CN109207559B - 一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，属于分子生物学领域。本发明通过设计多条重叠引物，经过PCR扩增合成一段完整的DNA片段，后者体外转录成sgRNA，与Cas9酶结合使其发挥核酸切割功能。本发明首次使用多条重叠引物一步合成sgRNA的DNA模板，并且通过实验证明其具有高的剪切效率。本发明建立的这种方法在快速合成sgRNA，减少实验耗损方面具有价值。

Description

一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法。
技术背景
CRISPR是指成簇的规律的短回文重复序列(Clustered Regularly InterspersedShort Palindromic Repeats)，CRISPR/Cas9系统主要由三部分构成：crRNA(CRISPR-derived RNA)，tracrRNA(trans-activating RNA)和Cas9，crRNA通过碱基配对和tracrRNA结合形成向导RNA(Single guide RNA，sgRNA)，后者招募Cas9蛋白，而Cas9是CRISPR附近的相关基因，其编码的蛋白具有核酸酶功能，可以切割特定的DNA序列，产生双链断裂(DSB，DNA double-strand break)，之后通过两种修复机制(同源重组修复，非同源重组修复)形成突变，导致基因敲除。
利用CRSPR体系改造的基因编辑功能，在生物医学和工农业多方面具有广泛应用。其中一个关键点是sgRNA的制备。sgRNA既可以化学合成，也可以通过分子生物学的方法如PCR技术而得到。PCR是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，其应用非常广泛。常规PCR技术灵敏度高，特异性好，操作简便，不但用于基因序列分析、鉴定等基础方面的研究，还用于多种疾病的基因诊断。常见的PCR衍生技术有反转录PCR，实时荧光定量PCR，原位PCR，重叠延伸PCR，免疫PCR等。重叠延伸PCR是通过设计具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而连接不同的DNA片段，该技术主要应用于长片段的合成，基因的定点修饰，如替换，插入或删除。
发明内容
本发明旨在提供一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，包括如下步骤：
(1)基因靶位点的设计：三个基因的靶位点分别是EGFR-Exon19sgRNA：5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGA-3'，pu57-1sgRNA：5'-TAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGG-3'，pu57-2sgRNA：5'-CCACTGGTAACAGGATTAGCAG-3'；
(2)多条重叠引物的设计：AF1；AF2：5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC-3'；AF3：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT-3'；Tracr-R：AAAA5'-AAGCACCGACTCGGTGCCAC-3'；
AF1可以选自EGFR-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；pu57-1-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；或者pu57-2-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTGCTAATCCTGTTACCAGGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；优选地，AF1为EGFR-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；
(3)获得sgRNA的DNA模板：将步骤2)中的多条重叠引物进行PCR扩增，通过引物之间的重叠部分合成一段完整的DNA序列，然后将PCR扩增产物纯化；
(4)获得sgRNA mRNA：将纯化后的步骤3)中的sgRNA的DNA模板经过体外转录成sgRNA mRNA，纯化后分装保存；
(5)获得Cas9/sgRNA识别的目的DNA片段：在pUC57载体的两端设计两条引物PU57-F：5'-CGAATGCATCTAGATATCGG-3'和PU57-R：5'-TTACGCCAAGCTTGCATGCA-3'，扩增包含EGFR-Exon19在内的664bp大小的DNA片段作为切割靶序列，PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行纯化；
(6)检测sgRNA的活性和特异：将步骤4)获得的sgRNA mRNA与Cas9蛋白以及步骤(5)获得的目的DNA片段和Cas9缓冲液混合，通过琼脂糖凝胶电泳分析切割的片段。
