CN110938623A - 一种从少量样品中同时提取rna和dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，利用pH为8.1的平衡酚在少量样本中同时提取RNA和DNA，所需时间较短，操作步骤简单；而且所提取的RNA和DNA纯度较高、完整，能够用于反转录成cDNA等分子生物学操作。

Description

一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法。
背景技术
分子生物学广泛应用于医学、农业、药学、法医学等各个方面，有着重要的发展意义。从样品中分离出高纯度高质量的核酸是下游实验顺利进行的最基本前提。
DNA和RNA纯化技术主要包括酚氯仿抽提法，离子交换法，盐析法等，但是这些方法往往只能提取出其中一种核酸而浪费另一种核酸。当样品比较有限时，常常需要将同一种样品中的DNA和RNA提取出来；但是提取纯度比较低，难溶解，DNA片段断裂比较严重，只有10Kb左右，很难满足下游的实验要求。且现有同时提取RNA和DNA的方法，需准备试剂种类多，操作步骤多，耗时长，不同批次RNA提取的质量或浓度相差过大，也不能满足下游实验需求。因此，提供一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，所需时间较短，操作简单，且核酸纯度较高，能够满足下游实验需求。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，具体步骤如下：
(1)取样品粉末，加入80℃预热的pH为8.1的平衡酚、抽提缓冲液和β-巯基乙醇，涡旋混匀；每100mg样品粉末加入250μl平衡酚、250μl抽提缓冲液和4％β-巯基乙醇；
(2)向步骤(1)涡旋混匀的溶液中加入蛋白酶K至终浓度为2.0mg/mL，混匀，80℃水浴加热5min；
(3)向步骤(2)加热后的溶液中加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000×g离心15min；
(4)转移上清液，加入等体积的异丙醇，混匀，在-20℃放置30min；
(5)在4℃条件下12000×g离心10min，弃上清，留沉淀；
(6)将沉淀先用70％-75％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤，室温下放置3min；
(7)加入20-40μl DEPC水溶解，置于-20℃冰箱备用。
进一步，所述抽提缓冲液包括0.1M LiCl，0.1M Tris-HCl，0.01M EDTA，1％SDS。
进一步，步骤(3)所述氯仿、异戊醇的体积比为24:1。
进一步，步骤(6)所述70％-75％乙醇用DEPC水稀释。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，利用pH为8.1的平衡酚在少量样本中同时提取RNA和DNA，所需时间较短，操作步骤简单；而且所提取的RNA和DNA纯度较高、完整，能够用于反转录成cDNA等分子生物学操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明从棘孢曲霉中提取的RNA和DNA在琼脂糖凝胶上的电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)植酸酶诱导培养基的制备：100g麸皮加入到1000mL蒸馏水中，121℃灭菌1h，用8层纱布过滤，所得滤液用蒸馏水定容到1000mL；然后加入：(NH4)2SO40.04％；MgSO4·7H2O0.02％；KH2PO40.05％；K2HPO40.04％；pH为7.2。然后将1000mL滤液分装在250mL的三角烧瓶中，每瓶100mL，121℃灭菌30min。
2)菌丝粉的制备：将棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)ATCC16872菌株进行活化，接种到100mL植酸酶诱导培养基中(采用250mL三角瓶装)，30℃，160r/min振荡培养3d。抽滤并用无菌水将菌丝体中的培养基洗净，在研钵中加入液氮研磨成粉，获得菌丝粉，备用。
3)RNA和DNA提取方法：
将100mg菌丝粉转移到1.5mL Eppendorf管中，加入250μl 80℃预热的pH为8.1的平衡酚、250μl抽提缓冲液和4％β-巯基乙醇，涡旋混匀；再加入蛋白酶K至终浓度为2.0mg/mL，混匀，80℃水浴加热5min；加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，4℃，12000×g离心15min；小心地把上清液转移到一个新的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min，在4℃条件下12000×g离心10min；先用75％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤，室温下放置3min；加入30μl DEPC水溶解，置于-20℃冰箱备用。
根据核酸测定仪分析本发明提取的菌体总RNA和DNA，提取液的A260/A280为1.80～2.21，A260/A230为1.97～2.31，RNA浓度为380.52～786.43ng/μl；DNA浓度为562.87～856.43ng/μl。
对获得的提取液进行ITS序列扩增和反转录：
(1)ITS序列扩增:
采用真菌鉴定通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；SEQ ID NO.1)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；SEQ ID NO.2)对提取的样品进行PCR扩增，引物由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。
扩增程序：94℃变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，纯化后送上海Invitrogen生物技术有限公司完成序列测定。
通过PCR技术从棘孢曲霉的DNA中扩增出了ITS1+5.8S+ITS2序列，测序结果显示整个ITS区共计594bp(GenBankNo.HM140184)。
(2)使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，最后将产物放于-20℃冰箱保存。通过引物(PhyFor：5’-GGGGGTATCAATGCTTC-3’，SEQ IDNO.3；PhyRev：5’-CCAGATCTG GCAAAGCTC-3’，SEQ ID NO.4)进行植酸酶基因特异性片段扩增，结果显示获得的片段是棘孢曲霉植酸酶基因的一部分。根据测定的片段序列设计特异引物，利用SMART RACE法进行5’-RACE和3’-RACE扩增，测序后进行片段拼接获得棘孢曲霉植酸酶cDNA全序列1570bp(GenBank:GU120223)。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 安徽科技学院
<120> 一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gggggtatca atgcttc 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccagatctgg caaagctc 18

Claims (4)

1.一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)取样品粉末，加入80℃预热的pH为8.1的平衡酚、抽提缓冲液和β-巯基乙醇，涡旋混匀；每100mg样品粉末加入250μl平衡酚、250μl抽提缓冲液和4％β-巯基乙醇；
(2)向步骤(1)涡旋混匀的溶液中加入蛋白酶K至终浓度为2.0mg/mL，混匀，80℃水浴加热5min；
(3)向步骤(2)加热后的溶液中加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4℃，12000×g离心15min；
(4)转移上清液，加入等体积的异丙醇，混匀，在-20℃放置30min；
(5)在4℃条件下12000×g离心10min，弃上清，留沉淀；
(6)将沉淀先用70％-75％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤，室温下放置3min；
(7)加入20-40μl DEPC水溶解，置于-20℃冰箱备用。
2.根据权利要求1所述的一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，其特征在于，所述抽提缓冲液包括0.1M LiCl，0.1M Tris-HCl，0.01M EDTA，1％SDS。
3.根据权利要求1所述的一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，其特征在于，步骤(3)所述氯仿、异戊醇的体积比为24:1。
4.根据权利要求1所述的一种从少量样品中同时提取RNA和DNA的方法，其特征在于，步骤(6)所述70％-75％乙醇用DEPC水稀释。
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