JP7377247B2 - 標的化ゲノム解析のための方法 - Google Patents

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Description

関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１５日に出願した米国仮出願第６１／７９４，０４９号および２０１２年１２月１０日に出願した米国仮出願第６１／７３５，４１７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。これらの出願は、その全体が参考として援用される。
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は、書面による複写物の代わりにテキスト形式で提供され、これにより、本明細書に参照として援用する。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＣＬＦＫ＿００１＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１８８ＫＢであり、２０１３年１２月１０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子提出されている。
背景
技術分野
本発明は、全般的には、単一アッセイにおいて標的化された特異的なゲノム遺伝子座の遺伝的配列および染色体コピー数の両方を明らかにする、個体における遺伝学的解析のための方法に関する。特に、本発明は、標的遺伝子配列または遺伝子転写物の高感度かつ特異的な検出をもたらす方法と、単一アッセイにおいてバリアント配列および全体的な遺伝子コピー数の両方を明らかにする方法に関する。
関連出願の説明
個々のヒト対象の完全ヒトゲノム配列および部分的ゲノムリシークエンシング試験の両方により、あらゆるヒトが、完全とは言えないゲノムを保有すると考えられるという基本テーマが明らかになった。特に、正常な健康ヒト対象は、そのゲノム配列内に数千種まではいかないとしても数百種の遺伝的病変を持つことが判明した。このような病変の多くは、病変が存する遺伝子の機能を排除することが公知であるまたは予測される。正常二倍体のヒトは、大部分の遺伝子の機能的コピーを２個保有するが、あらゆるヒトにおいて、機能的遺伝子コピーが僅か１（またはゼロ）個存在するという事例が多くあることが暗示される。同様に、遺伝子が、遺伝子重複／増幅事象により過剰出現するという事例にも有意な頻度で遭遇する。
生体ネットワークにおける重要な特色の１つは、機能的冗長性である。正常な健康個体は、１コピーの損失の重要度が低くなるように、全遺伝子を平均して２コピー保有するため、遺伝的病変の平均負荷に耐容性を示すことができる。さらに、特異的遺伝子機能における軽微な撹乱が、機能的要素のより大きなネットワーク内で全般的に補償されるように、遺伝子のセットは、多くの場合、同様の機能を実行する。生体システムにおける機能的補償は、一般テーマであるが、特異的遺伝子損失が、急性の破壊的な事象を誘発し得るという事例が多くある。例として、がんは、複数の個々の病変の複合効果が、制御されない細胞増殖である遺伝的疾患の結果であると考えられる。同様に、処方薬は、多くの場合、非常に特異的な遺伝子により輸送、代謝および／または排除される特異的な化学物質である。このような遺伝子における撹乱は、正常環境下では一般に重要度が低いが、化学治療法において有害事象（例えば、副作用）として顕在化し得る。
「精密医学」と称されることがますます多くなった「個別化医学」の中心的な目標は、患者に特異的な遺伝情報を、個体の遺伝的プロファイルと適合する処置オプションと統合することである。しかし、個別化医学の莫大な潜在力は、まだ現実化されていない。この目標を現実化するためには、関連性のある遺伝子の遺伝的状態を確実に決定することができる、臨床的に許容される頑強な遺伝的診断検査が存在する必要がある。
簡単な概要
本明細書中で企図される特定の実施形態は、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製するための方法であって、断片化されたＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたＤＮＡを作製するステップと、ランダム核酸タグ配列ならびに必要に応じて試料コード配列および／またはＰＣＲプライマー配列を、前記断片化され末端修復されたＤＮＡにライゲーションして、前記タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製するステップとを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、前記ランダム核酸タグ配列は、約２～約１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本発明は、前記ランダム核酸タグ配列が、約２～約８ヌクレオチドであることを提供する。
ある特定の実施形態では、前記断片化され末端修復されたＤＮＡは、平滑末端を含有する。一部の実施形態では、前記平滑末端は、単一塩基対オーバーハングを含有するようさらに修飾される。
ある特定の実施形態では、前記ライゲーションステップは、多機能性アダプターモジュールを前記断片化され末端修復されたＤＮＡにライゲーションして、前記タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製することを含み、前記多機能性アダプター分子は、
ｉ）ランダム核酸タグ配列を含む第１の領域と、
ｉｉ）試料コード配列を含む第２の領域と、
ｉｉｉ）ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域と
を含む。
さらなる実施形態では、この方法は、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズさせて、複合体を形成するステップをさらに含み、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域とハイブリダイズする。
さらなる実施形態では、この方法は、前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、前記単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングして、一本鎖３’末端を除去するステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングにおいて使用される酵素は、Ｔ４ポリメラーゼである。
特定の実施形態において、方法は、単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用して、多機能性捕捉プローブの３’末端からの、単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長をさらに含む。
ある特定の実施形態において、方法は、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により、多機能性捕捉プローブおよび単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を連結するステップをさらに含む。
さらなる実施形態では、この方法は、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップをさらに含み、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含む。
種々の実施形態では、標的化遺伝学的解析のための方法が提供され、この方法は、
ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ＤＮＡライブラリーにおける特異的ＤＮＡ標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
ｅ）ｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む。
様々な特定の実施形態において、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）この単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用して、多機能性捕捉プローブの５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために単離された標的領域の相補体がコピーされ、このハイブリッド核酸分子が、ＤＮＡ標的領域の相補体、多機能性捕捉プローブの標的特異的領域および多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列を含むステップと、ｅ）ｄ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む、標的化遺伝学的解析のための方法が提供される。
様々なある特定の実施形態において、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により、ハイブリッド多機能性捕捉プローブによって単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的分子の作製を実行するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、この多機能性捕捉プローブ分子が、単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的クローンに連結され、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができるゲノム標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールの相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む、標的化遺伝学的解析のための方法が提供される。
特定の実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法であって、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む方法が提供される。
ある特定の実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法であって、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）この単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用して、多機能性捕捉プローブの５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む方法が提供される。
さらなる実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法であって、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により、ハイブリッド多機能性捕捉プローブによって単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的分子の作製を実行するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む方法が提供される。
追加的な実施形態において、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる複合体に対してＰＣＲを実行して、多機能性捕捉プローブの配列と比べて３’の領域を複製するステップであって、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、多機能性捕捉プローブと比べて３’に位置するタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域の相補体とを含むステップと、ｄ）ｃ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む、標的化遺伝学的解析のための方法が提供される。
特定の実施形態において、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、ゲノムライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用して、多機能性捕捉プローブの５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行するステップであって、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、多機能性捕捉プローブと比べて３’に位置するタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域の相補体とを含むステップと、ｄ）ｃ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む、標的化遺伝学的解析のための方法が提供される。
ある特定の実施形態において、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により、ハイブリッド多機能性捕捉プローブによって単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的分子の作製を実行するステップであって、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールの相補体と、多機能性捕捉プローブと比べて５’に位置するタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域を含むステップと、ｄ）ｃ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む、標的化遺伝学的解析のための方法が提供される。
特定の実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法であって、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる複合体に対してＰＣＲを実行して、多機能性捕捉プローブの配列と比べて３’である領域を複製するステップであって、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、多機能性捕捉プローブと比べて３’に位置するタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域の相補体とを含むステップと、ｄ）ｃ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む方法が提供される。
様々な実施形態において、標的化遺伝学的解析は、配列解析である。
特定の実施形態において、タグ付けされたＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲにより増幅されて、増幅されたタグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製する。
ある特定の実施形態において、ＤＮＡは、血液、皮膚、毛、毛包、唾液、口腔粘膜、膣粘膜、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精子液（seminal fluid）、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー氏腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液および組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料に由来する。
さらなる実施形態において、タグ付けされたＤＮＡライブラリーは、タグ付けされたＤＮＡ配列を含み、各タグ付けされたＤＮＡ配列は、ｉ）断片化され末端修復されたＤＮＡと、ｉｉ）ランダムヌクレオチドタグ配列と、ｉｉｉ）試料コード配列と、ｉｖ）ＰＣＲプライマー配列とを含む。
追加的な実施形態において、ハイブリッドタグ付けされたＤＮＡライブラリーは、標的化遺伝学的解析において使用されるハイブリッドタグ付けされたＤＮＡ配列を含み、各ハイブリッドタグ付けされたＤＮＡ配列は、ｉ）断片化され末端修復されたＤＮＡと、ｉｉ）ランダムヌクレオチドタグ配列と、ｉｉｉ）試料コード配列と、ｉｖ）ＰＣＲプライマー配列と、ｖ）多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列とを含む。
さらなる実施形態において、多機能性アダプターモジュールは、ｉ）ランダムヌクレオチドタグ配列を含む第１の領域と、ｉｉ）試料コード配列を含む第２の領域と、ｉｉｉ）ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域とを含む。
特定の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、ｉ）パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第１の領域と、ｉｉ）特異的標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域と、ｉｉｉ）テイル配列を含む第３の領域とを含む。一部の実施形態において、捕捉プローブモジュールの第１の領域は、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、パートナーオリゴヌクレオチドは、化学修飾されている。
一実施形態において、組成物は、タグ付けされたＤＮＡライブラリーと、多機能性アダプターモジュールと、多機能性捕捉プローブモジュールとを含む。
特定の実施形態において、組成物は、本発明の方法によるハイブリッドタグ付けされたゲノムライブラリーを含む。
ある特定の実施形態において、組成物は、本明細書において企図される方法を実行するための反応混合物を含む。
特定の実施形態において、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製することができる反応混合物は、ａ）断片化されたＤＮＡと、ｂ）断片化され末端修復されたＤＮＡを作製するためのＤＮＡ末端修復酵素とを含む。
ある特定の実施形態において、反応混合物は、多機能性アダプターモジュールをさらに含む。
追加的な実施形態において、反応混合物は、多機能性捕捉プローブモジュールをさらに含む。
一部の実施形態において、反応混合物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性およびＰＣＲ増幅活性を有する酵素をさらに含む。
一実施形態において、反応混合物は、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼと、ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡリガーゼとを含む。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ＤＮＡは、単離されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとなり得る。
様々な実施形態において、タグ付けされたゲノムライブラリーを作製するための方法であって、断片化されたゲノムＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡを作製するステップと、ランダム核酸タグ配列ならびに必要に応じて試料コード配列および／またはＰＣＲプライマー配列を、前記断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡにライゲーションして、タグ付けされたゲノムライブラリーを作製するステップとを含む方法が提供される。
特定の実施形態において、ランダム核酸タグ配列は、約２～約１００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、ランダム核酸タグ配列は、約２～約８ヌクレオチドである。
追加的な実施形態において、断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡは、平滑末端を含有する。
さらなる実施形態において、平滑末端は、単一塩基対オーバーハングを含有するようさらに修飾される。
一部の実施形態において、ライゲーションステップは、断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡに多機能性アダプターモジュールをライゲーションして、タグ付けされたゲノムライブラリーを作製することを含み、多機能性アダプター分子は、ランダム核酸タグ配列を含む第１の領域と、試料コード配列を含む第２の領域と、ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域とを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図される方法は、タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズさせて、複合体を形成するステップを含み、この多機能性捕捉プローブモジュールは、ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域とハイブリダイズする。
ある特定の実施形態において、本明細書において企図される方法は、タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップを含む。
追加的な特定の実施形態において、本明細書において企図される方法は、単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングして、一本鎖３’末端を除去するステップを含む。
さらなる特定の実施形態において、３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングにおいて使用される酵素は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである。
一部の特定の実施形態において、本明細書において企図される方法は、先行する請求項から得られる３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができるゲノム標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含む。
様々な実施形態において、（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域に選択的とハイブリダイズするステップと、（ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、（ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができるゲノム標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、（ｅ）ｄ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む、標的化遺伝学的解析のための方法が提供される。
特定の実施形態では、ステップａ）～ｄ）は、少なくとも約２回反復され、ｅ）の前記標的化遺伝学的解析は、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られるハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントを含む。
さらなる実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
一部の実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする。
種々の実施形態では、特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュール複合体が、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｆ）ｅ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、前記定量化が、前記特異的ゲノム標的領域のコピー数の決定を可能にするステップと
を含む。
一部の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、ステップｅ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップを含む。
さらなる実施形態では、ステップａ）～ｅ）は、少なくとも約２回反復され、前記少なくとも２回のｅ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列を使用して、配列アラインメントが実行される。
追加的な実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする。
種々の実施形態では、特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュール複合体が、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、ステップｅ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップを含む。
特定の実施形態では、ステップａ）～ｅ）は、少なくとも約２回反復され、前記少なくとも２回のｅ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列を使用して、配列アラインメントが実行される。
一部の実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
追加的な実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする。
種々の実施形態では、特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュール複合体が、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｆ）ｅ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む。
特定の実施形態では、ステップａ）～ｅ）は、少なくとも約２回反復され、ｆ）の前記標的化遺伝学的解析は、前記少なくとも２回のｅ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントの実行を含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
追加的な実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする。
種々の実施形態では、標的化遺伝学的解析のための方法が提供され、この方法は、（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体に対して前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記捕捉されたタグ付けされたゲノム標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記ゲノム標的領域とハイブリダイズする位置から３’方向に位置する前記タグ付けされたゲノム標的領域の一領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む。
さらなる実施形態では、ステップａ）～ｃ）は、少なくとも約２回反復され、ｄ）の前記標的化遺伝学的解析は、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントを含む。
一部の実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
特定の実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする。
種々の実施形態では、特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体に対して前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記捕捉されたタグ付けされたゲノム標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記ゲノム標的領域とハイブリダイズする位置から３’方向に位置する前記タグ付けされたゲノム標的領域の一領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、前記定量化が、前記特異的ゲノム標的領域のコピー数の決定を可能にするステップと
を含む。
特定の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、ステップｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップを含む。
ある特定の実施形態では、ステップａ）～ｄ）は、少なくとも約２回反復され、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列アラインメントが行われる。
追加的な実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
さらなる実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする。
一部の実施形態では、前記標的化遺伝学的解析は、配列解析である。
特定の実施形態では、前記タグ付けされたゲノムライブラリーがＰＣＲにより増幅されて、増幅されたタグ付けされたゲノムライブラリーを作製する。
関連の特定の実施形態では、前記ゲノムＤＮＡは、血液、皮膚、毛、毛包、唾液、口腔粘膜、膣粘膜、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精子液、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー氏腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液および組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料に由来する。
種々の実施形態では、タグ付けされたゲノム配列を含むタグ付けされたゲノムライブラリーが提供され、ここで、各タグ付けされたゲノム配列は、断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡと、ランダムヌクレオチドタグ配列と、試料コード配列と、ＰＣＲプライマー配列とを含む。
種々の関連の実施形態では、タグ付けされたｃＤＮＡ配列を含むタグ付けされたｃＤＮＡライブラリーが提供され、ここで、各タグ付けされたｃＤＮＡ配列は、断片化され末端修復されたｃＤＮＡと、ランダムヌクレオチドタグ配列と、試料コード配列と、ＰＣＲプライマー配列とを含む。
種々の特定の実施形態では、標的化遺伝学的解析において使用するためのハイブリッドタグ付けされたゲノム配列を含むハイブリッドタグ付けされたゲノムライブラリーが提供され、ここで各ハイブリッドタグ付けされたゲノム配列は、断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡと、ランダムヌクレオチドタグ配列と、試料コード配列と、ＰＣＲプライマー配列と、ゲノム標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列とを含む。
種々のある特定の実施形態では、標的化遺伝学的解析において使用するためのハイブリッドタグ付けされたｃＤＮＡ配列を含むハイブリッドタグ付けされたｃＤＮＡライブラリーが提供され、ここで各ハイブリッドタグ付けされたｃＤＮＡ配列は、断片化され末端修復されたｃＤＮＡと、ランダムヌクレオチドタグ配列と、試料コード配列と、ＰＣＲプライマー配列と、ｃＤＮＡ標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列とを含む。
種々の特定の実施形態では、多機能性アダプターモジュールが提供され、この多機能性アダプターモジュールは、ランダムヌクレオチドタグ配列を含む第１の領域と、試料コード配列を含む第２の領域と、ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域とを含む。
種々の追加的な実施形態では、多機能性捕捉プローブモジュールが提供され、この多機能性捕捉プローブモジュールは、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第１の領域と、特異的ゲノム標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域と、テイル配列を含む第３の領域とを含む。
特定の実施形態では、前記第１の領域は、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。
特定の実施形態では、多機能性アダプタープローブハイブリッドモジュールが提供され、この多機能性アダプタープローブハイブリッドモジュールは、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、ＰＣＲプライマーとして機能することができる第１の領域と、特異的ゲノム標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域とを含む。
ある特定の実施形態では、前記第１の領域は、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。
一部の実施形態では、前記パートナーオリゴヌクレオチドは、化学修飾されている。
さらなる実施形態では、タグ付けされたゲノムライブラリーと、多機能性アダプターモジュールと、多機能性捕捉プローブモジュールとを含む組成物が提供される。
追加的な実施形態では、先行する実施形態のいずれかに記載のハイブリッドタグ付けされたゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを含む組成物が提供される。
種々の実施形態では、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法を実行するための反応混合物が提供される。
特定の実施形態では、タグ付けされたゲノムライブラリーを作製することができる反応混合物が提供され、この反応混合物は、断片化されたゲノムＤＮＡと、断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡを作製するためのＤＮＡ末端修復酵素とを含む。
特定の実施形態では、タグ付けされたゲノムライブラリーを作製することができる反応混合物が提供され、この反応混合物は、断片化されたｃＤＮＡと、断片化され末端修復されたｃＤＮＡを作製するためのＤＮＡ末端修復酵素とを含む。
特定の実施形態では、多機能性アダプターモジュールを含む、反応混合物が提供される。
一部の実施形態では、反応混合物は、多機能性捕捉プローブモジュールを含む。
ある特定の実施形態では、反応混合物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性およびＰＣＲ増幅活性を有する酵素を含む。
種々の実施形態では、ＤＮＡ配列解析のための方法が提供され、この方法は、各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、前記１種または複数のクローンに対してペアエンドシークエンシング反応を実行して１種または複数のシークエンシングリードを得るステップと、前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンの前記シークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップとを含む。
特定の実施形態では、ＤＮＡ配列解析のための方法が提供され、この方法は、各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、前記１種または複数のクローンに対してシークエンシング反応を実行するステップであって、約１００ヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、前記リードが、前記第１のＤＮＡ配列および前記第２のＤＮＡ配列の両方の同定に十分であるステップと、前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップとを含む。
ある特定の実施形態では、前記１種または複数のクローンの配列は、１種または複数のヒト参照ＤＮＡ配列と比較される。
追加的な実施形態では、前記１種または複数のヒト参照ＤＮＡ配列にマッチしない配列が同定される。
さらなる実施形態では、非マッチ配列が使用されて、前記非マッチ配列データからデノボアセンブリーを作成する。
一部の実施形態では、前記デノボアセンブリーが使用されて、前記捕捉プローブに関連する新規配列再編成を同定する。
種々の実施形態では、ゲノムコピー数決定解析のための方法が提供され、この方法は、各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、ランダムヌクレオチドタグ配列および標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、前記１種または複数のクローンに対してペアエンドシークエンシング反応を実行して１種または複数のシークエンシングリードを得るステップと、前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンの前記シークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップとを含む。
一部の実施形態では、ゲノムコピー数決定解析のための方法が提供され、この方法は、各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、ランダムヌクレオチドタグ配列および標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、前記１種または複数のクローンに対してシークエンシング反応を実行するステップであって、約１００ヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、前記リードが、前記第１のＤＮＡ配列および前記第２のＤＮＡ配列の両方の同定に十分であるステップと、前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップとを含む。
ある特定の実施形態では、前記ランダムヌクレオチドタグ配列は、約２～約５０ヌクレオチドの長さである。
さらなる実施形態では、本明細書中で企図される方法は、独特のシークエンシングリードおよび重複したシークエンシングリード（unique and redundant sequencing reads）の分布を決定し、独特のリードが遭遇する回数を計数し、前記独特のリードの度数分布を統計分布に適合させ、独特のリードの総数を推量し、推量された独特のリードの前記総数を、大部分のヒト遺伝子座が一般に二倍体であるという仮定に対して正規化することにより、第２のリード配列に関連するあらゆるシークエンシングリードを解析するステップを含む。
追加的な実施形態では、１種または複数の標的化遺伝子座の推量されたコピー数が決定される。
一部の実施形態では、予想されるコピー数値から逸脱する前記１種または複数の標的遺伝子座が決定される。
さらなる実施形態では、遺伝子の前記１種または複数の標的化遺伝子座は、遺伝子座のコレクションにおいて共にグループ化され、標的化遺伝子座のコレクションから得られる前記コピー数測定値は、平均化および正規化される。
追加的な実施形態では、遺伝子の前記推量されたコピー数は、この遺伝子を表す全標的遺伝子座の前記正規化された平均によって表される。
ある特定の実施形態では、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するための方法が提供され、この方法は、ｃＤＮＡライブラリーを断片化するステップと、前記断片化されたｃＤＮＡライブラリーを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたｃＤＮＡを作製するステップと、多機能性アダプター分子を前記断片化され末端修復されたｃＤＮＡにライゲーションして、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するステップとを含む。
特定の実施形態では、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するための方法が提供され、この方法は、１個または複数の細胞の全ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製するステップと、前記ｃＤＮＡライブラリーを断片化するステップと、前記断片化されたｃＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたｃＤＮＡを作製するステップと、多機能性アダプター分子を前記断片化され末端修復されたｃＤＮＡにライゲーションして、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するステップとを含む。
種々の実施形態では、前記ｃＤＮＡライブラリーは、オリゴｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーである。
特定の実施形態では、前記ｃＤＮＡライブラリーは、約６～約２０ランダムヌクレオチドを含むランダムオリゴヌクレオチドによってプライミングされる。
ある特定の実施形態では、前記ｃＤＮＡライブラリーは、ランダムヘキサマーまたはランダムオクタマーによってプライミングされる。
追加的な実施形態では、前記ｃＤＮＡライブラリーは、約２５０ｂｐ～約７５０ｂｐのサイズに断片化される。
さらなる実施形態では、前記ｃＤＮＡライブラリーは、約５００ｂｐのサイズに断片化される。
一部の実施形態では、前記多機能性アダプターモジュールは、ランダム核酸タグ配列を含む第１の領域と、必要に応じて、試料コード配列を含む第２の領域と、必要に応じて、ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域とを含む。
関連の実施形態では、前記多機能性アダプターモジュールは、ランダム核酸タグ配列を含む第１の領域と、試料コード配列を含む第２の領域と、ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域とを含む。
種々の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、タグ付けされたｃＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズさせて、複合体を形成するステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ｃＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域とハイブリダイズするステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、前記タグ付けされたｃＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップを含む。
特定の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、前記単離されたタグ付けされたｃＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングして、一本鎖３’末端を除去するステップを含む。
一部の実施形態では、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングにおいて使用される酵素は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである。
ある特定の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ｃＤＮＡ標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップを含む。
さらなる実施形態では、標的化遺伝子発現解析のための方法が提供され、この方法は、
（ａ）タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝子発現解析を実行するステップと
を含む。
追加的な実施形態では、標的化遺伝子発現解析のための方法が提供され、この方法は、（ａ）タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ＲＮＡ発現ライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体における前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記捕捉されたタグ付けされた標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記標的領域とハイブリダイズする位置の３’方向に位置する前記タグ付けされた標的領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む。
