CN110878298A - rRNA捕获探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种rRNA捕获探针及其应用方法。其中，所述rRNA捕获探针选自如下三组探针序列中的一种或者多种：5SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；16SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.3至SEQ ID No.24；23SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.25至SEQ ID No.76。以该捕获探针为基础，可以有效去除转录产物中90％以上的核糖体RNA序列，克服了原核生物mRNA不含polyA尾巴，无法通过oligo dT富集分离的技术难题，极大的节省了测序数据量和成本。

Description

rRNA捕获探针及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种rRNA捕获探针及其应用。

背景技术

核糖体RNA(rRNA)是细胞内含量最高的一类RNA，占胞内所有RNA 总量的80％以上。其与蛋白质结合形成核糖体，在mRNA的序列引导下转运特定的氨基酸合成蛋白质肽链。

在原核生物中，核糖体RNA主要分为5S rRNA(约120nt)、16S rRNA (约1540nt)和23S rRNA(约2900nt)三大类，真核生物主要分为5S rRNA (约120nt)、5.8S rRNA(约160nt)、18S rRNA(约1900nt)和28S(约4700nt) rRNA。

由于核糖体RNA的占比含量极高，在总RNA测序研究其它功能性RNA 的表达丰度、修饰状态等，核糖体RNA将侵占大量的可用数据，如何在检测前针对不同物种有效的去除核糖体RNA，或精准分离目标类型RNA进行相应检测，已成为“转录组学”研究和“表观转录组学”研究样本前期制备的核心技术问题。

在实现本发明过程中，发明人发现相关技术存在以下问题：在真核生物中通常会利用oligo dT磁珠钓取含有poly A尾巴的总mRNA，然后通过文库构建进行高通量测序分析细胞或组织mRNA的表达情况。

但原核生物的mRNA含量极低，约占总RNA的2％-5％左右。而且，绝大多数原核生物mRNA都不存在3’端的poly(A)结构。因此，对原核生物的mRNA分离并进行检测非常困难。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种rRNA捕获探针及其应用，以解决现有rRNA去除方法中存在的一种或者多种的问题。

本发明实施例的第一方面提供一种蓝细菌的rRNA捕获探针。其中，所述rRNA捕获探针选自如下三组探针序列中的一种或者多种；

其中，5SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；16SrRNA 探针序列组包括：SEQ ID No.3至SEQ ID No.24；23SrRNA探针序列组包括： SEQ ID No.25至SEQ IDNo.76。

可选地，每条rRNA捕获探针的长度范围为30bp-120bp；相邻的rRNA 捕获探针之间的长度间距小于30bp。

可选地，所述rRNA捕获探针还包括生物素标记。

本发明实施例的第二方面提供一种全转录组测序检测方法。其中，所述方法包括应用如上所述的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA。

本发明实施例的第三方面提供了一种RNA修饰的高通量检测方法。其中，所述方法包括应用如上所述的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的 rRNA。

可选地，每种rRNA捕获探针的摩尔浓度为0.1uM-1uM；所述样本总RNA 的投入量为50ug-10ng，浓度大于等于5ng/uL。

可选地，每种所述rRNA捕获探针的摩尔浓度为0.5uM。

可选地，所述通过所述rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA，具体包括：

在杂交缓冲体系中，将所述rRNA捕获探针与所述样本总RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链；

在杂交完成后，在核糖核酸酶H的作用下，特异性的消化DNA-RNA杂合链中的rRNA；

在脱氧核糖核酸酶I的作用下，特异性的消化所述rRNA捕获探针。

可选地，所述通过所述rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA，具体包括：

在杂交缓冲体系中，将所述rRNA捕获探针与所述样本总RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链；

在杂交完成后，在双链特异性核酸酶的选择性降解下，去除杂交后形成的所述DNA-RNA杂合链。

可选地，通过所述混合后的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA，具体包括：

在杂交缓冲体系中，将所述rRNA捕获探针与所述样本总RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链；其中，所述rRNA捕获探针带有生物素标记；

通过生物素-链霉素亲和捕获，将杂交后形成的所述DNA-RNA杂合链从所述样本总RNA中去除。

本发明实施例提供的技术方案中，设计了特异性的rRNA捕获探针，可以此为基础，有效去除转录产物中90％以上的核糖体RNA序列，克服了原核生物mRNA不含polyA尾巴，无法通过oligo dT富集分离的技术难题，极大的节省了测序数据量和成本。