其中，上述利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，步骤(2)中设计了4条引物的方案，分别是AF1、AF2、AF3、Tracr-R，引物之间具有重叠的碱基序列，它们之间的作用方式如图1：首先是AF3和tracr-R通过重叠序列延伸一段DNA片段，然后该DNA片段再与AF2以相同的方式延伸，依次反应，直至形成DNA片段与AF1重叠互补配对，合成一条完整的DNA片段。在后续的反应中，再以完整的DNA片段为模板，通过AF1和tracr-R引物扩增使产物倍增从而获得可用于转录的模板。引物的碱基数目不尽相同，并且引物延伸的顺序不同，因此本发明对引物浓度进行了一系列的摸索，所述AF1、AF2、AF3、tracr-R的初始浓度分别为8～12μM、8～12μM、0.8～1.2μM、8～12μΜ；优选为10μM、10μM、1.0μM、10μΜ；
所述AF1、AF2、AF3、tracr-R的最终浓度分别为1～1.5μM、0.2～0.3μM、0.02～0.07μM、1～1.5μM；优选为1.25μM、0.25μM、0.05μM、1.25μΜ。
其中，上述利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，步骤(3)中所述PCR扩增的反应程序为：93～97℃，0.8～1.5min；55～57℃，0.8～1.5min；70～75℃，0.8～1.5min；70～75℃，1～3min；循环数为28～40次。优选地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；72℃，2min；循环数为30次。
其中，上述利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，步骤(3)中所述PCR扩增的体系包括：聚合酶2×预混液(即2×Q5mix，NEB公司提供)、AF1、AF2、AF3、Tracr-R和无核糖核酸酶水。
其中，上述利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，步骤(4)中所述体外转录体系包括：缓冲液、ATP、GTP、CTP、UTP、DNA。
其中，上述利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，步骤(5)中所述PCR扩增体系包括：聚合酶2×预混液(即2×Q5mix，NEB公司提供)、PU57-F、PU57-R、质粒DNA和无核糖核酸酶水。其中，所述PU57-F和PU57-R的初始浓度均为18～22μM，优选20μM。其中，所述质粒DNA的浓度为1～2ng/μl。
其中，上述利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，步骤(5)中所述PCR扩增的反应程序为：95～100℃，1～3min；95～100℃，8～12s；53～56℃，12～16s；70～75℃，25～33s；70～75℃，1～3min；循环数为30～40次。优选地，所述PCR扩增的反应程序为：98℃，2min；98℃，10s，55℃，15s，72℃，30s；72℃，2min；循环数为35次。
其中，上述利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，步骤(6)中的反应体系包括：缓冲液、步骤(4)所述sgRNA mRNA、步骤(5)所述目的DNA片段、Cas9酶和无核糖核酸酶水。优选地，所述sgRNA mRNA的浓度为480～520ng/μl(例如500ng/μl)，Cas9酶的浓度为90～120ng/μl(例如100ng/μl)，目的DNA片段的浓度为50～70ng/μl(例如60ng/μl)。
本发明的技术核心是设计具有重叠序列的引物，引物之间通过重叠部分延伸而合成一段完整的DNA片段，从而体外转录成sgRNA mRNA。
本发明的关键之处在于重叠引物的设计以及合适的引物的浓度，重叠序列的碱基在15-20为宜。通过改变不同引物之间的浓度，经过PCR扩增后能够合成片段大小相符，条带均一的完整DNA片段，从而为体外转录提供高质量的模板，这一目的通过改变引物的浓度已经得到了实现。多条重叠引物PCR法是在重叠延伸PCR的基础上设计多条重叠引物，彼此之间通过重叠的序列依次延伸，直至合成一段完整的DNA片段，它作为sgRNA的DNA模板，不需要从质粒上扩增目的基因，一步即可获得。
本发明的有益效果：
本发明中首次利用多条引物重叠法直接合成sgRNA的DNA模板，提供了一种制备sgRNA的新方法。本发明的有益效果如下：在获取sgRNA的DNA模板片段的过程中，该方法不需要从质粒上扩增目的片段，直接将多条引物混匀后经PCR扩增，一步即可获得，省去了繁琐的步骤，简单快捷，节约时间。2.本发明所设计的4条重叠引物片段不超过60bp，并且后两条引物是通用序列，经济，节省费用。同时化学合成短引物比合成长引物发生序列错误的机会要小许多。3.通过步骤6)检测sgRNA的活性和特异，切割靶基因后形成的DNA片段与理论片段的大小一致，特异性强，并且效率高，为后续的实验奠定了基础。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的描述：
图1为重叠引物扩增示意图，AF1、AF2、AF3是所设计的上游重叠引物，Tracr-R是与AF3具有互补序列的下游引物。sgRNA转录模板是由T7启动子序列，sgRNA特异识别序列，sgRNA保守序列(其余部分序列)三部分组成。