種々の実施形態では、標的化遺伝子発現解析のための方法が提供され、この方法は、（ａ）タグ付けされたｃＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ｃＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたｃＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体における前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記ｃＤＮＡライブラリーにおける前記捕捉されたタグ付けされた標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記標的領域とハイブリダイズする位置の３’方向に位置する前記ｃＤＮＡライブラリーにおける前記タグ付けされた標的領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む。
特定の実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記標的領域の上流とハイブリダイズする。
追加的な実施形態では、ｃＤＮＡ配列解析のための方法が提供され、この方法は、（ａ）各クローンが第１のｃＤＮＡ配列および第２のｃＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のｃＤＮＡ配列が、標的化ゲノムｃＤＮＡ配列を含み、前記第２のｃＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してペアエンドシークエンシング反応を実行して１種または複数のシークエンシングリードを得るステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンの前記シークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む。
種々の実施形態では、ｃＤＮＡ配列解析のための方法が提供され、この方法は、（ａ）各クローンが第１のｃＤＮＡ配列および第２のｃＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のｃＤＮＡ配列が、標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のｃＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してシークエンシング反応を実行するステップであって、約１００ヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、前記リードが、前記第１のｃＤＮＡ配列および前記第２のｃＤＮＡ配列の両方の同定に十分であるステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む。
特定の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、独特のシークエンシングリードおよび重複したシークエンシングリードの分布を決定し、独特のリードが遭遇する回数を計数し、前記独特のリードの度数分布を統計分布に適合させ、独特のリードの総数を推量し、各ｃＤＮＡライブラリー試料内で収集される前記総リードに対する正規化を使用して、独特のリード計数を転写物存在量に変換することにより、第２のリード配列に関連するあらゆるシークエンシングリードを解析するステップを含む。
ある特定の実施形態では、標的化遺伝学的解析のための方法が提供され、この方法は、（ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性、５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖を含む、ｂ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体の協奏的酵素プロセシングを実行して、前記多機能性捕捉プローブ結合部位の５’にある前記標的領域に前記多機能性捕捉プローブの相補体を連結するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールの相補体と、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記ゲノム標的領域とハイブリダイズする位置の５’に位置する前記タグ付けされた標的領域の一領域を含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む。
種々の実施形態では、ステップａ）～ｃ）は、少なくとも約２回反復され、ｄ）の前記標的化遺伝学的解析は、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントを含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
特定の実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記標的領域の上流とハイブリダイズする。
追加的な実施形態では、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性、５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖を含む、ｂ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体の協奏的酵素プロセシングを実行して、前記多機能性捕捉プローブ結合部位の５’にある前記標的領域に前記多機能性捕捉プローブの相補体を連結するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールの相補体と、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記標的領域とハイブリダイズする位置の５’に位置する前記タグ付けされた標的領域の一領域を含むステップと、
（ｄ）ｃ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、前記定量化が、前記特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップと
を含む。
種々の実施形態では、本明細書中で企図される方法は、ステップｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップを含む。
特定の実施形態では、ステップａ）～ｄ）は、少なくとも約２回反復され、少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列アラインメントが行われる。
特定の実施形態では、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールは、少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする。
追加的な実施形態では、前記標的化遺伝学的解析は、配列解析である。
さらなる実施形態では、前記標的領域は、ゲノム標的領域であり、前記ＤＮＡライブラリーは、ゲノムＤＮＡライブラリーである。
一部の実施形態では、前記標的領域は、ｃＤＮＡ標的領域であり、前記ＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
タグ付けされたゲノムライブラリーを作製するための方法であって、
（ａ）断片化されたゲノムＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡを作製するステップと、
（ｂ）ランダム核酸タグ配列ならびに必要に応じて試料コード配列および／またはＰＣＲプライマー配列を、前記断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡにライゲーションして、前記タグ付けされたゲノムライブラリーを作製するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ランダム核酸タグ配列が、約２～約１００ヌクレオチドである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目３）
前記ランダム核酸タグ配列が、約２～約６ヌクレオチドである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡが、平滑末端を含有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記平滑末端が、単一塩基対オーバーハングを含有するようさらに修飾される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ライゲーションステップが、多機能性アダプターモジュールを前記断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡにライゲーションして、前記タグ付けされたゲノムライブラリーを作製することを含み、前記多機能性アダプター分子が、
（ｉ）ランダム核酸タグ配列を含む第１の領域と、
（ｉｉ）試料コード配列を含む第２の領域と、
（ｉｉｉ）ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域と
を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズさせて、複合体を形成するステップをさらに含み、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域とハイブリダイズする、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングして、一本鎖３’末端を除去するステップをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングにおいて使用される酵素が、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
先行する項目から得られる前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップをさらに含み、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む、標的化遺伝学的解析のための方法。
（項目１３）
ステップａ）～ｄ）が、少なくとも約２回反復され、ｅ）の前記標的化遺伝学的解析が、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られるハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法であって、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュール複合体が、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｆ）ｅ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、前記定量化が、前記特異的ゲノム標的領域のコピー数の決定を可能にするステップと
を含む方法。
（項目１７）
ステップｅ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ステップａ）～ｅ）が、少なくとも約２回反復され、前記少なくとも２回のｅ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列を使用して、配列アラインメントが実行される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法であって、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュール複合体が、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
を含む方法。
（項目２２）
ステップｅ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ステップａ）～ｅ）が、少なくとも約２回反復され、前記少なくとも２回のｅ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列を使用して、配列アラインメントが実行される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法であって、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュール複合体が、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｆ）ｅ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む方法。
（項目２７）
ステップａ）～ｅ）が、少なくとも約２回反復され、ｆ）の前記標的化遺伝学的解析が、前記少なくとも２回のｅ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントの実行を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体に対して前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記捕捉されたタグ付けされたゲノム標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記ゲノム標的領域とハイブリダイズする位置から３’方向に位置する前記タグ付けされたゲノム標的領域の一領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む、標的化遺伝学的解析のための方法。
（項目３１）
ステップａ）～ｃ）が、少なくとも約２回反復され、ｄ）の前記標的化遺伝学的解析が、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
特異的ゲノム標的領域のコピー数を決定するための方法であって、
（ａ）タグ付けされたゲノムライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたゲノムライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体に対して前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記捕捉されたタグ付けされたゲノム標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記ゲノム標的領域とハイブリダイズする位置から３’方向に位置する前記タグ付けされたゲノム標的領域の一領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、前記定量化が、前記特異的ゲノム標的領域のコピー数の決定を可能にするステップと
を含む方法。
（項目３５）
ステップｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ステップａ）～ｄ）が、少なくとも約２回反復され、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列アラインメントが行われる、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記標的化遺伝学的解析が、配列解析である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
前記タグ付けされたゲノムライブラリーがＰＣＲにより増幅されて、増幅されたタグ付けされたゲノムライブラリーを作製する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
前記ゲノムＤＮＡが、血液、皮膚、毛、毛包、唾液、口腔粘膜、膣粘膜、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精子液、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー氏腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液および組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料に由来する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
タグ付けされたゲノム配列を含むタグ付けされたゲノムライブラリーであって、各タグ付けされたゲノム配列が、
（ａ）断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡと、
（ｂ）ランダムヌクレオチドタグ配列と、
（ｃ）試料コード配列と、
（ｄ）ＰＣＲプライマー配列と
を含む、ゲノムライブラリー。
（項目４３）
標的化遺伝学的解析において使用するためのハイブリッドタグ付けされたゲノム配列を含むハイブリッドタグ付けされたゲノムライブラリーであって、各ハイブリッドタグ付けされたゲノム配列が、
（ａ）断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡと、
（ｂ）ランダムヌクレオチドタグ配列と、
（ｃ）試料コード配列と、
（ｄ）ＰＣＲプライマー配列と、
（ｅ）ゲノム標的領域と、
（ｆ）多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列と
を含む、ゲノムライブラリー。
（項目４４）
（ａ）ランダムヌクレオチドタグ配列を含む第１の領域と、
（ｂ）試料コード配列を含む第２の領域と、
（ｃ）ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域と
を含む多機能性アダプターモジュール。
（項目４５）
（ａ）パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第１の領域と、
（ｂ）特異的ゲノム標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域と、
（ｃ）テイル配列を含む第３の領域と
を含む多機能性捕捉プローブモジュール。
（項目４６）
前記第１の領域が、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している、先行する項目のいずれかに記載の多機能性捕捉プローブモジュール。
（項目４７）
（ａ）パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、ＰＣＲプライマーとして機能することができる第１の領域と、
（ｂ）特異的ゲノム標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域と
を含む多機能性アダプタープローブハイブリッドモジュール。
（項目４８）
前記第１の領域が、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している、先行する項目のいずれかに記載の多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール。
（項目４９）
前記パートナーオリゴヌクレオチドが、化学修飾されている、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
タグ付けされたゲノムライブラリーと、多機能性アダプターモジュールと、多機能性捕捉プローブモジュールとを含む組成物。
（項目５１）
先行する項目のいずれかに記載のハイブリッドタグ付けされたゲノムライブラリーを含む組成物。
（項目５２）
先行する項目のいずれか一項に記載の方法を実行するための反応混合物。
（項目５３）
タグ付けされたゲノムライブラリーを作製することができる反応混合物であって、
（ａ）断片化されたゲノムＤＮＡと、
（ｂ）断片化され末端修復されたゲノムＤＮＡを作製するためのＤＮＡ末端修復酵素とを含む反応混合物。
（項目５４）
多機能性アダプターモジュールをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の反応混合物。
（項目５５）
多機能性捕捉プローブモジュールをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の反応混合物。
（項目５６）
３’－５’エキソヌクレアーゼ活性およびＰＣＲ増幅活性を有する酵素をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の反応混合物。
（項目５７）
（ａ）各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してペアエンドシークエンシング反応を実行して１種または複数のシークエンシングリードを得るステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンの前記シークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む、ＤＮＡ配列解析のための方法。
（項目５８）
（ａ）各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してシークエンシング反応を実行するステップであって、約１００ヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、前記リードが、前記第１のＤＮＡ配列および前記第２のＤＮＡ配列の両方の同定に十分であるステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む、ＤＮＡ配列解析のための方法。
（項目５９）
前記１種または複数のクローンの配列が、１種または複数のヒト参照ＤＮＡ配列と比較される、項目５７または項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記１種または複数のヒト参照ＤＮＡ配列にマッチしない配列が同定される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
非マッチ配列が使用されて、前記非マッチ配列データからデノボアセンブリーを作成する、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記デノボアセンブリーが使用されて、前記捕捉プローブに関連する新規配列再編成を同定する、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
（ａ）各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、ランダムヌクレオチドタグ配列および標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してペアエンドシークエンシング反応を実行して１種または複数のシークエンシングリードを得るステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンの前記シークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む、ゲノムコピー数決定解析のための方法。
（項目６４）
（ａ）各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のＤＮＡ配列が、ランダムヌクレオチドタグ配列および標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してシークエンシング反応を実行するステップであって、約１００ヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、前記リードが、前記第１のＤＮＡ配列および前記第２のＤＮＡ配列の両方の同定に十分であるステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む、ゲノムコピー数決定解析のための方法。
（項目６５）
前記ランダムヌクレオチドタグ配列が、約２～約５０ヌクレオチドの長さである、項目６３または項目６４に記載の方法。
（項目６６）
（ａ）独特のシークエンシングリードおよび重複したシークエンシングリードの分布を決定し、
（ｂ）独特のリードが遭遇する回数を計数し、
（ｃ）前記独特のリードの度数分布を統計分布に適合させ、
（ｄ）独特のリードの総数を推量し、
（ｅ）推量された独特のリードの前記総数を、大部分のヒト遺伝子座が一般に二倍体であるという仮定に対して正規化すること
により、第２のリード配列に関連するあらゆるシークエンシングリードを解析するステップをさらに含む、項目６３または項目６４に記載の方法。
（項目６７）
１種または複数の標的化遺伝子座の推量されたコピー数が決定される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
予想されるコピー数値から逸脱する前記１種または複数の標的遺伝子座が決定される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
遺伝子の前記１種または複数の標的化遺伝子座が、遺伝子座のコレクションにおいて共にグループ化され、標的化遺伝子座のコレクションから得られる前記コピー数測定値が、平均化および正規化される、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
遺伝子の前記推量されたコピー数が、この遺伝子を表す全標的遺伝子座の前記正規化された平均によって表される、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するための方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーを断片化するステップと、
（ｂ）前記断片化されたｃＤＮＡライブラリーを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたｃＤＮＡを作製するステップと、
（ｃ）多機能性アダプター分子を前記断片化され末端修復されたｃＤＮＡにライゲーションして、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するステップと
を含む方法。
（項目７２）
タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するための方法であって、
（ａ）１個または複数の細胞の全ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製するステップと、
（ｂ）前記ｃＤＮＡライブラリーを断片化するステップと、
（ｃ）前記断片化されたｃＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたｃＤＮＡを作製するステップと、
（ｄ）多機能性アダプター分子を前記断片化され末端修復されたｃＤＮＡにライゲーションして、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するステップと
を含む方法。
（項目７３）
前記ｃＤＮＡライブラリーが、オリゴｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーである、項目７１または項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記ｃＤＮＡライブラリーが、約６～約２０ランダムヌクレオチドを含むランダムオリゴヌクレオチドによってプライミングされる、項目７１または項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記ｃＤＮＡライブラリーが、ランダムヘキサマーまたはランダムオクタマーによってプライミングされる、項目７１または項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記ｃＤＮＡライブラリーが、約２５０ｂｐ～約７５０ｂｐのサイズに断片化される、項目７１または項目７２に記載の方法。
（項目７７）
前記ｃＤＮＡライブラリーが、約５００ｂｐのサイズに断片化される、項目７１または項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記多機能性アダプターモジュールが、
（ｉ）ランダム核酸タグ配列を含む第１の領域と、必要に応じて、
（ｉｉ）試料コード配列を含む第２の領域と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域と
を含む、項目７１～７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記多機能性アダプターモジュールが、ランダム核酸タグ配列を含む第１の領域と、試料コード配列を含む第２の領域と、ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域とを含む、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
タグ付けされたｃＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズさせて、複合体を形成するステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ｃＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域とハイブリダイズするステップをさらに含む、項目７１～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記タグ付けされたｃＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップをさらに含む、項目７１～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記単離されたタグ付けされたｃＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングして、一本鎖３’末端を除去するステップをさらに含む、項目７１～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングにおいて使用される酵素が、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼである、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ｃＤＮＡ標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップをさらに含む、項目８２または項目８３に記載の方法。
（項目８５）
（ａ）タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる前記単離されたタグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、前記多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記標的領域と、前記多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、
（ｅ）ｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝子発現解析を実行するステップと
を含む、標的化遺伝子発現解析のための方法。
（項目８６）
（ａ）タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ＲＮＡ発現ライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体における前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記捕捉されたタグ付けされた標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記標的領域とハイブリダイズする位置の３’方向に位置する前記タグ付けされた標的領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む、標的化遺伝子発現解析のための方法。
（項目８７）
（ａ）タグ付けされたｃＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ｃＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたｃＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、ｂ）から得られる前記複合体における前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行して、前記多機能性捕捉プローブの３’にある前記ｃＤＮＡライブラリーにおける前記捕捉されたタグ付けされた標的領域の一領域を複製するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記標的領域とハイブリダイズする位置の３’方向に位置する前記ｃＤＮＡライブラリーにおける前記タグ付けされた標的領域の相補体とを含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む、標的化遺伝子発現解析のための方法。
（項目８８）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目８５～８７のいずれか一項に記載の方法。（項目８９）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記標的領域の上流とハイブリダイズする、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
（ａ）各クローンが第１のｃＤＮＡ配列および第２のｃＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のｃＤＮＡ配列が、標的化ゲノムｃＤＮＡ配列を含み、前記第２のｃＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してペアエンドシークエンシング反応を実行して１種または複数のシークエンシングリードを得るステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンの前記シークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む、ｃＤＮＡ配列解析のための方法。
（項目９１）
（ａ）各クローンが第１のｃＤＮＡ配列および第２のｃＤＮＡ配列を含む１種または複数のクローンを得るステップであって、前記第１のｃＤＮＡ配列が、標的化ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記第２のｃＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、
（ｂ）前記１種または複数のクローンに対してシークエンシング反応を実行するステップであって、約１００ヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、前記リードが、前記第１のｃＤＮＡ配列および前記第２のｃＤＮＡ配列の両方の同定に十分であるステップと、
（ｃ）前記シークエンシングリードの前記プローブ配列に従って、前記１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップと
を含む、ｃＤＮＡ配列解析のための方法。
（項目９２）
（ａ）独特のシークエンシングリードおよび重複したシークエンシングリードの分布を決定し、
（ｂ）独特のリードが遭遇する回数を計数し、
（ｃ）前記独特のリードの度数分布を統計分布に適合させ、
（ｄ）独特のリードの総数を推量し、
（ｅ）各ｃＤＮＡライブラリー試料内で収集される前記総リードに対する正規化を使用して、独特のリード計数を転写物存在量に変換すること
により、第２のリード配列に関連するあらゆるシークエンシングリードを解析するステップをさらに含む、項目９０または項目９１に記載の方法。
（項目９３）
（ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性、５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖を含む、ｂ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体の協奏的酵素プロセシングを実行して、前記多機能性捕捉プローブ結合部位の５’にある前記標的領域に前記多機能性捕捉プローブの相補体を連結するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールの相補体と、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記ゲノム標的領域とハイブリダイズする位置の５’に位置する前記タグ付けされた標的領域の一領域を含むステップと、
（ｄ）ｃ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップと
を含む、標的化遺伝学的解析のための方法。
（項目９４）
ステップａ）～ｃ）が、少なくとも約２回反復され、ｄ）の前記標的化遺伝学的解析が、前記少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子配列の配列アラインメントを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、前記少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記標的領域の上流とハイブリダイズする、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
特異的標的領域のコピー数を決定するための方法であって、
（ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、前記ゲノムライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ａ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、
（ｃ）ハイブリッド核酸分子を作製するために、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性、５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖を含む、ｂ）から得られる前記タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体の協奏的酵素プロセシングを実行して、前記多機能性捕捉プローブ結合部位の５’にある前記標的領域に前記多機能性捕捉プローブの相補体を連結するステップであって、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールの相補体と、前記多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが前記標的領域とハイブリダイズする位置の５’に位置する前記タグ付けされた標的領域の一領域を含むステップと、
（ｄ）ｃ）における前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、前記定量化が、前記特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップと
を含む方法。
（項目９８）
ステップｄ）から得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列を得るステップをさらに含む、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
ステップａ）～ｄ）が、少なくとも約２回反復され、少なくとも２回のｄ）ステップから得られる前記ハイブリッド核酸分子の配列アラインメントが行われる、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが、少なくとも２回のａ）ステップにおいて使用され、前記少なくとも２回のａ）ステップが、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の下流とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが、前記ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズする、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記標的化遺伝学的解析が、配列解析である、項目９３～１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記標的領域が、ゲノム標的領域であり、前記ＤＮＡライブラリーが、ゲノムＤＮＡライブラリーである、項目９３～１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記標的領域が、ｃＤＮＡ標的領域であり、前記ＤＮＡライブラリーが、ｃＤＮＡライブラリーである、項目９３～１０３のいずれか一項に記載の方法。