由于rRNA捕获探针仅捕获rRNA序列。因此，在用于转录组测序分析等高通量测序时，除了检测到mRNA外，还可以检测到非编码RNA，lncRNA、 tRNA、circle RNA和小RNA等。

另外，在RNA修饰检测时，只需要微量的总RNA(约2ug)即可检测哺乳动物rRNA外的其它RNA修饰情况，还可以进一步的用于分析植物、微生物等其它物种的修饰水平，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例的全转录组测序检测的的一个实施例示意图；

图2为本发明实施例的RNA修饰的高通量检测方法的一个实施例示意图。

SEQ ID No.1和SEQ ID No.2是针对5SrRNA设计的捕获探针；

SEQ ID No.3至SEQ ID No.24是针对16SrRNA设计的捕获探针；

SEQ ID No.25至SEQ ID No.76是针对23SrRNA设计的捕获探针。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”、“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

本发明实施例提供了一种rRNA捕获探针。该rRNA捕获探针以蓝细菌的 5S，16S以及23SrRNA序列为参考序列，按照碱基互补配对的原则进行设计，获得三组探针，分别可以5S，16S以及23SrRNA与rRNA特异性结合，形成 RNA-DNA杂交双链。

在设计过程中，控制每条探针的长度范围在30bp-120bp之间，并且探针中的CG含量均衡，相邻的rRNA捕获探针之间的长度间距小于30bp。

其中，5SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；16SrRNA 探针序列组包括：SEQ ID No.3至SEQ ID No.24；23SrRNA探针序列组包括： SEQ ID No.25至SEQ IDNo.76。

在本实施例中，提供了蓝细菌的rRNA捕获探针。本领域技术人员基于相同的发明构思，还可以针对性的设计确定其他不同物种的rRNA捕获探针而在其他的生物的基因测序或者分析中使用。

基于本发明实施例提供的rRNA捕获探针，可以适用于多种高通量测序平台，如illumina、华大MGI-seq或者life等，应用于转录组学研究和表观转录组学研究等检测范围，用于有效的去除总RNA中的rRNA。

rRNA捕获探针与总RNA杂交完成，形成RNA-DNA杂交双链后，可以通过任何合适的方式将RNA-DNA杂交双链从总RNA中剔除，以进行后续的测序和检测步骤。

在实际使用过程中，可以将每种rRNA捕获探针(即序列表中的不同序列)调整至设定的摩尔浓度并混合后，作为完整的rRNA捕获探针组使用，与样本总RNA进行杂交。

具体的，可以将每种rRNA捕获探针摩尔浓度控制在0.1uM-1uM的范围内，相对应地，所述样本总RNA的投入量为50ug-10ng，并保证RNA浓度大于等于5ng/uL。

令人惊喜的发现，每种rRNA捕获探针摩尔浓度为0.5uM，样本总RNA 的投入量为500ng-2ug之间时，可以取得最优的杂交效果，将样本总RNA中的rRNA去除。

在一些实施例中，可以利用核糖核酸酶H(R Nase H)和脱氧核糖核酸酶 I(D NaseI)进行酶切以特异性的去除探针和rRNA。具体的去除过程可以包括如下步骤：

首先，在杂交缓冲体系中，将所述rRNA捕获探针与样本总RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链。

然后，在杂交完成后，在核糖核酸酶H的作用下，特异性的消化DNA-RNA 杂合链中的rRNA。

最后，在脱氧核糖核酸酶I的作用下，特异性的消化所述rRNA捕获探针，从而达到去除总RNA中的rRNA的目的。

在另一些实施例中，还可以使用双链特异性核酸酶(DSN)达到同样的效果。亦即，在杂交完成后，在双链特异性核酸酶的选择性降解下，去除杂交后形成的所述DNA-RNA杂合链，从而达到去除总RNA中的rRNA的目的。

在又一些实施例中，可以利用生物素-链霉素亲和反应从总RNA中捕获 DNA-RNA杂合链。当然，在本实施例中，rRNA捕获探针还包括有生物素标记。

这样的，在杂交后形成的DNA-RNA杂合链将带有生物素标记，而其他的RNA不带有生物素标记。由此，DNA-RNA杂合链会被链霉素通过亲和反应捕获，从而将DNA-RNA杂合链从总RNA中剔除。

图1为本发明实施例提供的全转录组测序检测的方法流程图。该全转录组测序检测利用上述rRNA捕获探针实现从样本总RNA中去除rRNA的目的。如图1所示，该方法包括如下步骤：