图2为四条重叠引物进行PCR扩增反应后产物电泳图，从左到右，第一泳道为50bpDNA marker，第二泳道为阴性对照，是由AF2、AF3和Tracr-R三条重叠引物合成的，AF1未参与合成，第三、四、五泳道分别为EGFR-Exon-19，pu57-1和pu57-2的sgRNA转录模板，均由四条重叠引物合成的。
图3为sgRNA转录产物的电泳图，从左到右，第一泳道为100bp DNA marker，第二、三、四泳道分别为EGFR-Exon-19，pu57-1和pu57-2的sgRNA mRNA。
图4为EGFR-Exon-19扩增产物电泳图，从左到右，第一泳道为100bp DNA marker，第二泳道为EGFR-Exon-19基因片段。
图5为sgRNA/Cas9体外切割DNA目的片段电泳图，从左到右，第一泳道为100bp DNAmarker，第二、四、六泳道分别为EGFR-Exon-19，pu57-1和pu57-2的目的片段，作为阴性对照，它表示酶切前DNA片段的大小，DNA上样量为60ng。第三、五、七泳道分别是EGFR-Exon-19，pu57-1和pu57-2目的片段酶切后大小。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
1、根据CRISPR/Cas9系统原理，选择合适的靶位点，我们以EGFR-Exon19靶基因为例，使用CRISPOR在线设计软件(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，挑选一个特异性位点作为sgRNA的靶序列，EGFR-Exon19sgRNA：5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGA-3'。
2、在南京金斯瑞生物科技有限公司订购了4条引物：EGFR-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；AF2：5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC-3'；AF3：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT-3'；Tracr-R：5'-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3'。
3、PCR扩增：将4条重叠引物进行PCR扩增，合成一段完整的DNA片段，作为EGFR-Exon19sgRNA的DNA模板。EGFR-AF1、AF2、AF3、tracr-R的初始浓度分别是10μM、10μM、1.0μM、10μΜ。
Figure BDA0001870710330000051
热启动超保真聚合酶2×预混液(NEB公司，#M0494S)。
PCR扩增体系如下：
Figure BDA0001870710330000061
将以上试剂充分混匀，放置PCR仪中。PCR反应程序为：95℃1min，56℃1min，72℃1min；72℃2min；循环数为30次。将全部的PCR产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳，得到图2，从电泳图中可以清楚的观察到DNA片段的大小大约为120bp，这与理论的片段大小一致。使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，28704)切胶回收PCR产物，具体操作参照说明书。
4、体外转录获得sgRNA mRNA：将以上获得的DNA模板进行体外转录，体外转录试剂盒使用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo ScientificTM，K0441)。
体外转录体系如下：
Figure BDA0001870710330000062
将以上试剂充分混匀，37℃，过夜。使用RNA纯化试剂盒(miRNeasy Micro Kit，Qiagen，217084)将转录产物进行纯化，具体操作参照说明书。获取的sgRNA在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳，得到图3，将mRNA通过Nanodrop2000超微量分光光度计测定浓度以及纯度，分装保存，每管浓度500ng/μl。
5、Cas9/sgRNA识别的目的DNA片段的扩增和纯化：设计的两条引物PU57-F：5'-CGAATGCATCTAGATATCGG-3'和PU57-R：5'-TTACGCCAAGCTTGCATGCA-3'扩增包含EGFR-Exon19在内的664bp大小的DNA片段作为切割靶序列。
PCR扩增体系如下：
Figure BDA0001870710330000071
引物最初浓度为20μM，质粒DNA的浓度稀释为1ng/μl，PCR反应程序为：98℃，2min；98℃，10s，55℃，15s，72℃，30s；72℃，2min；循环数为35次。将全部的PCR产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，得到图4，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化回收的产物即为切割靶序列片段。