増幅可能で、試料コード処理され、タグ付けされた、ゲノムＤＮＡライブラリーの構築。精製ゲノムＤＮＡは、全血液または口腔内頬スワブなどの供給源から単離した。ＤＮＡを断片化（例えば、機械的手段、酵素的手段、または化学的手段により）し、ＤＮＡの末端を、この例では、平滑末端に修復した。修復されたＤＮＡを、ユニバーサル増幅配列、ランダムヌクレオチドタグ配列、および試料コード配列を含有する、多機能性アダプターモジュールにライゲーションした。例を目的として、典型的なアダプター二重鎖分子の具体例を示す。 ゲノム捕捉プローブのデザイン。（Ａ）原型的な１１４ヌクレオチドのプローブの構造。領域１は、高度に修飾された、３４ヌクレオチドのパートナーオリゴヌクレオチドとの完全な相補性を共有する、３４ヌクレオチドの配列である。パートナーオリゴヌクレオチドを、その５’端において、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ上の捕捉を可能とする、ビオチン－ＴＥＧ化学実体で修飾した。Ｂは、「Ｂｉｏ－ＴＥＧ」修飾を表す。領域２は、ゲノムＤＮＡ標的と相互作用するようにデザインされた、６０ヌクレオチドのプローブ領域である。領域３は、ＰＣＲ増幅配列を、捕捉されたゲノム断片に導入する、２０ヌクレオチドのテイルである。（Ｂ）各個別のプローブの領域１と相補的な、高度に修飾されたパートナー鎖の例。 従来の、ハイブリダイゼーションベースの捕捉実験における、配列の「スプレッディング」。（Ａ）フランキング断片は、プローブ断片－フランキング断片間相互作用を伴う、正規のハイブリダイゼーション三重鎖を介して、捕捉ライブラリーに「ヒッチハイク」しうる。（Ｂ）交差断片ハイブリダイゼーションの正味の結果は、標的領域（破線）の近傍内にあるが、所望の標的の境界から外れる配列を意味する、配列の「スプレッディング」である。 断片：プローブハイブリダイズ複合体の酵素プロセシング。（Ａ）プロセシング前の、断片（明るいグレー）とプローブ（黒色）との精製複合体。Ｂ：ビオチンアフィニティー修飾である。（Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）は、捕捉された断片の３’セグメントを除去する、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をコードした。（Ｃ）プローブ：断片二重鎖領域に遭遇すると、ポリメラーゼは、プローブのテイルセグメントを、ハイブリダイズしたゲノム断片にコピーする。（Ｄ）多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールのテイルセグメントが、標的ゲノム断片にコピーされた、最終的な修飾断片。 捕捉複合体の酵素プロセシングは、標的領域上のシークエンシングリードに「フォーカス」する。（Ａ）捕捉プローブとの関連で示される、酵素プロセシングされた断片。シークエンシングリードの配向性は、プローブにより指定され、薄い黒色の矢印により描示される。（Ｂ）「スプレッディング」を最小化した、フォーカスされたリードの仮説的トレース。 有向プローブの「フォーカシング効果」。（Ａ）典型的なエキソンの平均長は、１００～１５０ｂｐである。有向捕捉プローブは、標的セグメントを挟むイントロン領域内に配置される。（Ｂ）各個別のプローブ配列のリード分布を破線で示す。相加的なカバレージを実線で示す。この例において示される通り、カバレージの有向的性格を使用して、クエリー領域に対する鋭利なフォーカスを得ることができる。 アダプター二量体非含有断片ライブラリーが、「チューニング可能なオン／オフ」増幅特性を伴うことの実証。全く同じゲル画像を、４つの異なる色スキームおよびコントラストスキームで示す。試料は、（１）ＡＣＡ２ ２０により増幅される、インサートを伴わない、アダプターだけのライゲーション；（２）ＡＣＡ２（通常の２５ヌクレオチドのＰＣＲプライマー）により増幅される、インサートを伴わない、アダプターだけのライゲーション；（３）ＡＣＡ２ ＦＬＦＰ（全長フォワードプライマー：ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）により増幅される、インサートを伴わない、アダプターだけのライゲーション；（４）ＡＣＡ２ ２０により増幅される、約２００ｂｐのｈｇＤＮＡインサート＋アダプターによるライゲーションミックス２０ｎｇ；（５）ＡＣＡ２（通常の２５ヌクレオチドのＰＣＲプライマー）により増幅される、約２００ｂｐのｈｇＤＮＡインサート＋アダプターによるライゲーションミックス２０ｎｇ；および（６）ＡＣＡ２ ＦＬＦＰ（全長フォワードプライマー）により増幅される、約２００ｂｐのｈｇＤＮＡインサート＋アダプターによるライゲーションミックス２０ｎｇであった。アダプター単独のライゲーション→ＰＣＲ産物では、増幅された材料は、目視可能ではなかった（レーン１～３）。短鎖の２０ヌクレオチドのＡＣＡ２プライマーは、「通常の」２５ヌクレオチドのＡＣＡ２プライマー（レーン５）と比べて非効率的な増幅（レーン４）を示した。５８ヌクレオチドのＡＣＡ２ ＦＬＦＰプライマー（レーン６）では、材料のごくかすかな痕跡が目視可能であるに過ぎなかった。 ＣｏｖａｒｉｓによるｇＤＮＡの断片化の後における、平均断片サイズの均等な分布。男性（Ｍ）および女性（Ｆ）ヒトｇＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡから受領した）を、Ｃｏｖａｒｉｓ条件によりシアリングし、２μｌ（約１２０ｎｇ）または５μｌ（約３００ｎｇ）の断片化前（Ｕ）試料または断片化後（Ｃ）試料を、２％のアガロースゲル上にロードした。平均断片サイズは、２００ｂｐ近傍を中心とする均等分布であった。 男性試料と女性試料との間の予測コピー数の差違を実証する、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１：ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）ｑＰＣＲアッセイ６についての増幅トレース。男性ゲノムＤＮＡ鋳型または女性ゲノムＤＮＡ鋳型を、ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイ６を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｅｃｏ測定器上のリアルタイムＰＣＲにより３連で増幅した。増幅トレースは、女性試料と男性試料との間のコピー数の差違を明確に実証した。 ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイプライマーによる従来のＰＣＲの後において予測される、アンプリコンのサイズおよび独特のものであること（uniqueness）の実証。男性ゲノムＤＮＡ鋳型または女性ゲノムＤＮＡ鋳型を、ｑＰＣＲアッセイプライマーセット１～８を使用する従来のＰＣＲにより増幅し（実施例３）、精製されていないＰＣＲ反応物を、２％のアガロースゲル上に直接ロードした。各二重項の上側バンドは、アッセイＰＣＲ産物の推定移動度と符合した。下側の「ファジー」材料は、使用されないＰＣＲプライマーであった可能性が高い。 ２倍濃度のＡＢＩ ＳＹＢＲミックスおよび複数の条件を使用する、ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイの性能についての解析。ゲノムライブラリーＩ（実施例４で構築される）から得られるＤＮＡ断片を、鋳型として使用して、２倍濃度のＡＢＩ ＳＹＢＲマスターミックスを２ステップのＰＣＲ反応で使用して、室温で準備された場合のＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイの性能を測定した。非鋳型対照トレース（Ａ）および＋ｇＤＮＡトレース（Ｂ）は、アッセイの性能についての定性的描像を提示することが示される。 Ｔ４－ＤＮＡポリメラーゼによる捕捉後プロセシングの後におけるインサートサイズの低減。アダプターをライゲーションされた、ゲノムライブラリーＩ（実施例４で構築される）から得られるｇＤＮＡ断片の試料４例を、記載される通りに（実施例６：ＰＬＰ１エキソン２）捕捉した。これらの試料のうちの２例では、ユニバーサル結合性オリゴＣ１を活用したが、他の２例の試料は、オリゴＣ１０と結合させた。次いで、試料を、Ｔ４－ＤＮＡポリメラーゼで処理する（Ｔ４プロセシング）か、またはＴ４ポリメラーゼを欠く反応溶液中で同様に加工した（非処理）。Ｔ４ポリメラーゼによる捕捉後プロセシングは、試料のサイズ分布の全体的な低減を誘導したことから、インサートの平均サイズの低減が示唆される。加えて、Ｔ４プロセシングは、２つの弱いバンド（約２５０ｂｐおよび約１７５ｂｐ）の出現を結果としてもたらした。 捕捉後プロセシング感度の直接的な測定。まず、ＰＬＰ１エキソン２特異的ゲノムＤＮＡ断片を、単一のＰＬＰ１捕捉プローブを独立の反応で使用する女性ｇＤＮＡライブラリー（実施例１）からのプルダウン／プルアウトにより単離した。捕捉された材料は、（Ａ）で例示される通り、隣接するＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイプライマー対を使用して定量化した。酵素プロセシングの後、プロセシングされた複合体の量を、（Ｂ）で示される通り、１種のＰＬＰ１特異的プライマーおよび１種のプローブ特異的プライマーを使用するｑＰＣＲにより再度測定した。［Ｂ／Ａ×１００％］における測定値の比により、プロセシング効率の推定値がもたらされるであろう。リアルタイム反応から得られるＰＣＲ産物を抽出し、ゲル解析にかけて、予測される長さのアンプリコンが作製されたことを検証した（Ｃ）。これは、いずれのＰＣＲ反応も個別の開始点および停止点を有したので可能であった。プロセシング効率は、Ａ＋Ｂ＋Ｃから解釈可能なデータをもたらすプルアウトから推量した。 プロセシング前およびプロセシング後における、ＰＬＰ１エキソン２で捕捉されたＤＮＡ断片の、リアルタイムの定量化から得られるｑＰＣＲ産物についてのゲル解析。６種の独立の捕捉反応物（プローブ１による２種の反応物、プローブ４による２種の反応物、プローブ２による１種の反応物、およびプローブ３による１種の反応物）を、図１６において記載される通りにプロセシングした。プローブは、Ｂ１０ユニバーサルオリゴセット（実施例４）に由来し、ユニバーサルオリゴおよびＵｌｔｒａｍｅｒプローブを含んだ。これらの条件下で、アッセイセット３（プローブ４）、５（プローブ２）、および６（プローブ３）は、アッセイのアンプリコン（上のゲル）またはアダプターアンプリコンに照らしたプロセシング後におけるＰＬＰ１（下のゲル）と符合するＰＣＲ産物をもたらしたが、他のアッセイセットでは、検出可能な産物が観察されなかった。 代替的な断片：プローブハイブリダイズ複合体の酵素プロセシング。図４で概括した方法とは対照的に、この代替法は、クローンにプローブをコピーさせる手法から、プローブにクローンをコピーさせる手法にシフトした。この極性の逆転は、プローブの５’端を、プルダウン配列およびリバースＰＣＲ配列のいずれとしても使用したことを意味する。プローブの３’端は、非修飾のまま放置し、これにより、ＤＮＡポリメラーゼを使用してクローンをコピーすることが可能となり、タグ付けされた単離ＤＮＡライブラリー断片を鋳型として活用して、５’－３’ＤＮＡポリメラーゼにより、多機能性捕捉プローブを伸長させた。 代替的な酵素プロセシングの概念について調べるために援用された実験デザイン。挙動が良好な４種のｑＰＣＲアッセイ（１０、１４、１５、および１６）は、これらのアッセイを「指さす」プローブとマッチした。プローブの標的配列と、ｑＰＣＲアッセイとは、互いの近傍内にある領域を指向したが、重複しなかったことは重要である。したがって、これらの十分に確立されたアッセイセットを使用すれば、プロセシングの効果を直接調べることができよう。 代替的プロセシング法により誘導される、ライブラリーの平均インサートサイズの減殺。ＤＮＡ断片を、捕捉プローブ／Ｕｌｔｒａｍｅｒとハイブリダイズさせ、前出で記載した（図１２）通りに、ストレプトアビジンビーズ上で捕捉した。捕捉後プロセシングは、図１７において記載した代替法およびを使用して実行し、投入試料ならびにプロセシング前における試料およびプロセシング後における試料を、２％のアガロースゲル電気泳動により解析した。予測される通り、プロセシング試料中で、ライブラリーの平均インサートサイズは減殺され、これにより、プロセシングが働くという結論が裏付けられた。また、ライブラリーの、プロセシング試料の下方の見かけのバンドへの分解も観察されたことから、プローブのある程度のプライミングオフが生じたことが指し示される。 代替的プロセシング法による標的配列のフォーカシングの増強。実施例１３において得られた配列リードを、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒに表示して、特異的標的部位内で捕捉された断片のカバレージおよび分布を評価した。一方はＰＬＰ１遺伝子のエキソンに対応し（ＡおよびＢ）、他方はＺＮＦ６３０遺伝子のイントロンセグメントに対応する（ＣおよびＤ）、Ｘ染色体上の２つの標的領域のための、「捕捉だけ」のライブラリーおよび「プロセシング」ライブラリーに対応する配列リードの密度（黒色）を示す。代替的プロセシング法により作製されたライブラリー（ＢおよびＤ）から得られるリードは、捕捉単独により構築されるライブラリー（ＡおよびＣ）より、標的部位内で高度に濃縮される。捕捉プローブ結合性部位を赤色で示す。各トラックは、ゲノム座標（ｘ軸）の所与の連なりについて観察される、最大リード密度値（ｙ軸）に照らしてスケーリングする。 バーティカルアラインメントについての概略図。全ての次世代配列（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）解析は、参照ゲノムに照らしたアラインメントから始まる。（Ａ）初期リードアラインメントは、一塩基変異体（ＳＮＶ：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔ）に対応し、限定された程度で、挿入／欠失にも対応しうる、コンフィギュラブルワードストリング検索に基づく。（Ｂ）整列されたリードの集合セットを、ＳＮＶについて解析する。示される例では、候補ＳＮＶを２回にわたり観察したが、これらの２つのリードのためのリード座標は同一であった。バーティカルアラインメントパラダイムは、直交的な検証を必要とする、多数のＳＮＶ仮説および／または挿入／欠失仮説をもたらす。 データ解析スキームの概略図。ステップ１は、リードをプローブとマッチさせることである。ステップ２は、各プローブに「ホリゾンタルに」接続された配列情報を解析することとなろう。 リードの、プローブ１およびプローブ２との会合を「強いる」ホリゾンタルアラインメントについての概略図。アセンブリーは、１つは野生型のエキソン構造を伴い、１つは挿入構造を伴う、２種のコンティグをもたらすであろう。２つの重要な原理が立ち現れる：１）隣接するプローブから得られる重複リードは、捕捉されたエキソンのインデル含有対立遺伝子についての仮説に対する実証または反証となり、２）捕捉プローブの外側のマイクロＣＮＶ対立遺伝子は、ホリゾンタル法により容易に検出可能である。 「信頼性の低い」ＳＮＶ判定についての概略図。候補ヌクレオチド変異体は、試料を回収およびプロセシングされる個体において保有される実際のイベントでありうるが、また、試料のプロセシングおよびシークエンシングにおいて導入されるアーチファクトでもありうる。本明細書で記載される方法は、実際の「信頼性の高い」変異体判定と、アーチファクト的な「信頼性の低い」変異体判定とを差別化するようにデザインした。標的領域をカバーするシークエンシングリードを、複数の異なるクローンから、可能なシークエンシング配向性の両方において回収し、各リードをタグ情報で注釈する。タグは、同じクローニングイベントから得られるリードの同定および群分けを可能とする。全てが同じクローニングイベントから得られるクローンのうちの１種のセット内だけで発生するＳＮＶおよびインデルは、さらなる解析から棄却される信頼性の低い判定である。 「信頼性の高い」ＳＮＶ判定についての概略図。候補ヌクレオチド変異体は、試料を回収およびプロセシングされる個体において保有される実際のイベントでありうるが、また、試料のプロセシングおよびシークエンシングにおいて導入されるアーチファクトでもありうる。本明細書で記載される方法は、実際の「信頼性の高い」変異体判定と、アーチファクト的な「信頼性の低い」変異体判定とを差別化するようにデザインした。標的領域をカバーするシークエンシングリードを、複数の異なるクローンから、可能なシークエンシング配向性の両方において回収し、各リードをタグ情報で注釈する。タグは、異なるクローニングイベントから得られるリードの同定を可能とする。示される例は、（Ａ）開始点は同じであるが、配列標識が異なるリード、（Ｂ）異なる開始点および異なる標識を有する、配向性が同じリード、ならびに（Ｃ）配向性が逆向きのリードである。これらの全ての場合では、独立のクローニングイベントにおける変異体の発生および検出により、その変異体を高い信頼性でマークし、このような変異体を、さらなる直交的な検証法で追跡する。 分子注釈されたシークエンシングリード。（Ａ）フォワードフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａによる化学反応）のグラフト配列およびシークエンシングプライマー結合性部位。（Ｂ）リバースフローセルのグラフト配列およびリバースシークエンシングプライマーのアニーリング部位。（１）配列標識。（２）試料標識。（３）フォワードリード開始部位。（４）ゲノム断片の配列。（５）ゲノムインデックス（プローブ配列）。（１）＋（３）の組合せは、変異体の判定およびコピー数の決定のいずれにもきわめて重要な独特のリードタグを構成する。 ＤＮＡ配列変異体（挿入、欠失、点突然変異、および／または転座の発生）のうちの最も重要なクラスはまた、アラインメントベースの方法で検出するのが最も困難でもある。 二重プローブによる標的領域（例えば、エキソン）の精査。（Ａ）典型的なエキソンの平均長は、１００～１５０ｂｐである。捕捉プローブは、標的セグメントを挟むイントロン領域内に配置される。これらのプローブは、配列極性が逆である（一方は「＋」鎖をクエリーし、他方は「－」鎖クエリーする）。（Ｂ）各個別のプローブ配列のリード分布は、影を付したエリアで指し示し、リードの配向性は、矢印で指定する。鍵となる側面は、標的領域を、いずれの配向性にもある、複数のリードでシークエンシングすることである。さらに、各プローブは、隣接するプローブ結合性部位をシークエンシングするリードも捕捉する。この配置は、変異体判定の信頼性を増大させる１つの要素である。 変異体の判定における配列タグの役割。配列「タグ」は、ヌクレオチドコード（卵型；Ｃｌｅａｒｆｏｒｋによる場合、３つのヌクレオチドによる１６の可能な配列のコレクション）および任意のクローン断片の粘着末端配列を含む。（Ａ）偽陽性の変異体判定とは、全てが同一な配列タグを保有する同種配列のコレクションの中で変異体が同定される判定である。（Ｂ）信頼性の高い変異体判定は、異なる配列タグを有する配列のコレクションの中で見出される。 リード観察統計を使用するコピーの決定。 分子注釈されたシークエンシングリード。（Ａ）フォワードフローセル（ＩｌｌｕｍｉｎａによるＳＢＳ化学反応）のグラフト配列およびシークエンシングプライマー結合性部位。（Ｂ）リバースフローセルのグラフト配列およびリバースシークエンシングプライマーのアニーリング部位。（１）配列標識。（２）試料標識。（３）フォワードリード開始部位。（４）ゲノム断片の配列。（５）ゲノムインデックス（プローブ配列）。（６）捕捉標識。（１）＋（３）の組合せは、コピー数の決定にきわめて重要な独特のリードタグを構成する。（５）＋（６）の組合せは、捕捉イベントをモニタリングし、定量化するのに使用されうる、ゲノムインデックスタグを構成する。注釈エレメント１、２、３、および４の配列を決定するフォワードシークエンシングリード１、ならびに注釈エレメント５および６の配列を決定するペアエンドリバースリード２が指し示される。 プローブ（例えば、多機能性捕捉プローブ）は一般に有向であり、プローブは、配列をそれらの位置の一方の側（一般に３’側）において捕捉することを意味する。６０マーの標的化コアに加えて、さらなる機能性（例えば、ＰＣＲプライマー結合性部位、ビオチンによるプルアウトなどを可能とするパートナーオリゴのための結合性部位）を付加するテイル配列も付加する。６０ヌクレオチドの標的化配列は、以下の制約および基準：（１）プローブは、標的配列の開始点に照らして－１００～＋５０ヌクレオチドに配置すること。目下の例示では、標的配列の「開始点」とは、イントロン：エキソン接合部であること；（２）プローブは、例示される通り、プローブ対から得られる配列が、逆向きの配向性で重複しているように、冗長性を伴ってデザインすること；（３）プローブは、３３％以上のＧＣ含量（６０マー当たり＞２０のＧまたはＣ）および６７％以下の（６０マー当たり＜４０のＧまたはＣ）を保有するように選択する（可能な場合）こと；（４）プローブは、可能な場合は常にリピートを回避するように選択すること。これは、いずれもがＵＣＳＣゲノムブラウザー上で閲覧しうる、ＲＥＰＥＡＴＭＡＳＫＥＲおよび／または独特の整列可能性基準を一助として行うこと；（５）万一、位置要件、ＧＣ要件、および独特のものであるという要件を満たすことができない場合は、選択規則を、以下の順位（ＧＣ＞位置＞独特のものであること）で緩和することにより選択する。言い換えると、ＧＣ基準および位置どり基準は厳密でないが、独特のものであるという基準は厳密である。 標的化されたゲノムシークエンシングライブラリーを創出するためのプロセシング。（Ａ）初期捕捉複合体は、タグ付けされた「基準」ゲノムライブラリー断片、プローブに対して５’のゲノム「標的領域」を標的化する、テイル処理された捕捉プローブ、および全てのプローブに共通な、ビオチニル化パートナーオリゴヌクレオチドを含む。（Ｂ）複合体の、配列準備されたクローンへのプロセシングは、３つのステップ：（１）ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（例えば、全長Ｂｓｔポリメラーゼ）の５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼにより、ゲノムクローンの５’テイルをクリッピングするステップ；（２）ポリメラーゼにより、重合化を介して、パートナーオリゴ配列を伸長させるステップ（ステップ１と同時に生じうる）；および（３）Ｔａｑリガーゼにより、パートナーオリゴとゲノム断片との間のニックを修復するステップを含む。これらの協奏的ステップにより、配列準備されたクローンを創出する。 図３２は、捕捉後ＰＣＲ産物／プロセシングＰＣＲ産物を示す。レーン１は、ＡＣＡ２単一プライマーにより増幅された、プロセシングされていない捕捉複合体である。レーン２～４は、ＡＦ＋ＣＲ二重ＰＣＲプライマーにより増幅した。 図３３～３５は、タグ付けされたゲノムＤＮＡを作製するためのライブラリーフリー法、ならびに関連する捕捉法、プロセシング法、および解析法を示す。 図３３～３５は、タグ付けされたゲノムＤＮＡを作製するためのライブラリーフリー法、ならびに関連する捕捉法、プロセシング法、および解析法を示す。 図３３～３５は、タグ付けされたゲノムＤＮＡを作製するためのライブラリーフリー法、ならびに関連する捕捉法、プロセシング法、および解析法を示す。 図３６は、タグ付けされたゲノムＤＮＡを作製するためのライブラリーフリー法におけるプライマー二量体によるアーチファクトを回避するための抑制ＰＣＲ戦略を示す。 図３７は、タグ付けされたゲノムＤＮＡを作製するためのライブラリーフリー法で使用される、生のｇＤＮＡおよび超音波処理したｇＤＮＡについてのゲル電気泳動結果を示す。 図３８は、ライブラリーフリー法により調製される４つのｇＤＮＡ試料についての、ｑＰＣＲ増幅プロットを示す。 図３９は、ライブラリーフリー法により調製される試料から増幅される、生のＰＣＲ産物によるゲル電気泳動結果を示す。 図４０は、ライブラリーフリー法により調製される試料から増幅される、ビーズで洗浄されたＰＣＲ産物によるゲル電気泳動結果を示す。 図４１は、異なる酵素の組合せ：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｌ）、およびＴ４遺伝子３２タンパク質（３２）、または無酵素対照を使用する、ライブラリーフリー法により調製される試料についてのｑＰＣＲ増幅プロットを示す。 図４２は、異なる酵素の組合せ：Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｌ）、およびＴ４遺伝子３２タンパク質（３２）、または無酵素対照を使用する、ライブラリーフリー法により調製される、ＰＣＲ増幅（１０サイクルまたは１６サイクル）試料についてのゲル電気泳動結果を示す。 図４３は、プーリングの前にライブラリーフリー法により調製される個々の試料についてのゲル電気泳動結果を示す。 図４４は、ＰＬＰ１のＣＮＶを、Ｘ染色体のコピー量を可変とする試料を通じた、常染色体の遺伝子座であるＫＲＡＳおよびＭＹＣの標準化との関連で示す。試料は、ライブラリーフリー法を使用して調製した。 図４５は、ＸＸＸＸ（４コピー量）試料中の、Ｘ染色体領域１５のＤＮＡ配列の開始点を、捕捉プローブ配列と比べて示す。リードは、左から右に進み、試料は、ライブラリーフリー法を使用して調製した。 図４６は、本明細書で想定されるＲＮＡ－ｓｅｑ法、捕捉されたｃＤＮＡ、およびＰｉｐｐｉｎ自動式ＤＮＡサイズセレクターでサイズ処理されたｃＤＮＡ調製物を使用してＲＮＡ試料から調製される、ｃＤＮＡについてのゲル電気泳動結果を示す。 図４７は、ライブラリーを調製するための標的化された発現戦略と対比した、全ＲＮＡを使用して調製されるライブラリーにおける、心臓内の多様な転写物の遺伝子発現の相関を、肝臓と対比して示す。 図４８は、全ＲＮＡ－ｓｅｑにおいて測定される多様な転写物の絶対発現レベルの相関を、標的化されたＲＮＡ－ｓｅｑと比較して示す。
詳細な説明
Ａ．概要
本発明は、少なくとも一部には、標的化遺伝学的解析の実行において、数種類の重要な分子モジュールの協調的な利用を用いることができるという発見に基づく。
本発明の実施において、それと反対のことが特に示されていなければ、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学および細胞生物学の従来方法を当業者の技能範囲内で利用することができ、例証目的のために、その多くについて後述する。斯かる技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);ならびにHarlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998)を参照されたい。
本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、これにより参照としてその内容全体を援用する。
Ｂ．定義
他に定義されていなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般に理解されているものと同じ意義を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様または均等ないかなる方法および材料を使用することもできるが、組成物、方法および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。本発明の目的のために、次の用語を下に定義する。
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、この冠詞の文法上の目的語の１個または２個以上（即ち、少なくとも１個）を指すよう本明細書において使用されている。例として、「要素（an element）」は、１個の要素または２個以上の要素を意味する。
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか一方、両方またはこれらのいずれかの組合せを意味するものと理解されたい。
用語「および／または」は、選択肢のいずれか一方または両方を意味するものと理解されたい。
本明細書において、用語「約」または「およそ」は、参照含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％ほど変動する含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、用語「約」または「およそ」は、参照含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
本明細書を通して、文脈がそれ以外を要求しない限り、単語「を含む（comprise、comprisesおよびcomprising）」は、記述されているステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包接を暗示するが、他のいかなるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除も暗示しないものと理解されよう。特定の実施形態において、用語「含む（include）」、「有する（has）」、「含有する（contains）」および「を含む（comprise）」は、同義的に使用されている。
「からなる（consisting of）」とは、いかなるものであれ語句「からなる」に続くものを含み、これに限定されることを意味する。よって、語句「からなる」は、列挙されている要素が必要または必須であり、他のいかなる要素も存在しなくてよいことを示す。
「から本質的になる（consisting essentially of）」とは、この語句の後に列挙されているいかなる要素も含み、列挙されている要素の開示に指定されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、語句「から本質的になる」は、列挙されている要素が、必要または必須であるが、他の要素が必要に応じてであり、列挙されている要素の活性または作用に影響するか否かに応じて、存在してもしなくてもよいことを示す。
本明細書を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的な実施形態」もしくは「さらなる実施形態」またはこれらの組合せの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも一実施形態において含まれることを意味する。よって、本明細書を通した様々な箇所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指す訳ではない。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１種または複数の実施形態においていずれかの適した様式で組み合わせることができる。
本明細書において使用される場合、用語「単離される」は、その天然状態では通常それに付随している構成成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。特定の実施形態において、用語「得られる」または「由来する」は、単離と同義的に使用される。
本明細書において使用される場合、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を指す。様々な実施形態において、用語、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを指す。一実施形態において、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを指す。特定の実施形態において、ＤＮＡは、「標的領域」を含む。本明細書において企図されるＤＮＡライブラリーは、ゲノムＤＮＡライブラリーおよびＲＮＡから構築されるｃＤＮＡライブラリー、例えば、ＲＮＡ発現ライブラリーを含む。様々な実施形態において、ＤＮＡライブラリーは、１種または複数の追加的なＤＮＡ配列および／またはタグを含む。
「標的領域」は、ＤＮＡ配列内の対象とする領域を指す。様々な実施形態において、標的化遺伝学的解析は、標的領域において実行される。特定の実施形態において、標的領域がシークエンシングされる、あるいは標的領域のコピー数が決定される。
Ｃ．例示的な実施形態
本発明は、一部には、タグ付けされたゲノムライブラリーを作製するための方法を企図する。特定の実施形態において、方法は、断片化されたＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたＤＮＡを作製し、続いてランダム核酸タグ配列をライゲーションして、タグ付けされたゲノムライブラリーを作製するステップを含む。一部の実施形態において、試料コード配列および／またはＰＣＲプライマー配列が、必要に応じて、断片化され末端修復されたＤＮＡにライゲーションされる。
本発明は、一部には、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製するための方法を企図する。特定の実施形態において、方法は、断片化されたＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたＤＮＡを作製し、続いてランダム核酸タグ配列をライゲーションして、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製するステップを含む。一部の実施形態において、試料コード配列および／またはＰＣＲプライマー配列が、必要に応じて、断片化され末端修復されたＤＮＡにライゲーションされる。
ＤＮＡを断片化するための例証的方法として、剪断、超音波処理、制限消化を含む酵素消化および他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ＤＮＡを断片化するための当技術分野において公知のいずれかの方法を、本発明と共に用いることができる。
一部の実施形態において、断片化されたＤＮＡは、末端修復酵素によってプロセシングされて、末端修復されたＤＮＡを作製する。一部の実施形態において、末端修復酵素は、例えば、平滑末端、５’－オーバーハングおよび３’－オーバーハングを生じることができる。一部の実施形態において、末端修復されたＤＮＡは、平滑末端を含有する。一部の実施形態において、末端修復されたＤＮＡは、平滑末端を含有するようプロセシングされる。一部の実施形態において、末端修復されたＤＮＡの平滑末端は、単一塩基対オーバーハングを含有するようさらに修飾される。一部の実施形態において、平滑末端を含有する末端修復されたＤＮＡは、アデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）オーバーハングを含有するようさらにプロセシングすることができる。一部の実施形態において、平滑末端を含有する末端修復されたＤＮＡは、単一塩基対オーバーハングとしてアデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）オーバーハングを含有するようさらにプロセシングすることができる。一部の実施形態において、末端修復されたＤＮＡは、鋳型によらない（non-templated）３’オーバーハングを有する。一部の実施形態において、末端修復されたＤＮＡは、３’－オーバーハングを含有するようプロセシングされる。一部の実施形態において、末端修復されたＤＮＡは、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）により、３’－オーバーハングを含有するようプロセシングされる。一部の実施形態において、ＴｄＴによりＧ－テイルを付加することができる。一部の実施形態において、末端修復されたＤＮＡは、いずれか公知の制限酵素（例えば、酵素Ｓａｕ３Ａその他）による部分的消化を使用して、オーバーハング末端を含有するようプロセシングされる。
特定の実施形態において、ＤＮＡ断片は、１種または複数の「ランダムヌクレオチドタグ」または「ランダム核酸タグ」を使用してタグ付けされる。本明細書において、用語「ランダムヌクレオチドタグ」または「ランダム核酸タグ」は、個別の長さのポリヌクレオチドを指し、ヌクレオチド配列は、ランダムに作製または選択された。特定の例証的実施形態において、ランダム核酸タグの長さは、約２～約１００ヌクレオチド、約２～約７５ヌクレオチド、約２～約５０ヌクレオチド、約２～約２５ヌクレオチド、約２～約２０ヌクレオチド、約２～約１５ヌクレオチド、約２～約１０ヌクレオチド、約２～約８ヌクレオチドまたは約２～約６ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ランダムヌクレオチドタグの長さは、約２～約６ヌクレオチドである（例えば、図１を参照）。一実施形態において、ランダムヌクレオチドタグ配列は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、当技術分野において公知の方法を用いて、断片化されたＤＮＡに本発明のランダムヌクレオチドタグを付加することができる。一部の実施形態において、「タグメンテーション（tagmentation）」を用いることができる。タグメンテーションは、市販のＮｅｘｔｅｒａ技術であり（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ａｎｄ Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、米国）、トランスポゾンタンパク質複合体に本発明のランダムヌクレオチドタグおよび／または多機能性アダプターモジュールをロードするために使用することができる。次に、ロードされたトランスポゾン複合体を、記載されている方法に従ってタグ付けされたゲノムライブラリーの作製において使用することができる。
本方法において使用されるＤＮＡは、当業者に公知のいかなる供給源に由来してもよい。ＤＮＡは、いずれかの供給源から収集し、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）としてＲＮＡから合成し、本方法において使用される純粋または実質的に純粋ＤＮＡにプロセシングすることができる。一部の実施形態において、断片化されたＤＮＡのサイズは、約２～約５００塩基対、約２～約４００塩基対、約２～約３００塩基対、約２～約２５０塩基対、約２～約２００塩基対、約２～約１００塩基対または約２～約５０塩基対の範囲内である。
ＤＮＡ断片末端配列と導入された「ランダム核酸タグ」（単数または複数）の組合せは、以後「ゲノムタグ」または「ｃＤＮＡタグ」と称される２要素の組合せを構成する。一部の実施形態において、「ゲノムタグ」または「ｃＤＮＡタグ」が独特のものであることは、ＤＮＡ断片末端配列プールの多様性を乗じた、付着されたランダムヌクレオチドタグプール内の多様性の組合せの積により決定することができる。
本発明は、一部には、多機能性アダプターモジュールも企図する。本明細書において、用語「多機能性アダプターモジュール」は、（ｉ）ランダムヌクレオチドタグ配列を含む第１の領域と、必要に応じて（ｉｉ）試料コード配列を含む第２の領域と、必要に応じて（ｉｉｉ）ＰＣＲプライマー配列を含む第３の領域とを含むポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、多機能性アダプターモジュールは、ＰＣＲプライマー配列と、ランダムヌクレオチドタグと、試料コード配列とを含む。ある特定の実施形態において、多機能性アダプターモジュールは、ＰＣＲプライマー配列およびランダムヌクレオチドタグまたは試料コード配列を含む。一部の実施形態において、試料コードを含む第２の領域は必要に応じてである。一部の実施形態において、多機能性アダプターモジュールは、第２の領域を含まないが、代わりに、第１および第３の領域のみを含む。本発明の多機能性アダプターモジュールは、本明細書の他の箇所に開示されている末端と共に、断片化されたＤＮＡに多機能性アダプターモジュールをライゲーションするための当業者に公知のその他の末端を含む、用いられるライゲーション方法に適切な平滑または相補的末端を含むことができる。
様々な実施形態において、第１の領域は、ランダムヌクレオチドタグ配列を含む。特定の実施形態において、第１の領域は、約２～約１００ヌクレオチド、約２～約７５ヌクレオチド、約２～約５０ヌクレオチド、約２～約２５ヌクレオチド、約２～約２０ヌクレオチド、約２～約１５ヌクレオチド、約２～約１０ヌクレオチド、約２～約８ヌクレオチドもしくは約２～約６ヌクレオチドまたはいずれかの介在する数のヌクレオチドのランダムヌクレオチドタグ配列を含む。
特定の実施形態において、第２の領域は、必要に応じて存在する場合、試料コード配列を含む。本明細書において、用語「試料コード配列」は、試料の同定に使用されるポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、第２の領域は、約１～約１００ヌクレオチド、約２～約７５ヌクレオチド、約２～約５０ヌクレオチド、約２～約２５ヌクレオチド、約２～約２０ヌクレオチド、約２～約１５ヌクレオチド、約２～約１０ヌクレオチド、約２～約８ヌクレオチドもしくは約２～約６ヌクレオチドまたはいずれかの介在する数のヌクレオチドの試料コード配列を含む。
ある特定の実施形態において、第３の領域は、必要に応じて存在する場合、ＰＣＲプライマー配列を含む。特定の実施形態において、第３の領域は、約５～約２００ヌクレオチド、約５～約１５０ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、約１０～約７５ヌクレオチド、約１０～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチドもしくは約２０～約３０ヌクレオチドまたはいずれかの介在する数のヌクレオチドのＰＣＲプライマー配列を含む。
特定の実施形態において、ライゲーションステップは、多機能性アダプターモジュールを断片化され末端修復されたＤＮＡにライゲーションすることを含む。このライゲーション反応を使用して、多機能性アダプター分子および／またはランダムヌクレオチドタグにライゲーションされた末端修復されたＤＮＡを含む、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製することができる。一部の実施形態において、単一の多機能性アダプターモジュールが用いられる。一部の実施形態において、２種以上の多機能性アダプターモジュールが用いられる。一部の実施形態において、同一配列の単一の多機能性アダプターモジュールが、断片化され末端修復されたＤＮＡの各末端にライゲーションされる。
本発明は、多機能性捕捉プローブモジュールも提供する。本明細書において、用語「多機能性捕捉プローブモジュール」は、（ｉ）パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第１の領域と、（ｉｉ）特異的標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域と、必要に応じて（ｉｉｉ）テイル配列を含む第３の領域とを含むポリヌクレオチドを指す。
一実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる領域と、ＤＮＡ標的配列とハイブリダイズすることができる領域と、テイル配列とを含む。
一実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる領域と、ゲノム標的配列とハイブリダイズすることができる領域とを含む。
特定の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、必要に応じて、ランダムヌクレオチドタグ配列を含む。
様々な実施形態において、第１の領域は、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる領域を含む。本明細書において、用語「パートナーオリゴヌクレオチド」は、多機能性捕捉プローブモジュールのヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第１の領域は、約２０～約２００ヌクレオチド、約２０～約１５０ヌクレオチド、約３０～約１００ヌクレオチド、約３０～約７５ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約３０～約４５ヌクレオチドまたは約３５～約４５ヌクレオチドの配列である。ある特定の実施形態において、領域は、約３０～約５０ヌクレオチド、約３０～約４０ヌクレオチド、約３０～約３５ヌクレオチドもしくは約３４ヌクレオチドまたはいずれかの介在する数のヌクレオチドである。
特定の実施形態において、第２の領域は、必要に応じて存在する場合、特異的ＤＮＡ標的領域とハイブリダイズすることができる領域を含む。本明細書において、用語「ＤＮＡ標的領域」は、本明細書において企図される組成物および方法を使用した解析に選択されるゲノムまたはｃＤＮＡの領域を指す。特定の実施形態において、特異的標的領域とハイブリダイズすることができる領域を含む第２の領域は、約２０～約２００ヌクレオチド、約３０～約１５０ヌクレオチド、約５０～約１５０ヌクレオチド、約３０～約１００ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約５０～約９０ヌクレオチド、約５０～約８０ヌクレオチド、約５０～約７０ヌクレオチドまたは約５０～約６０ヌクレオチドの配列である。ある特定の実施形態において、第２の領域は、約６０ヌクレオチドまたはいずれかの介在する数のヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、第３の領域は、必要に応じて存在する場合、テイル配列を含む。本明細書において、用語「テイル配列」は、特定の実施形態において、ＰＣＲプライマー結合部位として役立つことができる、多機能性捕捉プローブモジュールの５’末端におけるポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、第３の領域は、約５～約１００ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、約５～約７５ヌクレオチド、約５～約５０ヌクレオチド、約５～約２５ヌクレオチドまたは約５～約２０ヌクレオチドのテイル配列を含む。ある特定の実施形態において、第３の領域は、約１０～約５０ヌクレオチド、約１５～約４０ヌクレオチド、約２０～約３０ヌクレオチドもしくは約２０ヌクレオチドまたはいずれかの介在する数のヌクレオチドである。
一実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる領域と、ゲノム標的配列とハイブリダイズすることができる領域とを含む。多機能性捕捉プローブモジュールが、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる領域と、ゲノム標的配列とハイブリダイズすることができる領域を含む特定の実施形態において、パートナーオリゴは、テイル配列またはプライマー結合部位として機能することもできる。
一実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、テイル領域と、ゲノム標的配列とハイブリダイズすることができる領域とを含む。
様々な実施形態において、多機能性捕捉プローブは、結合対の特異的メンバーを含み、多機能性捕捉プローブとハイブリダイズする、タグ付けされたＤＮＡライブラリーの１種または複数の捕捉された断片の単離および／または精製を可能にする。特定の実施形態において、多機能性捕捉プローブは、ビオチンまたは別の適したハプテン、例えば、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニンにコンジュゲートされる。
本発明は、一部には、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズさせて、複合体を形成するステップをさらに企図する。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、ＤＮＡライブラリーにおける特異的ゲノム標的領域と実質的にハイブリダイズする。
ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイズ条件は、２種のヌクレオチド配列が、安定的複合体を形成するいずれかの反応条件を含むことができる；例えば、タグ付けされたＤＮＡライブラリーおよび多機能性捕捉プローブモジュールが、安定的なタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を形成する条件。斯かる反応条件は、当技術分野において周知のものであり、当業者であれば、斯かる条件を適切にかつ本発明の範囲内で修正することができることを認められよう。実質的ハイブリダイゼーションは、多機能性捕捉プローブ複合体の第２の領域が、タグ付けされたＤＮＡライブラリーの領域に対し、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８５％、８０％、７５％または７０％配列同一性、相同性または相補性を提示する場合に生じ得る。
特定の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールの第１の領域は、第２の領域が実質的にハイブリダイズするタグ付けされたＤＮＡライブラリーの領域と実質的にハイブリダイズしない。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールの第３の領域は、多機能性捕捉プローブモジュールの第２の領域が実質的にハイブリダイズするタグ付けされたＤＮＡライブラリーの領域と実質的にハイブリダイズしない。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールの第１および第３の領域は、多機能性捕捉プローブモジュールの第２の領域が実質的にハイブリダイズするタグ付けされたＤＮＡライブラリーの領域と実質的にハイブリダイズしない。
