityNumber(RIN)值为9.4(通常RIN值达到8以上认为RNA质量好，降解量低)，反映了被检测的RNA质量很高，然而含有大量的rRNA，尤其是18SRNA和28SRNA(见图2中分别对应于18SRNA和28SRNA的2000nt和4000nt峰值很高)，rRNA比对值[28S/18S]为1.7。用Agilent2100来检测比较用RNaseH方法和oligoDNA方法处理后总RNA标准品的质量。如图3和图4所示,虽然采用RNaseH和oligo(dT)的方法均能去除rRNA，而且被检测的RNA质量好，RNaseH处理后RIN为2.7(见图3)，oligo(dT)处理后RIN为2.9(见图4)。但是从图4上的结果来看oligo(dT)在2000～4000nt仍有突出峰(此区域是18SRNA和28SRNA区域)，可见用RNaseH方法筛除rRNA的效果比oligo(dT)方法明显要好。

比较用RNaseH方法和oligo(dT)方法处理后的总RNA标准品构建RNA文库的质量，通过IonProton测序平台进行数据分析。用RNaseH方法和OligodT方法处理后rRNA比对结果如表1A和表1B所示,RNaseH方法去除rRNA的效果明显优于oligo(dT)，RNaseH方法处理后rRNA只占0.03％(见图表1A)，而oligo(dT)方法rRNA残余有14.31％(表1B)。

表1A(RNaseH方法)

比对基因	序列数目	百分比
			总共序列数目	8302538	100.00％
总共比对上的序列数	2141	0.03％
			总共未比对上的序列数	8300397	99.97％

表1B(OligodT方法)

比对基因	序列数目	百分比
			总共序列数目	8614807	100.00％
总共比对上序列数	1232544	14.31％
			总共未比对上序列数	7382263	85.69％

如上实验的参考基因来自Rfam数据库(人核糖体数据库)

如表2A和表2B所示,用RNaseH方法与用oligo(dT)方法处理后构建RNA文库mRNA比对统计结果显示RNaseH方法比对到基因组的数据量与目前传统的方面一致。

表2A

方法	总共序列数	总共比对序列数	唯一匹配序列数
				RNaseH	8302538(100％)	6003923(72.31％)	3400391(40.96％)
Oligo dT	8614807(100％)	6060932(70.35％)	2712725(31.49％)

表2B

方法	总共序列数	总共比对序列数	唯一匹配序列数
				RNaseH	8302538(100％)	8253099(99.40％)	7744826(93.28％)
Oligo dT	8614807(100％)	8564915(99.42％)	7247702(84.13％)

如上所述的数据库来自人类基因组数据库h19。

从转录本的测序随机性分析来看，用RNaseH方法构建的RNA文库的基因覆盖率大且均一，没有3'端偏向性(见图5A)，而相比之下，用oligo(dT)方法构建的RNA文库的基因覆盖率相对小而且不均一，此外还存在3'端偏向性问题(见图5B)。

结合表1，表2和图5的结果，用RNaseH方法比用oligo(dT)方法处理后的总RNA标准品构建RNA文库，不但具有高质量和极低rRNA残余量(仅约0.03％，仅为常规oligo(dT)方法残留量14.31％的约1/477)，而且具有极高的基因覆盖率，因而富集了原始转录本信息的RNA。

在探针序列表中：

SEQIDNO.:1-38针对18SrRNA；

SEQIDNO.:39-139针对28SrRNA；

SEQIDNO.:140-142针对5.8SrRNA；

SEQIDNO.:143-173针对16SrRNA(mtrRNA)；

SEQIDNO.:174-192针对12SrRNA(mtrRNA)；

SEQIDNO.:193-195针对5SrRNA。

SEQIDNO.:196针对血球蛋白RNA(HBA1.3)；

SEQIDNO.:197针对血球蛋白RNA(HBA2.3)；

SEQIDNO.:198针对血球蛋白RNA(HBB.3)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种富集原始转录本信息的RNA文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：