6、sgRNA活性及特异性的检测：将识别EGFR-Exon19位点的sgRNA和Cas9酶及相应的目的DNA片段混合。
反应体系如下：
Figure BDA0001870710330000072
将以上的试剂(不包括DNA)充分混匀，37度，孵育15min，使sgRNA和Cas9酶充分结合，然后再加入60ng目的DNA，混匀，37度3h。将充分反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，未加入sgRNA和Cas9酶的DNA片段作为对照，如图5，可以清晰地观察到切割后条带的大小，与理论的片段大小一致。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）基因靶位点的设计：三个基因的靶位点分别是EGFR-Exon19 sgRNA：5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGA-3'，pu57-1 sgRNA：5'-TAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGG-3'，pu57-2sgRNA：5'-CCACTGGTAACAGGATTAGCAG-3'；
（2）多条重叠引物的设计：AF1；AF2：5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC-3'；AF3：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT-3'；Tracr-R：AAAA5'-AAGCACCGACTCGGTGCCAC-3' ；
AF1选自EGFR-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；或者pu57-1-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；或者pu57-2-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTGCTAATCCTGTTACCAGGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；
（3）获得sgRNA的DNA模板：将步骤2）中的多条重叠引物进行PCR扩增，通过引物之间的重叠部分合成一段完整的DNA序列，然后将PCR扩增产物纯化；
（4）获得sgRNA mRNA：将纯化后的步骤3）中的sgRNA的DNA模板经过体外转录成sgRNAmRNA，纯化后分装保存；
（5）获得Cas9/sgRNA识别的目的DNA片段：在pUC57载体的两端设计两条引物PU57-F：5'-CGAATGCATCTAGATATCGG-3'和PU57-R：5'-TTACGCCAAGCTTGCATGCA-3'，扩增包含EGFR-Exon19在内的664bp大小的DNA片段作为切割靶序列，PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行纯化；
（6）检测sgRNA的活性和特异：将步骤4）获得的sgRNA mRNA与Cas9蛋白以及步骤（5）获得的目的DNA片段和Cas9 缓冲液混合，通过琼脂糖凝胶电泳分析切割的片段；
步骤（2）中所述AF1、AF2、AF3、Tracr-R四条引物之间具有重叠的碱基序列，它们之间的作用方式如下：首先是AF3和tracr-R通过重叠序列延伸一段DNA片段，然后该DNA片段再与AF2以相同的方式延伸，依次反应，直至形成DNA片段与AF1重叠互补配对，合成一条完整的DNA片段，在后续的反应中，再以完整的DNA片段为模板，通过AF1和tracr-R引物扩增使产物倍增从而获得用可用于转录的模板；
步骤（2）中所述AF1、AF2、AF3、tracr-R的初始浓度分别为10μM、10μM、1.0μM、10μΜ；
所述AF1、AF2、AF3、tracr-R的最终浓度分别为1.25μM、0.25μM、0.05μM、1.25μM；
步骤（3）中所述PCR扩增的反应程序为：93~97℃，0.8~1.5min；55~57℃，0.8~1.5min；70~75℃，0.8~1.5min；70~75℃，1~3min；循环数为28~40次；
步骤（3）中所述PCR扩增的体系包括：聚合酶2×预混液、AF1、AF2、AF3、Tracr-R和无核糖核酸酶水；
步骤（4）中所述体外转录体系包括：缓冲液、ATP、GTP、CTP、UTP、DNA；
步骤（5）中所述PCR扩增体系包括：聚合酶2×预混液、PU57-F、PU57-R、质粒DNA和无核糖核酸酶水；
其中，所述PU57-F和PU57-R的初始浓度均为18~22μM，所述质粒DNA的浓度为1~2ng/μl；
步骤（5）中所述PCR扩增的反应程序为：95~100℃，1~3min；95~100℃，8~12s；53~56℃，12~16s；70~75℃，25~33s；70~75℃，1~3min；循环数为30~40次；
步骤（6）中的反应体系包括：缓冲液、步骤（4）所述sgRNA mRNA、步骤（5）所述目的DNA片段、Cas9酶和无核糖核酸酶水；
所述sgRNA mRNA的浓度为480~520 ng/μl，Cas9酶的浓度为90~120 ng/μl，目的DNA片段的浓度为50~70ng/μl。
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