ある特定の実施形態において、本明細書において企図される方法は、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ複合体を単離するための方法は、当業者に周知のものであり、当業者により適切と考慮されるいかなる方法を、本発明の方法と共に用いてよい（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、２００７～２０１２頁）。特定の実施形態において、複合体は、ビオチン－ストレプトアビジン単離技法を使用して単離される。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールの第１の領域とハイブリダイズすることができるパートナーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ複合体単離方法において使用されるカラム、ビーズまたは他の基板に連結されたストレプトアビジンと相互作用することができるビオチンを５’末端または３’末端に含有するよう修飾される。
特定の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールの第１の領域は、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の形成前に、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の形成後に、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールは、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の形成と同時に、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、パートナーオリゴヌクレオチドは、化学修飾されている。
特定の実施形態において、単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体からの一本鎖３’末端の除去が企図される。ある特定の実施形態において、方法は、単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングして、一本鎖３’末端を除去するステップを含む。
ある特定の他の実施形態において、方法は、単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用した、多機能性捕捉プローブの５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行するステップを含む。
ある特定の他の実施形態において、方法は、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により、ハイブリッド多機能性捕捉プローブによって単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的分子を作製するステップを含む。
単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングのために、種々の酵素を用いることができる。特定の実施形態において用いることのできる、３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素活性を提示する適した酵素の例証のための例として、Ｔ４またはエキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、Ｖが挙げられるがこれらに限定されない（Shevelev IV，Hubscher U.、「The 3' 5' exonucleases」、Nat Rev Mol Cell Biol.３巻（５号）：３６４～７６頁（２００２年）も参照）。特定の実施形態において、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を含む酵素は、Ｔ４ポリメラーゼである。特定の実施形態において、例えば、Ｔ４またはエキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、Ｖを含む、３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素活性を提示し、プライマー鋳型伸長することができる酵素を用いることができる。Ｉｄ．３’５’
一部の実施形態において、本明細書において企図される方法は、上記および本明細書の他の箇所に記述される３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップを含む。特定の実施形態において、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされる。一実施形態において、作製されるハイブリッド核酸分子は、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含む。
様々な実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法も企図される。ある特定の実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ゲノムライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、ハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む。
様々な実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法が企図される。特定の実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、ｂ）から得られる単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行して、一本鎖３’末端を除去するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｆ）ｅ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む。
様々な実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法も企図される。ある特定の実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ゲノムライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用して、多機能性捕捉プローブの５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む。
様々な実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法が企図される。特定の実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー断片を鋳型として利用して、多機能性捕捉プローブの５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｆ）ｅ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む。
様々な実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法も企図される。ある特定の実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ゲノムライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、（ｃ）５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により、ハイブリッド多機能性捕捉プローブによって単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的分子を作製するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分がコピーされ、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む。
様々な実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法が企図される。特定の実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により、ハイブリッド多機能性捕捉プローブによって単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的分子を作製するステップと、ｄ）ｃ）から得られる酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲ反応を実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分が複製され、このハイブリッド核酸分子が、多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる標的領域と、多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列の相補体とを含むステップと、ｅ）ｄ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｆ）ｅ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む。
特定の実施形態において、当業者に周知のいずれかの標準ＰＣＲ反応条件を使用して、ＰＣＲを実行することができる。ある特定の実施形態において、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲプライマーを用いる。一実施形態において、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、標的領域とハイブリダイズする第１のＰＣＲプライマーを用いる。特定の実施形態において、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、標的領域／テイル接合部におけるハイブリッド分子とハイブリダイズする第２のＰＣＲプライマーを用いる。ある特定の実施形態において、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、標的領域とハイブリダイズする第１のＰＣＲプライマーと、標的ゲノム領域／テイル接合部におけるハイブリッド分子とハイブリダイズする第２のＰＣＲプライマーとを用いる。特定の実施形態において、第２のプライマーは、プライマーの少なくとも１個または複数のヌクレオチドが、標的領域とハイブリダイズし、プライマーの少なくとも１個または複数のヌクレオチドが、テイル配列とハイブリダイズするように、標的領域／テイル接合部とハイブリダイズする。ある特定の実施形態において、ステップｅ）から得られるハイブリッド核酸分子は、シークエンシングされ、配列は、ホリゾンタルに整列される、即ち、互いに整列されるが、参照配列とは整列されない。特定の実施形態において、ステップａ）～ｅ）は、１種または複数の多機能性捕捉プローブモジュール複合体により、１回または複数回反復される。多機能性捕捉プローブ複合体は、同じであっても異なっていてもよく、標的配列のいずれかのＤＮＡ鎖を標的化するよう設計される。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブ複合体が異なっている場合、これらは、タグ付けされたＤＮＡライブラリー内の同じ標的領域の近くとハイブリダイズする。一実施形態において、１種または複数の多機能性捕捉プローブは、標的領域からのあらゆる介在する距離を含む、タグ付けされたＤＮＡライブラリーにおける標的領域の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｂｐ以上の内でハイブリダイズする。
一部の実施形態において、方法は、標的領域当たり２種の多機能性捕捉プローブモジュールを使用して実行することができ、一方は、標的領域上流の「ワトソン」鎖（非コードまたは鋳型鎖）とハイブリダイズし、一方は、標的領域下流の「クリック」鎖（コードまたは非鋳型鎖）とハイブリダイズする。
特定の実施形態において、本明細書において企図される方法は、いずれかの数の多機能性プローブモジュールにより、複数回さらに実行することができ、例えば、標的領域当たり２、３、４、５、６、７、８、９または１０種以上の多機能性捕捉プローブモジュールを用い、そのうちいずれかの数が、いずれかの組合せでワトソンまたはクリック鎖とハイブリダイズする。一部の実施形態において、差異の数のいずれかを同定するために、得られる配列は、互いに整列することができる。
ある特定の実施形態において、１種または複数の多機能性プローブモジュールを使用して、単一の反応において複数の標的領域が照合され、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００、５０００００種以上が照合される。
コピー数は、独特のリードおよび重複したリードに関する有用な情報を提供することができると共に、公知リードのバリアントの探索を補助することができる。本明細書において、用語「リード」、「リード配列」または「シークエンシングリード」は、同義的に使用されており、ポリヌクレオチドのシークエンシングにより得られるポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態において、ＤＮＡタグ、例えば、ランダムヌクレオチドタグを使用して、解析されている核酸配列のコピー数を決定することができる。
一実施形態において、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールは、（ｉ）パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、ＰＣＲプライマーとして機能することができる第１の領域と、（ｉｉ）特異的ゲノム標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域とを含む。
様々な実施形態において、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールの第１の領域は、ＰＣＲプライマー配列を含む。特定の実施形態において、この第１の領域は、いずれかの介在する数のヌクレオチドを含む、約５～約２００ヌクレオチド、約５～約１５０ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、約１０～約７５ヌクレオチド、約１０～約５０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチドまたは約２０～約３０ヌクレオチドのＰＣＲプライマー配列を含む。
特定の実施形態において、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールの第１の領域は、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。ある特定の実施形態において、多機能性捕捉ハイブリッドプローブモジュールは、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体の形成前に、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。特定の実施形態において、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールは、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体の形成後に、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールは、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉ハイブリッドプローブモジュール複合体の形成と同時に、パートナーオリゴヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、パートナーオリゴヌクレオチドは、化学修飾されている。
様々な実施形態において、本明細書において企図される方法は、捕捉されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列をコピーして、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体と、ハイブリッドモジュールがゲノム標的とハイブリダイズする位置に対して多機能性捕捉プローブ配列の３’または５’に位置する捕捉されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域に相補的な配列を含むハイブリッド核酸分子を作製することができるように、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体に対してＰＣＲを実行するステップを含む。特定の実施形態において、コピーされた標的領域は、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールがゲノム標的にハイブリダイズする位置の配列の３’または５’末端から１～５０００ｎｔのいずれかの位置である。ある特定の実施形態において、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールがハイブリダイズする位置に対して３’の領域の相補的配列がコピーされる。作製されるハイブリッド核酸分子は、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが標的領域とハイブリダイズする位置から３’または５’に位置する捕捉されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域の相補体とを含む。
様々な実施形態において、本明細書において企図される方法は、タグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体をプロセシングして、ハイブリッド核酸分子（即ち、ハイブリッド多機能性捕捉プローブによって単離されたタグ付けされたＤＮＡ標的分子）を作製するステップを含む。特定の実施形態において、ハイブリッド核酸分子は、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが標的領域とハイブリダイズする位置に対して３’に位置するタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域の相補体とを含む。非限定的な一実施形態において、ハイブリッド核酸分子は、単離されたタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体から一本鎖３’末端を除去する３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングおよび／または多機能性捕捉プローブの５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長により作製される。
他の特定の実施形態において、ハイブリッド核酸分子は、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールと、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが標的領域とハイブリダイズする位置に対して５’に位置するタグ付けされたＤＮＡライブラリー配列の領域の相補体とを含む。非限定的な一実施形態において、ハイブリッド核酸分子は、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏的作用により作製される。
様々な実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法が提供される。一実施形態において、標的化遺伝学的解析のための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）ｂ）から得られる複合体に対してＰＣＲを実行して、ハイブリッド核酸分子を形成するステップと、ｄ）ｃ）から得られるハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行するステップとを含む。特定の実施形態において、ステップｃ）から得られるハイブリッド核酸分子は、シークエンシングされ、配列は、ホリゾンタルに整列される、即ち、互いに整列されるが、参照配列とは整列されない。ある特定の実施形態において、ステップａ）～ｃ）は、１種または複数の多機能性捕捉プローブモジュールにより１回または複数回反復される。
多機能性捕捉プローブモジュールは、同じであっても異なっていてもよく、ゲノムのいずれかの鎖に対しハイブリダイズするよう設計される。一部の実施形態において、多機能性捕捉プローブモジュールが異なっている場合、これらは、タグ付けされたＤＮＡライブラリーにおける同じ標的領域の１～５０００ｎｔからのいずれかの位置とハイブリダイズする。
特定の実施形態において、方法は、２種の多機能性捕捉プローブモジュールを使用して２回実行することができ、一方は、ゲノム標的領域の上流とハイブリダイズし（即ち、５’末端に；即ち、フォワード多機能性捕捉プローブモジュールまたは複合体）、一方は、反対側のゲノム鎖におけるゲノム標的領域の下流とハイブリダイズする（即ち、３’末端に；即ち、リバース多機能性捕捉プローブモジュールまたは複合体）。
一実施形態において、１種または複数の多機能性捕捉プローブは、標的領域からのあらゆる介在する距離を含む、タグ付けされたＤＮＡライブラリーにおける標的領域の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｂｐ以上の内でハイブリダイズする。
一部の実施形態において、方法は、いずれかの数の多機能性プローブモジュールにより、複数回さらに実行することができ、例えば、標的領域当たり２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の多機能性捕捉プローブモジュールを用いて、そのうちいずれかの数がいずれかの組合せでワトソンまたはクリック鎖とハイブリダイズする。
ある特定の実施形態において、１種または複数の多機能性プローブモジュールを使用して、単一の反応において複数の標的領域が照合され、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００、５０００００種以上が照合される。
特定の実施形態において、突然変異を同定するために、本方法により得られる配列は、参照配列と整列することなく、互いに整列することができる。ある特定の実施形態において、得られる配列は、必要に応じて、参照配列と整列することができる。
様々な実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法が企図される。特定の実施形態において、特異的標的領域のコピー数を決定するための方法は、ａ）タグ付けされたＤＮＡライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、ＤＮＡライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、ｂ）ａ）から得られるタグ付けされたＤＮＡライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、ｃ）ｂ）から得られる複合体に対してＰＣＲを実行して、ハイブリッド核酸分子を形成するステップと、ｄ）ｃ）におけるハイブリッド核酸のＰＣＲ増幅を実行するステップと、ｅ）ｄ）におけるＰＣＲ反応を定量化するステップであって、定量化が、特異的標的領域のコピー数の決定を可能にするステップとを含む。特定の実施形態において、ＰＣＲは、当業者に周知のいずれかの標準ＰＣＲ反応条件を使用して実行することができる。ある特定の実施形態において、ｄ）におけるＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲプライマーを用いる。特定の実施形態において、ｄ）におけるＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲプライマーを用い、そのそれぞれは、多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールがタグ付けされたＤＮＡライブラリーとハイブリダイズする位置に対して下流の領域とハイブリダイズする。さらなる実施形態において、ＰＣＲプライマーがハイブリダイズする領域は、ステップｃ）において増幅される領域に位置する。様々な実施形態において、ステップｃ）から得られるハイブリッド核酸分子は、シークエンシングされ、配列は、ホリゾンタルに整列され、即ち、互いに整列されるが、参照配列とは整列されない。特定の実施形態において、ステップａ）～ｃ）は、１種または複数の多機能性捕捉プローブモジュールにより１回または複数回反復される。多機能性捕捉プローブモジュールは、同じであっても異なっていてもよく、ゲノムのいずれかの鎖とハイブリダイズするよう設計される。
一実施形態において、１種または複数の多機能性捕捉プローブは、標的領域からのあらゆる介在する距離を含む、タグ付けされたＤＮＡライブラリーにおける標的領域の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｂｐ以上の内でハイブリダイズする。
一部の実施形態において、方法は、いずれかの数の多機能性プローブモジュールにより、複数回さらに実行することができ、例えば、標的領域当たり２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の多機能性捕捉プローブモジュールを用いて、そのうちいずれかの数がいずれかの組合せでワトソンまたはクリック鎖とハイブリダイズする。
ある特定の実施形態において、１種または複数の多機能性プローブモジュールを使用して、単一の反応において複数の標的領域が照合され、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００、５０００００種以上が照合される。
特定の例証的実施形態において、例えばＰＣＲにより、タグ付けされたＤＮＡライブラリーが増幅されて、増幅されたタグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製する。
あらゆるゲノム標的領域は、５’末端および３’末端を有するであろう。特定の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、それぞれ５’および３’方向の両方からの標的化ゲノム領域の増幅をもたらす２種の多機能性捕捉プローブ複合体により実行することができる。一実施形態において、１種または複数の多機能性捕捉プローブは、標的領域からのあらゆる介在する距離を含む、タグ付けされたＤＮＡライブラリーにおける標的領域の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｂｐ以上の内でハイブリダイズする。
一部の実施形態において、方法は、いずれかの数の多機能性プローブモジュールにより、複数回さらに実行することができ、例えば、標的領域当たり２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の多機能性捕捉プローブモジュールを用いて、そのうちいずれかの数がいずれかの組合せでワトソンまたはクリック鎖とハイブリダイズする。
ある特定の実施形態において、１種または複数の多機能性プローブモジュールを使用して、単一の反応において複数の標的領域が照合され、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００種以上が照合される。
特定の実施形態において、標的化遺伝学的解析は、配列解析である。特定の実施形態において、配列解析は、一配列が第２の配列から区別されるいずれかの解析を含む。様々な実施形態において、配列解析は、シークエンシングのための組成物または方法の非存在下で実行されるいずれかの純粋にメンタルな（mental）配列解析を排除する。ある特定の実施形態において、配列解析として、シークエンシング、一塩基多型（ＳＮＰ）解析、遺伝子コピー数解析、ハプロタイプ解析、突然変異解析、メチル化状態解析（限定されない例として、非メチル化シトシン残基の亜硫酸水素塩変換により決定される）、クロマチン免疫沈降実験において得られるＤＮＡ配列の標的化リシークエンシング（ＣＨＩＰ－ｓｅｑ）、妊娠中の母体血漿ＤＮＡから収集された捕捉された胎児ＤＮＡの配列における父子鑑定、微生物特異的捕捉プローブにより捕捉された試料における微生物存在および集団評価ならびに胎児遺伝的配列解析（例えば、母体試料における胎児細胞または細胞外胎児ＤＮＡを使用）が挙げられる。
コピー数解析として、特定の遺伝子または所定のゲノムＤＮＡ試料において生じる突然変異のコピー数を試験する解析が挙げられるがこれに限定されず、所定の遺伝子のコピー数または所定の試料における配列の差の定量的決定をさらに含むことができる。
参照配列とアラインメントする必要なく実行することができる、配列アラインメント解析のための方法も本明細書において企図され、これは、本明細書において、ホリゾンタル配列解析と称される（例えば、図２０に例証）。斯かる解析は、本明細書において企図される方法または他のいずれかの方法によって作製されるいずれかの配列において実行することができる。特定の実施形態において、配列解析は、本明細書において企図される方法により得られるハイブリッド核酸分子において配列アラインメントを実行するステップを含む。一実施形態において、１種または複数の多機能性捕捉プローブは、標的領域からのあらゆる介在する距離を含む、タグ付けされたＤＮＡライブラリーにおける標的領域の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｂｐ以上の内でハイブリダイズする。
一部の実施形態において、方法は、いずれかの数の多機能性プローブモジュールにより、複数回さらに実行することができ、例えば、標的領域当たり２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の多機能性捕捉プローブモジュールを用いて、そのうちいずれかの数がいずれかの組合せでワトソンまたはクリック鎖とハイブリダイズする。
ある特定の実施形態において、１種または複数の多機能性プローブモジュールを使用して、単一の反応において複数の標的領域が照合され、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００種以上が照合される。
特定の実施形態において、ＤＮＡは、いずれかの生物学的供給源から単離することができる。ＤＮＡの例証的な供給源として、血液、皮膚、毛、毛包、唾液、口腔粘膜、膣粘膜、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精子液、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー氏腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液または組織抽出物試料または生検試料が挙げられるがこれらに限定されない。
一実施形態において、本明細書において企図される方法により使用するためのタグ付けされたＤＮＡライブラリーが提供される。一部の実施形態において、タグ付けされたＤＮＡライブラリーは、タグ付けされたゲノム配列を含む。特定の実施形態において、各タグ付けされたＤＮＡ配列は、ｉ）断片化され末端修復されたＤＮＡと、ｉｉ）１種または複数のランダムヌクレオチドタグ配列と、ｉｉｉ）１種または複数の試料コード配列と、ｉｖ）１種または複数のＰＣＲプライマー配列とを含む。
一実施形態において、ハイブリッドタグ付けされたＤＮＡライブラリーが企図される。特定の実施形態において、ハイブリッドタグ付けされたＤＮＡライブラリーは、ハイブリッドタグ付けされたＤＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態において、各ハイブリッドタグ付けされたＤＮＡ配列は、ｉ）標的領域を含む断片化され末端修復されたＤＮＡと、ｉｉ）１種または複数のランダムヌクレオチドタグ配列と、ｉｉｉ）１種または複数の試料コード配列と、ｉｖ）１種または複数のＰＣＲプライマー配列と、ｖ）多機能性捕捉プローブモジュールテイル配列とを含む。
様々な実施形態において、本明細書において企図される方法において使用される試薬のキットおよび組成物が提供される。一部の実施形態において、組成物は、タグ付けされたＤＮＡライブラリーと、多機能性アダプターモジュールと、多機能性捕捉プローブモジュールとを含む。特定の実施形態において、組成物は、タグ付けされたゲノムライブラリーを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、ハイブリッドタグ付けされたゲノムライブラリーを含む。
様々な実施形態において、本明細書において企図される方法を行うための反応混合物が提供される。特定の実施形態において、反応混合物は、本明細書において企図される方法のいずれかを実行するための反応混合物である。ある特定の実施形態において、反応混合物は、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製することができる。一部の実施形態において、タグ付けされたＤＮＡライブラリーを作製することができる反応混合物は、ａ）断片化されたＤＮＡと、ｂ）断片化され末端修復されたＤＮＡを作製するためのＤＮＡ末端修復酵素とを含む。特定の実施形態において、反応混合物は、多機能性アダプターモジュールをさらに含む。様々な実施形態において、反応混合物は、多機能性捕捉プローブモジュールをさらに含む。ある特定の実施形態において、反応混合物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性およびＰＣＲ増幅活性を有する酵素をさらに含む。
様々な実施形態において、本明細書において企図される１種または複数のクローンの配列のために、ＤＮＡ配列解析のための方法が提供される。一実施形態において、方法は、各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む、１種もしくは複数のまたは複数のタグ付けされたＤＮＡライブラリークローンを得るステップであって、この第１のＤＮＡ配列が、標的化ＤＮＡ配列を含み、この第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、１種または複数のクローンに対してペアエンドシークエンシング反応を実行して１種または複数のシークエンシングリードを得るステップと、あるいは１種または複数のクローンに対してシークエンシング反応を実行するステップであって、約１００、２００、３００、４００、５００以上のヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、このリードが、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列の両方の同定に十分であるステップと、シークエンシングリードのプローブ配列に従って、１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップとを含む。
配列リードは、１種または複数のヒト参照ＤＮＡ配列と比較することができる。参照配列とマッチしない配列リードを同定し、非マッチ配列データからのデノボアセンブリーの作成に使用することができる。特定の実施形態において、デノボアセンブリーを使用して、捕捉プローブに関連する新規配列再編成を同定する。
様々な実施形態において、各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む、１種もしくは複数のまたは複数のクローンを得るステップであって、この第１のＤＮＡ配列が、ランダムヌクレオチドタグ配列および標的化ＤＮＡ配列を含み、この第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップを含む、コピー数決定解析のための方法が提供される。関連する実施形態において、１種または複数のクローンにおけるペアエンドシークエンシング反応が実行され、１種または複数のシークエンシングリードが得られる。別の実施形態において、１種または複数のクローンにおけるシークエンシング反応が実行され、約１００ヌクレオチドを超える単一の長いシークエンシングリードが得られ、このリードが、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列の両方の同定に十分である。１種または複数のクローンのシークエンシングリードは、シークエンシングリードのプローブ配列に従って、順序付けまたはクラスター形成することができる。
特定の実施形態において、コピー数を決定するための方法が提供される。特定の実施形態において、方法は、各クローンが第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む、１種もしくは複数のまたは複数のクローンを得るステップであって、この第１のＤＮＡ配列が、ランダムヌクレオチドタグ配列および標的化ＤＮＡ配列を含み、この第２のＤＮＡ配列が、捕捉プローブ配列を含むステップと、シークエンシングリードのプローブ配列に従って、１種または複数のクローンのシークエンシングリードを順序付けまたはクラスター形成するステップとを含む。特定の実施形態において、ランダムヌクレオチドタグは、約２～約５０ヌクレオチドの長さである。
方法は、独特のシークエンシングリードおよび重複したシークエンシングリードの分布を決定することにより、第２のリード配列に関連するあらゆるシークエンシングリードを解析するステップと、独特のリードが遭遇する回数を計数するステップと、独特のリードの度数分布を統計分布に適合させるステップと、独特のリードの総数を推量するステップと、推量された独特のリードの総数を、ヒトが一般に二倍体であるという仮定に対して正規化するステップとをさらに含むことができる。
特定の実施形態において、本明細書において企図される方法を使用して、１種または複数の標的化遺伝子座の推量されるコピー数を計算し、あるとすれば、予想されるコピー数値からのこの計算の逸脱を計算することができる。ある特定の実施形態において、遺伝子の１種または複数の標的化遺伝子座は、遺伝子座のコレクションにおいて共にグループ化され、標的化遺伝子座のコレクションのコピー数測定値は、平均化および正規化される。一実施形態において、遺伝子の推量されるコピー数は、この遺伝子を表す全標的遺伝子座の正規化された平均により表すことができる。
様々な実施形態において、本明細書において企図される組成物および方法は、ＲＮＡ発現の作製および解析にも適用可能である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、タグ付けされたｇＤＮＡライブラリーの作製に使用される方法および組成物のいずれかを、タグ付けされたｃＤＮＡライブラリーの作製に使用することもでき、配列解析を限定することなく含む、その後のＲＮＡ発現解析のためにｃＤＮＡにおいて具体化されるＲＮＡ配列に相当する標的領域を捕捉およびプロセシングできることが企図される。
様々な実施形態において、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するための方法は、先ず、ｃＤＮＡライブラリーを得るまたは調製するステップを含む。ｃＤＮＡライブラリー合成の方法は、当技術分野において公知のものであり、様々な実施形態に適用可能となり得る。ｃＤＮＡライブラリーは、適用に応じて、１種または複数の同じまたは異なる細胞型から調製することができる。一実施形態において、方法は、ｃＤＮＡライブラリーを断片化するステップと、この断片化されたｃＤＮＡライブラリーを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたｃＤＮＡを作製するステップと、多機能性アダプター分子を、断片化され末端修復されたｃＤＮＡにライゲーションして、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製するステップとを含む。
特定の実施形態において、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー）は、１個または複数の細胞の全ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得るまたは調製し、このｃＤＮＡライブラリーを断片化し、断片化されたｃＤＮＡを末端修復酵素で処理して、断片化され末端修復されたｃＤＮＡを作製し、多機能性アダプター分子を、断片化され末端修復されたｃＤＮＡにライゲーションして、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを作製することにより調製される。
ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡライブラリーは、オリゴｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーである。
ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡライブラリーは、約６～約２０ランダムヌクレオチドを含むランダムオリゴヌクレオチドによってプライミング作製される。特定の好ましい実施形態において、ｃＤＮＡライブラリーは、ランダムヘキサマーまたはランダムオクタマーによってプライミングされる。
所望の平均ライブラリー断片サイズを達成するために、ｃＤＮＡライブラリーは、公知の方法を使用して剪断または断片化することができる。一実施形態において、ｃＤＮＡライブラリーは、約２５０ｂｐ～約７５０ｂｐの平均サイズに断片化される。ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡライブラリーは、約５００ｂｐの平均サイズに断片化される。
様々な実施形態において、本明細書において企図されるＲＮＡ発現ライブラリーは、軽微な変化ありまたはなしで、タグ付けされたゲノムＤＮＡライブラリーを捕捉、プロセシングおよびシークエンシングするための本明細書において企図される方法のいずれかを使用して、捕捉、プロセシング、増幅およびシークエンシング等することができる。
一実施形態において、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを多機能性捕捉プローブモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブモジュールが、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離するステップと、単離されたタグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブモジュール複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングおよび／または５’－３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行するステップと、酵素によりプロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行するステップであって、ハイブリッド核酸分子を作製するために、多機能性捕捉プローブ分子のテイル部分（例えば、ＰＣＲプライマー結合部位）がコピーされ、このハイブリッド核酸分子が、標的領域の相補体、特異的多機能性捕捉プローブ配列および捕捉モジュールテイル配列を含むステップと、ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝子発現解析を実行するステップとを含む、標的化遺伝子発現解析のための方法が提供される。
一実施形態において、標的化遺伝子発現解析のための方法は、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリーを多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体とハイブリダイズさせるステップであって、この多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュールが、ＲＮＡ発現ライブラリーにおける特異的標的領域と選択的にハイブリダイズするステップと、タグ付けされたＲＮＡ発現ライブラリー－多機能性捕捉プローブハイブリッドモジュール複合体を単離するステップと、複合体に対してＰＣＲを実行して、ハイブリッド核酸分子を形成するステップとを含む。
特定の実施形態において、少なくとも２回のハイブリダイゼーションステップにおいて、少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが使用され、この少なくとも２回のハイブリダイゼーションステップは、それぞれ１種の多機能性捕捉プローブモジュールを用いる。ある特定の実施形態において、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、標的領域の５’とハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールは、標的領域の３’とハイブリダイズする。
一実施形態において、１種または複数の多機能性捕捉プローブは、標的領域からのあらゆる介在する距離を含む、タグ付けされたＲＮＡ発現またはｃＤＮＡライブラリーにおける標的領域の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｂｐ以上の内にハイブリダイズする。
一部の実施形態において、方法は、いずれかの数の多機能性プローブモジュールにより、複数回さらに実行することができ、例えば、標的領域当たり２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の多機能性捕捉プローブモジュールを用いて、そのうちいずれかの数がいずれかの組合せでワトソンまたはクリック鎖とハイブリダイズする。