S110：制备样本总RNA。

具体可以通过任何合适的方法提取样本总RNA，例如Trizol法或使用市面销售的商业化试剂盒。提取后的样本总RNA需要通过电泳法检测，确定存在明显的5S，16S和23SrRNA主带，无降解并且浓度不低于5ng/ul。

S120：将混合后的rRNA捕获探针与样本总RNA进行杂交，形成 DNA-RNA杂合链以捕获样本总RNA中的rRNA。

具体的，可以在杂交缓冲体系下，取1-2ug的样本总RNA与混合完毕的 rRNA捕获探针(每种rRNA捕获探针的摩尔浓度控制在0.5uM)在预设的杂交反应条件(95-75摄氏度下变性，以0.1-0.5摄氏度每秒的速度梯度降温至 20摄氏度，反应5分钟)下进行杂交。

S130：在样本总RNA中去除DNA-RNA杂合链。

具体可以选用如上实施例所提供的任意一种方法，将DNA-RNA杂合链特异性的从样本总RNA中去除。基于上述实施例揭露的发明思路，本领域技术人员还可以根据实际情况的需要，调整或者改变具体使用的方法，例如使用其他的标记物替代生物素。

S140：片段化RNA并反转录为cDNA。

在盐离子的作用，可以通过加热将样本总RNA中的剩余部分片段化至 150-300bp这样的理想片段长度范围内。片段化后的RNA可以通过反转录酶，逆转录为cDNA并在DNA聚合酶的作用下进行第二链的合成。

S150：修复cDNA并与通用接头连接。

具体的，在反转录后获得的cDNA可以在聚合酶、磷酸化酶等酶的作用下(包括但不限于T4 DNA Polymerase、Bst DNA polymerase、Klenow Fragment、Klenow Frgment(3’-5’exo-)、PCR DNA polymerase和T4 Polynucleotide Kinase)，以dNTP为作用底物进行末端加A和磷酸化修饰。

然后，在T4 DNA Ligase的作用下，连接通用接头。具体可以选择使用双链DNA平末端连接、粘性末端如T-A连接、单链DNA随机引物延申介导的接头引入或单链DNA连接等的方式在cDNA上连接通用接头。

具体所使用的通用接头修饰也可以由技术人员根据实际情况的需要而设定，包括但不限于羟/甲基化修饰，硫代磷酸酯修饰，LNA bases修饰等。

S160：在PCR扩增后，进行高通量测序。

将步骤S150获得的通用接头连接产物作为扩增模板，借助人工合成的引物序列可以进行PCR扩增。扩增产物纯化以后，选用定量PCR的方式，对扩增后的目标区域/位点文库进行安捷伦2100插入片段检测后，进行高通量测序。

图2为本发明实施例提供的RNA修饰的高通量检测方法。该RNA修饰可以是任何合适类型的RNA修饰，例如m6A或者m5C等(本实施例中以 m6A修饰为例进行描述)。其对于样本总RNA的投入量要求较低，可以使用微量的样本总RNA进行检测。

如图2所示，该RNA修饰的高通量检测方法可以包括如下步骤：

S210：制备样本总RNA并片段化。

具体可以使用任何合适的方式将样本总RNA进行片段化处理，使其能够片段化至50bp-300bp的理想长度范围内。具体的，可以在设置好的缓冲体系中，70-95摄氏度反应1-10分钟对RNA进行片段化。

令人惊喜的发现，片段化的最优长度范围为100-250bp。亦即，片段化以后的样本总RNA中，RNA的片段都分布在该最优长度范围内。

S220：制备磁珠和抗体复合物。

在实际使用过程中，可以分别取等量的protein A/G偶联磁珠混合，每种磁珠体积为5-50ul，用100-200ul的免疫富集缓冲液洗涤磁珠(150mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH7.5,0.1％IGEPAL CA-630)洗涤1到2次。

然后，将磁珠重选于100-500ul的免疫富集缓冲液中，加入5-20ug的anti-m6A的抗体和1ul的蛋白酶抑制剂(包括Cocktail，PMSF蛋白酶抑制剂) 室温反应1-6h或者4℃旋转过夜。

S230：通过抗体免疫法，富集m6A修饰的片段化RNA。

基于步骤220制备获得磁珠-抗体复合物，可以首先用磁力架去除上清， 100-500ul的免疫富集缓冲液洗涤磁珠-抗体复合物2-3次后去除上清。

将打断纯化的总RNA75℃加热变性5-10分钟，快速至于冰上孵育5min 后，进一步将片段化的2-5ug的总RNA与复合体混合，同时加入1-5ul的RNA 酶抑制剂，100ul高浓度免疫富集缓冲液(750mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5％IGEPAL CA-630)和片段化的RNA(总体积控制在500ul)，最后，将混合物4摄氏度旋转反应2-4h。