(i)提供分离的总RNA样本；

(ii)用针对目标RNA的反义DNA探针对所述的总RNA样本进行退火处理，从而获得含RNA:DNA退火产物的混合物；

其中，所述的目标RNA选自下组：核糖体RNA、线粒体mtrRNA、球蛋白RNA；

(iii)对上一步骤中的所述的混合物，用专一性降解RNA:DNA退火产物的核酸酶进行消化，从而获得经消化的混合物；

(iv)将上一步骤获得的所述经消化的混合物作为RNA文库构建材料，构建获得RNA文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸酶为RNaseH。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反义DNA探针是长度为45-60bp，较佳地45-55bp的寡核苷酸单链片段。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反义DNA探针包括了针对以下目标RNA的探针：核糖体rRNA、线粒体mtrRNA和球蛋白RNA。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反义DNA探针包括了选自下组的探针：

(a)SEQIDNO.:1-198所示的198种寡核苷酸；

(b)SEQIDNO.:1-195所示的195种寡核苷酸。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的总RNA样本选自下组：来自血液的RNA样本、来自组织的RNA样本、来自细胞的RNA样本。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)-(iv)包括以下步骤：

(a)提供分离的总RNA样本；

(b)用针对目标RNA的反义DNA探针对所述的总RNA样本进行退火处理，从而获得RNA:DNA退火产物；

(c)对上一步骤(b)中获得的所述RNA:DNA退火产物进行RNaseH处理，去除反义DNA探针对应的目标RNA序列部分；从而获得经消化的混合物；

(d)将上述步骤(c)中获得的所述含有单链DNA探针的混合物用RNAcleanXP磁珠进行纯化，从而获得纯化的RNA；

(e)把从上一步骤(d)中获得的所述纯化的RNA打碎，从而获得RNA片段混合物；

(f)在上一步骤(e)中获得的所述RNA片段混合物中加入引物，进行反转录第一链的合成反应，从而获得合成的一链cDNA产物；

(g)对上一步骤(f)中获得的所述一链cDNA产物进行反转录PCR扩增，从而获得双链DNA扩增产物混合物；

(h)对上一步骤(g)中得到的所述双链DNA扩增产物混合物，用AmpureXP磁珠进行纯化，从而获得纯化的双链DNA扩增产物；

(i)对上一步骤(h)中获得的纯化的双链DNA扩增产物进行末端修复反应，从而获得末端修复的双链DNA产物混合物；

(j)在上一步骤(i)中获得的所述末端修复的双链DNA产物混合物再用Ampure磁珠纯化，从而获得纯化的末端修复的双链DNA产物；

(k)对上一步骤(j)中获得的所述末端修复的双链DNA产物，加接头和连接酶,从而获得带有接头的双链DNA产物混合物；

(l)对上一步骤(k)中的所述带有接头的双链DNA产物混合物再次用Ampure磁珠进行纯化，从而获得纯化的带有接头的双链DNA产物；

(m)对上一步骤(l)中的所述纯化的带有接头的双链DNA产物作凝胶电泳，分离片段为230-250bp范围的含有cDNA产物并作回收，获得该范围的回收cDNA片段；

(n)对上一步骤(m)中的所述回收DNA片段加入引物对进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；

(o)对上一步骤(n)中所述的PCR扩增产物，再用Ampure磁珠纯化，从而获得纯化的PCR扩增产物；

(p)对上一步骤(o)中所述的纯化的PCR扩增产物用来制备文库，从而获得制备的RNA文库；

(q)对上一步骤(p)中获得的所述制备的RNA文库用高敏芯片Agilent2100进行质量检测；

(r)对上一步骤(q)中获得的所述制备的RNA文库进行浓度标准化处理，从而获得预定浓度的RNA测序文库；

(s)对步骤(r)中所述的预定浓度的RNA文库上机，用IonProton平台进行测序。

8.一种用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库,其特征在于，所述的富集原始转录本信息的RNA文库是用如权利要求1所述的构建方法制备的。

9.如权利要求8所述的RNA文库，其特征在于，所述的文库具有选自下组的一个或多个特征：

(1)包含polyA(+)和polyA(-)的RNA；

(2)去除大量的核糖体rRNA，mtrRNA；

(3)去除了血液球蛋白RNA。

10.如权利要求8所述的RNA文库，其特征在于，所述的用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库用于IonProton测序平台；或

所述的用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库用于Illumina测序平台；或

所述的用于测序的富集原始转录本信息的RNA文库用于CompleteGenomics测序平台。