ある特定の実施形態において、１種または複数の多機能性プローブモジュールを使用して、単一の反応において複数の標的領域が照合され、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００種以上が照合される。
さらなる実施形態において、当業者にｃＤＮＡライブラリーからの遺伝子発現解析を実行させることができる、ｃＤＮＡ配列解析のための方法が提供される。特定の実施形態において、本明細書において企図されるシークエンシング方法のいずれかは、タグ付けされたゲノムクローンのシークエンシングへのその適用から殆どまたは全く逸脱することなく、ｃＤＮＡライブラリーのシークエンシングに適応させることができる。上述の通り、本明細書において企図されるＲＮＡ発現解析におけるｃＤＮＡの標的領域のタグ付けされたｃＤＮＡシークエンシングリードの統計分布は、ｃＤＮＡライブラリーを調製したまたは得た細胞における標的領域の遺伝子発現のレベルと相関する。
本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許出願および交付された特許は、あたかも個々の刊行物、特許出願または交付された特許のそれぞれが、参照として援用すると特にかつ個々に示されているかのように、ここに参照として援用する。
理解を明確にするために、例証および具体例として、前述の発明を詳細に記載してきたが、当業者であれば、本発明の教示するところを鑑み、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、これにある一定の変更および修正を行ってよいことが容易に明らかとなるであろう。次の実施例は、限定としてではなく、単なる例証として示されている。当業者であれば、本質的に同様の結果を得るために変更または修正することができる、種々の重大でないパラメータを容易に認識するであろう。
（実施例１）
遺伝子解析のための標的ゲノム領域の調製
総括
特定の実施形態では、本明細書で想定される方法は、いくつかの鍵となる分子モジュールの組織化された活用を含む。以下の節では、各モジュールについて個別に記載する。本節の末尾では、モジュールの相互関連について記載する。
１節：ゲノムＤＮＡ断片へのタグ付け
個体から得られるゲノムＤＮＡは、回収し、純粋なＤＮＡにプロセシングすることができ、１ヌクレオチド以上の、一部の実施形態では、２～１００ヌクレオチドの範囲の、または２～６ヌクレオチドの範囲の、断片化されたランダムなヌクレオチド配列を、ゲノムＤＮＡ断片のランダム末端に結合させる（図１）。導入されたランダムヌクレオチドタグ配列の、ゲノム断片末端配列との組合せは、本明細書の以下では、多機能性アダプターモジュールの第１の領域と称する、２つのエレメントの独特の組合せを構成する。多機能性アダプターモジュールの第１の領域が独特のものであることは、結合させた多機能性アダプターモジュールの第１の領域のプール内の多様性に、ゲノム断片末端配列の多様性を乗じた組合せの積により決定する。
２節：試料特異的コードおよびユニバーサル増幅配列の付加
多機能性アダプター分子は、試料特異的コード（本明細書では、多機能性アダプターモジュールの第２の領域と称する）およびユニバーサル増幅配列（本明細書では、ＰＣＲプライマー配列または多機能性アダプターモジュールの第３の領域と称する）もさらに含みうる。多機能性アダプターモジュールの第１の領域から得られる、導入されたランダムヌクレオチドに加えて、断片化されたゲノムＤＮＡに結合させた各セグメントは、この領域のＤＮＡ配列を使用して、複数の試料が一体に組み合わされている配列のセット内の所与の試料配列を独特に同定（言い換えると、試料のバーコード化）しうるように、各試料に共通であるが、試料間で異なるヌクレオチドのさらなるセットも含みうる。加えて、結合させたヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドを増幅する（例えば、ＰＣＲにより）のに使用されうる、ユニバーサル配列も含有しうる。ランダムヌクレオチドタグ配列、試料コード、およびユニバーサル増幅配列のエレメントの組合せは、最も一般的には、ヌクレオチドライゲーションにより、断片化されたゲノムＤＮＡに結合させる、「アダプター」（また、多機能性アダプターモジュールとも称する）を構成する。
断片化されたｇＤＮＡにライゲーションされた多機能性アダプターモジュールの例示的な（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ）例を、図１に例示し、（例により限定されることを望まないが）このような配列の例示的な（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）セットを、表１に示す。表１内では、アダプター配列のセットを、４種のアダプター配列のセットにクラスター形成する。各欄内では、同じ２種の塩基コードを共有する全てのアダプターおよび可能な１６のランダムタグの全てを表す。可能な１６のアダプターは、断片とのライゲーションの前に混合する。各アダプターのトップ鎖である「ライゲーション鎖」だけを示すが、これは、末端修復されたＤＮＡ断片に共有結合させる鎖である。最終的に失われるボトム鎖であるパートナー鎖は、図１には示すが、表１には組み入れない。
単一の増幅配列を伴う単一のアダプター群（すなわち、ユニバーサル増幅配列、試料特異的コード、およびランダムタグのセット；また、多機能性アダプターモジュールとも称する）の、ゲノム断片の両方の末端への適用は、その２つの末端において、同じゲノム断片に独立にタグ付けするという事実を含む、いくつかの顕著な利点を有する。以下のいくつかの節において記載する通り、所与の任意の断片による２種の鎖は、最終的には互いから分離され、本発明では独立の分子として挙動するであろう。したがって、同じ断片の２つの末端における２種の異なるタグの存在は、本発明の欠点ではなく、利点となる。加えて、アダプター間のライゲーション事象は、初期目標が異種末端を伴うアンプリコンを創出することである、次世代ライブラリーの構築において大きな問題であるという事実もある。本発明の方法を使用する場合、方法でこの非対称性を導入するのは、工程の後半であり、したがって、本発明では、同一な末端も許容可能である。本方法の未見で驚くべき利益は、本発明のライブラリー構築法では、アダプター二量体が観察されないことである。理論により束縛されずに、本発明者らは、これが、急速に形成された、希少なアダプター二量体分子種は、ＰＣＲ増幅に必要な変性ステップおよびアニーリングステップにおいて、緊密なヘアピン構造を形成するためでありうることを想定するが、これらのヘアピン構造が、プライマーに方向付けられたさらなる増幅に対して完全に耐性であることもさらに想定される。アダプター二量体非含有ライブラリーを作製する可能性は、単一細胞～少数細胞によるゲノム解析、循環ＤＮＡ解析（胎児診断法、組織移植拒絶の監視、またはがんスクリーニングへの適用）、または単一細胞のトランスクリプトーム解析など、極低投入量の適用において重要な技術的特色である。本方法はそれ自体、このような適用において、顕著な有用性を提供する。単一プライマーによるアンプリコンのさらに顕著な特色は、２５ヌクレオチドのＰＣＲプライマーによる増幅を「オン」にし、より長い５８ヌクレオチドのプライマーによる増幅を「オフ」にすることが可能なことである。これについては、下記の６－５節でより詳細に記載し、本発明に対する重要性についても強調する。
概説
単一のユニバーサル増幅配列を、標的断片の両方の末端において使用するアダプター戦略により、アダプター二量体に関する問題が解消される。これは、一例として、実施例３：単一アダプターによるゲノムライブラリーの構築において明確に実証される。
３節：ライブラリーによる定量化
ゲノム解析戦略のための本方法のさらなる側面は、「カバレージ深度」が既知である、すなわち、ライブラリー内に存在する平均ゲノムコピー数が既知であるか、またはこれを決定しうることである。カバー深度は、後続のステップに必要なライブラリーのバルク増幅の前に、精製されたライゲーション反応物を使用して測定する。例示を目的として述べると、５０ゲノム相当のＤＮＡを、本発明の実施形態のライブラリースキームに投入し、アダプターの、断片の両方の末端へのライゲーションが１００％の効率でなされる場合、各アダプター末端が他のアダプター末端とは独立に作用し、よって、２末端×５０ゲノム＝１００カバレージであるため、カバレージ深度は１００である。本明細書で想定されるユニバーサルＰＣＲプライマーでは、アダプター二量体は増幅されず、両方の末端においてアダプター処理された断片が増幅されるという単純な事実は、ライブラリーによる定量化が、単に、ユニバーサルプライマーを使用する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）によりライブラリーの複雑性を測定し、結果をカバレージ深度が既知である基準物質に対して較正する問題となることを意味する。本明細書では、「ゲノムコピー」および「カバレージ深度」という語句は、同じ事柄を意味し、互換的に使用することができる。本方法は、４～１０００、好ましくは２０～１００倍のカバレージ深度を、次の段階（ｐｈａｓｅ）である、本発明に従う試料プロセシングに送り込む。
４節：ライブラリーによる増幅
特定の実施形態では、アダプターをライゲーションされた、２０～１００倍のカバレージ深度に相当するゲノム断片ライブラリーの一部を、増幅を駆動する単一のユニバーサルプライマー配列による、標準的なＰＣＲ法を使用して増幅することになる。特定の実施形態では、この段階（ｓｔａｇｅ）において、初期ライブラリー内の数ピコグラムの材料を、１０，０００倍の増幅を含意する、数マイクログラムの増幅された材料に転換することが有利である。
５節：標的ライブラリー断片の、捕捉プローブとのハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチド合成化学における進歩により、洗練されたゲノム捕捉戦略のための新たな機会が創出されている。特に、現在では、１塩基当たりの合成費用が妥当であり、収率が比較的高く、塩基精度が優れた、長いオリゴヌクレオチド（１００～２００ヌクレオチドの長さ）が、様々な販売元から市販されている。この能力により、本発明者は、多機能性捕捉プローブを創出する（図２）。多機能性捕捉プローブの例示的な例のエレメントは、以下を含む。
領域１は、全てのプローブに共通な３４ヌクレオチドの領域であって、修飾された相補的なオリゴヌクレオチド（また、パートナーオリゴヌクレオチドとも称する）とハイブリダイズする領域を含む。この修飾オリゴヌクレオチドは、５’端において、ストレプトアビジンタンパク質に緊密に結合することが可能なビオチンであって、ビオチン結合に対する立体障害を緩和する、長い親水性のスペーサーアームである、ビオチン－ＴＥＧ修飾もさらに含む。３’端において、オリゴヌクレオチドは、このパートナーオリゴヌクレオチドをプライマーの伸長に対して不活性とする、ジデオキシシトシン残基で終結する。プローブデザインのこのエレメントは、前記プローブを直接修飾することなく、非限定的な数のプローブを、ビオチンによる捕捉機能性でアダプター処理することを可能とする。
領域２は、標的特異的であり、ｇＤＮＡ断片分子と相互作用する、特注の６０ヌクレオチドの領域を含む。ゲノム内の配列が独特のものであること、結合効率を損ないうる共通なＳＮＰの存在、および二次構造についての検討を促すこの領域は、コンピュータによる方法を介してデザインする。
領域３は、後続の断片増幅において、ＰＣＲプライマー結合性部位として用いられる、２０ヌクレオチドのセグメントを含む。この特色については、以下の段落においてさらに詳細に記載する。
プローブの多重性を使用して、対象のゲノム領域を捕捉することができる（プローブのマルチプレックス化）。少なくとも２種のプローブを援用して、典型的な、１００～１５０ｂｐの長さのコードエキソンを完全にクエリーすることができる。一例として、これにより、２０種のプローブを使用して、典型的な１０種のエキソン遺伝子を捕捉し、合計２０００種のプローブを使用して、１００種の遺伝子パネルを精査することになろうことが指し示される。ゲノムライブラリー断片の、プローブとのハイブリダイゼーションは、熱変性に続く再アニーリングにより実行することができる。一実施形態では、ステップは、以下を含む。
１．ゲノムライブラリー断片を、プールされたプローブ配列（この場合、「プローブ配列」とは、個々のプローブの、等モル量の、高度に修飾されたパートナーオリゴヌクレオチドとの組合せを指す）と、プローブ１種に対する標的１種～プローブ１，０００，０００種に対する標的１種の範囲にわたる具体的な標的対プローブ比で組み合わせるステップ。一実施形態では、最適の比は、プローブ１０，０００種に対する断片約１種である。
２．組み合わせた断片＋プローブを、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＴｗｅｅｎ ２０（非イオン性の洗浄剤）を含有する溶液中で、＞３０秒間にわたり９５℃まで加熱して、全ての二本鎖ＤＮＡ構造を変性させるステップ。
３．組み合わせたプローブおよび断片を、段階的に制御して、例えば、２分ごとに温度１℃ずつ、＜６０℃までの低下により冷却するステップ。この緩徐な冷却により、標的ゲノム断片とプローブ配列との二重鎖が結果としてもたらされるであろう。
４．プローブ：断片複合体を、カルボキシルでコーティングされ、ストレプトアビジンで修飾された常磁性ビーズに結合させ、これらのビーズを、強力な磁石を使用して「プルアウト」するステップ。
５．結合させた複合体を、２５（ｖ／ｖ）％のホルムアミド、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有する溶液で洗浄するステップ。特定の実施形態では、洗浄ステップを、少なくとも２回にわたり実行する。
６．洗浄されたビーズを、後続の酵素プロセシングステップに適する溶液中に再懸濁させるステップ。
捕捉反応
捕捉反応の実施形態は、実施例３（単一アダプターによるゲノムライブラリーの構築）において提示し、実施例５（ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイの検証）において展開され、さらに記載される、ｑＰＣＲアッセイを援用する。
６節：ハイブリダイズさせたプローブ：標的複合体の酵素プロセシング
当技術分野で現在実行されている通り、ハイブリダイゼーションベースの配列捕捉法は一般に、最適未満の標的配列の濃縮を結果としてもたらす。文献および市販の刊行物からは、リードのうちで、それらの意図される標的配列にマップされるのは、せいぜい約５％～１０％であると推定することができる。残りのリードは、意図される標的の近傍にマップされることが多く、市販品の販売元は、「的中」を、意図される遺伝子座から約１０００塩基以内に収まるリードと定義し直している。この「スプレッディング」効果の理由は、完全に理解されてはおらず、正規の配列ハイブリダイゼーションイベントの結果である可能性が高い（例えば、図３を参照されたい）。
本明細書で想定される複合体の酵素プロセシングは、捕捉された配列を、正確な対象領域に、より鋭利にフォーカスする。このステップでは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性もまた保有するＤＮＡポリメラーゼを援用する。このような酵素の例示的な例は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、ダングリングテイル配列を、プローブと標的配列との間で形成された二重鎖領域から「齧り取る」であろう。次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、プローブ上のテイルセグメントをコピーするであろう。例えば、図４を参照されたい。このステップによりもたらされる利益は、以下を含むがこれらに限定されない。
１．この種の酵素プロセシングを援用することにより、プローブと直接にハイブリダイズして二重鎖化された断片だけを先に進める。最終的なシークエンシングライブラリーは、断片およびプローブの両方から得られる分子のキメラ（ハイブリッド）セットである。
２．プローブは、鎖特異的であり、したがって、捕捉された標的は、プローブに照らした独特の有向性を有する（図５で例示する）。これは、単一の断片から作製された２種の鎖のうちの一方だけが、プローブと相互作用し、プロセシングは、リードを、プローブ配列の５’領域に「フォーカス」することを意味する。この点で、断片の相補鎖は、完全に独立の分子種となる。有向プローブを、標的領域（例えば、エキソン）の片側に配置することにより、技術は、標的領域上のシークエンシングリードの高度に特異的なフォーカシングを可能とする（図６）。
３．標的断片と正規に交差ハイブリダイズした（しかし、プローブとは交差ハイブリダイズしなかった；図３）標的分子は、不可欠のプローブ配列を取得せず、したがって、後続の増幅ステップでは失われる。
４．プローブの実際の「テイル」配列は、増幅配列の一部として、標的断片にコピーされる。全ての市販の実行可能なシークエンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製の、可逆性ターミネーター化学反応によるシークエンシングプラットフォーム）は、標的断片が非対称末端を有するシークエンシングライブラリーを必要とし、これは、「フォワード」アダプター配列および「リバース」アダプター配列と称するか、またはシークエンシングラボの略称では、「Ｐ１」および「Ｐ２」と称することが多い。特定の実施形態では、この時点までに、本明細書で想定される断片ライブラリーは、末端において単一の分子種を有し、「Ｐ１」と判定される。酵素プロセシングステップは、２つの事柄を達成する。第１に、酵素プロセシングステップは、これらのＰ１末端のうちの１つを「消失させる」（３’－５’エキソヌクレアーゼ活性により）。第２に、酵素プロセシングステップは、Ｐ１とは異種のＰ２末端の基部を「付加する」（ＤＮＡポリメラーゼによるプローブテイル配列のコピーを介して）。
５．正規のＰ１－Ｐ２末端で酵素的に修飾された標的分子は、プロセシングに後続するＰＣＲ増幅ステップにおいて、選択的に濃縮することができる。これは、長いＰＣＲプライマーの使用により達成する。特に、長いプライマーは、次世代シークエンシングに必要とされる十分な機能性を付加するために必要であり、また、増幅に選択性も付与する。増幅の第１ラウンドから得られる「夾雑物」である、残留Ｐ１－Ｐ１ライブラリー断片は、長いＰ１プライマーでは増幅されない。これは、本方法の顕著な利点である。初期Ｐ１－Ｐ１ライブラリーは、単一の、２５ヌクレオチドのＰＣＲプライマーで効果的に増幅される。このプライマーの長さが、５７ヌクレオチドまで伸長し（シークエンシングの機能性が付加され）たら、これらの同じＰ１－Ｐ１分子は、いかなる程度でも増幅されない。したがって、初期ライブラリーの増幅は、２５ヌクレオチドのプライマーで「オン」にし、５７ヌクレオチドのプライマーで「オフ」にすることができる。
概説
Ｐ１－インサート－Ｐ１ライブラリーが増幅されないことは、実施例３（単一アダプターによるゲノムライブラリーの構築）で実証される。Ｐ１－インサート－Ｐ２のプロセシングされたＤＮＡ断片の優先的な増幅を、実施例３（単一アダプターによるゲノムライブラリーの構築）に示す。実施例３では、プロセシングに伴う標的特異度の実質的な改善についてもさらに実証する。最後に、プロセシングされた初期複合体のパーセントを意味するプロセシングの「感度」は、捕捉された全ての複合体のうちの１０％のオーダーにあることを、実施例９（捕捉後プロセシングの直接的な測定）において実証する。
７節：増幅およびシークエンシング
初期概念実証実験に適用されるコアアダプター配列およびプライマー配列を表２に示す。ステップ６から得られた、酵素プロセシングされた複合体を、全長フォワードＰＣＲプライマーおよび全長リバースＰＣＲプライマーを含有する、ＰＣＲ増幅反応物に直接付加する。増幅の後、ライブラリーを、精製し、定量化し、ハイスループットの次世代シークエンサー上にロードすることができ（この実施形態では、ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる可逆性ターミネーターベースのプラットフォーム用に構成する）、約数百万種の断片の配列を決定する。この段階では、＞３６ヌクレオチド、好ましくは７２または１００＋ヌクレオチドの長さの単一のリードを観察することができる。
８節：データ解析
シークエンシング後データ解析には、少なくとも２つの主要な側面がある。第１の側面は、配列変異体（参照配列の確立されたセットに照らした、一塩基変異体、微細挿入および／または微細欠失）の同定である。複雑ではあるが、当技術分野では、これらの方法が十分に記載されており、当業者であれば、このような方法を理解するであろう。第２の側面は、標的化シークエンシングデータから得られるコピー数変異の決定である。
（実施例２）
コピー数の決定
コピー数の決定は、ＤＮＡシークエンシングの分野において様々に使用される。非限定的な例として、大量パラレルＤＮＡシークエンシング技術は、生物学的試料を精査および解析する、少なくとも２つの機会をもたらす。十分に確立された１つの側面は、試料中に存在するデノボ配列を意味するＤＮＡ配列の決定（例えば、新たに単離された微生物のシークエンシング）または変異体のための、既知の領域のリシークエンシング（例えば、既知の遺伝子内の変異体の検索）を意味するＤＮＡ配列の決定である。大量パラレルシークエンシングの第２の側面は、定量的生物学および特定の配列に遭遇する回数をカウントする可能性である。これは、カウンティングを使用して、それぞれ、遺伝子発現または特定のタンパク質のゲノムＤＮＡとの関連を推量する、「ＲＮＡ－ｓｅｑ」および「ＣＨＩＰ－ｓｅｑ」などの技術の根本的な側面であろう。本実施例は、ＤＮＡシークエンシングの定量的でカウンティングベースの側面に関する。
ＤＮＡ断片は、高度な類似性を共有する配列の配座としてカウントされる（すなわち、ＤＮＡ断片は、公知のゲノム配列の特異的領域と整列する）ことが極めて多い。これらのクラスター内の配列は、同一であることが多い。ａ）異なる開始ＤＮＡ配列および終結ＤＮＡ配列のリード、またはｂ）セット内の他のリードから得られる高品質の配列差を伴うＤＮＡ配列はしばしば、「独特のリード」と考えられることに注目されたい。したがって、異なる開始配列位置および配列変異は、クローンから得られる独特のイベントを差別化するのに使用される「タグ付け」の一形態である。本実施例ではまた、ライブラリー構築のコースにおいて、ゲノム断片に、ランダムヌクレオチドタグ（例えば、ランダムの６ヌクレオチド配列）も導入する。１）ランダムヌクレオチドタグ配列を、２）ＤＮＡシークエンシングリードの開始点、および３）リードの実際の配列と組み合わせることにより、タグを集合的に構成する。このタグにより、同じ断片が２回にわたりクローニングされた収束イベント（このような断片は、ライブラリー構築において導入された、異なるランダムヌクレオチドタグ配列を有するであろう）と、ライブラリーによる増幅において複製された同じ由来の断片（これらの「クローン」は、同じランダムヌクレオチドセグメント、および同じクローン開始点を有するであろう）とを差別化することが可能となる。この種のタグ付けはとりわけ、ゲノムＤＮＡについての定量的解析もさらに可能とするが、より一般には、ＤＮＡ分子（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー）についての定量的解析もさらに可能とする。
ランダムヌクレオチドタグ（ＤＮＡクローン末端と組み合わせたランダムＮマー）を、ＤＮＡシークエンシングライブラリーに導入することにより、理論的には、ライブラリー内の各独特のクローンを、その独特のタグ配列により同定することが可能となる。「理論的には」と明記することにより、シークエンシングにおけるエラー、ライブラリーによる増幅において導入されるエラー、他のライブラリーからの夾雑クローンの導入など、生じうる通常の実験データセットの交絡特徴を認識する。これらの交絡源の全ては、本明細書で提起される理論的検討を交絡させる。配列捕捉および標的化リシークエンシングの文脈では、ライブラリーをタグ付けすることにより、捕捉されたライブラリー内の遺伝子座コピー数についての定量的解析を可能とすることができる。
非限定的な例として、男性対象から創出された、１００二倍体ゲノム相当の投入量から構築されるライブラリーについて検討しよう。予測では、各常染色体の遺伝子座において、約２００種のライブラリークローンが存在し、各Ｘ染色体遺伝子座において、１００種のクローンが存在するであろう。常染色体領域を捕捉し、２０００回にわたりシークエンシングすれば、２００種のタグの全てに、９９％の確実性を超える信頼区間で遭遇するであろう。Ｘ染色体領域では、理論的には、２０００種のリードは、合計１００種のタグを明らかにするであろう。例示として、本実施例では、ＤＮＡシークエンシングライブラリー内でＤＮＡタグを創出することにより、コピー数の差違を保存しうるという一般的概念が裏付けられる。この一般的枠組みを、本明細書で記載される方法に適用することができる。経験的証拠は、遺伝子座ごとのベースのクローニング効率の差違について、実験エラーなどからのアーチファクトタグの散在的な導入について調整を行う必要がありうることを示唆する。この概念の実際的な実装は、異なる文脈において異なる可能性があり、事例ごとの配列解析法を伴いうるが、本明細書で概括される一般的原理は、このような適用の全てに通底するであろう。
現時点まで、タグ付けされたＤＮＡライブラリーの創出は、ゲノムＤＮＡ解析の文脈において検討されているが、この概念は、全てのカウンティングベースのＤＮＡシークエンシング適用に当てはまることを強調しなければならない。特定の実施形態では、タグ付けは、ｍＲＮＡ試料から作製されるｃＤＮＡ分子を、タグを創出する方法によりクローニングする、ＲＮＡ－ｓｅｑに適用することができる。このような手法は、配列ベースの遺伝子発現解析の忠実度を実質的に増大させうる。ある特定の実施形態では、タグ付けにより、クロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）－ｓｅｑ）実験の分解能を増大させうることが想定される。多様な実施形態では、タグ付けにより、ミクロビオーム区画内および環境試料内の微生物の存在および存在量を決定するのに使用される、配列カウンティングの定量的側面が増強されるであろう。
（実施例３）
単一アダプターによるゲノムライブラリーの構築
目的
本実施例の目標は、音響処理により断片化されたＰｒｏＭｅｇａによる女性ｈｇＤＮＡ（約２００ｂｐ）から、ゲノムＤＮＡライブラリーを創出することであった。
概要
結果は、アダプターをデザインするための本方法の顕著な特色を明確に実証した。特に、アダプター単独のライゲーション反応は、検出可能なアダプター二量体分子種を存在させなかった。本方法と同様、投入量の限界は、アダプター二量体のバックグラウンドレベルにより不変的に決定されるので、極低投入量のシークエンシングライブラリー調製技術の文脈では、これは、極めて重要であった。アダプター二量体の夾雑に対する点検を維持しようとする試みでは、高度に特化された技術が適用されている。これらは、カラムまたはゲル精製などのサイズ除外法、アダプターの自己ライゲーションイベントを最小化するようにデザインされた、高価な特注のオリゴヌクレオチド修飾、およびライブラリー構築の後における、制限消化によるアダプター二量体の破壊を可能とする、アダプター配列修飾を含む。
本明細書で想定される、単純な、単一アダプター、単一プライマーの概念により、ＤＮＡ構造原理の基本原理を喚起する単純な溶液に伴うアダプター二量体問題に取り組む。この極低投入量の技術は、ゲノム解析のためのゲノムライブラリーを構築するのに有用であり、例えば、１種または数種の特殊な細胞に対するＲＮＡ－ｓｅｑ適用における、クローニングされた二本鎖ｃＤＮＡについてのトランスクリプトーム解析にも有用であり、高度に修飾され、保存不良の、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）核酸試料中に存在しうるいくつかのインタクトな断片をレスキューするのにも有用であろう。
本発明のアダプターデザインの別の不可欠の特色は、異なるＰＣＲプライマーの長さを使用することにより、標的アンプリコンライブラリーのＰＣＲ増幅を「オン」および「オフ」にする能力である。明確に実証された通り、ライブラリーによる増幅に最適のプライマーの長さは、推定Ｔｍ（標準的なイオン強度条件下における）を≧５５℃とする、２５ヌクレオチドのプライマー分子種であった。短く、Ｔｍの低いプライマーは、アンプリコンの低効率の増幅を提示し、平均インサートサイズが小さなアンプリコンに好都合であると考えられた。異種配列の逆向きのプライマーと対合させる場合は、このサイズクラスのプライマーが良好に働くという先例は多くみられる。
まとめると、これらのデータは、本発明のアダプターおよびＰＣＲ増幅法により、「チューニング可能な、オン／オフ」の増幅特性を伴う、アダプター二量体非含有断片ライブラリーが作製されることを実証した。
方法
ＩＤＴから受領したプライマーを、ＴＥｚｅｒｏ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中に１００μＭまで水和させた。
断片の修復：
－ １４μｌの水
－ ５μｌのｈｇＤＮＡ
－ １０倍濃度の末端修復緩衝液２．５μｌ
－ １ｍＭのｄＮＴＰ ２．５μｌ
－ １μｌの末端修復酵素と、０．５μｌのＰｒｅＣＲ酵素修復ミックスとを、混合および添加したもの
を組み合わせることにより、融解させたｇＤＮＡおよび５００ｎｇのｇＤＮＡを末端修復した。
混合物を、２０℃で３０分間にわたり、かつ、７０℃で１０分間にわたりインキュベートし、１０℃で保持した。
アダプターのアニーリング：６８μｌのＴＥｚｅｒｏと、５ＭのＮａＣｌ ２μｌと、２０μｌのオリゴ１１と、１０μｌのオリゴ１２とを組み合わせた。１０秒間にわたり９５℃まで加熱し、６５℃で５分間にわたり加熱し、ＲＴまで冷却した。
ライゲーション：２０μｌの総容量：
－ １３μｌまたは８μｌの水
－ ０または５μｌの末端修復された断片＝１００ｎｇ。
－ １０倍濃度のＴ４リガーゼ緩衝液２μｌ
－ ５０％のＰＥＧ８０００ ３μｌ
－ １０μＭのＡＣＡ２アダプター２３の二重鎖１μｌ
－ １μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを混合および添加したもの
中に、１＝インサートを伴わないｈｇＤＮＡ、２＝１００ｎｇの末端修復されたｈｇＤＮＡを組み合わせた。
２３℃で３０分間にわたり、かつ、６５℃で１０分間にわたりインキュベートした。反応１回当たり８０μｌのＴＥｚおよび１２０μｌのビーズを添加した。混合し、ＲＴで１０分間にわたりインキュベートした。７０％のＥｔＯＨ：水（ｖ／ｖ）のアリコート２００μｌで、２回にわたり洗浄し、５０μｌのＴＥｚ中に再懸濁させた。
ＰＣＲ増幅：ライゲーションミックスのアリコート各１０μｌ＝２０ｎｇずつのライブラリー。１８サイクルにわたり増幅するように計画した。
プライマーおよび鋳型を除く全ての成分を含有する６００μｌのミックスを作製した。８０μｌのアリコート６つを作製した。１０μｌのインサートを伴わないライゲーションミックスを、セット１に添加し、１０μｌのｈｇＤＮＡインサートを、セット２に添加した。下記に示される対合したプライマーのうちの１０μＭのプライマーを、インサートを伴わないライゲーションミックスおよびｈｇＤＮＡインサートによるライゲーションミックスに添加した。混合した。９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間の１８サイクルにわたりサーマルサイクリングさせ、最後に７２℃で２分間にわたりサーマルサイクリングさせ、１０℃で保持した。
ＰＣＲ産物を、１２０μｌのビーズで精製した。７０％のＥｔＯＨ ２００μｌで、２回にわたり洗浄した。ビーズを乾燥させ、ＤＮＡを、５０μｌのＴＥｚで溶出させる。５μｌの各試料を、２％のアガロースゲル上で解析した。
結果
全く同じゲル画像を、４つの異なる色およびコントラストスキームで、図７に示す。ゲル上にロードした試料は、
１．ＡＣＡ２ ２０により増幅される、インサートを伴わない、アダプターだけのライゲーションミックス
２．ＡＣＡ２（通常の２５ヌクレオチドのＰＣＲプライマー）により増幅される、インサートを伴わない、アダプターだけのライゲーションミックス
３．ＡＣＡ２ ＦＬＦＰ（全長フォワードプライマー）により増幅される、インサートを伴わない、アダプターだけのライゲーションミックス
４．ＡＣＡ２ ２０により増幅される、約２００ｂｐのｈｇＤＮＡインサート＋アダプターによるライゲーションミックス２０ｎｇ
５．ＡＣＡ２（通常の２５ヌクレオチドのＰＣＲプライマー）により増幅される、約２００ｂｐのｈｇＤＮＡインサート＋アダプターによるライゲーションミックス２０ｎｇ
６．ＡＣＡ２ ＦＬＦＰ（全長フォワードプライマー）により増幅される、約２００ｂｐのｈｇＤＮＡインサート＋アダプターによるライゲーションミックス２０ｎｇ
であった。
アダプター単独のライゲーション→ＰＣＲ産物中（レーン１～３）では、材料が増幅されないことが明らかであった。短い、２０ヌクレオチドのＡＣＡ２プライマー（レーン４）は、「通常の」、２５ヌクレオチドのＡＣＡ２プライマー（レーン５）と比べて非効率的な増幅を示した。５８ヌクレオチドのＡＣＡ２ ＦＬＦＰプライマー（レーン６）では、材料のごくかすかな痕跡が目視可能であるに過ぎなかった。
さらなる実施形態では、ＡＣＡ２プライマーの量で滴定し、収率をモニタリングすることが有用でありうる。通常の高収率のＰＣＲプライマーは、合計２μＭのプライマー（１００μｌのＰＣＲ反応物当たり）につき、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方を１μＭずつ保有する。したがって、ＡＣＡ２を２μＭまで（フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方であるので）添加することにより、収率を増大させることができる。同様に、特定の実施形態では、６０℃より低いプライマーアニーリング温度において、ライブラリーの増幅特徴をモニタリングすることが有用でありうる。
（実施例４）
ｇＤＮＡの断片化
目的
初期の原理実証実験のために、男性および女性から得られた、シアリングされたヒトｇＤＮＡを必要とした。本例では、Ｐｒｏｍｅｇａ製のヒト女性およびヒト男性のｇＤＮＡを援用する。チューブ上に示される量に基づき、これらを、１００ｎｇ／μｌのＤＮＡ１０００μｌまで希釈し、２００ｂｐの範囲の断片を作製することが意図される、Ｃｏｖａｒｉｓ条件下に置いた。
概要
実験室の研究基盤には、少なくとも２つの構成要素が存在する。一方は、ＤＮＡを定量化する能力であり、他方は、ゲル上のＤＮＡのサイズ分布を可視化する能力である。本実施例では、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＱｕｂｉｔ ２．０測定器を援用して、ＤＮＡ濃度を測定した。記録された読取り値は、Ｎａｎｏｄｒｏｐによる本発明者らのかつての実験より一般に小さいことが分かった。Ｑｕｂｉｔによる読取り値は、ｄｓＤＮＡ特異的な色素結合および蛍光に基づいた。Ｑｕｂｉｔの１つの主要な利点は、あらかじめのクリーンナップを伴わずに、ＤＮＡ増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を定量化するのに使用しうることである。これらの実験では、１００ｎｇ／μｌであると考えられたＰｒｏｍｅｇａ ｇＤＮＡが、Ｑｕｂｉｔでは、約６０ｎｇ／μｌと測定されることが分かった。ゲルおよびサイズ分布についての定性的評価に関しては、電気泳動が施され、システムは効果的に働いたという記録がなされている。本実施例では、断片化されたｇＤＮＡは、所望の約２００ｂｐを中心とする平均サイズ分布を有することが分かった。
方法および結果
Ｃｏｖａｒｉｓ処理の後、Ｑｕｂｉｔ測定器を使用して、ＤＮＡ濃度を測定した。ｇＤＮＡを１０倍に希釈し、２μｌを、２００μｌの最終容量のアッセイ溶液に添加した。女性試料および男性試料のいずれについての読取り値も、約６０ｎｇ／ｍＬと記録されたが、これは、開始溶液が、６０ｎｇ／μｌであることを意味する。これは、当初の予想を下回ったが、十分に、特定の実施形態に適切な範囲内にはあった。次いで、本発明者らは、断片化前および断片化後両方の材料２μｌ（１２０ｎｇ）および５μｌ（３００ｎｇ）を、２％のアガロースゲル上にロードした（図８）。上の行の記号は、Ｍ：男性のｇＤＮＡおよびＦ：女性のｇＤＮＡを表す。下の行の記号は、Ｕ：断片化されていない、およびＣ：Ｃｏｖａｒｉｓにより断片化されたである。１つの重要な観察は、平均断片サイズが、２００ｂｐ近傍を中心とする均等分布であることであった。
（実施例５）
ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイの検証
目的
Ｘ染色体上のプロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）遺伝子を、初期概念実証捕捉研究のために検討した。この遺伝子は、がんに関与性であり、Ｘ染色体上に存在し、これは、男性と女性との間で天然のコピー変異を有することを意味するために選択した。ＰＬＰ１のＲｅｆ－Ｓｅｑ転写物であるＮＭ０００５３３．３の、１８７ヌクレオチドのエキソン２領域を、標的領域として使用した。原理実証研究のために、ＰＬＰ１エキソン２内およびＰＬＰ１エキソン２近傍の領域を、ｑＰＣＲによりモニタリングする能力が必要とされた。本実施例は、８つのこのようなアッセイのデザインおよびバリデーションについての記載を提示する。
概要
ＰＬＰ１エキソン２の捕捉をモニタリングするように、８種のｑＰＣＲアッセイ（この場合、単純なプライマー対を意味する）をデザインした。５種のアッセイが的中したことは、それらが、捕捉プローブにより標的化される領域内にあることを意味する。２種が「標的の近傍」にあることは、１種のアッセイが、標的領域から２００ｂｐのゲノム座標に位置し、１種のアッセイが、逆向きの鎖上の標的領域から１０００ｂｐのゲノム座標に位置することを意味する。これらの２種のアッセイは、捕捉実験において、標的遺伝子座の近傍の領域が、「ヒッチハイカー」として引き回される現象である「スプレッディング」を定量化するようにデザインした。最後に、９番染色体領域に対しても、１種のアッセイをデザインしたが、これは、ヒトｇＤＮＡの任意の非類縁セグメントをモニタリングするようにデザインしている。本明細書では、例は、８種のアッセイ全てにより、予測されたサイズのアンプリコンと符合するＰＣＲ断片が作製されることを示す。例は、Ｘ染色体上に位置するＰＬＰ１アッセイにより、投入されたｇＤＮＡ １ｎｇ当たりの比活性は、男性より女性において大きいことが適切に示された。これらのデータにより、これらのアッセイの、ｇＤＮＡの捕捉をモニタリングするさらなる実験における使用の妥当性が検証された。
方法、結果、および考察
ＰＬＰ１エキソン２の近傍を中心とする４００ｂｐの領域を、８０～１００ｂｐの長さであるアンプリコンを作製するために、平均２４ヌクレオチドの長さであり、Ｔｍが６０℃～６５℃であるプライマーのためのプライマー３に切り出した。検索領域を操作して、エキソン２の５’イントロン－エキソン間境界部から、ＣＤＳを通って、３’エキソン－イントロン間境界部に「ウォーキングする」プライマー対（ｑＰＣＲのためのアンプリコン）を得た。この近くでまた、エキソン２に対して遠位であり、エキソン３に向かい、エキソン２から約２００ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチドに配置された、近傍捕捉アッセイもデザインした。これらは、副次的ハイブリダイゼーションイベントにおいて捕捉される「ヒッチハイカー」ゲノム断片をモニタリングするのに使用されるであろう。最後に、９番染色体上で、実験におけるバルクのゲノムＤＮＡレベルをモニタリングする１種のアッセイも創出した。これらのアッセイのプライマー配列を下記に示し、詳細は本実施例の末尾の付録とする。
プライマー対の性能を検証するため、男性ゲノムＤＮＡまたは女性ゲノムＤＮＡを鋳型として含有するＰＣＲ反応物を準備した。次いで、これらを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｅｃｏ測定器上のリアルタイムＰＣＲにより、または従来のＰＣＲにより増幅した。ｑＰＣＲにより、女性は、男性より若干強いＰＬＰ１（Ｘ染色体）シグナルを示すと推論した。従来のＰＣＲにより、本発明者らは、アンプリコンのサイズおよび独特のものであることを点検することが可能であった。いずれの試験も、８種のアッセイ全ての性能が良好であるという解釈と符合するデータをもたらした。
ＰＣＲ反応物の準備：各女性のＰＣＲ反応物または各男性のＰＣＲ反応物について、
－ １００μｌの水
－ ２５μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液
－ ２５ｍＭのＭｇＣｌ２ ２５μｌ
－ ６０ｎｇ／μｌのシアリングされたｇＤＮＡ ２５μｌ（Ｑｕｂｉｔにより、女性および男性ともに同じ濃度とした）
－ １２．５μｌのＤＭＳＯ
－ １０ｍＭのｄＮＴＰ １２．５μｌ
－ ６．２５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ色素（Ｂｉｏｔｕｍ）
－ ５μｌのＲＯＸ色素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）
－ ２．５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼをよく混合し、添加したもの
を含有する、２５０μｌのマスターミックスを、氷上で作製した。
実験のために、２４μｌのミックスを、８本のストリップチューブ２セット（女性または男性）にアリコート分割し、各アッセイから得られた１０μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含有する、６μｌのプライマーミックスを添加した。混合した後、３つの同一な５μｌずつの量を、４８ウェルＥｃｏ ＰＣＲプレートの列（列内の上側における３連の女性試料、列内の下側における３連の男性試料）にアリコート分割した。ＳＹＢＲおよびＲＯＸをモニタリングして、９５℃まで３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルにわたりサイクリングさせるように測定器を設定した。アッセイ６についての増幅トレースのＪＰＧ画像を、図９に示す。女性試料と男性試料との間のコピー差は、明確であった。女性試料および男性試料について、全ての「Ｃｑ」値（蛍光曲線が、自動で規定されたあるベースラインを超えるときの値）を集積し、次いで、３連の測定値の平均値の間の差違を計算した。これを、上記の表７に示す（下線＝男性－女性）が、ここでは、９番染色体アッセイを除き、全ての値が正である。全体的なデータにより、８種のアッセイ全ての性能は同様であり（２２～２４のＣｑ値）、Ｘ染色体によるアッセイは一般に、女性におけるシグナルが大きいことが指し示される。
従来のＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間、７２℃で２分間にわたる休止、１０℃での保持の３０サイクルにわたりサイクリングさせた。合計５μｌの産物を、精製せずに、２％のアガロースゲル上に直接ロードしたが、これを図１０に示す。各二重項の上側バンドは、アッセイＰＣＲ産物の推定移動度と符合した。下側の「ファジー」材料は、使用されないＰＣＲプライマーであった可能性が高い。
リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲに続くゲル解析の結果から、これらの８種のアッセイは、もっぱらそれらの意図された領域を増幅し、断片の濃縮をモニタリングするのに適すると結論付けることができる。
実施例５の付録：アッセイデザインについての詳細
ＰＬＰ１遺伝子：転写物ＩＤ：ＮＭ＿０００５３３．３；エキソン２：１８７ヌクレオチド；ＵＣＳＣブラウザーから得られるＣＤＳ２ ＣＤＳは下線を付した太字の大文字で示し、プライマー配列には影を付す。フランキング配列は小文字で示す。
（実施例６）
ＰＬＰ１エキソン２の捕捉
目的
一実施形態では、Ｃｌｅａｒｆｏｒｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｖ１．０によるＤＮＡ捕捉戦略は、特異的ゲノム標的領域に標的化された、多機能性プローブの使用を伴う。目標は、ＰＬＰ１エキソン２を標的とする、Ｕｌｔｒａｍｅｒ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ；Ｕｌｔｒａｍｅｒとは、４５～２００ヌクレオチドの範囲にわたる長さの特化合成オリゴヌクレオチドに与えられた商標名である）を使用する手法を検証することであった。
概要
本実施例では、捕捉反応を実証した。ＩＤＴ－ＤＮＡ製のＵｌｔｒａｍｅｒは、捕捉のために良好に働き、基本プロトコールは、捕捉ステップを通じて、試薬の化学量論比に関して妥当であり、分子密集剤であるＰＥＧは、効果的な捕捉に干渉した。捕捉後、続いて、酵素プロセシングに取り組んだ。
簡単な記載
多機能性プローブを、図２に概略図化する。この実験データセットの目標は、これらのプローブの３つの特色全てについて調べることであった。領域１は、３４ヌクレオチドの、５’ビオチン－ＴＥＧ修飾され、かつ、３’ジデオキシシトシン修飾された、ユニバーサル「プルダウン」オリゴのための結合性部位であった。これらのユニバーサル領域のうちの２種は、同等の（望ましくは）性能を検証する（ｖａｌｉｄａｔｅ／ｖｅｒｉｆｙ）ようにデザインした。
これらの２種のユニバーサルオリゴの配列を、下記の表８に示す。
以下は、これらの配列をどのようにして選択したのかについての簡単な記載である。これらのオリゴの機能的役割は、捕捉プローブとハイブリダイズし、これにより、ストレプトアビジンで修飾された磁気ビーズ上で捕捉するために使用されうる、安定的に結合させたビオチン突出をもたらすことであった。