S240：分离纯化m6A修饰的片段化RNA。

在进行分离前，可以对步骤230获得的免疫富集反应混合物分别用免疫富集洗涤两次，低盐缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.5，0.1％IGEPAL CA-630)洗涤两次，高盐缓冲液(500mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.5，0.1％ IGEPAL CA-630)洗涤两次。然后使用合适的纯化方式，去除非修饰RNA片段，回收片段中含有m6A修饰的总RNA(包括mRNA、smallRNA、tRNA、 lncRNA和占绝大部分的rRNA)。

具体可以采用任何合适m6A竞争洗脱或试剂盒纯化等任何合适的方法进行纯化(如Qiagen的RNeasy Mini Kit)。

S250：将混合后的rRNA捕获探针与m6A修饰的片段化RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链以捕获m6A修饰的片段化RNA中的rRNA。

具体的，可以在杂交缓冲体系下，取m6A修饰的片段化RNA与混合完毕的rRNA捕获探针(每种rRNA捕获探针的摩尔浓度控制在0.1-0.5uM)在预设的杂交反应条件(95-75摄氏度下变性，以0.1-0.5摄氏度每秒的速度梯度降温至20摄氏度，反应5分钟)下进行杂交。

S260：去除DNA-RNA杂合链。

具体可以选用如上实施例所提供的任意一种方法，将DNA-RNA杂合链特异性的去除，从而达到去除rRNA的效果。在捕获探针包括生物素标记时，可用M280链霉素磁珠孵育，钓取DNA-RNA杂合链而去除rRNA。

基于上述实施例揭露的发明思路，本领域技术人员还可以根据实际情况的需要，调整或者改变具体使用的方法，例如使用其他的标记物替代生物素。

S270：回收去除rRNA后的m6A修饰的片段化RNA，进行反转录、PCR 扩增和文库构建测序。

经过步骤S260，可以回收获得去除了rRNA的m6A修饰的RNA片段。在进行反转录时，可以加入dNTP(10uM)、N6 primer，70-75℃反应2-5min，置于冰上变性，然后在反应体系中加入TSO primer、反转录酶、RNA酶抑制剂及反转录缓冲液，混匀42℃反应进行反转录及末端转移酶反应。

在反转录反应后，在反应体系中分别加入PCR Primer1和PCR Primer2进行PCR扩增。最终获得的扩增产物用磁珠纯化，利用安捷伦生物分析仪2100 和QPCR检测文库片段及摩尔浓度进行高通量测序，构建文库。

以下结合具体实例，详细描述本发明实施例提供的rRNA捕获探针的具体应用过程。

实施例1：蓝细菌的原核转录组建库测序分析

1.1)System6803 Pool Mix(即基因序列表中所示的多种rRNA捕获探针的混合物)与总RNA退火杂交：

首先，配制Hybridization Buffer：500mM Tris-HCl(pH 7.0)、1M NaCl。取蓝细菌全转录组RNA 200ng于0.2ml PCR管中，加入Hybridization Buffer 3ul，Probe Mix0.5ul，总体积为15ul。PCR仪上95℃反应2min，然后梯度降温(0.1℃/sec)至22℃，反应5min。反应结束后马上置于冰盒上，尽量减少 RNA降解。

1.2)RNase H酶消化：

在上一步反应的PCR管中Nuclease free water 1ul，RNase H Buffer 2ul，RNase H(5U/ul)2ul，总体积为20ul。PCR仪上37℃，热盖温度47℃，反应 30min。反应结束后马上置于冰盒上，尽量减少RNA降解。

1.3)DNase I酶消化：

在上一步反应的PCR管中Nuclease free water 4.5ul，10×DNase I Buffer3ul，DNase I(2U/ul)2.5ul，总体积为30ul。PCR仪上37℃，热盖温度47℃，反应30min。反应结束后用1.8×RNA clean XP beads纯化，洗脱到10ul Nuclease free water中。

1.4)RNA片段化：

在上一步10ul洗脱液中加入5×First Strand Buffer 3ul，PCR仪中94℃，反应10min，结束后立即放在冰盒上。

1.5)RNA反转录：

其中，反转录第一链的合成：向上步片段化的RNA中加入N6 primer (0.1ug/ul)0.5ul，PCR仪中65℃反应5min，放冰盒上冷却后加入RNase Inhibitor(40U/ul)0.5ul，dNTP(10mM)0.5ul，100mM DTT 0.5ul，总体积15ul。室温反应2min，加入Superscript II(200U/ul)0.25ul，混匀后PCR仪中按以下程序进行反应：