１０種のランダム配列を、ランダムＤＮＡ配列作製セットにより、塩基組成が約５０％のＧＣとなるように作製した。使用したウェブサイトは、www.faculty.ucr.edu/mmaduro/random.htmであった。次いで、１０種の配列を、ＢＬＡＴにより、ヒトゲノムのｈｇ１９ ｂｕｉｌｄに照らしてスクリーニングした。顕著なアラインメントを示したのは、配列３だけであった。「Ｃ」で終結する２種の配列は、ｄｄＣによりブロックされうるので選択した。両方の配列を、ＩＤＴ ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒにより解析した。配列１は、ＧＣが４７％であり、１ＭのＮａＣｌ中の融解温度が７６℃である。配列２のＧＣ含量は、５７％であり、高濃度の塩中の融解温度は８６℃である。選択された配列である１および１０は、実際の「ユニバーサル」５’ビオチンＴＥＧ－ｄｄＣと相補的なプローブ配列である。これらのうちのリバース相補鎖を、捕捉プローブ上のテイルとして使用した。続いて、４種の塩基、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴを付加することにより、これらの配列を変化させて、長さを３４塩基まで延長した。この長さは、ＳＢＣについて良好に働き、変化させる確固たる理由は見いだされなかった。第２に、ＣＧＣＧ型のモチーフのうちのいくつかを破壊して、自己二量体の形成を低下させた。
領域２は、試料であるゲノムライブラリー内のゲノム配列に接触するようにデザインされたプローブの部分を包摂した。この実験では、標的領域は、ＰＬＰ１のエキソン２であった。ＰＬＰ１エキソン２のＤＮＡ配列を下記に示す。ＣＤＳであるエキソン２を、下線を付した太字の大文字体で強調する。等間隔の捕捉プローブ配列には影を付す。
領域３は、ＣＡＣ３と呼ばれる、検証されたＰＣＲプライマーと相補的であった。ＣＡＣ３ ＰＣＲプライマーの配列は、ＣＡＣＧＧＧＡＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣ（配列番号７２）である。
これらのプローブ領域を含むＵｌｔｒａｍｅｒの配列を表９に示す。
モル、マイクログラム、および分子についての検討：実施例３で構築したゲノムライブラリー（Ｐｒｏｍｅｇａ製の女性ｈｇＤＮＡライブラリー）を使用した。このライブラリーの大スケール（８００μｌ）の増幅は、投入物としての２０μｌのライゲーションミックスで開始して実行した。精製ライブラリー（４００μｌ）の最終濃度は、２２ｎｇ／μｌであった。本明細書で記載される実験１回当たり１マイクログラムを使用した。さらに、５０ｂｐである全アダプターおよび１５０～２００ｂｐであるインサートに基づき、ライブラリー質量のうちの７５％は、ゲノムＤＮＡであると仮定した。次いで、この仮定と、１つのヒトゲノムの質量は３ｐｇであるという事実とに基づき、約２５０，０００（７５０×１０－９／３×１０－１２＝２５０，０００）コピーの所与の任意のゲノム領域が存在した。かつての実験および文献は、１０，０００倍のモル過剰量のプローブが、妥当な出発点であることを示唆した。これは、２，５００，０００，０００個のプローブ分子を含意する。分子２．５×１０９個／分子６．０２×１０２３個／モル＝４．１５×１０－１５モル＝４アトモルのプローブである。これを、原液の容量に変換すると、４ｎＭ（の各プローブ）１μｌ＝４アトモルのプローブである。最後に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＭｙＯｎｅ ｓｔｒｅｐでコーティングされたＣ１ビーズは、１μｌのビーズ当たり約１ピコモルの５００ｂｐビオチニル化ｄｓＤＮＡに結合する。この実験では、合計４アトモル×４プローブ＝１６アトモルのプローブを添加した。１μｌのビーズは、１０００アトモルに結合し、１μｌは、ビーズが働くための実際的な量であり、１μｌのビーズは、添加されるプローブの６０倍過剰量の結合能を有する。したがって、本実施例では、以下のパラメータ：
－ 単位質量のライブラリー内の標的分子の数（１μｇのライブラリー当たり、２５０，０００コピーの独特の二倍体遺伝子座）；
－ １０，０００倍のモル過剰量のプローブで標的遺伝子座に取り組むのに必要なプローブのモル濃度（４アトモルの各プローブ、１６アトモルの全プローブ（４種のプローブ）、４ｎＭのプローブ溶液１μｌ）；および
－ 添加される全てのプローブを定量的に捕捉するのに必要なビーズの量（１μｌは、１０００アトモルのｄｓＤＮＡおよび／または結合していないプローブに結合する）
を計算した。
緩衝液および作業溶液
溶液１：結合性プローブ：ユニバーサル結合性パートナーおよびＰＬＰ１のプローブを、１００μＭまで水和させた。２つの個別のチューブ内で、９２μｌのＴＥｚ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０緩衝液と、４μｌのユニバーサルオリゴと、各々１μｌずつの４種のコグネイト（ユニバーサルオリゴと）プローブとを組み合わせた。これにより、１μＭのプローブ原液のうちの２種を作製した。これらの各々４μｌずつを、１０００μｌのＴＥｚ＋Ｔｗｅｅｎに希釈して、４ｎＭのプローブ作業溶液をもたらした。
４倍濃度の結合緩衝液＝４ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．４％のＴｗｅｅｎ ２０。５ＭのＮａＣｌ ４０ｍｌと、１Ｍのトリス、ｐＨ８．０ ２ｍｌと、１０％のＴｗｅｅｎ２０ ２ｍｌと、０．５ＭのＥＤＴＡ ４０μｌと、６ｍｌの水とを組み合わせることにより、５０ｍｌを作製した。
洗浄緩衝液＝２５％のホルムアミド、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０。３７ｍｌの水と、１２．５ｍｌのホルムアミドと、１Ｍのトリス、ｐＨ８．０ ５００μｌと、０．５ＭのＥＤＴＡ １０μｌと、１０％のＴｗｅｅｎ ２０ ２５０μｌとを組み合わせることにより、５０ｍｌを作製した。
ビーズ：４倍濃度の結合緩衝液２５０μｌと、７５０μｌの水とを組み合わせて、１倍濃度の結合緩衝液を作製した。１０μｌのビーズを、１倍濃度の結合緩衝液９０μｌに添加し、磁石で引き寄せ、ビーズを、１倍濃度の結合緩衝液１００μｌで２回にわたり洗浄し、洗浄されたビーズを、１倍濃度の結合緩衝液１００μｌ中に再懸濁させた。１０マイクロリットルの洗浄されたビーズは、製造元のチューブから取り出されたときの１μｌのビーズに相当する。
方法
以下の３つのパラメータについて調べた。
１．オリゴ１０と対比したユニバーサルビオチンオリゴ１；
２．７．５％のＰＥＧ８０００（アニーリングの速度を増強しうる分子密集剤）を加えた１倍濃度の結合緩衝液中の結合と対比した、１倍濃度の結合緩衝液中の結合；
３．プロセシングを伴わない結合後におけるＰＬＰ１領域の濃縮倍数、および酵素プロセシングを加えた結合後におけるＰＬＰ１領域の濃縮倍数
これらのパラメータについて調べるために、８例の試料（２×２×２）を作製した。これらの試料は、５０μｌの２０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡ、４倍濃度の結合緩衝液２５μｌ、１μｌの結合性プローブ、および２４μｌの水または５０％のＰＥＧ８０００ ２０μｌ＋４μｌの水（ＰＥＧを伴う４例の試料およびＰＥＧを伴わない４例の試料）を含有した。ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒについてのＩＤＴ ＤＮＡウェブサイトによれば、高濃度の塩（例えば、１ＭのＮａＣｌ）中では、オリゴのＴｍは、劇的に高い温度にシフトすることが記載されていた。したがって、試料を９５℃で融解させ、次いで、１℃および２分間の減分で、６０℃まで温度を下げた（本発明者らによるＡＢＩ２７２０サーマルサイクラー上のＡｕｔｏＸによる３５サイクルであり、各サイクルでは、１℃ずつ低下させ、各サイクルは、２分間にわたり持続させる）。試料を室温（ＲＴ）まで冷却した後、試料１例当たり１０μｌの洗浄されたビーズを添加し、２０分間にわたりインキュベートした。ビーズは、強力な磁石でプルアウトし、溶液を吸引し、廃棄した。ビーズを、洗浄緩衝液による２００μｌの洗浄液で４回にわたり洗浄し、ビーズを再懸濁させるたびごとに、ＲＴで５分間にわたりインキュベートした。最終回の洗浄の後、残りの洗浄液の大部分を、チューブから十分に吸引した。
４本のチューブのセットを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した。１０μｌのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ １０× Ｑｕｉｃｋ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと、同じキットから得られる１ｍＭのｄＮＴＰ １０μｌと、１０μｌの水と、１μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとを組み合わせることにより、カクテルを作製した。２０μｌを、４本のチューブのセットに添加し、反応物を、２０℃で１５分間にわたりインキュベートした。
捕捉後におけるＰＣＲ増幅のため、非Ｔ４処理試料（捕捉だけ施された）を、単一プライマー反応において、ＡＣＡ２－２５（ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡ；配列番号６７）で増幅した。Ｔ４処理試料は、ＡＣＡ２ＦＬプライマーおよびＣＡＣ３ＦＬプライマー(それぞれ、AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTCATGCAGGACCAGAGAATTCGAATACA(配列番号69)およびCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGCACGGGAGTTGATCCTGGTTTTCAC(配列番号74))により増幅した。コア反応ミックスは、反応物４００μｌ当たり、１２０μｌの水、４０μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液（ＮＥＢ）、２５ｍＭのＭｇＣｌ２ ４０μｌ、１０μＭの単一プライマー８０μｌ、または４０μｌ＋４０μｌのＦプライマーおよびＲプライマー、２０μｌのＤＭＳＯ、１０ｍＭのｄＮＴＰ ２０μｌ、ならびに４μｌのＴａｑポリメラーゼを含有した。８０μｌのアリコートを、２０μｌのＴＥｚ中に再懸濁させたビーズ（結合だけ）または２０μｌのＴ４ミックスに添加した。最終的な容量は、１００μｌであった。これらの試料を、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間の３０サイクルにわたるＰＣＲにより増幅した。ゲル解析（レーン１つ当たり５μｌのＰＣＲ後材料をロードした）を、結果節に示す。Ｑｕｂｉｔによる読取り値により、各ＰＣＲ反応物の濃度は、約２０～２５ｎｇ／μｌであることが指し示された。
増幅後解析のために、２００μｌの水と、１０倍濃度のＴａｑ緩衝液５０μｌと、２５ｍＭのＭｇＣｌ２ ５０μｌと、２５μｌのＤＭＳＯと、１０ｍＭのｄＮＴＰ ２５μｌと、１２．５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｕｍ）と、５μｌのＴａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）とを組み合わせることにより、従来のＰＣＲミックスによる、５００μｌ（最終容量）のマスターミックスを作製した。４２μｌのアリコートを、８本のチューブに分配し、１０μＭのＦ＋Ｒ ＰＬＰ１プライマーミックス１２μｌ（アッセイについては、実施例５：ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイの検証において記載されている）を添加した。９μｌのミックスを、８列の各アッセイに分配した。ウェル１つ当たりの試料１μｌで合計６例の試料をアッセイした。これらの試料は、
行１：ｇＤＮＡライブラリー出発材料
行２：ビオチンオリゴ１捕捉材料
行３：ビオチンオリゴ１＋ＰＥＧ捕捉材料
行４：ビオチンオリゴ１０捕捉材料
行５：ビオチンオリゴ１０＋ＰＥＧ捕捉材料
行６：ＴＥｚ ＮＴＣ対照
であった。
Ｔ４処理試料は、ＰＣＲ増幅で処理されたのが異常な材料だけであることがゲル解析により示されたため、アッセイしなかった。
結果
捕捉だけのライブラリーは、予測される通り、投入されたゲノムライブラリーと同様のスメアをもたらした。試料は、左から右へ、（１）オリゴ１、（２）オリゴ１＋ＰＥＧ、（３）オリゴ１０、および（４）オリゴ１０＋ＰＥＧであった。Ｔ４処理試料には、残留Ｔ４ポリメラーゼが夾雑した（５～８）。特定の実施形態では、Ｔ４ポリメラーゼを熱不活化した。
Ｑｕｂｉｔで測定した４つの捕捉だけのライブラリーの収率を下記の表１０に示す。
ｑＰＣＲのために、８つの検証されたＰＬＰ１アッセイ（実施例５）の全てを、列において使用し、試料を行において使用した。試料のアレイは、
行１：１μｌの２５ｎｇ／μｌのｇＤＮＡライブラリー
行２：１μｌの約２５ｎｇ／μｌのＣ１捕捉試料
行３：１μｌの約２５ｎｇ／μｌのＣ１＋Ｐ捕捉試料
行４：１μｌの約２５ｎｇ／μｌのＣ１０捕捉試料
行５：１μｌの約２５ｎｇ／μｌのＣ１０＋Ｐ捕捉試料
行６：１μｌのＴＥｚ（ＮＴＣ）
であった。
ウェル１つ当たり１例の試料という、この構成では、データは、厳密な定量的測定ではなく、定性的概観であることを意図した。データを下記の表に示す。上の表は、生のＣｑ値である。次の表は、全ての試料およびアッセイは、同じ２倍の検量線に適合するという仮定に基づいて絶対値に変換されたＣｑ値である。下の表は、捕捉された試料のＣｑ値を、ｇＤＮＡライブラリーのＣｑ値で除した商を示す。これにより、捕捉後における濃縮倍数の意味が分かる。
データからいくつかの結論が引き出された。（１）捕捉は働いた。Ｃ１について、的中アッセイ１～５を通じた捕捉濃縮の平均は、８２，０００倍であった。Ｃ１０についての平均は、２８，０００倍であった。アッセイ部位では、約数百～数万倍の濃縮が観察された。これは、Ｕｌｔｒａｍｅｒが働き、基本プローブのデザインが効果的であることを含意する。これは、ｇＤＮＡ対プローブ対ビーズの基本的な化学量論比が適正であることを意味した；（２）２つのビオチンデザインは、ほぼ同様に働いた；（３）ＰＥＧは、捕捉効率を増強せず、阻害した；および（４）アッセイ６では、標的から２００ｂｐの、顕著な「混獲」が観察された。１０００ｂｐ離れた領域について認められる逸脱活性は小さかった。
特定の実施形態では、捕捉された複合体の酵素プロセシングが、このスキームにおける感度（濃縮倍数）および特異度（「混獲」の程度）に寄与するのかどうかを決定することが重要でありうる。
（実施例７）
ＳＹＢＲ空間におけるＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイ
目的
場合によっては、リアルタイムの条件が、非リアルタイムの増幅条件を正確に模倣することが有用である。本実施例では、これは、氷上における準備と、３段階の比較的緩徐なＰＣＲ反応とを意味した。代替的に、いく種かのアッセイは、増幅条件のセットの複製を必要とせず、定量的測定値を厳密に求めることが意図される。例えば、ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイは、断片を作製するためには使用せず、遺伝子座の濃縮を測定するためだけに使用することが好ましい。この種の状況では、室温で準備されたｑＰＣＲ反応物および迅速なサイクリングが有利である。この実験では、ＡＢＩ ２× ＳＹＢＲミックスによる８種のＰＬＰ１アッセイについて調べた。これらは、実施例５（ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイの検証）で記載したアッセイと同じプライマーアッセイである。
概要
これらのデータは、８種のＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイのうちの少なくとも６種を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲミックスおよび条件と共に使用しうることを示唆した。
方法
女性ｇＤＮＡライブラリー（実施例３：Ｐｒｏｍｅｇａ製の女性ｈｇＤＮＡライブラリー）に対するＰＬＰ１アッセイの性能を測定した。１０μｌのウェル１つ当たり、５μｌのＡＢＩ ２× ＳＹＢＲマスターミックスと、１０μＭのＦ＋Ｒプライマー原液０．２μｌと、１μｌのｇＤＮＡライブラリー（２０ｎｇ／μｌの）と、３．８μｌの水とを組み合わせた（大容量のマスターミックスを作製し、アリコート分割した）。非鋳型対照についての３連の測定およびｇＤＮＡライブラリーについての３連の測定を、各アッセイを通じて行った。ＲＯＸパッシブ基準色素による標準化を伴う、標準的な２ステップのＰＣＲ（９５℃で１５秒間、６０℃で４５秒間）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＥｃｏリアルタイムＰＣＲ上で、４０サイクルにわたりサイクリングさせた。
結果
各ウェルについて判定されたＣｑ値を、下記の表１２に示す。ＮＴＣは、極めて清浄であり、ｇＤＮＡのＣｑは可変的であり、これは、ピペティングに起因する可能性が高い。一般的な主題は、アッセイ１および７の性能が低かったのに対し、残りのアッセイは、ＳＹＢＲ空間において妥当な程度に良好に働いたことである。図１１では、ＮＴＣトレース（Ａ）および＋ｇＤＮＡトレース（Ｂ）は、アッセイの性能についての定性的描像を提示するようにコピーされた。
（実施例８）
複合体の酵素プロセシングの前および後における、ＰＬＰ１エキソン２濃縮の測定
目的
本実施例では、ＰＬＰ１エキソン２ ＤＮＡの「比活性」を、プロセシング前およびプロセシング後の捕捉複合体において測定することにより、複合体の酵素プロセシングを、収率について直接調べた。Ｕｌｔｒａｍｅｒは、優れた捕捉効率を裏付け、コア捕捉プロトコールの性能も良好であった。
概要
この実験は、Ｔ４－ＤＮＡポリメラーゼによる捕捉後プロセシングが、捕捉反応の特異度を劇的に改善することを実証した。
背景
実施例６（ＰＬＰ１エキソン２の捕捉）では、捕捉の成功について記載したが、ＰＣＲの前にＴ４ポリメラーゼを除去しない捕捉後プロセシングステップでは、アーチファクトライブラリーがもたらされた。本実施例では、ＰＣＲの前にＴ４を９５℃で１分間にわたり熱不活化したことを除き、同じ基本実験を繰り返す。
方法、結果、考察
この実験では、酵素プロセシングの前および後における複合体の捕捉効率を評価するために、２つのユニバーサルビオチン捕捉プローブを含む４例の試料を作製した。各試料は、２０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡ ５０μｌ、４倍濃度の結合緩衝液２０μｌ、１μｌの結合性プローブ、および最終容量を８０μｌとするための９μｌの水を含有した。試料は、９５℃で１分間にわたり融解させ、１℃、２分間の減分で６０℃まで温度を低下させることによりアニーリングさせる（本発明者らによるＡＢＩ２７２０サーマルサイクラー上のＡｕｔｏＸによる３５サイクル）のに続いて、ＲＴまで冷却した。次いで、試料１例当たり合計１０μｌの洗浄されたビーズ（１μｌのＭｙＯｎｅビーズ溶液（ストレプトアビジンでコーティングされたＣ１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に相当する）を添加し、２０分間にわたりインキュベートした。ビーズは、強力な磁石でプルアウトし、溶液を吸引し、廃棄した。ビーズを、洗浄緩衝液による２００μｌの洗浄液で４回にわたり洗浄し、ビーズを再懸濁させるたびごとに、ＲＴで５分間にわたりインキュベートした。最終回の洗浄の後、残りの洗浄液の大部分を、チューブから十分に吸引し、捕捉複合体でコーティングされたビーズを静置した。
２例の試料のＴ４プロセシングのために、本発明者らは、４０μｌの水、５μｌの１０× ｑｕｉｃｋ ｂｌｕｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌ、および０．５μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを含有する、５０μｌの酵素プロセシングミックスを調製した。複合体の２つのアリコートを、２０μｌ（ずつ）のＴ４ミックス中に再懸濁させ、２０℃で１５分間、９５℃で１分間にわたりインキュベートし、ＲＴまで冷却した。「非処理」対照を、Ｔ４ポリメラーゼを欠く、２０μｌの同じ緩衝液（４０μｌの水、５μｌの１０× ｑｕｉｃｋ ｂｌｕｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌ）中に懸濁させた。
比活性を測定するため、捕捉単独試料および捕捉＋プロセシング試料の両方を、３０サイクルのＰＣＲにより増幅した。次いで、ＤＮＡを定量化し、特殊量および既知量の増幅されたＤＮＡによるＰＬＰ１アッセイシグナルを測定した。本実施例では、２つの増幅反応物を準備した。捕捉単独では、これらのライブラリーは、この単一プライマーだけで増幅可能であるので、増幅をＡＣＡ２－２５（ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡ；配列番号６７）で実行した。酵素プロセシングされた複合体では、増幅を、ＡＣＡ２ＦＬプライマーおよびＣＡＣ３ＦＬプライマー(それぞれ、AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTCATGCAGGACCAGAGAATTCGAATACA(配列番号69)およびCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGCACGGGAGTTGATCCTGGTTTTCAC(配列番号74))で実行した。１００μｌのＰＣＲミックスは、１０μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液（別段に指定されない限り、全ての試薬は、ＮＥＢから得た）、２５ｍＭのＭｇＣｌ２ １０μｌ、１０μＭの単一プライマー２０μｌ、または１０μＭの二重プライマー１０μｌ＋１０μｌ、２０μｌの鋳型（非処理対照またはＴ４プロセシング、ビーズおよび全ての鋳型）、５μｌのＤＭＳＯ、１０ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌ、および１μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（全ては、増幅の前に氷上で準備した）を含有した。試料は、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の３ステッププロトコールに続き、７２℃で２分間を施し、１０℃で休止させる、３０サイクルのＰＣＲにより増幅した。
増幅の後、ＤＮＡ収率を測定し、ＰＣＲ増幅された材料を、ＤＮＡゲル電気泳動で検討した。Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定された（ＤＮＡ ＨＳキット）収率を、下記の表１３に示す。これらのデータは、二重プライマーによる増幅は、単一プライマーによる増幅より大きな全体的収率を裏付けるという基本特色を強調する。
ゲル画像（２％のアガロース、ロードされた材料１００ｎｇ）を、図１２に示す。プロセシングは、２つの注目すべき効果を及ぼした。第１に、プロセシングは、約２５０ｂｐ（上矢印）および約１７５ｂｐ（下矢印）の２つの弱いバンドに加えて、予測されるスメアをもたらした。下側のバンドは、プローブの不測のクローニング（１１５ｂｐのアダプター＋６０ｂｐのプローブ＝１７５ｂｐ）と符合した。第２に、プロセシングは、全体的な試料のサイズ分布を低減した。これは、５０ｂｐの単一のアダプターを、プロセシングされた材料の、上方への６５ｂｐの全体的なシフトをもたらすことが予測される、１１５ｂｐの全長アダプターで置きかえたので、注目に値した。プロセシングにより、ライブラリーの平均インサートサイズが、顕著に低減されると解釈された。
ｑＰＣＲによる濃縮効率を測定するために、２種の試みを行った。第１のより定性的な試みでは、８種のＰＬＰ１アッセイ全て（実施例５：ＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイの検証において詳細に記載した）を使用して、６例の試料：
１．アッセイ１種当たり２５ｎｇの出発ｇＤＮＡライブラリー
２．アッセイ１種当たり０．２５ｎｇの非処理Ｃ１
３．アッセイ１種当たり０．２５ｎｇの非処理Ｃ１０
４．アッセイ１種当たり０．２５ｎｇのＴ４処理Ｃ１
５．アッセイ１種当たり０．２５ｎｇのＴ４処理Ｃ１０
６．非鋳型対照
を測定した。
これらの単回の測定から得られるＣｑ値を、下記の表１４に示す。ｇＤＮＡおよびＮＴＣ対照の性能は良好であり（上および下；最も明るい影）、さらには査定しなかった。
Ｔ４処理試料（暗い影）のシグナルは、定量的解析がそれほどインフォーマティブでなくなる程度に強かった（１０未満のＣｑ）。しかし、定性的レベルでは、非処理捕捉複合体（中程度の影）と比較して、２つの傾向が明確であった。一方は、アッセイ１～５から得られる的中シグナルが劇的に増大する（低値のＣｑ）ことであった。他方は、プロセシングされると、アッセイ６から得られる、標的領域から２００ｂｐ離れた標的外シグナルが、顕著に減殺されることであった。データには、いくつかの凹凸が見られたが、中心的なメッセージは、プロセシングにより、ＰＬＰ１エキソン２シグナルの特異度が大きく増強されることであった。
この実験のより定量的側面を捉えるため、ｑＰＣＲの前に、非処理Ｃ１０捕捉アンプリコンを１０００倍に希釈し、プロセシングされたＣ１０アンプリコンを１５，０００倍に希釈した。これは、Ｃｑ値を測定可能な範囲内に収めるために行った。次いで、出発ｇＤＮＡライブラリーを検討し、ｑＰＣＲプレートの４連ウェル内のこれらの希釈された試料を、２種の的中アッセイ（アッセイ２および５）および２種の標的外アッセイ（アッセイ６および７）を通じて検討した。４連ウェルのＣｑ値を平均し、これらの値を下記の表１５に示す。ここでもまた、ｇＤＮＡシグナルは弱かったが、これらの実験の目標は、プロセシングされていない捕捉複合体におけるＰＬＰ１エキソン２シグナルを、Ｔ４ポリメラーゼ処理された捕捉複合体と比較することであるため、弱いシグナルの、データ解釈に対する影響は、それほど顕著ではなかった。Ｃｑ値は、あらゆるＰＣＲサイクルによる２倍の増幅を仮定する「ユニバーサル」検量線を使用して、絶対値に変換した。表の第３の区画は、希釈率についての調整を示す。第４の区画である、プロセシングのされていない複合体およびＴ４処理された複合体の、ｇＤＮＡに対する比は、それほど有用ではないが、表の下欄の、Ｔ４処理された複合体と対比した、プロセシングされていない複合体の定量比は有用である。実施例６では、Ｃ１についての８２，０００倍の非処理捕捉濃縮およびＣ１０についての２８，０００倍の非処理捕捉濃縮が観察された（これらの実験全てと同様、ｇＤＮＡの分母は、極めて低度のシグナルから導出されたので、倍数範囲は、これに定性的側面をもたらした）ので、捕捉単独は、３００ｂｐのＰＬＰ１エキソン２領域の５０，０００倍の濃縮をもたらすと推定するのが妥当であった。プロセシングは、この濃縮を、さらに５０倍（表１５から得られる、８３倍と２４倍との平均値）増大させ、濃縮を、２５０万倍～１千万倍（ゲノム１つ当たり３０億塩基／３００ｂｐの標的）に押し上げる。したがって、ｑＰＣＲ測定値のレベルでは、捕捉＋プロセシングは、濃縮に関する最良の状況に近づくと考えられた。アッセイ６によりモニタリングされた標的から２００ｂｐ離れた標的外シグナルが、捕捉単独では大幅に濃縮される（ヒッチハイカー、交差ハイブリダイゼーション効果）が、プロセシングにより顕著に減殺されることは注目に値した。
この実験は、捕捉＋プロセシングの特異度（非標的ｑＰＣＲシグナル）に取り組んだ。増幅されたＤＮＡ（ＰＬＰ１エキソン２から得られる）の１ｎｇ当たりの比活性は、捕捉後プロセシングにより大幅に増強された。この実験は、感度、すなわち、酵素により転換される捕捉複合体のパーセントには取り組まなかった。特定の実施形態ではまた、本方法の特異度および感度の両方についての定量的理解も重要である。
（実施例９）
捕捉後プロセシングの直接的な測定
目的
実施例８では、捕捉後プロセシングが、標的捕捉の特異度を実質的に増大させる所望の目的を達成することを決定した。検討される他のきわめて重要なパラメータは、感度、すなわち、初期に捕捉された複合体であって、最終的なシークエンシングライブラリー内に回収される複合体の百分率である。本実施例では、本発明者らは、感度の直接的な測定により、酵素プロセシングが、初期に捕捉された配列のうちの＞１０％について効果的であることを実証した。
概要
この実験から得られるデータにより、的中捕捉複合体のうちの１０％が、Ｔ４ポリメラーゼにより、捕捉後シークエンシングライブラリー断片にプロセシングされることが指し示された。
検討
参照として、捕捉後プロセシングについての図式的例示を、図４に示す。この図では、プロセシングの感度を、図１３の右下で例示される、３ステップの手順で測定した。まず、単一のＰＬＰ１捕捉プローブを、女性ｇＤＮＡライブラリー（実施例３：Ｐｒｏｍｅｇａ製の女性ｈｇＤＮＡライブラリー）から、ＰＬＰ１エキソン２特異的ゲノムＤＮＡ断片をプルダウン／プルアウトする独立の反応において使用した。４種のプローブが存在するので、４種のプルダウンを実行した。図１３（Ａ）で例示する通り、捕捉された材料の量は、隣接するＰＬＰ１ ｑＰＣＲアッセイプライマー対を使用して測定した。図１３（Ｂ）に示す通り、複合体の酵素プロセシングの後、１種のＰＬＰ１特異的プライマーおよび１種のプローブ特異的プライマーを使用することにより、ｑＰＣＲを介して、プロセシングされた複合体の量を再度測定した。［Ｂ／Ａ×１００％］における測定値の比により、プロセシング効率の推定値がもたらされた。リアルタイム反応から得られるＰＣＲ産物を抽出し、ゲル解析により、予測される長さのアンプリコンが作製されたことを検証した（図１３（Ｃ））ことは、実験結果の適正な解釈に極めて重要である。これは、いずれのＰＣＲ反応も個別の開始点および停止点を有したので可能であった。プロセシング効率は、Ａ＋Ｂ＋Ｃから解釈可能なデータをもたらすプルアウトを使用して、プロセシング効率を決定した。
アッセイ
個々のプローブは、ｑＰＣＲアッセイにマッチさせることが必要であった。ｑＰＣＲアッセイの前工程および後工程にマッチさせたプローブの６種の組合せを選び出した。これらを、プローブ配列を斜字体とし、ＰＬＰ１エキソン２特異的プライマーに影を付して、下記に示す。暗い影を付したプライマーは、プロセシング後にＣＡＣ３プライマーと対合させたプライマーである。また、各アッセイセットについて、ＰＣＲアンプリコンの予測される産物サイズも示す。
方法
プローブ：これらのアッセイでは、プローブのＢ１０ユニバーサルオリゴセットを選択した（２０１２年８月２４日の実験４：ＰＬＰ１エキソン２の捕捉）。個々の捕捉プローブを作製するために、１μｌのユニバーサルオリゴ１０（１００μＭ）を、１００μＭのＵｌｔｒａｍｅｒプローブ１μｌおよび９８μｌのＴＥｚ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と組み合わせた。これを、４μｌから９９６μｌのＴＥｚ＋Ｔｗｅｅｎにさらに希釈して、４ｎＭの作業溶液をもたらした。
捕捉：捕捉のために、２２ｎｇ／μｌのｇＤＮＡライブラリー５０μｌと、４倍濃度の結合緩衝液２０μｌと、１μｌのプローブと、９μｌの水とを組み合わせた。６種の独立の捕捉反応物（プローブ１による２種の反応物、プローブ４による２種の反応物、プローブ２による１種の反応物、およびプローブ３による１種の反応物）が存在した。これらを、１分間にわたり９５℃まで加熱し、次いで、前出で記載した通り、－１℃および２分間の３５「サイクル」で６０℃まで冷却した。アニーリングの後、１０μｌの洗浄されたビーズ（＝１μｌのビーズ原液）を添加し、ＲＴで２０分間にわたり結合をインキュベートした。次いで、ビーズを引き寄せ、洗浄緩衝液の２００μｌアリコートで、５分間ずつ４回にわたり洗浄した。最後の洗浄の後、全ての残りの接触可能な流体をビーズから吸引した。
プロセシング：ビーズを、１０μｌのｑｕｉｃｋ ｂｌｕｎｔ溶液（２００μｌ＝２０μｌの１０× ｑｕｉｃｋ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭのｄＮＴＰ ２０μｌ、および１６０μｌの水）中に再懸濁させた。６つのビーズのアリコートの各々を、５μｌずつの２つのアリコートに分割した。酵素を伴わない５μｌのＱＢ緩衝液を、チューブの１種のセット（これらは、捕捉だけのアリコートである）に添加した。他の５μｌのアリコートへは、０．０２５μｌのＴ４ポリメラーゼを含有する５μｌのＱＢ緩衝液（これは、１００μｌのＱＢ緩衝液を、０．５μｌのＴ４ポリメラーゼと組み合わせ、５μｌずつのアリコートに分配することにより作製した）を添加した。捕捉だけのチューブおよび捕捉＋プロセシングのチューブの両方を、２０℃で１５分間、９８℃で１分間にわたりインキュベートし、ＲＴまで冷却し、速やかに磁石上に置いた。約１０μｌの上清を、捕捉だけの複合体およびＴ４－プロセシングされた複合体の６種の対から取り出した（これで、合計１２本のチューブ）。これらの上清を、下記で記載されるｑＰＣＲにおいて直接使用した。
ｑＰＣＲ：これらのアッセイのために、標準的なＴａｑ反応ミックスおよび３ステップのサーマルサイクリングを選択した。各々が、
－ １４μｌの水
－ ４μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液
－ ２５ｍＭのＭｇＣｌ２ ４μｌ
－ 各々１０μＭずつのＦプライマーとＲプライマーとのブレンド４μｌ
－ ８μｌの鋳型（上記から得られた上清）
－ ２μｌのＤＭＳＯ
－ １０ｍＭのｄＮＴＰ ２μｌ
－ １μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ
－ ０．８μｌのＲＯＸ
－ ０．４μｌのＴａｑポリメラーゼ
を含有する、４０μｌのｑＰＣＲミックス１２種を構築した。
反応物を４幅対に分配し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の４０サイクルにわたりサイクリングさせた。ＰＣＲの後、反応ミックスを、４幅対の４つのウェルの各々からプールし、５μｌを２％のアガロースゲル上で解析した。
結果
実験データを解釈するために、図１４に示されるアガロースゲルを検討した。使用されるプライマー（など）と共に使用されるサイクリング条件下で、アッセイセット３、５、および６は、アッセイのアンプリコン（上のゲル）またはアダプターアンプリコンに照らしたプロセシング後におけるＰＬＰ１（下のゲル）と符合するＰＣＲ産物をもたらすことが観察された。より良好なアッセイセットは、
－ アッセイ３を伴うプローブ４
－ アッセイ５を伴うプローブ２
－ アッセイ４を伴うプローブ３
に対応した。
ｑＰＣＲのＣｑ値を、下記の表１６に示す。アッセイ１および２は、ゲル解析が不良であった。良好なアッセイを、アッセイ３、５、および４に示す。プロセシング％値を導出するため、Ｃｑを、絶対値（「Ｅｘｃｅｌ言語」では、絶対値＝ｐｏｗｅｒ（１０，ｌｏｇ１０（１／２）×Ｃｑ＋１０）に変換した。次いで、プロセシング後Ｃｑ／捕捉だけによるＣｑの商を、百分率として表した。この測定は、全てのアンプリコンの増幅効率が同じであり、理想化された検量線（おそらく妥当な程度に正確な）に適合することを仮定した。次いで、これが適正であると仮定すると、捕捉された材料のうちの約１０％がプロセシングされると考えられた。
（実施例１０）
拡張コード処理された男性ｇＤＮＡライブラリーおよび女性ｇＤＮＡライブラリーの構築目的
単回のＭｉＳｅｑシークエンシングランで複数の捕捉パラメータについて調べるのに使用される、１６種のコード処理された男性ｇＤＮＡライブラリーおよび女性ｇＤＮＡライブラリーのセットを構築する。
方法
ステップ１：ｇＤＮＡ：修復されたｇＤＮＡを調製した。
ステップ２：全１６種の可能なアダプターコードを作製した。これらのコードは、４種の塩基構造である。－４および－３位（インサートに照らして）の塩基位置は、ランダム塩基であり、－２および－１位の塩基位置は、試料コードである。４種の「クラスター」試料コードが存在する。これらは、
－ クラスター１：ＡＣ、ＧＡ、ＣＴ、ＴＧ
－ クラスター２：ＡＡ、ＧＣ、ＣＧ、ＴＴ
－ クラスター３：ＡＧ、ＧＴ、ＣＡ、ＴＣ
－ クラスター４：ＡＴ、ＧＧ、ＣＣ、ＴＡ
である。
クラスター２～４は、プレート内の１００μＭのオリゴとして並べられた。プレートのうちの１種のセットは、ライゲーション鎖を有し、プレートのうちの１種のセットは、パートナー鎖を有した。プレートアレイは、Ａ１－Ｈ１、Ａ２－Ｈ２などであった。９６ウェルＰＣＲプレートの２種のセット内でアダプターをアニーリングさせるために、ウェル１つ当たり７０μｌの、６８μｌのＴＥｚおよび２μｌの５ＭのＮａＣｌを含有する「アニーリング溶液」を、テープで覆われた、２０μｌのパートナー鎖オリゴおよび１０μｌのライゲーション鎖オリゴに添加し、９５℃で１０秒間、６５℃で５分間にわたりアニーリングさせ、ＲＴまで冷却した。１６種のコードのセット（同じ試料コードを有するランダムコード）を、４種のコードのセットにプールした。赤色＝セットＡＡ、ＧＣ、ＣＧ、およびＴＴ。紫色＝セットＡＧ、ＧＴ、ＣＡ、およびＴＣ。青色＝セットＡＴ、ＧＧ、ＣＣ、およびＴＡ（この順序で並べる）。
ステップ３：いずれの種類も、１６種の独特のアダプター型の同じセットを受容する、女性ＤＮＡのための１６種のライゲーション鎖および男性ＤＮＡのための１６種のライゲーション鎖を創出することが最も容易である。これにより、後で、どの試料の組合せを創出しようと欲するのかを、最大限に柔軟に決定することが可能となる。これを行うために、実験から得られる、末端修復されたｇＤＮＡを使用した。これにより、以下の通り、反応１回当たり２０μｌ中の、必須の３２回にわたるライゲーションが実行されるであろう。
１種を女性とし、１種を男性とする、２種のｇＤＮＡカクテルであって、
－ １４４μｌの水
－ １０倍濃度のライゲーション緩衝液 ３２μｌ
－ ５０％のＰＥＧ８０００ ４８μｌ
－ ６４μｌのｇＤＮＡ
を含有するｇＤＮＡカクテルを作製した。
カクテルを混合し、１８μｌずつを伴う１６本のチューブにアリコート分割した。２μｌのアダプターおよび０．５μｌのＨＣ Ｔ４リガーゼを添加し、結果として得られる反応物を、２２℃で６０分間、６５℃で１０分間にわたりインキュベートし、ＲＴまで冷却した。８０μｌのＴＥｚ、次いでまた、１２０μｌのＡｍｐｕｒｅビーズも、反応物に添加し、混合し、ＲＴで１０分間にわたりインキュベートした。反応物を、７０％のＥｔＯＨ／水（ｖ／ｖ）２００μｌで、２回にわたり洗浄し、通気乾燥させ、１００μｌのＴＥｚ中に再懸濁させたた。
ステップ４：ｑＰＣＲ：
－ １７５μｌの水
－ ５０μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液
－ ２５ｍＭのＭｇＣｌ２ ５０μｌ
－ １００μｌのＡＣＡ２プライマー（１０μＭ）
－ （５０μｌの鋳型：後で添加される）
－ ２５μｌのＤＭＳＯ
－ １０ｍＭのｄＮＴＰ ２５μｌ
－ １２．５μｌのＥｖａ Ｇｒｅｅｎ
－ １０μｌのＲＯＸ
－ ５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
を含有するｑＰＣＲマスターミックスを作製した。
９μｌを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｅｃｏ ｑＰＣＲプレートの４８のウェルに分配した。ライブラリー較正基準物質の、１０ｐｇ／μｌおよび１ｐｇ／μｌの２種の系列希釈液を作製した。プレートの残りには、下記の表に示されるライブラリーをロードした。
第２のプレートは、下記の表１８に示されるレイアウトを有した。
ライゲーション効率は、以下のサイクリングプログラム：
－ ７２℃で２分間
－ ９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間の４０サイクルにわたる
により測定した。
結果
下記の表１９は、基準物質および試料のＣｑ値（（ｉ）プレート２上で繰り返された実験、ならびに（ｉｉ）Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３を２連のセット３種において測定した（３つの測定値の平均値を取った）ことを除き、２連の測定値の平均値）を示す。
これらを、Ｅｘｃｅｌ（青色の影）の式量＝ｐｏｗｅｒ（１０，ｌｏｇ１０（１／２）×Ｃｑ＋８）により、任意の絶対値に変換した。次いで、絶対値に、１０／１５８３（プレート１）または１０／１４６９（プレート２）を乗じることにより、値を、公知の基準（赤色の影）に照らして標準化した。１μｌ当たりのゲノムは、７／８（アダプター質量に対応する）を乗じ、次いで、ゲノム１つ当たり３ｐｇで除することにより計算した。ライゲーション効率を計算し（ライゲーション１回当たり２０ｎｇで、１／１００が測定される＝２００ｐｇがライゲーションされる）、計算された効率により、ライブラリーへの変換約５％がおおよその平均値であることが指し示された。これは、埋め込みを伴わずに作製されたライブラリーについて同じであり、これにより、埋め込み反応の反応速度は急速であり、第１のサイクルにおいて、試料が９４℃に加熱されるときに生じうることが示唆された。
この実験の目標は、ｇＤＮＡライブラリーを含有するライゲーションミックスを創出し、測定された数のゲノムを、マイクログラム量のライブラリー材料に増幅しうるように、ライゲーションミックス１μｌ当たりのゲノム相当量を定量化することであった。上記の表２０は、作製された各ライブラリーについて、１μｌ当たりのゲノムを示す。下記に示される表２１の目標は、表示される試料（ランダムな抜き取りにより採取された）を、後段の捕捉試験のための、１０コピー、２０コピー、４０コピー、８０コピーなどのライブラリーに転換することであった。表は、１μｌ当たりのゲノム数を、表示のカバレージ深度を達成するための、ＰＣＲ反応１回当たりのμｌ数に転置する。表では、試料１例当たり２００μｌのＰＣＲおよび４０μｌの鋳型投入量が仮定される。これらの実験は、実際のライブラリーを作製および精製する場合の指針として使用することができる。
（実施例１１）
８種の新規捕捉ｑＰＣＲアッセイの検証
目的
拡張プローブコレクションの捕捉効率を追求するようにデザインされた、８種の新たなｑＰＣＲプライマーセットの性能を検証する。
概要
８種のアッセイ全ては、ヒトｇＤＮＡを増幅するのに使用される場合に予測されるサイズのアンプリコンをもたらした。Ｘ染色体：１５４３７６０５１領域（女性において４コピー、男性において２コピー）についての定量的解析は、観察されたコピー数と予測されるコピー数との驚くほど緊密な相関を示した。
方法
４９種のプローブ標的領域のサンプリングを表す、アッセイデザインのための８種のセグメントを選択した。アッセイをデザインするために、プローブのの５’端から２００ｂｐ以内のＤＮＡセグメントを同定した。標的領域の多少ともランダムな選択となるように、下記の表２２に示される８種の領域を選択した。２００ｂｐのセグメントを、本発明者らが、プライマーのＴｍを６５℃（最適のＴｍ）とし、プライマーの長さを２４ヌクレオチド（最適の長さ）とする、５０～１００ｂｐのアンプリコンを指定する、ＰＣＲプライマー採取のプライマー３に切り出した。下記の表２２は、領域および独特のゲノム属性、フォワード（Ｆ）プライマー配列およびリバース（Ｒ）プライマー配列、予測されるアンプリコンの長さ、ならびにゲノム配列の文脈における実際のアンプリコンを示す。
２００ｎｇ（２ｎｇ／μｌ）の女性ゲノムＤＮＡを含有する１００μｌのＰＣＲ反応を実行することにより、各プライマー対の性能を探索した。反応物ミックスは、１００μｌ当たり、５０μｌの水、１０μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液、２５ｍＭのＭｇＣｌ２ １０μｌ、各プライマーが１０μＭで存在する１０μｌのＦ＋Ｒプライマーブレンド、１０μｌの２０ｎｇ／μｌのｇＤＮＡ、５μｌのＤＭＳＯ、１０ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌ、および１μｌのＴａｑポリメラーゼを含有した。反応物は、氷上で準備した。増幅は、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の３０サイクルにわたり実行し、これに続き、７２℃で２分間にわたるインキュベーションを施し、１０℃で保持した。５μｌのＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル上で検討した。
ＰＣＲ産物は、残りのＰＣＲ産物９５μｌを、５００μｌのＰＢと組み合わせることにより、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラム上で精製した。材料は、カラムを通して、６ＫＲＰＭで３０秒間にわたりスピンし、７５０μｌのＰＥで洗浄し、１３．２ＫＲＰＭでスピンした。産物は、５０μｌのＥＢでカラムから溶出させ、Ｑｕｂｉｔにより定量化した。
ｑＰＣＲ解析のために、ｃｈｒＸ－１５４３７６０５１領域（アッセイ１０および１１）を、より詳細に検討した。精製ＰＣＲ産物を、１００ｆｇ／μｌ、１０ｆｇ／μｌ、および１ｆｇ／μｌに希釈した。ゲノムＤＮＡを、１０ｎｇ／μｌに希釈した。２マイクロリットルの基準物質またはｇＤＮＡを、４８ウェルＥｃｏ ｑＰＣＲプレートのウェル１つ当たり８μｌのＰＣＲマスターミックスと組み合わせた。マスターミックスは、５００μｌの最終反応容量（鋳型の添加に対応する）当たり、１７５μｌの水、５０μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液、２５ｍＭのＭｇＣｌ２ ５０μｌ、１０μＭのＦ＋Ｒプライマーブレンド ５０μｌ、２５μｌのＤＭＳＯ、１０ｍＭのｄＮＴＰ ２５μｌ、１２．５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ、１０μｌのＲＯＸ、および５μｌのＴａｑポリメラーゼを含有した。３２μｌのミックスを、１６のウェルに分配し、８μｌの鋳型を添加した。次いで、これらを、４幅対でｑＰＣＲプレートに分配した。プレートのレイアウトを、下記の表２３に示す。
結果および考察
ゲノムＤＮＡから増幅されるＰＣＲ産物についてのゲル解析は、８種のＰＣＲ反応物全てが、予測されたサイズの独特の産物をもたらすことを示した（データは示さない）。アンプリコンは、十分に清浄であり（剰余バンドを伴わず、余剰プライマーを伴わない）、定量的解析のための検量線を作成するのに有用であった。アンプリコンを、Ｑｉａｇｅｎ