Step 1：25℃，10min；Step 2：42℃，40min；Step 3：70℃，15min；Step 4：4℃，Hold。

反转录第二链的合成：将合成的共15.25ul的一链cDNA转入1.5ml EP 管中，加入ddH2O 20ul，5×Second Strand Buffer 10ul，dNTP(10mM)2ul，RNase H(5U/ul)0.5ul，DNApol I(10U/ul)2.5ul，总体积为50ul。混匀后置于 Thermomixer上，16℃反应2h，350rpm间歇震动15s，静置2min。

纯化：向cDNA中加入1.8×egene beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于MPC上2min，小心吸出上清；加入80％乙醇200ul，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入30ul EB solution重悬磁珠，室温反应5min，置于MPC上2min，吸取上清于新1.5ml EP管中进行下一步反应。

1.6)cDNA末端修复：

向上一步反转录获得的30ul cDNA产物中，加入5ul 10×PNK buffer，1ul dNTP(10mM)，1.2ul T4 DNA polymerase(3U/ul)，0.2ul Klenow Fragment，1.2ul T4Polynucleoyide Kinase，11.4ul H2O，总体积50ul。混匀后置于Thermomixer 上，20℃反应30min。

纯化：向上步产物中加入1.2×egene beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于MPC上2min，小心吸出上清；加入75％乙醇200ul，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入20ul EB solution重悬磁珠，室温反应5min，置于MPC上2min，吸取上清于新1.5ml EP管中进行下一步反应。

1.7)末端加A

向末端修复后的20ul产物中，加入2.3ul 10×blue buffer，0.5ul dATP (5mM)，0.5ulKlenow(3’-5’exo)，总体积23ul。混匀后置于Thermomixer 上，37℃反应30min。

1.8)通用接头连接：

向上一步末端添加了粘性端以后的23ul产物中，加入1.2ul 2×Rapid ligationbuffer，1.2ul T4 DNA ligase，1ul PEI adapter(2uM)，0.1ul 10mM ATP，总体积26.5ul。混匀后置于Thermomixer上，20℃反应20min。

纯化：向上步产物中加入1.8×egene beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于MPC上2min，小心吸出上清；加入75％乙醇200ul，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入20ul EB solution重悬磁珠，室温反应5min，置于MPC上2min，吸取上清于新PCR 管中进行下一步反应。

1.9)PCR扩增及产物纯化：

向连接通用接头的20ul产物中，加入10ul 5×kapa HiFi buffer，0.8ul kapaHiFi polymerase，2ul 10mM dNTP，1.5ul 10uM universal primer，1.5ul 10uM indexprimer，14.2ul H2O总体积50ul。混匀后置于PCR上，按以下程序进行反应：

95℃2min循环1次；94℃30s，58℃30s，72℃45s，循环12次；72℃ 3min循环1次；12℃保温。

纯化：向上步产物中加入0.9×egene beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于MPC上2min，小心吸出上清；加入75％乙醇200ul，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入20ul EB solution重悬磁珠，室温反应5min，置于MPC上2min，吸取上清于新1.5ml EP管中。

1.10)高通量测序数据统计：

文库质控后进行二代高通利郎测序，通过数据比对显示，rRNA的去除效果较好，下机数据比对率可靠，残留的为去除rRNA为7％左右，满足实验要求且与类似商业化探针(人/鼠)结果相似。

1.11)下机数据处理统计：

统计结果如下表格所示，表格显示基因组比对率较高，而rRNA比对率较低。

样品名	C1
		原始下机数据量	4983065700
原始数据Q20	96.62％
		原始数据Q30	91.72％
有效数据量(Gb)	4.417
		有效数据得率	99.92％
比对数据	28062897
		比对率	84.55％
rRNA残留率	7.09％

实施例2：基于探针去除核糖体rRNA的微量RNA甲基化检测：

2.1)磁珠-抗体复合物制备：

在1.5ml的离心管中分别加入30ul的protein A magnetic beads和30ul的protein G magnetic beads，分别用200ul的免疫富集缓冲液洗涤两次，去上清；在含磁珠的离心管中加入500ul的免疫富集缓冲液，5ug的anti-m6A抗体，4℃旋转反应过夜。

2.2)抗体富集m6A总RNA片段：

取5ug总RNA在20ul的体系中进行片段化反应，反应条件为70℃反应 5min，反应后加入2ul的EDTA终止反应，乙醇沉淀法回收片段化RNA，长度为100-200bp。