ＰＣＲスピンカラムを使用して精製し、産物を５０μｌ中に溶出させた。産物収率は、アッセイ９－１８．４ｎｇ／μｌ；アッセイ１０－２６．１ｎｇ／μｌ；アッセイ１１－１３．９ｎｇ／μｌ；アッセイ１２－２６．６ｎｇ／μｌ；アッセイ１３－７．９ｎｇ／μｌ；アッセイ１４－１９．２ｎｇ／μｌ；アッセイ１５－２３．１ｎｇ／μｌ；およびアッセイ１６－２０．４ｎｇ／μｌであった。
定量的解析は、女性が４コピーを有し、男性が２コピーを有するように、Ｘ染色体上の潜在性セグメント重複に対応する、アッセイ１０および１１について実行した。
平均Ｃｑ値を、下記の表２４に示す。これらを使用して、示される検量線を作成した。２つの反応は、基本的に重ね合せ可能であった。これらの曲線を使用して、本発明者らは、検量線ウェルおよびゲノム投入ウェルの両方について、フェムトグラム単位の絶対量を計算した。データは、表２４の検量線データの下に示す。
本実施例の１つの要点は、定量的分子生物学の効力を強調することであった。この実験で、２μｌの基準物質を添加し、サンプリングしたことは、１ｆｇ／μｌの基準物質が、ｑＰＣＲ反応物中に、実際に２ｆｇ存在することを意味する。これは、アッセイ１０の５３ｂｐの断片による分子１７，５００個に対応する。２０ｎｇのゲノムＤＮＡを、反応物に投入した。これは、６６６７ゲノム相当のＤＮＡに対応する。ゲノムＤＮＡを、２００ｂｐの平均サイズに断片化したことは、標的領域のうちの７５％だけが、インタクトを維持することを意味する。よって、ｇＤＮＡは、約５０００の「ｑＰＣＲ実行可能」ゲノムコピーを有した。最後に、男性では、予測されるゲノム１つ当たりのＸ染色体の重複領域は平均１コピーであり、女性では、予測される平均は２コピーであった。観察される分子の数だけ発生した観察値と対比した予測値は以下：男性予測値＝５０００コピー；男性観察値＝３５００コピー；女性予測値＝１００００コピー；および女性観察値＝７０００コピーの通りであることが分かった。
（実施例１２）
さらなる捕捉後プロセシング戦略
目的
捕捉後プロセシングを達成するための代替法（図１５を参照されたい）を開発した。
概要
再デザインされたプローブにより実行された捕捉後プロセシングステップは、既に頑健な捕捉を、さらに５～９倍増強すると考えられた。全般的に、試験は極めて成功した。
背景
アッセイデザインの他の実施形態では、ＰＣＲプライミング部位を付加する、プローブテイル配列をコピーする前に、クローンの３’端において、エキソヌクレアーゼステップを使用することが想定された。特定の実施形態では、クローンにプローブをコピーさせることから、プローブにクローンをコピーさせることにシフトすることがさらに想定された。この極性の逆転は、本発明者らが、プローブの５’端を、プルダウン配列およびリバースＰＣＲプライマー配列のいずれとしても使用することを意味する。プローブの３’端は、非修飾のまま放置し、ついで、ＤＮＡポリメラーゼを使用してクローンをコピーすることができる。構想として、この手法にはいくつかの利点がある。まず、エキソヌクレアーゼ活性および重合化の両方を必要とするステップから、単純な重合化ステップへのシフトがなされたため、このステップを、ＰＣＲと協奏させて施すことができる。さらに、このステップは、熱安定性のポリメラーゼ酵素により、７２℃で施しうることから、一本鎖クローンの潜在的な二次構造がそれほど問題とならないことも意味する。最後に、プローブは、１１４ヌクレオチドから９５ヌクレオチドに短縮され、これにより、費用節減の利点がもたらされることが含意された。
４種の良好に挙動したｑＰＣＲアッセイ（実施例１１：８種の新たな捕捉ｑＰＣＲアッセイの検証）である、アッセイ１０、１４、１５、および１６は、これらのアッセイを「指さす」プローブとマッチした。プローブと、ｑＰＣＲアッセイとは、互いの近傍内にあったが、それらのＤＮＡ配列が互いと重複しなかったことは重要である（図１６を参照されたい）。プローブ配列および対応するアッセイを、下記の表２６および２７に示す。
方法
２０μｌずつのライゲーションミックスを、合計８０μｌに組み合わせ、合計８００μｌ中で増幅することにより、ｇＤＮＡライブラリーを、試料Ｆ１３～Ｆ１６（実施例１０）から作製し直した。ビーズを洗浄して４００μｌとし、Ｑｕｂｉｔにより、３２ｎｇ／μｌのプール濃度を測定した。
下記に列挙されるＩＤＴ製のオリゴを、１００μＭに再懸濁させた。Ｕｌｔｒａｍｅｒは、４ナノモルで得られるので、これらを４０μｌのＴＥｚｅｒｏ中に懸濁させた。４種の試験プローブの、２μｌずつ４つのアリコートを、８μｌの１００μＭのユニバーサルテイル配列（全長リバースプライマー９の最初の３５塩基から得られる）と組み合わせて、５０μＭの二重鎖のチューブをもたらした。この二重鎖を、１０μｌから、９９０μｌのＴＥｚｅｒｏ＋Ｔｗｅｅｎに希釈して、５００ｎＭとし、１０μｌから、９９０μｌに再度希釈して、５ｎＭとした。
組み合わされた４０μｌのｇＤＮＡを、４倍濃度の結合緩衝液１５μｌおよび５μｌの捕捉二重鎖と組み合わせた。反応物ミックスをアニーリングさせ、２μｌの洗浄されたＭｙＯｎｅストレプトアビジンコーティングビーズ上で捕捉した。反応物を、洗浄緩衝液で４回にわたり洗浄し、洗浄緩衝液をビーズペレットから吸引した。捕捉単独試料を測定するため、１種のビーズペレットを、単一のＰＣＲプライマーであるＡＣＡ２を含有する、１００μｌのＰＣＲミックス中に再懸濁させた。捕捉＋プロセシング試料を測定するため、別種のビーズペレットを、全長ＡＣＡ２フォワードプライマー（オリゴ８）および全長ＣＡＣ３リバースプライマー（オリゴ９）を含有する、１００μｌのＰＣＲミックス中に再懸濁させた。後者の試料を、７２℃で２分間にわたりインキュベートした。両方の試料を、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間の２５サイクルにわたり増幅した。７２℃で２分間にわたり保持し、ＲＴまで冷却した後、ビーズ上でＰＣＲアンプリコンを精製し、５０μｌのＴＥｚｅｒｏ中に再懸濁させた。
ｑＰＣＲのために、レポーター色素としてのＥｖａＧｒｅｅｎ、基準色素としてのＲＯＸ、ならびに９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間の４０サイクルにわたる３ステップＰＣＲを使用して、試料を、アッセイ９～１６（アッセイ１０、１４、１５、および１６は標的である）でアッセイした。元のｇＤＮＡライブラリーは、２ｎｇ／μｌの最終濃度で存在した。捕捉された試料および捕捉＋プロセシング試料は、２ｐｇ／μｌの最終濃度（ＴＥｚｅｒｏ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０中で希釈された）で存在した。
結果および考察
捕捉だけによるＰＣＲ収率は、２７．８ｎｇ／μｌであり、捕捉＋プロセシングによるＰＣＲ収率は、４０．４ｎｇ／μｌであった。これらの頑健な収率により、増幅は完全であることが指し示された。２％のアガロースゲル画像により、出発投入ライブラリー、捕捉されたライブラリー、および捕捉＋プロセシングライブラリーを示す（図１７）。プロセシングが働いた場合、ライブラリーの平均インサートサイズは減少するはずであり、実際に減少した。ライブラリーの下端が多少とも「バンド」をなすという事実により、プローブのある程度のプライミングオフが生じうることが指し示される。このフォーマットでは、本発明者らのプローブの３’端が露出されているため、残留する、結合していないプローブを、ｓｓＤＮＡ特異的な、３’→５’エキソヌクレアーゼである、エキソヌクレアーゼＩにより消失させることが可能でありうる。
この実験における重要な計量は、ｑＰＣＲによる、捕捉感度および捕捉特異度の測定であった。ｑＰＣＲデータを、下記の表２８に示す。
特異度に関しては、標的化された領域（明るいグレーの強調）だけが、著明な濃縮を呈示した。さらに、プロセシングされたライブラリーは、全ての標的領域について、比活性の、捕捉単独と比べて著明な増大を示した。これらのデータにより、このさらなるプローブデザインの実施形態ならば、効率的な捕捉後プロセシングに使用しうることが指し示された。
（実施例１３）
捕捉後プロセシング戦略についての配列解析
目的
この実験の目的は、シークエンシングライブラリー内の標的領域の濃縮およびカバレージを評価することであった。
概要
標的配列の濃縮およびフォーカシングのレベルは、ハイブリダイゼーションベースの捕捉を、酵素プロセシングとカップリングすることにより、捕捉単独と比較して劇的に改善された。
背景
本明細書で開示されるかつての実験により、捕捉後プロセシングは、標的含量およびｑＰＣＲにより測定される濃縮ライブラリーの比活性を増大させることが実証されている。この実験では、次世代ＤＮＡシークエンシングを使用して、捕捉単独または代替的プロセシング法により作製されたライブラリー内の標的配列の表示および分布を比較した。
方法
特異的遺伝子（ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＰＬＰ１、ＣＹＰ２Ｄ６およびＡＭＹ１）内の部位およびＸ染色体上の重複領域を標的化する、４９種の捕捉プローブのセットを使用して、２種の濃縮ライブラリープールを、男性ヒトゲノムＤＮＡと女性ヒトゲノムＤＮＡとの均等なミックスから構築した。プローブ配列を、下記の表２９に示す。
第１のライブラリープールは、実施例１２において「捕捉＋プロセシング」ライブラリーについて記載した通りに作製した。第２のプールは、以下の改変を除き、実施例１２において「捕捉だけ」ライブラリーについて記載した通りに作製した。捕捉ＰＣＲの後、第２ラウンドのＰＣＲを実行して、単一のプライマーであるＡＣＡ２で増幅されたライブラリーを、二重プライマーによる、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングに適する異種末端ライブラリーに転換した。これを行うため、ライブラリーを希釈し、以下のプライマー：
プライマー５５
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧ（配列番号１９９）および
プライマー５６
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＧＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡ（配列番号２００）
により再増幅した。
１００μｌの反応ミックスは、４０ｎｇのライブラリー、１０μｌの１０× ＳＴＤ Ｔａｑ緩衝液、２５ｍＭのＭｇＣｌ２ １０μｌ、いずれも１０ｕＭである１０μｌの５５プライマーおよび１０μｌの５６プライマー、５μｌのＤＭＳＯ、５μｌのｄＮＴＰ、ならびに１μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有した。試料は、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、５２．５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、５７．５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃－１分間の２サイクルにわたり増幅した。次いで、試料を、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間の８サイクルにわたり増幅するのに続き、７２℃で２分間を施した。ＰＣＲミックスをビーズで精製し、５０μｌずつに再懸濁させた。
結果および考察
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して、両方のプールを解析した。各ライブラリープールから得られる５０ヌクレオチドの配列リードをトリミングして、４塩基のバーコード配列を除去し、Ｂｏｗｔｉｅ配列アラインメントプログラムを使用して、ヒトゲノムの参照配列（ｈｇ１９変化形）にマップした。両方のライブラリー内のリードのうちの約８０％が、参照配列と明確に整列した。整列されたリードのさらなる特徴付けは、ハイブリダイゼーションベースの捕捉を、酵素プロセシングとカップリングすることにより、４．９キロ塩基の標的領域の、投入されたゲノムＤＮＡと比べた９７９，５９２倍の濃縮が結果としてもたらされることを明らかにした。これは、ライブラリー含量の、プロセシングされない「捕捉だけ」の手法と比較した３倍の改善を表した。全般的に、この代替的プロセシング法により得られる５種の配列のうちの約４種が、捕捉プローブにより特異的に標的化されるゲノム部位にマップされた。
各ライブラリープールについてのアラインメント統計の概要を、下記の表３０に示す。
各ライブラリープールから得られるリードはまた、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒによっても表示して、標的部位近傍の局所的配列カバレージおよび配列分布を評価した。Ｘ染色体の２つのセグメントの拡大画像は、プロセシングされたライブラリーにより、「捕捉だけ」ライブラリーより標的化部位内で高度に濃縮された配列カバレージがもたらされることを示す（図１８）。さらに、標的領域への配列マッピングは、プロセシングされたライブラリーにおいて、プロセシングされていない対照より均一に分配された。まとめると、これらのデータにより、代替的プロセシング法により、濃縮されるライブラリー内に存在する標的配列の量および品質が劇的に改善されることが指し示された。
（実施例１４）
バイオインフォマティクス
総括
従来の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）解析は、「バーティカル」である。本明細書で想定される本発明の分子の独特のデザインは、臨床リシークエンシング手法を革新する、「ホリゾンタル」法を可能とする。
配列アラインメントに関連して本明細書で用いられる「バーティカル」とは、図１９により例示される手法を指す。インフォマティクス解析へのかつての手法は、短いリードを参照ゲノムと整列させる、第１のステップを伴う。アラインメントの後、重複するリードを、ＳＮＶ（一塩基変異体）を指し示しうる塩基変化について解析する。本明細書では、リードの垂直的な積み重ねとして描示されることが多いアラインメントに依拠するため、手法を「バーティカル」という愛称で呼ぶ。多様なプログラムが、ＳＮＶおよびインデル（挿入／欠失）を許容するが、コアとなる手法は、アラインメント認識ベースである。
これに対し、本明細書で想定される方法により得られるペアエンドリードデータは、リード１内のＤＮＡタグ付けされた配列情報およびリード２内のプローブＩＤ情報を有するであろう。データ解析における第１のステップは、リードをプローブにマッチさせるステップである。ステップ２は、各プローブと「ホリゾンタルに」関連する配列情報を解析するステップである。例えば、図２０を参照されたい。
リード深度が十分であるとき、ホリゾンタルな、プローブベースの配列の会合は、アラインメントに依拠しない。そうではなくて、リードは、デノボのコンティグにアセンブルすることができる。方法の利点は、いずれも、従来の、アラインメントベースの方法が、検出するのに難航し、最も多くの困難を経る状況である、短い配列の連なりにおける挿入／欠失および複数の配列変化に対して極度に頑健なことである。さらに、ホリゾンタルな会合を、プローブおよびタグ付けと組み合わせることにより、より正確な仮説の提起（すなわち、観察される配列変異体が、真の配列変異体である可能性が高いのか、偽の配列変異体である可能性が高いのかの決定）が容易となる。
ＣＮＶおよび構造的変異Ｉ
大スケールのコピー数変異（ＣＮＶ：ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）解析では、方法は、捕捉された配列領域と関連する独特のリードの数の決定を含む。観察されるＣＮＶの大多数は、２～１００ｂｐの長さのオーダーにある塩基の挿入および欠失を伴う、「マイクロＣＮＶ」である。バーティカルアラインメント法は、それらが、多数の偽陽性仮説を促進する、アラインメントの厳密性緩和を必要とするため、マイクロ挿入／欠失（インデル）で難航する。ホリゾンタル法およびデノボコンティグアセンブリーは、アラインメントパラメータのこのような緩和を必要とせず、構造的変異の把握を要求する。
図２１に例示される、エキソンの１種の対立遺伝子内の小規模な挿入という単純な場合について検討しよう。本実施例では、ホリゾンタルアラインメントにより、リードの、プローブ１およびプローブ２との会合を「強いる」。アセンブリーは、１種は野生型のエキソン構造を伴い、１種は挿入構造を伴う、２種のコンティグを作製するであろう。この解析から、２つの原理が立ち現れる：１）隣接するプローブから得られる重複リードは、捕捉されたエキソンのインデル含有対立遺伝子についての仮説に対する実証または反証となり、２）捕捉プローブの外側のマイクロＣＮＶ対立遺伝子は、ホリゾンタル法によりたやすく検出可能である。
ＣＮＶおよび構造的変異ＩＩ
ＣＮＶの検証は、バーティカルアラインメント法を伴うことが多い。これらの研究では、参照配列に照らして完全であることが典型的なアラインメントが要求される。基準と異なる、リードを横切るＳＮＶを棄却するこのような方法は、ＳＮＶ（一般的なＳＮＰなど）に対して脆弱である。正味の結果は、コピー数の常習的な過小評価となろう。先に進むには、本発明の方法により可能なホリゾンタル法を使用すべきである。
ＳＮＶについてのホリゾンタルな仮説の検定Ｉ
ＳＮＶを検出するための、バーティカルな、アラインメントベースの方法は、解析が困難である。単一の塩基に関与するホモ接合性変異体の対立遺伝子は、同定するのがごく単純であるが、これらの変化はまれである。より一般には、ＳＮＶは、ヘテロ接合性であり、変異体は、いくつかの連続的な位置で生じる場合もあり、近接した間隔を置いた位置で生じる場合もある（エラープローン修復は、複数の塩基がコンセンサスでない位置を追跡する傾向がある）。４９種のリードがＳＮＶを保有し、４７種のリードが野生型の基準塩基を保有する場合（厳密に仮説的な例としての）、ヘテロ接合性のＳＮＶ仮説は、真の高度なカバレージ検出から逸脱する。リード深度が浅く、ＷＴのリードと対比したＳＮＶのリードの数が、５０／５０から著明に解離する（例えば、８種がＷＴであり、２種が変異体である、合計１０種のリード）場合、判定は、さらにより思弁的となる。直交的な検証にかけられる仮説は、不変的に任意のカットオフを受ける。
ホリゾンタルプローブベースの会合をタグと組み合わせる特定の実施形態では、ＳＮＶ仮説におけるはるかに大きな精度が達成される。単一のタグ（タグ＝コード＋端点）上に存在するＳＮＶは、とりわけ、同じタグ内のリードがＷＴである場合には無視される。例えば、図２２を参照されたい。
ＳＮＶについてのホリゾンタルな仮説の検定ＩＩ
リードの開始部位が同一であってもなお、２つの異なるタグ上で生じるＳＮＶ仮説（Ａ）、または同じプローブとホリゾンタルに会合する、異なるリード上で生じるＳＮＶ仮説（Ｂ）、または同じエキソンにおける異なるプローブの会合から生じるＳＮＶ仮説（Ｃ）は、必然的に、真剣に検討しなければならない仮説である。例えば、図２３を参照されたい。
（実施例１５）
分子注釈
総括
本実施例は、シークエンシングライブラリーについての「分子注釈」（図２４）と、結果として得られるシークエンシング情報を査定するのに後続のステップで使用されるインフォマティクスとの相互作用について記載する。プローブから得られるリバースリードは有用である。ＤＮＡプローブ配列の領域を決定するリバースリード２は、全ての後段における解析検討において、著明に有用である。例えば、有用性は、変異体の判定において見出すことができ、ここから得られる成果は、コピー数の決定において有用である。データ解析のこれらの２つの側面について、下記で記載する。
リード＿２のプローブ配列
プローブセットとは、１種もしくは２種のプローブ、なおまたは数万種のプローブを含みうる、独特の、公知の配列コレクションである。これは、リード＿２を使用して、ある実験における任意の全てのプローブを同定しうることを意味する。これは当然ながら、リード２の長さが十分であり、プローブは、リード＿２により精査される領域が、独特の識別子を構成するようにデザインされることを仮定する。表３１は、１９２種のプローブのコレクションおよび各プローブについての独特の識別子として用いられる１０ヌクレオチドのリード＿２配列について記載する。２種のプローブ（ＣＹＰ２Ｃ１９＿ｒ５＿ＦおよびＣＹＰ２Ｃ９＿ｒ５＿Ｆ）は当然ながら、同一な１０ヌクレオチドの５’ＤＮＡ配列を共有し、それらの間を識別する、「ＡＧ」または「ＣＴ」の２ヌクレオチドのコード（影を付した）を付加されていることに注目されたい。
ペアエンドシークエンシング実験では、リード＿１およびリード＿２を、同じＤＮＡクローンから導出する。これは、リード＿１のゲノム配列（図２４の部分図（３）および（４））が、特定のプローブ（図２４の部分図（５））と会合したために存在することを含意する。まとめると、このデータにより、次世代配列のコレクション内に存在する各ＤＮＡ配列は、それを標的化したプローブ配列と会合しうることが指し示される。特定のプローブと会合する全てのＤＮＡ配列を回収することができる。
次世代リシークエンシング解析（標的化解析または他の形の解析）のための本パラダイムは、リードを再び参照ゲノムと整列させることである。プローブ会合を標的化する知見は、リードをプローブによりまず分取し、次いで、アラインメントベースの方法、デノボアセンブリー法、またはこれらの両方により解析する新規のワークフローをもたらす。実施例１４において記載する通り、ＰＡＲＳＡＲ（ｐｒｏｂｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－ｒｅａｄ－ｓｃａｆｆｏｌｄ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、変異体の発見における、より複雑で困難な問題のうちの１つであって、最も興味深い変異体は、参照配列から最も著明に逸脱する変異体であるが、これらはまさに、従来の配列ベースのアラインメントに対して最も屈折的な配列（図２５）であるという問題を解決する。プローブ会合に続いて、デノボの局所的アセンブリーを使用すると、このような変異体は、容易に同定される。
プローブベースのリードの群分けを、変異体を高度な初回通過の信頼性で同定する、分子デザインの他の側面と共に使用する。図２６において示される通り、プローブは一般に、標的領域を一括するようにデザインする。リードの重複的側面により、潜在的な変異体部位を、双方向的な独立のリードによりクエリーすることが可能となる。加えて、この二重プローブのデザインは、隣接するプローブ結合性部位自体をシークエンシングすることも確保する。これは、プローブの捕捉性能が問題となりうる場合に重要な特色である。例として述べると、この分子デザインでは、一塩基変異体が捕捉プローブ配列のうちの１種の基底をなす変異体の対立遺伝子が同定され、後段のインフォマティクス解析において把握される。
分子注釈から後段の変異体解析への情報の流れのさらなる側面は、３つの塩基配列による標識と、粘着末端の配列開始部位との組合せとして規定される配列「タグ」（図２４の（１）＋（３））を伴う。配列タグは、各シークエンシングクローンが独特のものであることを規定する。図２７で例示される通り、同種クローンのコレクション内で生じる変異体であって、同一な配列タグを共有する変異体は、偽陽性である可能性が高い。これに対し、異なるタグ（低頻度で生じる場合であってもなお）を伴う配列の間で共有される変異体は、真陽性の変異体である可能性が高い。配列をタグ付けし、タグを使用して、信頼性の予測を変異体の判定に割り当てるこのシステムは、後段における変異体の検証（費用がかさみ、時間がかかる可能性がある）の負担を実質的に軽減する見通しがある。分子注釈は、分子技術によるシークエンシングプラットフォームについて記載する、実施例１６の文献においてより詳細に記載されている。
まとめると、本明細書で想定される技術プラットフォームの顕著な特色のうちの１つは、全ての「アニーリングプローブ」イベントが、さらなる分子注釈もまた保有するＤＮＡクローンにコピーされるということである。配列は、プローブおよび試料標識により、特異的投入試料の特異的標的領域に属するコレクションに分別される。次いで、アラインメントとデノボアセンブリーとの組合せを、変異体を検出するために使用することができる。最後に、候補変異体の出現の冗長性を使用して、変異体の判定における信頼性を割り当てることができる。変異体の解析に加えて、コピー数を決定するための方法もまた提供される。これら２つのエレメントは、緊密にカップリングされており、コピー数の決定は、信頼性の高いシークエンシングリードに依存するために特異的である。コピー数を配列情報から決定するための全体的な図式を、図２８に示す。
（実施例１６）
分子技術シークエンシングプラットフォーム
総括
本明細書で想定されるゲノムシークエンシングプラットフォームは、（１）複数の個体から得られるゲノム試料に、単一のシークエンシングランで取り組み；（２）一（および／または複数）塩基変異体（ＳＮＶ）ならびに一（および／または複数）塩基挿入および欠失（ＳＮＩＤ）を、高い信頼性で検出し；（３）クエリーされる全ての遺伝子環境における、大スケールおよび小スケールのコピー数変異（ＣＮＶ）を検出し；（４）クエリーされる遺伝子環境において、マイクロスケールの転座、反転、および挿入／欠失イベントを検出し；（５）≧エキソームスケールの探索（ヒトゲノム配列全体のうちの≧１～２％）から、≦単一遺伝子スケールの検証までスケーラブルな技術システムを開発し；（６）ゲノム変異検定における高特異度（低偽陰性率）および高感度（低偽陽性率）を達成し；（７）単純で、携帯可能で、その実行においてスケーラブルな、分子技術およびバイオインフォマティクス技術を創出し；（８）品質管理測定にたやすく適する分子法をもたらす方法を提供する。
ゲノムシークエンシングリードの全体的な図式を、図２９に示す。各要素についての記載は、以下の通りである。
（１）「配列標識」とは、リード開始位置（３）と共に使用されて、各シークエンシングリードが独特のものであることを確立する、（連続＊）ヌクレオチドのセット（すなわち、独特の３マーのセット）である。先駆的文献では、この標識とリード開始点との組合せを、「独特の配列タグ」と称した。配列標識は、遭遇する最初の塩基セットであり、一塩基合成（ＳＢＳ：ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）化学反応では、４つのＤＮＡ塩基全てが、各リード位置において同等に提示されなければならないため、シークエンシング標識に対する制約は、独特のものであることだけでなく、また、配列標識の集合セットで使用される塩基のコレクションは、４つの塩基全てを、シークエンシングされる全ての位置に存在させなければならないことでもある。局所的ＣＮＶを決定する独特の配列タグの使用については、この文献のバイオインフォマティクス節で記載されている。
（２）「試料標識」とは、マルチプレックス化された試料のセット内の特定の試料を独特に同定する、（連続＊）ヌクレオチドコードのセットである。シークエンシング標識と同様に、試料標識のコレクションもまた、ＳＢＳによる配列塩基判定の要件を満たす、４つの塩基全てを含有する。試料コードは、ゲノムＤＮＡ断片に隣接して意図的に配置される。このデザインの駆動因子は、ライゲーションバイアスであることは、ライゲーション接合部の約２塩基上流および１～２塩基下流において、ＤＮＡライゲーション効率への塩基優先性が存在することを意味する。試料コードを、ライゲーション接合部に配置することにより、特異的試料内の全ての断片は、ライゲーションの影響／バイアスを受ける。
＊いかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに述べると、配列標識および試料標識は、櫛形ヌクレオチド配列として創出しうることが想定される。
（３）ゲノム断片内の「リード開始点」とは、「独特の配列リード」を規定する、２種の鍵となるエレメントのうちの１種である。上記の節（１）で論じた通り、各リードに独特の同定「タグ」は、シークエンシング標識およびリード開始点を含む。下記でより詳細に検討する通り、独特の［（１）＋（３）］配列タグのコレクションは、大スケールのＣＮＶを決定するのに不可欠である。本明細書では、「大スケールのＣＮＶ」を、何らかの隣接配列を加えた、少なくとも１種のプローブ結合性領域の全体を伴う任意のＣＮＶとして規定する。大スケールのＣＮＶは、染色体全体の獲得または喪失と同程度に大規模のＣＮＶでありうる。
［（１）＋（２）］配列標識および試料標識は、ゲノムライブラリーの全体が創出される、ライブラリー構築工程の初期段階において、末端修復されたゲノム断片にライゲーションされたアダプター配列内に埋め込まれる。
（４）シークエンシングリード：ゲノム断片から得られる配列情報は当然ながら、ゲノムアッセイの中心的な焦点である。各リードは、同じアッセイ内でもたらされる、複数の、重複するリードの文脈において検討される。
（５）プローブレベル（「ゲノムインデックス処理」）：全体的なゲノムアッセイ戦略は、複数の配列標識を、各シークエンシングリードをゲノム解析のより大きな枠組みに位置づける、複合的「分子注釈」と組み合わせることである。この操作パラダイム内では、リード１は、各注釈されたクローンのエレメント（１～４）を明らかにする。リード２は、ハイブリダイゼーションベースの捕捉および後続の酵素プロセシングにより各クローンを回収したプローブ配列を明らかにする。全てのリードは、それらを捕捉したプローブに従い、まずクラスター形成されるため、プローブ配列情報は、ゲノム戦略に中心的である。各リードは、解析の前に、ゲノムプローブに照らしてインデックス処理されるため、このプローブごとベースの情報のクラスター形成を、「ゲノムインデックス処理」と称する。
プローブ標識の興味深い特色のうちの１つは、捕捉反応物中の全てのプローブ配列の配座が、十分に規定されている（どのプローブが捕捉反応にかけられるのかが既知である）ことである。これは、リード２が、６０ヌクレオチドのプローブ配列の全体を、必ずしも対象とする必要がないことを含意する。そうではなく、リード２は、特異的反応物中の全てのプローブの明確な同定を可能とする程度に十分な長さであるだけでよい。非限定的な一例として述べると、実施例１５において論じたプローブセットは、５’プローブ配列のうちの７ヌクレオチドのだけに基づいて差別化しうる（同一な７ヌクレオチドの５’末端を伴う２種のプローブを、ジヌクレオチドコードでタグ付けしたので、情報論的に差別化することができるであろう）、１９２のプローブからなる。
（６）捕捉標識：ライブラリーの組成は、プローブと標的配列との緊密な分子相互作用により決定する。各独特のプローブ配列の性能は、いくつかの（４～６つの）ランダム塩基の連なりほどに単純でありうる、捕捉標識を使用してモニタリングすることができる。シークエンシングにおいて検出される捕捉標識の多様性および統計学的分布は、プローブ性能の直接的な尺度である。一例として、特定のプローブと会合する配列が極めて少数の配列である場合を想像されたい。この配列の欠損をプローブ性能の不良に帰し、これにより、プローブ再デザインの反復サイクルを開始してみたくなるかもしれない。しかし、配列の提示不足はまた、アダプターに良好にライゲーションされない配列、および／または使用される特定のＰＣＲレジメンで良好に増幅されない配列の帰結でもありうる。捕捉標識の使用は、これらの欠陥モードの差別化を可能とする。プローブの性能が不良であると、実際に生じる極めて少数の捕捉イベントは、多数回にわたり現れる極めて少数の捕捉標識として顕示されるであろう。これに対し、実際の捕捉反応の前段における理由（ライゲーション、ＰＣＲ、末端修復など）で提示が不良である場合は、該して、独特に提示される捕捉標識の大規模な配座が結果としてもたらされるであろう。特定の実施形態では、数千種のプローブの自動式デザインに移行する場合、プローブの性能を情報論的に品質管理する能力が、ますます重要となるであろう。
（実施例１７）
プローブの選択および実装
概要
プローブ配列の選択とそれらを使用する方法とは、必ずしも協奏的に開発されてはいない。本実施例は、Ｉ節でプローブの選択基準について記載し、ＩＩ節でそれらを最も効果的とする実験室法について記載する。例えば、図３０を参照されたい。
Ｉ節：標的化プローブの選択
最も一般的に述べると、標的濃縮プローブは、６０ヌクレオチドの長さである。プローブが一般に有向であることは、それらの位置の一方の側（一般に３’側）において、配列を捕捉することを意味する。６０マーの標的化コアに加えて、さらなる機能性（例えば、ＰＣＲプライマー結合性部位、ビオチンによるプルアウトなどを可能とする相補的オリゴのための結合性部位）を付加するテイル配列も付加する。６０ヌクレオチドの標的化配列は、以下の制約および基準：（１）プローブは、標的配列の開始点に照らして－１００～＋５０ヌクレオチドに配置すること。図３０では、標的配列の「開始点」とは、イントロン：エキソン接合部であること；（２）プローブは、例示される通り、プローブ対から得られる配列が、逆向きの配向性で重複しているように、冗長性を伴ってデザインすること；（３）プローブは、３３％以上のＧＣ含量（６０マー当たり＞２０のＧまたはＣ）および６７％以下の（６０マー当たり＜４０のＧまたはＣ）を保有するように選択する（可能な場合）こと；（４）プローブは、可能な場合は常にリピートを回避するように選択すること。これは、いずれもがＵＣＳＣゲノムブラウザー上で閲覧しうる、ＲＥＰＥＡＴＭＡＳＫＥＲおよび／または独特の整列可能性基準を一助として行うこと；および（５）万一、位置要件、ＧＣ要件、および独特性要件を満たすことができない場合は、選択規則を、以下の順位（ＧＣ＞位置＞独特性）で緩和することにより選択する。言い換えると、ＧＣ基準および位置どり基準は厳密でないが、独特のものであるという基準は厳密である。
ＩＩ節：実験室法
標的濃縮への投入物は、本明細書の他の箇所で記載した、プローブ、ｇＤＮＡライブラリー、および緩衝液である。標的化濃縮における第１のステップは、二本鎖ＰＣＲ断片としての形態で始まる、ｇＤＮＡライブラリーの融解ステップである。これは、ｇＤＮＡを、好ましくは、１０μｌの総容量中１００ｎｇ／μｌの濃度で、９８℃で２分間にわたり変性させるのに続いて、速やかに氷に移すことにより達成する。ｇＤＮＡライブラリーは、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０および０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する低濃度の塩緩衝液中に懸濁させる。第２のステップは、５μｌの濃縮結合緩衝液（４ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．４％のＴｗｅｅｎ２０）を添加することである。これらの条件は特殊であるが、全体の構想は、塩濃度を、２Ｎのオスモル濃度まで増大させて、相補的なＤＮＡ鎖の、急速な反応速度による会合を達成しなければならないということである。プローブの最終濃度が、各プローブ２５０ｐＭずつとなるように、５マイクロリットルのプローブもまた添加する。ｇＤＮＡライブラリー、緩衝液、およびプローブの混合物を、２分間にわたり９８℃まで加熱し、４分間ごとに１℃ずつの減分で６８℃まで下げて冷却した。第３のステップでは、プローブ：ｇＤＮＡ複合体（プローブには、ビオチンを会合させている）を、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに結合させた。第４のステップでは、厳密な洗浄を使用して、例えば、プローブとｇＤＮＡとの間のヌクレオチド配列の短いマッチのために生じうる、プローブと非標的配列との望ましくない会合を除去する。厳密性は、塩濃度が低く、ホルムアミド濃度が高い洗浄緩衝液、例えば、３０％～３５％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有する緩衝液を使用することにより達成する。複数回（例えば、４回）にわたるビーズの洗浄を使用して、標的配列の所望の純度を達成する。洗浄されたビーズは、プロセシングされ、増幅され、シークエンシングされたプローブに結合した標的配列を保有する。まとめると、低塩濃度によるｇＤＮＡライブラリーの融解、高塩濃度によるプローブのアニーリング、および高いホルムアミド濃度による洗浄を、プローブのデザインと協奏的に使用して、高レベルの標的配列濃縮を達成する。
（実施例１８）
例示的な配列
総括
例示的なゲノムタグ、試料コード、およびライブラリー情報を、下記の表３２～３４に示す。
（実施例１９）
タグ付けされ、標的化された、ゲノムライブラリーの構築
概要
本明細書では、タグ付けされ、標的化された、ゲノムシークエンシングライブラリーへの複数の方途が想定されている。本実施形態では、ＤＮＡ修復を使用して、プローブ会合配列を、捕捉されたゲノム断片に接合させる。この手法は、配列準備された標的化ゲノムライブラリーを創出するのに良好に働いた。
構想
ライブラリー構築の重要な原理は、配列準備されたクローンが、ゲノム断片および捕捉プローブの両方から得られるＤＮＡ配列を含むことである。この部分の「組換え」により、プローブと直接接触するゲノム断片が大幅に濃縮され、シークエンシングリードを、プローブ配列の一方の側にフォーカスすることが可能となる。このデザインでは、標的ゲノムライブラリー断片、捕捉プローブ、および共通なパートナーオリゴの間で形成される三幅対の複合体は、ＤＮＡ複製フォークを想起させる構造を保有する。このようなフォークは、通常のＤＮＡ複製において生じるが、また、ＤＮＡ修復工程においても生じる。後者の場合、５’置換鎖をトリミングして、新たに重合化した鎖の、隣接する３’配列への接合を可能とすることが必要であることが多い。この修復工程は、２種の酵素および３種の酵素活性を必要とする。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素は、これらの活性のうちの２種である、これらの５’置換フラップを除去する５’－３’エンドヌクレアーゼ活性と、当然ながら、ＤＮＡポリメラーゼ活性とを保有する。
特定の実施形態では、Ｂｓｔポリメラーゼはまた、ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素と関連することが多い、３’－５’ヌクレアーゼ活性も欠くために好ましい。例えば、図３１を参照されたい。この特色は、標的ゲノムクローンの一本鎖３’ＤＮＡ突出は、保護を必要としないことを示唆するために有用である。必要とされる他の酵素および活性は、ＮＡＤ＋要求性Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼなどの、ニック閉鎖型ＤＮＡリガーゼである。プロセシングの後、プロセシングされた断片を、ＰＣＲにより増幅して、シークエンシングの前の、サイズの選択および定量化を可能とする。
原理実証オリゴヌクレオチド
この実験のために、本発明者らがｑＰＣＲアッセイを施す、８種のゲノム領域に対応する、８種の標的領域を選択した。これらの８種の領域のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを表３５に示す。捕捉プローブは、本明細書の他の箇所で使用および検証された捕捉プローブの、正確なリバース相補鎖である。これらのプローブは、表３７で言及される通り、２２％～７３％のＧＣ％の範囲にわたる。
プローブは、ＩＤＴによりＵｌｔｒａｍｅｒとして合成されたものであり、１００ｕＭまで再水和させ、プールしたが、プール内の各プローブは、６．２５ｕＭで存在する。各プローブが１００ｎＭで存在する、１００倍濃度の原液を創出するために、１０ｕＭのプールと１００ｕＭの共通なビオチニル化パートナーオリゴ １０μｌとを、６０５μｌのＴＥｚｅｒｏ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＴＴ）中で組み合わせた。１００倍濃度の原液を、さらに１００倍に希釈し（１０μｌを、９９０μｌのＴＴに）て、各プローブが１ｎＭの濃度で存在する作業溶液をもたらした。
捕捉／プロセシングプロトコール
原理実証研究の１つの目的は、プローブの性能を検証し、配列準備されたライブラリー収率に対するプロセシングの効率について調べることであった。ゲノムライブラリープールは、１６例の試料セットライブラリーから導出した。プローブをアニーリングさせるため、個別のＰＣＲストリップチューブ内に１０μｌずつのライブラリーアリコート４つを、２分間にわたり９８℃まで加熱し、氷上で冷却した。４倍濃度の結合緩衝液 ５μｌおよび５μｌのプローブを、各チューブに添加し、９８℃から６９℃への、４分間にわたり１℃ずつのステップによるサーマルサイクラープログラムを使用して、溶液をアニーリングさせた。アニーリングされた複合体を、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに結合させ、２５％のホルムアミド含有洗浄緩衝液で４回にわたり洗浄し、ＴＥｚｅｒｏで１回洗浄した。最終的な複合体を、２μｌのＴＥｚｅｒｏ中に懸濁させた。
４種の複合体に対する４種の処理：１）生の捕捉効率を決定する、プロセシングを伴わない、ＡＣＡ２プライマー単独による増幅；（２）プロセシングを伴わない増幅および捕捉効率を決定する、プロセシングを伴わない、ＡＦおよびＣＲによる増幅；（３）低容量のプロセシングについて探索する、ＡＦおよびＣＲによる増幅の前の、１０μｌ中のＰｒｅＣＲによるプロセシング；ならびに（４）高容量のプロセシング効果を確立する、５０μｌのＡＦおよびＣＲによる増幅の前の、ＰｒｅＣＲによるプロセシングについて探索した。
ＰｒｅＣＲによるプロセシングは、１００μｌ当たり
－ ８２μｌの水
－ １０μｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液
－ １μｌの１００倍濃度のＮＡＤ＋
－ １０ｍＭのｄＮＴＰ １μｌ
－ ２μｌのＰｒｅＣＲ酵素ミックス
を含有する、製造元の推奨溶液を添加することにより達成した。
１０μｌのＰｒｅＣＲカクテルを、チューブ３に添加し、５０μｌを、チューブ４に添加した。これらを、３７℃で２０分間にわたりインキュベートした。
ＰｒｅＣＲ処理の後、ＴＥｚｅｒｏを添加することにより、４例の試料全てを、５０μｌに再懸濁させ、適切なＰＣＲプライマーを伴うＱ５ ＰＣＲカクテルを、２５０μｌの最終容量に添加した。ＰＣＲカクテルの各アリコートは、
－ １２５μｌの水
－ ５倍濃度のＱ５反応緩衝液５０μｌ
－ １０ｕＭのプライマー２５μｌ（ＡＣＡ２またはＡＦとＣＲとの１：１ブレンド）
－ １０ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌ
－ ２．５μｌのＱ５ホットスタート酵素
を含有した。
５０μｌずつの各ＰＣＲ反応ミックスを、１．２５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎおよび１μｌのＲＯＸ色素を含有するチューブにアリコート分割し、混合し、４連の１０μｌアリコートを、ｑＰＣＲ用光学ＰＣＲプレートに添加した。残りの２００μｌを、１００μｌのアリコートに分割した。ｑＰＣＲ反応および従来のＰＣＲ反応の両方を、
－ ９８℃で３０秒間
－ ９８℃で１０秒間、６９℃で１０秒間、７２℃で１０秒間の４０サイクル（ｑＰＣＲ）およびプラトーサイクル（従来のＰＣＲ）
の通りにサイクリングさせた。
リアルタイムＰＣＲ反応をモニタリングして、従来のＰＣＲ反応に最適の停止点を決定した。ＡＣＡ２反応では、停止点は、２１サイクル目であった。残りの反応では、停止点は、２８サイクル目であった。これらのｑＰＣＲ反応については、以下の結果節においてさらに記載する。
１０μｌの生のＰＣＲを、ゲル解析のために回収し、残りの１００μｌのアリコートを、ビーズと１：１で精製した。精製ＰＣＲ産物を、５０μｌのＴＥｚｅｒｏで溶出させ、Ｑｕｂｉｔにより定量化した。ＤＮＡ収率は、（１）７．４４ｎｇ／μｌ；（２）１０．６ｎｇ／μｌ；（３）１２．１ｎｇ／μｌ；および（４）１５．７ｎｇ／μｌであった。
捕捉／プロセシングについてのｑＰＣＲ解析
６例ずつの試料による８種のアッセイ－アッセイ１７～２４（表３７）のアレイを含有する、単一のＥｃｏ ｑＰＣＲプレートを使用して、捕捉効率を評価した。６例の試料は、
１． 元のｇＤＮＡライブラリー１０ｎｇ／μｌ
２． ＮＴＣ
３． ０．０１ｎｇ／μｌの試料１
４． ０．０１ｎｇ／μｌの試料２
５． ０．０１ｎｇ／μｌの試料３
６． ０．０１ｎｇ／μｌの試料４
であった。
Ｑ５ホットスタートアッセイ混合物は、
－ ２３７．５μｌのＨ２Ｏ
－ ５倍濃度のＱ５反応緩衝液１００μｌ
－ １０μｌのｄＮＴＰ
－ １２．５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ
－ １０μｌのＲＯＸ
－ ５μｌのＱ５ホットスタート酵素
を含有した。
このカクテルを、４８μｌのアリコートに分配し、３μｌのアッセイプライマー（ＦプライマーおよびＲプライマーのいずれも１０ｕＭ）を添加した。これを列に分配した。２μｌの試料を行に添加し、プレートを上記で記載した通りにサイクリングさせた。
結果
複合体の増幅：増幅用複合体の蛍光プロファイルを、増幅プラトー（単一のプライマーによるによるアンプリコンについては、二重プライマーによるアンプリコンはるかに早く生じる）を同定するのに主に使用する一方で、Ｃｑ値を使用して、アンプリコンの含量を、試料間で注視することができる。この実験では、観察されたＣｑ値は、
であった。
これらのデータは、ＰｒｅＣＲ処理により、Ｐ１＋Ｐ２（ＡＦ＋ＣＲ）によるアンプリコンの存在量が増大することを実証した。
図３３に示される、プロセシング後ＰＣＲ産物のゲル画像は、ＰｒｅＣＲ処理により、サイズ分布の大きなクローンの増幅が支援されたことを示す。非処理試料２のアンプリコンは主に、サイズの小さな断片のクラスターである。試料３と、より大きな程度において、試料４とは、より広く分布するスメアである。
標的濃縮を示すｑＰＣＲの結果を、下記の表３６に示す。試料１における生の配列捕捉は、驚くべき程度に多かった。既往のデータセットに対する、このような予測外の改善には、少なくとも２つの因子：（１）コアのアニーリング工程（融解前の、高温で低塩濃度によるストレプトアビジンビーズへの結合）を最適化したこと；および（２）長いパートナーオリゴ（３５ヌクレオチドと対比した４０ヌクレオチド）を使用したことが寄与した可能性がある。
ＰｒｅＣＲ処理を伴わないＰ１＋Ｐ２（ＡＦ＋ＣＲ）による増幅用材料（試料２）も作製したところ、ｇＤＮＡ（および／またはＮＴＣ）に対する標的シグナルの実質的な濃縮が観察された。
ＰｒｅＣＲで処理された複合体はまた、プロセシングされていない対照（試料１）と同等な濃縮レベルももたらした。これは、ＰｒｅＣＲによるプロセシングが、プローブベースのパートナーオリゴの、ゲノムライブラリーベースの標的クローンによる組換えを刺激しうるという事実の目覚ましい実証である。濃縮レベルが顕著ではない場合、クローン材料の大部分は少量であり、ｑＰＣＲアッセイの範囲から外れた。本明細書の他の箇所で言及される通り、ビーズによる注意深い濃縮は、ｑＰＣＲ部位をカバーするライブラリーの比率を劇的に増大させうる。
加えて、結果により、ＰｒｅＣＲ処理が大量であるほど、必ずしも良好であるわけではないことも指し示された。濃縮比活性に関する、８種のアッセイのうちの６種において、試料３（１０μｌのＰｒｅＣＲ処理）の成果は、試料４（５０μｌのＰｒｅＣＲ処理）を上回った。
考察
本実施例で開示される捕捉法およびプロセシング法の性能は、非処理複合体を使用しても良好であった。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに述べると、非処理複合体の成果が良好である１つの理由は、捕捉プローブおよびゲノム断片のいずれもが、プライマー結合性部位を保有するためであったことが想定される。
実施例１９への付録
本実施例のためのプライマーおよびアンプリコンのデザインを、下記の表３７に示す。
（実施例２０）
ライブラリーフリーの標的化ゲノム解析
概要
本実施例は、ライブラリーフリーゲノム解析について実証する。目標は、このような方法を、信頼でき、再現可能で、廉価で、ハイスループットのフォーマットで実装するのに最も有用なパラメータを同定することであった。特に、Ｔ４ポリメラーゼは、ＰＥＧ８０００（分子密集剤）の存在下でＴ４遺伝子３２タンパク質を補充すると仮定した場合において、多くの多様なゲノム配列をコピーしうることが発見された。加えて、配列ライブラリー構築のすぐ前段における抑制ＰＣＲが、長いインサートのシークエンシングクローンを濃縮する強力な方法であることも分かった。
背景
ライブラリーフリー法の背景にある分子概念は、
（１）ｇＤＮＡを、約４００ｂｐに断片化すること、またはｄｄＮＴＰの存在下で、ランダムな１５マーによる第１鎖のｃＤＮＡ合成を実行すること（図３３）；
（２）ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡを、標識された捕捉プローブと共に融解させ、末端修復されたｇＤＮＡ／ｃＤＮＡを精製すること。ｇＤＮＡについては、ゲノム配列を、テイル部分内に含有されるランダムヘキサマー配列を含む配列タグで修復すること（図３３）；
（３）２０℃の単一の反応においてＤＮＡ複合体をプロセシングすること。使用される緩衝液は、ＮＥＢ ＣｕｔＳｍａｒｔ（ＮＥＢ＃４およびＢＳＡ）、ＡＴＰ、ｄＮＴＰ、およびＰＥＧ８０００である。複合体は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（ＳＢ）、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼでプロセシングする。アダプターライゲーション鎖は、５’リン酸化されており、パートナー鎖は、３’ｄｄＣを含む。アダプターの逆側の末端は、粘着末端であり、保護することができること。平滑末端構成は、自己二量体をなさず、極めて効果的であり、ライゲーション鎖を含有するＰ１を、標的を含有するＰ２に接合させること（図３４）；
（４）フローセルに適合的な配列を添加し、試料特異的インデックス配列を各反応物に導入するＰＣＲ増幅（図３５）；ならびに
（５）ＤＮＡシークエンシング（図３５）
を含む。
特定の実施形態において生じうる、１種の潜在的なアーチファクトは、占有されていないプローブの存在量と関連する。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性により、これらの分子において、平滑末端を作製することが可能であり、次いで、これを、Ｐ１アダプター配列へのライゲーションの基質とする（図３６）。これらの短い「オリゴ二量体」産物は、介入しなければ、後続のＰＣＲ反応物を圧倒するであろう。潜在的なアーチファクトを回避するために、２５ヌクレオチドのＰ２セグメントをＰ１アダプター内に組み入れる抑制ＰＣＲデザインを使用した。このセグメントを伴う抑制ＰＣＲ増幅の後、Ｐ１またはＰ２に、特異的な突出を伴うフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、インデックス配列およびフローセル適合的突出を付加する。
プロセシング後抑制ＰＣＲ、全長増幅、およびシークエンシングを可能とするオリゴヌクレオチドを、下記の表３８に示す。
材料
ゲノムＤＮＡ試料を、４例の対象から回収し、Ｏｒａｇｅｎｅ唾液回収キットを使用して精製した。この研究でシークエンシングした試料は、以下の通りであった。
これらの実験で使用したプローブを、下記の表３９に提示する。捕捉後増幅において発生する同種クローンから得られる、同じシークエンシング開始部位を伴う、独立の捕捉イベントを確立するのに、ヘキサマータグが必要とされる。
方法、結果および考察
Ｉ部：４種のｇＤＮＡ（Ｆ、Ｓ、Ｃ、およびＬ）を、１５０μｌの最終容量中に２０ｎｇ／μｌに希釈した。試料を、５００ｂｐに超音波処理し、１２５μｌを、１２５μｌのビーズで精製した。出発材料および精製され、断片化されたｇＤＮＡを、図３７に示す。ｇＤＮＡの濃度は、（１）Ｆ：１３７ｎｇ／μｌ；（２）Ｓ：１２９ｎｇ／μｌ；（３）Ｃ：１５３ｎｇ／μｌ；および（４）Ｌ：１２４ｎｇ／μｌであった。
捕捉のために、１０μｌのｇＤＮＡ試料を、２分間にわたり９８℃まで加熱して（鎖の解離を達成し）、氷上で冷却した。４倍濃度の結合緩衝液５μｌおよび４９種のプローブプール（配列番号１５０～１９８）５μｌ（５０ｎＭのユニバーサルオリゴ６１と組み合わせた、１ｎＭの各プローブ）を添加し、ミックスをアニーリングさせた（９８℃で２分間に続いて、１℃ずつ逐次的に６９℃まで温度を低下させる、４分間にわたるインキュベーション）。複合体を、２μｌのＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズに結合させ、これを、１８０μｌのＴＥｚｅｒｏ中に、３０分間にわたり懸濁させ（総容量を２００μｌとする）、２５％のホルムアミド洗浄液で５分間ずつ４回にわたり洗浄し、ＴＥｚｅｒｏで１回洗浄し、上清をビーズ複合体から抜き取った。
プロセシングおよびアダプターライゲーションのために、６０μｌの水；１０μｌのＮＥＢ「ＣｕｔＳｍａｒｔ」緩衝液；５０％のＰＥＧ８０００ １５μｌ；１０ｍＭのＡＴＰ １０μｌ；１ｍＭのｄＮＴＰブレンド １μｌ；１μｌのＴ４遺伝子３２タンパク質（ＮＥＢ）；および０．５μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を含有する、１００μｌのＴ４ミックスを作製した。２５μｌのミックスを、４例の試料の各々に添加し、２０℃で１５分間にわたりインキュベートするのに続き、７０℃で１０分間にわたるインキュベーションを施して、Ｔ４ポリメラーゼを熱不活化した。不活化ステップの後、１．２５μｌのアダプター（１０μＭ）および１．２５μｌのＨＣ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加した。この混合物を、２２℃で３０分間および６５℃で１０分間にわたり、さらにインキュベートした。
ライブラリーフリー法の１つの魅力的な特色は、プロセシングされた複合体を、ビーズにさらに接合させることである。ビーズをライゲーション緩衝液から引き寄せ、２００μｌのＴＥｚｅｒｏで１回洗浄した。次いで、複合体を２μｌ中に再懸濁させた。増幅のために、２０μｌの容量中の単一プライマーによる増幅を使用して、標的断片を増幅し、かつ、プローブ「スタブ」を超える長いゲノム断片を濃縮した。増幅の後、全長プライマーを伴う大容量のＰＣＲ反応物を使用して、「配列準備された」ライブラリーを創出した。
５７μｌの水と、５倍濃度のＱ５反応緩衝液２０μｌと、１０μｌの単一プライマー１１７（表３８を参照されたい）と、１０ｍＭのｄＮＴＰ ２μｌと、１μｌのＱ５ホットスタートポリメラーゼを組み合わせることにより、Ｑ５ベースの単一プライマーによるＰＣＲ増幅緩衝液を作製した。１８μｌずつを、各チューブに添加するのに続いて、２０サイクルにわたり増幅した（９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、６９℃で１０秒間、７２℃で１０秒間の２０サイクルにわたり増幅し、１０℃で保持した）。ＰＣＲの後、ビーズをプルアウトし、２０μｌの増幅前上清を、１６３．５μｌの水、５倍濃度のＱ５緩衝液６０μｌ、１５μｌのフォワードプライマー１１８（１０ｕＭ）、１５ｕＭのリバースプライマー１１９（１０ｕＭ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ ６μｌ、１３．５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ＋ＲＯＸ色素ブレンド（ＲＯＸを１に対してＥＧを１．２５とする）、および３μｌのＱ５ホットスタートポリメラーゼを含有する（全ての反応物への色素の添加は意図しなかった）、２８０μｌのＰＣＲミックスに移した。１００μｌのアリコート２つは、従来のＰＣＲ（９８℃で１０秒間、６９℃で１０秒間、７２℃で１０秒間）で増幅し、４連の１０μｌアリコートは、ｑＰＣＲ条件下で増幅した。図３８は、４例の試料全てについて観察された増幅プロットを示す。反応は、ＰＣＲを想起させる変曲点／プラトーを経ていると考えられ、従来の反応は、２０サイクルで停止させた（これで、合計４０のサイクルのＰＣＲ）。図３９は、これらの増幅反応の産物を含有する、２％のアガロースゲルを示す。図４０は、ビーズによる精製の後における増幅産物を含有する、２％のアガロースゲルを示す。
本明細書の他の箇所で記載されている、十分に検証されたｑＰＣＲ捕捉アッセイを使用して、ライブラリーフリー試料をアッセイして、遺伝子特異的標的が捕捉され、選択的に増幅されるのかどうかを決定した。アッセイ１～１６の標的領域を表４０に示す。
ｑＰＣＲ解析のために、試料Ｆから１０ｎｇ／μｌ（２μｌを８μｌのＰＣＲミックスに添加して、それぞれ、１０μｌおよび２ｎｇ／μｌの最終容量および最終濃度をもたらす）で得られるゲノムＤＮＡを、対照として使用した。Ｆ試料およびＳ試料から精製されたプロセシング材料を、０．０１ｎｇ／μｌ＝１０ｐｇ／μｌに希釈し、２μｌを、８μｌずつのＰＣＲ反応に添加して、２ｐｇ／μｌの最終濃度をもたらした。結果を表４１に示す。
ｑＰＣＲデータにより、ライブラリーフリー技術が、標的化ゲノム領域を回収し、標的外領域を棄却するのに極めて効果的である（例えば、アッセイ６、８）ことが指し示された。＞５００，０００倍であることが多い精製倍数は、本明細書の他の箇所で開示されるライブラリーにより作成された、早期の実験から得られるデータと直接比較可能であった。
ＩＩ部：ＬＯＯ（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ）解析：複合体プロセシングの酵素要件を査定した。実験のデザインを、下記の表４２に示す。
解析のための捕捉複合体を作製するため、１２種の同一な反応物を創出した。１３５ｎｇ／μｌの超音波処理したｇＤＮＡ １０μｌを、上記で記載した通りに、融解させ、タグ付けされた捕捉プローブとアニーリングさせ、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに結合させ、洗浄し、ＴＥｚｅｒｏ中に再懸濁させた。５００μｌのプロセシングマスターミックスを、２７０μｌの水と、５０μｌの１０倍濃度のＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液と、１０ｍＭのＡＴＰ ５０μｌと、５０％のＰＥＧ８０００ ７５μｌと、１０ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌとを組み合わせることにより調製した。この緩衝液を、１０の９０μｌアリコートに分け（２連の試験を実行した）、酵素を、上記で記載した量で添加した（マスターミックス９０μｌ当たり、１μｌのＴ４遺伝子３２タンパク質、０．５μｌのＴ４ポリメラーゼ、５μｌのアダプター、および／または５μｌのＨＣ Ｔ４リガーゼを添加した）。上記で記載したＴ４による埋め込みおよびライゲーションの後、複合体を、プロセシングミックスを含まないＴＥｚｅｒｏ中で洗浄し、２μｌのＴＥｚｅｒｏ中に再懸濁させた。複合体を、最終容量２０μｌずつの、単一プライマーによる増幅ミックス中に再懸濁させ、上記で記載した通りに、２０サイクルにわたり増幅した。次いで、磁石を使用してビーズを引き寄せ、２０μｌの洗浄された増幅物を、１８０μｌの全長Ｆ＋Ｒ（１１８＋１１９）ＰＣＲ増幅ミックスに希釈した。５０μｌをｑＰＣＲ解析のために取り置き、残りの１５０μｌを２つに分割し、従来のＰＣＲにより増幅した。５０μｌのｑＰＣＲ試料を、２．５μｌの色素ブレンドと混合し、１０μｌのアリコートを、蛍光の変化によりモニタリングした。この実験のトレースを、図４１に示す。
２つの従来のＰＣＲのためのアリコートのうちの一方を、１０サイクル目で取り置き、他方をＰＣＲの１６サイクル目で取り置いた。これらの生のＰＣＲ反応物（５μｌずつの反応物）のアリコートを、２％のアガロースゲル上で解析した。結果を、図４２に示す。驚くべき結果は、３種の酵素全てが、増幅用のライブラリー材料の効率的な作製に必要とされることである。より微細な観察は、１０サイクル目における３種全ての酵素による材料のサイズ分布は、１６サイクル目で現れる、Ｐ＋Ｌ単独によるサイズ分布より著明に大きいことである。
初期の探索から得られたｑＰＣＲデータと併せた、これらのデータにより、分子密集剤ＰＥＧ８０００の存在下における、Ｔ４遺伝子３２タンパク質を伴うＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（前者の寄与は査定しなかった）は、捕捉プローブ上で捕捉されたゲノム材料を効率的にコピーすることが可能であるという解釈が実証される。
ＩＩＩ部：ライブラリーフリーシークエンシングライブラリーの作製：上記で記載した方法を使用して、本報告の「材料」節に示される４例のＣｏｒｉｅｌ試料を伴うＤＮＡシークエンシングライブラリーを作製した。４例の試料のうちの各１例を、最終的なＰＣＲステップにおいて、個別のインデックスコードでコード処理した。最終的なライブラリー構成要素（プーリングの前に個別に示される）を、図４３のゲル画像に示す。「通常の」ライブラリースメアは通例、１７５ｂｐから上方に広がる。この図では、最も小さな断片でも、＞３００ｂｐである。同様に、最も大きな断片は、７５０ｂｐ以上であると考えられる。大きな断片は、最適のライブラリーをもたらさない。これらの試料は全て、８０％のビーズ：試料比で２回にわたり精製した。これらの試料を、１６．９ｎｇ／μｌ（推定平均インサートサイズを４００ｂｐとして、約６５ｎＭである）のプールにプールした。試料をシークエンシングした。
ライブラリーフリー法は、ＣＮＶ解析に良好に働いた。Ｘ連鎖遺伝子であるＰＬＰ１に独特のリードカウントを、常染色体の遺伝子座であるＫＲＡＳおよびＭＹＣに照らして標準化したが、これらのデータのプロットを、図４４に示す。データは、ライブラリーフリー手順では、絶対コピー数が失われることを例示する（ＫＲＡＳの、ＭＹＣに照らした「コピー」は、もはや同等ではない）。しかし、相対コピー数（ＰＬＰ１の、常染色体の標準化子と比べた変化）は、頑健に検出される。シークエンシング結果はまた、プローブに照らしたリード開始部位と関連する顕著な特色も示した。図４５は、リードは、プローブから９００ｂｐの距離にある限りにおいて、検出され、座標１１００～１３００の間では、あらゆる単一の開始点が、複数回にわたり使用されることを示す。これらのデータにより、リードは、あらゆる単一の可能な塩基位置において開始され、ライゲーション／プロセシングバイアスは、ほとんど見られないことが指し示された。加えて、プローブから１００ｂｐ以内で開始されるリードが極めて少数であることは、ゲル上で観察される、ライブラリーの極めて大きなサイズ分布と符合する。
（実施例２０）
標的化遺伝子発現解析
総括
本実施例は、標的化遺伝子発現ライブラリーの開発について実証する。投入するのは、ＲＮＡであり、ＤＮＡではなく、したがって、二本鎖ｃＤＮＡ合成ステップが必要とされる。好ましい方法は、ＲＮアーゼＨ－リバーストランスクリプターゼまたはＲＮアーゼＨ－様活性を呈示するキット（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＧｏＳｃｒｉｐｔ）を使用する第１鎖合成およびランダムヘキサマーによるプライミングである。第２鎖合成に好ましい方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素である、ＮＡＤ＋依存性リガーゼおよびＲＮアーゼＨを含むキット（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ第２鎖ｃＤＮＡ合成モジュール）を使用することである。
極めて広範にわたる転写物コピーが存在するため、これに応じて、シアリングされ、末端修復されたｃＤＮＡに対するアダプター上に導入される、広範にわたるランダムタグが存在しなければならない。したがって、ランダム８マー（６５，５３６種の可能な配列）を使用した。アダプターを、ランダム８マー配列に続く１０～１２の固定塩基であって、ライゲーションを容易とする、相補的な１０～１２塩基のためのアニーリング部位として用いられる可能性があり、かつ、マルチプレックス化された試料の場合に試料識別子として使用される固定塩基で操作した。
重複リードと対比した独特のリードの実際の数（言い換えるとリードの統計学的分布）は、発現レベルの決定において１つの重要な因子である。１つの潜在的なエラーの発生源は、捕捉イベントの後において重複するリードである。これらのエラーを同定するため、各捕捉イベントを標識するように、ランダムタグを、捕捉プローブに添加した。
標的化ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの処理およびシークエンシングも、ゲノムライブラリーの処理と同じ手順に従う。
インフォマティクス解析は、捕捉後の重複リードの除去および標的のトランスクリプトームに照らしたアラインメントと共に始まる。次いで、整列しているリードの間の独特のリードカウントを決定する。次いで、データが統計学的分布に適合しうる一方で、生の独特のリードカウントが、実際の発現レベルに対する極めて緊密な近似であることが分かった。
目的
これらの実験の目的は、標的化発現シークエンシングライブラリーを、心臓および肝臓の全ＲＮＡから作製し、全ＲＮＡライブラリーおよび標的化ＲＮＡライブラリーの両方を、直接的な比較がなされうる、同じ出発材料から作製することであった。
概要
全ＲＮＡライブラリーから得られるＲＮＡカウントと、標的化ＲＮＡライブラリーから得られるＲＮＡカウントとは、２つのパラメータに沿って良好な一致を示した。第１に、心臓試料の発現比と、肝臓試料の発現比とは、良好に相関した。第２に、全ＲＮＡカウントを、標的化ＲＮＡカウントと比較したところ、所与の試料中の異なる転写物の絶対存在量の測定は、良好に一致した。これらの初回通過データにより、定量的な標的化核酸法が、ゲノムＤＮＡを越えて、ｃＤＮＡライブラリーについての解析に広がりうることが指し示された。
戦略
ｒＲＮＡを枯渇させた、妥当な全ＲＮＡライブラリーを創出するために、ｄＴプライミングを使用した。標的化ＲＮＡライブラリーを創出するために、全ＲＮＡ試料を、ＩＤＴから供給されているランダムヘキサマーでまずプライミングした。ランダムヘキサマープライミングは、トランスクリプトームの最も包括的なカバレージをもたらす可能性が高い。Ｐ１フローセル配列およびＰ２フローセル配列を導入するＰＣＲプライマーによる増幅の後で、全ＲＮＡライブラリーをシークエンシングした。標的化解析のために、本明細書の他の箇所で想定される、捕捉ステップ、洗浄ステップ、プロセシングステップ、および増幅ステップを実行した。次いで、標的化クローンをシークエンシングした。
方法
オリゴヌクレオチド：全ＲＮＡライブラリーには、ポリｄＴプライマー：ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ（配列番号７２２）を使用した。標的化ＲＮＡ－ｓｅｑには、最初の８塩基がランダムであり、次の１２塩基が「コード」配列として用いられ、したがって、ライゲーション可能な二重鎖を形成しうる１２マーのパートナー鎖オリゴのアンカー配列としても用いられる、アダプターデザインを創出した。
これらのアダプターの配列は、以下の通りであった。
ｃＤＮＡライブラリー構築：以下の方法を使用して、以下の４種のｃＤＮＡライブラリー：（１）心臓の全ＲＮＡ（ｄＴプライミングされた）；（２）心臓の標的化ＲＮＡ（Ｎ６プライミングされた）；（３）肝臓の全ＲＮＡ；および（４）肝臓の標的化ＲＮＡ（Ｎ６プライミングされた）を合成した。１μｇ／μｌの全ＲＮＡを、ＴＥｚ中１００ｎｇ／μｌに１０倍に希釈した。以下の成分：２μｌの希釈された全ＲＮＡ（１００ｎｇ）；２μｌの５ｕＭのポリｄＴＶＮプライマー、または５０ｕＭのＮ６（ＩＤＴ）２μｌ；および６μｌの水を、１０μｌの総容量で組み合わせ、６５℃まで加熱し、氷に移した。
ミックスを、１０μｌの第１鎖カクテル（５倍濃度のＧｏＳｃｒｉｐｔ緩衝液 ４μｌ；２５ｍＭのＭｇ＋＋１．６μｌ（２ｍＭの最終濃度）；１０ｍＭのｄＮＴＰ １．０μｌ（５００ｕＭの最終濃度）；１．０μｌのＧｏＳｃｒｉｐｔ酵素；および２．４μｌの水）と組み合わせ、４２℃で３０分間にわたり、次いで、７０℃で１０分間にわたりインキュベートした。６０マイクロリットルの第２鎖合成試薬（４８μｌの水、ミックス；１０倍濃度の第２鎖合成緩衝液 ８μｌ；４μｌの第２鎖酵素ミックス）を、各反応物に添加し、１６℃で２時間にわたりインキュベートした。
第２鎖を合成した後、５５μｌのＴＥｚを、各反応物に添加し、反応物を、ガラス製のＣｏｖａｒｉｓ超音波処理チューブに移し、約５００ｂｐに超音波処理した。１２５μｌの超音波処理試料を、ＰＣＲストリップチューブに移し、１２５μｌのビーズを添加した。精製の後、試料を、２０μｌの最終容量に再懸濁させた。
本明細書で想定される方法を使用して、１９μｌの反応物について、末端修復を実行した。次いで、末端修復された断片を、２２℃で３０分間にわたり、アダプターにライゲーションし、６５℃で１０分間にわたり熱不活化した。４０μｌの最終容量：２５μｌの修復断片；１０ｕＭのアダプター２μｌ（１０ｕＭのＬ鎖、２０ｕＭのＰ鎖）；１０倍濃度の緩衝液 ４μｌ；５０％のＰＥＧ８０００ ６μｌ；１μｌの水；および２μｌのＨＣＴ４リガーゼ中でライゲーションを実行した。６０μｌのＴＥｚおよび１００μｌのビーズを、各反応物に添加し、試料を、最終容量の２０μｌに精製した。
ｑＰＣＲを使用して、ライブラリーによる増幅をモニタリングし、２０μｌの精製されたライゲーションミックスを、１３０μｌのＰＣＲミックス（７５μｌの２倍濃度のＮＥＢＮｅｘｔマスターミックス、１５μｌのＡＣＡ２－２０、４０μｌの水）と組み合わせることにより、ＰＣＲを介して、各ライブラリーを増幅した。５０μｌを、２．５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ＋ＲＯＸを含有するウェルにアリコート分割し、ｑＰＣＲプレート内で１０μｌにさらにアリコート分割した。残りの１００μｌは、ＰＣＲストリップチューブ内で保存した。７２℃で３０秒間、９８℃で３０秒間にわたり、かつ、９８℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で１０秒間の可変サイクルでＰＣＲ増幅を実行した。
ｄＴライブラリーのために、１００μｌのＰＣＲ反応物を、１２０μｌのビーズで精製した。ＡＣＡ２－２０（２０ヌクレオチドのＰＣＲプライマー）で増幅された材料を２０倍に（５μｌを、５０μｌの２倍濃度のＮＥＢＮｅｘｔマスターミックス、５μｌのＦプライマー、５μｌのＲプライマー、および３５μｌの水を含有する９５μｌのＰＣＲミックスに）希釈した。Ｆプライマーは、ＡＣＡ２＿ＦＬＦＰ ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡ（配列番号６９）である、オリゴ８であり、リバースプライマーは、エキソームＣＡＣ３＿ＦＬＲＰ ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡ（配列番号７４）である、オリゴ６３である。増幅は、８サイクルにわたり実行した。このステップは、短い、２０ｂｐのＡＣＡ２末端配列を、フローセル適合的で、シークエンシング可能な、長いＰ１配列およびＰ２配列に成長させるように組み入れた。２種の異なるプライマーを取る構築物が増幅されるのに対し、１種の配列だけを有する構築物は、抑制されるであろう。１００μｌのビーズを、１００μｌのＰＣＲ反応物に添加し、最終容量の５０μｌ中に再懸濁させることにより、結果として得られるＤＮＡを精製した。
ＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔにより定量化し、ゲル電気泳動により検討した。ＡＣＡ２＿ＦＳＰ ＡＣＡＣＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡ（配列番号６８）であるフォワードプライマーオリゴ７、およびエキソームＣＡＣ３＿ＲＳＰ ＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡ（配列番号７３）であるリバースプライマーオリゴ６２を使用して、ＤＮＡをシークエンシングした。ｄＴプライミングされたＲＮＡを、ラン＿４８および４９においてシークエンシングした。
ＤＮＡゲル試料を、図４６に示す。ｄＴプライミングされた全ＲＮＡライブラリーの大型断片のサイズ分布は、やや驚くべきものであった。
標的化ＲＮＡシークエンシングのために、Ｎ８プライミングしたライブラリーを、４０μｌのＴＥｚ中に再懸濁させた。心臓ライブラリー中および肝臓ライブラリー中の断片含量を定量化した：１５３ｆｇ／μｌの心臓試料ｃＤＮＡおよび７６０ｆｇ／μｌの肝臓試料ｃＤＮＡ。これらのデータに基づき、４０μｌの心臓ライゲーション試料および８μｌの肝臓ライゲーション試料を、後段のＰＣＲ増幅に送り込んだ。
ｑＰＣＲを使用して、ライブラリーによる増幅の進行をモニタリングし、４０μｌの精製されたライゲーションミックス（心臓）または８μｌのライゲーションミックス＋３２μｌのＴＥｚ（肝臓）を、２１０μｌのＰＣＲミックス（１２５μｌの２倍濃度のＮＥＢＮｅｘｔマスターミックス、２５μｌのＡＣＡ２、６０μｌの水）と組み合わせるＰＣＲにより、ライブラリーを増幅した。５０μｌを、２．５μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ＋ＲＯＸを含有するウェルにアリコート分割し、ｑＰＣＲプレート内で１０μｌのアリコートにさらにアリコート分割した。残りの１００μｌを、ＰＣＲストリップチューブに入れた。７２℃で３０秒間、９８℃で３０秒間にわたり、かつ、９８℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で１０秒間の可変サイクルでＰＣＲ増幅を実行した。２００μｌのＰＣＲ産物を、２００μｌのビーズで精製し、最終容量の２５μｌ中に再懸濁させた。ＰＣＲ産物の濃度は、心臓ライブラリーが４１ｎｇ／μｌであり、肝臓ライブラリーが４２ｎｇ／μｌであった。
捕捉のために、心臓試料と肝臓試料とを組み合わせ、タグ付けされたＲＮＡ－ｓｅｑ特異的プローブ（配列については、以下の付録を参照されたい）を伴う、２種の「２重」捕捉反応を実行し、洗浄し、プロセシングし（Ｃ＋Ｐ）（最終的な収率＝４０μｌの２３ｎｇ／μｌ）、２４０～６００ｂｐの断片を、Ｐｉｐｐｉｎ自動式ＤＮＡサイズセレクター上でサイズ選択した。５．４ｎｇ／μｌの断片を、Ｐｉｐｐｉｎ＝２０．８ｎＭから回収した。フローセルに、断片をロードし、５１ヌクレオチドの第１のリードおよび２４ヌクレオチドの第２のリードを回収した。
結果および考察
有用なＲＮＡ－ｓｅｑデータを決定するため、肝臓試料と対比した心臓試料を、比較のために選択した。一方の組織内または他方の組織内のそれらの絶対存在量（心臓または肝臓におけるＲＰＫＭ値を約１００、１０、１などとする）、およびそれらの組織間の比（ここでもまた、肝臓と対比した心臓の比を、約１００、１０、１、０．１、０．０１とする）に基づき、ＲＮＡ－ｓｅｑアトラス（medicalgenomics.org/rna_seq_atlas）において報告された転写物のうちの２１種の転写物を解析した。候補転写物のリスト、およびそれらの報告されたＲＰＫＭ値を、表４３に示す。
標的化ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、同じ全ＲＮＡ試料から作製された、標的化されていない全ＲＮＡライブラリーと比較した。ポリｄＴプライミングを使用して、全ＲＮＡ、主に、ｒＲＮＡを、非ｒＲＮＡ転写物ライブラリーに転換した。標的化ＲＮＡ－ｓｅｑには、ランダムヘキサマーを使用した。ｄＴプライミング全ＲＮＡライブラリーでは、リードを、それらの一部は極めて長い、転写物の全長に沿って導出することができる。例として述べると、心臓内のＭＹＨ７に沿ったリードの分布を検討し、この長い転写物の５’端の近傍から得られるリードを見い出した。１つの（長い）転写物を、別の（短い）転写物と比較するために、カウントを、転写物の長さで標準化（ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｂ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ法またはＲＰＫＭ法と称することが多い）した。この第１度の標準化の後、カウントを、全試料と標的化試料との間でもまた標準化した。最終的なリードカウントデータセットを、表４４に示す。
目視により、３種のデータ全て（アトラスデータ、全試料データ、および標的化試料データ）の間の良好な相関が明らかとなった。いずれのデータセットも、同じ全ＲＮＡ試料から導出されたため、１つの重要な比較は、本明細書で調製される全ＲＮＡ－ｓｅｑ試料と、本明細書で調製される標的化ＲＮＡ－ｓｅｑ試料との比較であった。比較の２つの重要点は、（１）心臓における実際の発現比と、肝臓における実際の発現比との相関；および（２）特異的試料内の転写物の絶対存在量の、全試料カウントと標的化試料カウントとの間の相関を含む。
第１の点では、発現プロファイルの保存に取り組むが、比較されるカウントの実際の大きさは無視する。心臓における発現比を、肝臓における発現比と対比した比較プロットを、標的化試料における発現比と対比した、全試料における発現比について、図４７に示す。このプロットは、２つの方法により作成された「発現プロファイル」の間の例外的な相関（ｒ２＝０．９５）を示す。
第２の点は、２つの方法の間の絶対比較について問うため、より厳密でありうる。全ＲＮＡ－ｓｅｑまたは標的化ＲＮＡ－ｓｅｑにおいて測定される絶対発現レベルの比較を、図４８に示すが、ここで、ｌｏｇ１０（カウント）値は、互いに対してプロットされる。この比較は、標的化に対して高感度であるだけでなく、また、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを根本的に異なる方法（全ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーには、ｄＴプライミングであり、標的化ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーには、ランダムヘキサマープライミングであった）で調製したという事実に対しても高感度であった。異なる調製法にもかかわらず、２つの方法の間には、優れた相関が認められた。
本研究は、配列特異的捕捉と組み合わされたランダムタグで標識づけするコア法により、絶対発現存在量を保存し、転写物特異的配列情報を明らかにし、トランスクリプトームデータの複雑性を劇的に軽減する、標的特異的ＲＮＡ転写物データを作成しうることを実証した。
以下の特許請求の範囲では一般に、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲で開示される特殊な実施形態に限定するものとみなされるべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲に沿って、全ての可能な実施形態を含むものとみなされるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (46)

  1. タグ付けされたＤＮＡ断片を作製する方法であって、
    （ａ）断片化されたゲノムＤＮＡを末端修復酵素で処理して、末端修復されたゲノムＤＮＡ断片を作製するステップと；
    （ｂ）末端修復されたゲノムＤＮＡ断片の各末端に多機能性アダプターモジュールをライゲーションして、タグ付けされたＤＮＡ断片を作製するステップであって、前記多機能性アダプターモジュールがランダム核酸タグ配列とユニバーサル増幅配列とを含み、前記ユニバーサル増幅配列が、各々の末端修復されたゲノムＤＮＡ断片の両方の末端で同一である、ステップと
    を含む、方法。
  2. タグ付けされたゲノムライブラリーを作製する方法であって、
    （ａ）断片化されたゲノムＤＮＡを末端修復酵素で処理して、末端修復されたゲノムＤＮＡ断片を作製するステップと；
    （ｂ）末端修復されたゲノムＤＮＡ断片の各末端に多機能性アダプターモジュールをライゲーションするステップであって、前記多機能性アダプターモジュールがランダム核酸タグ配列とユニバーサル増幅配列とを含み、前記ユニバーサル増幅配列が、各々の末端修復されたゲノムＤＮＡ断片の両方の末端で同一である、ステップと；
    （ｃ）前記多機能性アダプターモジュールがライゲーションされたＤＮＡ断片に対してＰＣＲ増幅を実行して、前記タグ付けされたゲノムライブラリーを作製するステップと
    を含む、方法。
  3. 前記末端修復されたゲノムＤＮＡ断片が平滑末端を含有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記平滑末端が、単一塩基対オーバーハングを含有するようさらに修飾される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記単一塩基対オーバーハングがアデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）を含有する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記末端修復されたゲノムＤＮＡ断片が５’－オーバーハングまたは３’－オーバーハングを含有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記末端修復されたゲノムＤＮＡ断片が、鋳型によらない３’－オーバーハングを含有する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記末端修復されたゲノムＤＮＡ断片が、平滑末端またはオーバーハングを含有するようにプロセシングされる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記末端修復されたゲノムＤＮＡ断片が、３’－オーバーハングを含有するようにターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によりプロセシングされる、請求項８に記載の方法。
  10. 前記末端修復されたゲノムＤＮＡ断片が、制限酵素によりプロセシングされる、請求項８に記載の方法。
  11. 前記ゲノムＤＮＡが、血液、皮膚、毛、毛包、唾液、口腔粘膜、膣粘膜、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精子液、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー氏腺液）、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液および組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料に由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記断片化されたゲノムＤＮＡが、機械的手段、酵素的手段、または化学的手段により作製される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記多機能性アダプターモジュールが試料コード配列を含み、前記試料コード配列は、前記タグ付けされたＤＮＡライブラリーの作製の由来となったＤＮＡ試料を同定することができる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記試料コード配列が２～６ヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ランダム核酸タグ配列が２～６ヌクレオチドである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ランダムヌクレオチド配列の数が、これと結合した核酸配列のコピー数を示す、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ランダム核酸タグ配列が、既知の核酸タグ配列のプールから選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ユニバーサル増幅配列が２０～３０ヌクレオチドである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記多機能性アダプターモジュールが、ライゲーション鎖と相補鎖を含み、前記相補鎖が、前記ライゲーション鎖の３’末端にハイブリダイズされ、これと部分的な二重鎖を形成する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記多機能性アダプターモジュールの前記二重鎖領域が、平滑末端化される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記多機能性アダプターモジュールの前記二重鎖領域が、前記ライゲーション鎖の３’末端にオーバーハングを含み、前記オーバーハングが、これにライゲーションされるＤＮＡ断片の３’－オーバーハングと相補的である、請求項１９に記載の方法。
  22. ステップ（ｂ）が、末端修復されたゲノムＤＮＡ断片に前記ライゲーション鎖をライゲーションすることを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記相補鎖が、前記末端修復されたゲノムＤＮＡ断片にライゲーションされず、前記部分的な二重鎖から分離する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記タグ付けされたゲノムライブラリーのタグ付けされたＤＮＡ断片を多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズさせて、タグ付けされたＤＮＡ断片－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を形成することを含み、前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記タグ付けされたゲノムライブラリー内で特定の標的領域と選択的にハイブリダイズする、請求項２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記多機能性捕捉プローブモジュールが、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる領域、ゲノム標的領域とハイブリダイズすることができる領域、および、テイル配列を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる領域が、前記テイル配列を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記多機能性捕捉プローブモジュールが、パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第１の領域、ゲノム標的領域とハイブリダイズすることができる第２の領域、および、テイル配列を含む第３の領域を含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記テイル配列が１０～５０ヌクレオチドの長さである、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記テイル配列が、ＰＣＲプライマー結合性部位を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記テイル配列が、シークエンシングプライマー結合性部位を含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記タグ付けされたＤＮＡ断片－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の単離および／または精製を容易にするように構成された結合対の特異的メンバーを含み、結合対の前記特異的メンバーは、ビオチンまたはハプテンである、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記パートナーオリゴヌクレオチドが、前記タグ付けされたＤＮＡ断片－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の単離および／または精製を容易にするように構成された結合対の特異的メンバーを含み、結合対の前記特異的メンバーは、ビオチンまたはハプテンである、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 結合対の前記特異的メンバーがハプテンである、請求項３１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ハプテンは、ジニトロフェノール分子またはジゴキシゲニン分子である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記多機能性捕捉プローブモジュールが、前記タグ付けされたＤＮＡ断片－多機能性捕捉プローブモジュール複合体の形成前に、前記パートナーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記タグ付けされたＤＮＡ断片－多機能性捕捉プローブモジュール複合体を単離して、単離された複合体を形成することを含む、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、前記単離された複合体に対して３’－５’エキソヌクレアーゼ酵素プロセシングを実行し、一本鎖の３’末端を除去して、酵素によりプロセシングされた複合体を作製することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記単離された複合体の協奏的酵素プロセシングを実行して、酵素プロセシングされた複合体を作製することを含み、前記協奏的酵素プロセシングが、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性、５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖を含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記酵素プロセシングされた複合体に対してＰＣＲを実行することを含み、前記テイル配列が、ハイブリッド核酸分子を作製するためにコピーされ、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールとハイブリダイズすることができる前記ゲノム標的領域と、前記テイル配列の相補体とを含む、請求項３７～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記単離された複合体に対して、前記多機能性捕捉プローブの５’から３’へのＤＮＡポリメラーゼ伸長を実行し、ハイブリッド核酸分子を作製するために前記多機能性捕捉プローブの３’である前記ゲノム標的領域の領域を複製することを含み、前記ハイブリッド核酸分子が、前記多機能性捕捉プローブモジュールと、前記多機能性捕捉プローブモジュールが前記ゲノム標的領域とハイブリダイズする位置から３’方向に位置する前記ゲノム標的領域の領域の相補体とを含む、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記ハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実行して、増幅されたハイブリッド核酸分子を作製することを含む、請求項３９～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記増幅されたハイブリッド核酸分子に対して次世代配列解析を実行することを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ハイブリッド核酸分子に対して標的化遺伝学的解析を実行することを含む、請求項３９～４０のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ハイブリッド核酸分子または増幅されたハイブリッド核酸分子に対して配列アラインメントを実行することを含む、請求項４２～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 少なくとも２種の異なる多機能性捕捉プローブモジュールが前記タグ付けされたゲノムライブラリーにハイブリダイズされる、請求項２５～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが前記ゲノム標的領域の下流にハイブリダイズし、少なくとも１種の多機能性捕捉プローブモジュールが前記ゲノム標的領域の上流にハイブリダイズする、請求項４５に記載の方法。
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