将过夜反应的磁珠抗体复合物置于磁力架去上清，分别用300ul的免疫缓冲液洗涤磁珠-抗体复合物2次，磁力架去上清，最后在洗涤后的磁珠-抗体复合物中加入RNA酶抑制剂5ul、回收纯化RNA，总体积500ul，在富集缓冲体系下4℃旋转反应2小时

2.3)总RNA中m6A修饰RNA分离：

分别用1ml的免疫缓冲液、低盐免疫缓冲液和高盐免疫缓冲液洗涤磁珠- 抗体-RNA复合物，每种缓冲液洗涤2次，捕获复合物加入200ul的RLT缓冲液，通过商业化试剂盒RAeasy Mini Kit(Qiagen)进行纯化。

2.4)基于捕获探针去除富集中的rRNA：

将富集好的RNA与1ul合成的探针System6803 Pool(基因序列表中所示的多种rRNA捕获探针的混合物)进行杂交，杂交温度为75℃变性5min，0.1-0.5℃ /秒梯度降温至20℃，反应5分钟，在反应产物中加入2ul的RNase H，37℃反应30min，反应后，进一步在反应体系中加入2.5ul的DNase I，37℃反应 30min，反应后经1.8X磁珠纯化。

2.5)富集RNA文库构建：

在磁珠-RNA混合物中加入2ul的N6 primer和2ul的dNTP和4ul的超纯水，72℃反应3min，立即放在冰上5min。离心后加入1ul的逆转录酶，0.5ul 的RNA酶抑制剂，4ul的一链合成缓冲液，1ul的DTT，4ul的5M甜菜碱， 0.12ul的1M氯化镁和0.2ul的TSO primer，混匀PCR仪上按照以下步骤进行反应：

42℃反应90min循环1次，50℃反应2min，42℃反应2min循环2次， 70℃反应15min循环1次。

在逆转录反应后，在反应体系中进一步加入PCR反应混合物25ul，primer 1(10uM)1ul和primer 2(10uM)1ul，超纯水3ul，进行10-14个循环的 PCR扩增，并基于PCR扩增产物进行基因测序，构建对应的RNA文库。

综上所述，本发明实施例通过分析蓝细菌转录产物及rRNA序列特征，设计核糖体去除探针，搭建了RNA-DNA杂交消除体系和RNA建库流程，可有效去除转录产物中90％以上的核糖体RNA序列。

这样的rRNA捕获探针对于转录组测序分析，可以有效克服原核生物 mRNA不含polyA尾巴，无法通过oligo dT富集分离的技术难题，极大的节省了测序数据量和成本。

此外，由于探针仅捕获rRNA序列，通过高通量测序，相比较与真核mRNA 钓取，可除了检测到mRNA的表达，修饰外，还可以检测到非编码RNA， lncRNA、tRNA、circle RNA和小RNA等。

而在RNA修饰检测应用上，本技术发明的方法流程，不仅可以设计合成探针序列，在微量总RNA(约2ug)中检测哺乳动物rRNA外的其它RNA 修饰情况，还可以进一步的用于分析植物、微生物等其它物种的修饰水平并实现另一种RNA修饰检测技术并试剂盒化。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 深圳市易基因科技有限公司

<120> rRNA捕获探针及其应用

<141> 2019-11-13

<160> 76

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 1

cggactattg tgccgtgggg caacccccag agtatcgtcg ccgctgtcac 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 2

cacaaccgag tgcgggatgg gatcggagtg gttccatgac gctaaagaca 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 3

gagttgcagc ctgcaatctg aactgaggcc gggtttgatg ggattcgctt 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 4

cgagctcgct gcccgttgtc ccgaccattg tagtacgtgt gtagcccaag 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 5

ggggcatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 6

ctctagagtg cccaacttaa tgatggcaac taaaaacgag ggttgcgctc 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 7

ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcaccac 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 8

cctggctccc taaggcactc ccacgtttcc gcaggattcc agggatgtca 50

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 9

ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa accacatact ccaccgcttg 50

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 10

ccccgtcaat tcctttgagt ttcacacttg cgtgcgtact ccccaggcgg 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 12

taacgcgtta gcttcggcac ggctcgggtc gatacaagcc acgcctagta 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 12

gtttacggct aggactacag gggtatctaa tccctttcgc taccctagct 50

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 13

cctcagtgtc agtttcagcc cagtagcacg ctttcgccac cgatgttctt 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 14

atctacgcat ttcaccgcta cactgggaat tcctgctacc cctactgtac 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 15

cttgcagttt ccaccgctcc tatggagtta agctccattc tttaacggca 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 16

cataaccacc tacggacgct ttacgcccaa taattccgga taacgcttgc 50

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 17

cgtattaccg cggctgctgg cacggagtta gccgatgctt attcatcagg 50

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 18

cagaacttct tccctgataa aagaggttta caatccaagg accttcctcc 50

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 19

cggtattgct ccgtcaggct ttcgcccatt gcggaaaatt ccccactgct 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 20

cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggctgc tcatcctctc 50

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 21

gctactgatc gttgccatgg taggctctta ccccaccatc tagctaatca 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 22

gcccatcttc agacgataaa tctttcacct ttcggcacat tgggtattag 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 23

ttccaactgt tgtccccatt ctgaaggtag gttctcacgt gttactcacc 50

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 24

cgtccgccac taagttccga agaactccgt tcgacttgca tgtgt 45

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 25

gtcaagccct cggtctatta gtactcctcg acttcatcca ttactggact 50

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 26

ctagagccta tcaacgggta gtcttcccgt gaccttactg gcttaacacc 50

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 27

gtactcatct tgaggtgggc ttcccactta gatgctttca gcggttatcc 50

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 28

cacttggcta ccctgcgttt accgttggca cgataacagg tacaccagag 50

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 29

acttcccggt cctctcgtac taaggaagtc tcctctcaat actcttacgc 50

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 30

cggatatgga ccgaactgtc tcacgacgtt ctgaacccag ctcacgtacc 50

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 31

atgggcgaac agcccaaccc ttgggacgta ctaccgcccc aggttgcgat 50

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 32

acatcgaggt gccaaacctc cgcgtcgatg tgaactcttg gcggagatca 50

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 33

tatccctaga gtaactttta tccgttgagc gacggccctt ccactcagtg 50

<210> 34

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 34

gatcactaaa gccgactttc gtccctgttt gacttgtcag tctcacagtc 50

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 35

ccttctgctt ttacactctt cggctgattt ccaaccagcc tgaggaaacc 50

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 36

cgcctccgtt accttttagg aggcgaccgc cccagtcaaa ctgcccacct 50

<210> 37

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 37

gtccttctcc cggataacgg gaacaagtta gaattctagc ctcaccagag 50

<210> 38

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 38

ctcaccgttg actccattac tcccacaaga gcaacttcat agtctcccac 50

<210> 39

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 39

tgcgcaagca aagcccgaac ccaattccaa gctacagtaa agcttcatag 50

<210> 40

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 40

tctgtccagg tgcagggagt ccgtatcttc acagacaatc ctatttcgcc 50

<210> 41

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 41

ctctccgaga cagtgcccag atcgttacgc ctttcgtgcg ggtcggaact 50

<210> 42

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 42

acaaggaatt tcgctacctt aggaccgtta tagttacggc cgccgttcac 50

<210> 43

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 43

cttcagtcgc tagcttcagg attactccct gaccaacttc cttaaccttc 50

<210> 44

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 44

tgggcaggcg tcagccccca tactgcgtct tacgactttg cggagacctg 50

<210> 45

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 45

tggtaaacag tcgcctgggc ctattcactg cgacctccat tgctggaggc 50

<210> 46

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 46

tctcccgaag ttacggggta attttgccga gttccttaga gagagttacc 50

<210> 47

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 47

cccttagtat tctctacctt cctacctgtg tcggtttcgg gtacaggtga 50

<210> 48

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 48

attaacgtgg ttcgggcttt tcttggaagc ttgacatcat gcacttcgtc 50

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 49

gagactcccc atcacacctc tgctcaagac gttttcgccg tctctcatcg 50

<210> 50

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 50

atgcttggac tggtaaccaa cttccagttg cactagcctt ctccgtcccc 50

<210> 51

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 51

caatctataa tcagtaccgg aatattgacc ggttgtccat cgactacgcc 50

<210> 52

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 52

cctcgcctta ggtcctgact aaccctccgc ggacgagcct tccggaggaa 50

<210> 53

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 53

ggatttcggg gtatgggatt ctcacccata ttttcgctac tcaagccgac 50

<210> 54

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 54

acttctgtac tgtccacacc tgcttgccgc tagtgcttca ccctatacag 50

<210> 55

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 55

cccctaccac tcatatctga gtccacagct tcggtacatc acttagcccc 50

<210> 56

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 56

tttcggcgca ggagcgcttg accagtgagc tattacgcac tcttttaagg 50

<210> 57

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 57

gcttctaggc aaacctcctg gttgtcaatg cactcccacc tcctttctca 50

<210> 58

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 58

gatgatttgg ggaccttagc tggtggtctg ggctgtttcc ctttcgacga 50

<210> 59

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 59

ttatccccca ccgtcttact ggtcgtttct tcttgggtat tctgagtttg 50

<210> 60

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 60

tttggtacag ctctcgccgc ccgcagcgaa acagtgcttt accccccaag 50

<210> 61

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 61

ttacaaccgc tgcgcctaaa cacatttcgg ggagaaccag ctagctccgg 50

<210> 62

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 62

ttggcatttc acccctaacc acagctcatc cgctaatttt tcaacattag 50

<210> 63

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 63

cggacctcca cttagtgtta cctaagcttc atcctggcca tggttagatc 50

<210> 64

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 64

gttcgggtct acaaattgtg actaacgccc tattcaggct cgctttcact 50

<210> 65

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 65

tcggtgcaac acaccttaac ctgccacaac ctgtaagtcg ccggctcatt 50

<210> 66

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 66

caggcacacg gtcactcgtt taatcgagct cccattgctt gtaggctaac 50

<210> 67

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 67

catgttctat ttcactcccc tcaacggggt tcttttcacc tttccctcgc 50

<210> 68

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 68

ttacgctatc ggtcacacag tagtatttag ccttaccggg tggtcccggc 50

<210> 69

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 69

aatcggaatt ccacgagctc cgacctactc gggatacagc taggctgatt 50

<210> 70

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 70

ttcgactaca ggactttcac ctcctctggt gcagttttca gctgcttcgt 50

<210> 71

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 71

tactcagtcc acgttgctgt cccacgaccc caatcttcga aaagattggt 50

<210> 72

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 72

tgttccccgt tcgctcgccg ctacttggag aatcactttt gttttctttt 50

<210> 73

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 73

gctactaaga tgtttcagtt cactaggttt gctctctccc gcctatttta 50

<210> 74

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 74

ggtagttcac ttgggttgcc ccattcggac acctccggat caatgcttgt 50

<210> 75

<211> 50

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 75

ccagctcccc gaagcgtttc gtcggtaacc acgtccttct tcgcctctgt 50

<210> 76

<211> 39

<212> DNA

<213> Cyanobacteria

<400> 76

gtgccaaggt atccaccgtt agccctttgt agcttgacc 39

Claims (10)

1.一种蓝细菌的rRNA捕获探针，其特征在于，所述rRNA捕获探针选自如下三组探针序列中的一种或者多种；其中，

5SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；

16SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.3至SEQ ID No.24；

23SrRNA探针序列组包括：SEQ ID No.25至SEQ ID No.76。

2.根据权利要求1所述的rRNA捕获探针，其特征在于，每条rRNA捕获探针的长度范围为30bp-120bp；相邻的rRNA捕获探针之间的长度间距小于30bp。

3.根据权利要求1所述的rRNA捕获探针，其特征在于，所述rRNA捕获探针还包括生物素标记。

4.一种全转录组测序检测方法，其特征在于，应用如权利要求1所述的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA。

5.一种RNA修饰的高通量检测方法，其特征在于，应用如权利要求1所述的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，每种rRNA捕获探针的摩尔浓度为0.1uM-1uM；所述样本总RNA的投入量为50ug-10ng，浓度大于等于5ng/uL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，每种所述rRNA捕获探针的摩尔浓度为0.5uM。

8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，应用所述的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA，具体包括：

在杂交缓冲体系中，将所述rRNA捕获探针与所述样本总RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链；

在杂交完成后，在核糖核酸酶H的作用下，特异性的消化DNA-RNA杂合链中的rRNA；

在脱氧核糖核酸酶I的作用下，特异性的消化所述rRNA捕获探针。

9.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，应用所述的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA，，具体包括：

在杂交缓冲体系中，将所述rRNA捕获探针与所述样本总RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链；

在杂交完成后，在双链特异性核酸酶的选择性降解下，去除杂交后形成的所述DNA-RNA杂合链。

10.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，应用所述的rRNA捕获探针捕获并去除样本总RNA中的rRNA，具体包括：

在杂交缓冲体系中，将所述rRNA捕获探针与所述样本总RNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合链；其中，所述rRNA捕获探针带有生物素标记；

通过生物素-链霉素亲和捕获，将杂交后形成的所述DNA-RNA杂合链从所述样本总RNA中去除。

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