CN105861552B - 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法 - Google Patents

一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105861552B
CN105861552B CN201610261461.3A CN201610261461A CN105861552B CN 105861552 B CN105861552 B CN 105861552B CN 201610261461 A CN201610261461 A CN 201610261461A CN 105861552 B CN105861552 B CN 105861552B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sgrna
promoter
rna polymerase
cas9
gene editing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610261461.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105861552A (zh
Inventor
张智英
邢佳妮
闫强
徐坤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN201610261461.3A priority Critical patent/CN105861552B/zh
Publication of CN105861552A publication Critical patent/CN105861552A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105861552B publication Critical patent/CN105861552B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

本发明主要属于高等生物体基因组编辑技术领域，具体涉及一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法。所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子‑sgRNA，将T7启动子‑sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处，进行切割，完成基因编辑过程。本发明所述方法利用T7启动子表达sgRNA，简化了CRISPR/Cas9系统的设计步骤，使得更多的人能够快速简便使用CRISPR/Cas9这一基因编辑工具研究感兴趣的基因位点。

Description

一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建 方法
技术领域
本发明主要属于高等生物体基因组编辑技术领域，具体涉及一种T7RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法。
背景技术
打靶高等动物基因组位点的基因编辑工具的发现和改造对于基因工程和遗传工程的研究应用都有很大意义。高等生物体的基因网络错综复杂，能改造出一个简便且高效的可适用于高等生物体基因组编辑的工具可以为高等生物遗传研究提供很大的帮助。近年来，细菌中发现的II型CRISPR/Cas9系统正被广泛研究以及应用。
CRISPR/Cas9系统是由Cas9核酸内切酶和单导向RNA(single guide RNA,sgRNA)组成的，sgRNA上有20bp的引导序列，是与基因组靶序列匹配的。
细菌的II型CRISPR/Cas系统被广泛应用于基因组编辑中，从酿脓链球菌中分离得到的SpCas9核酸内切酶通过人工修饰的单个引导RNA(single-guide RNA，sgRNA)的导向作用可以打靶DNA序列的5’-N20-NGG-3’(N代表任何脱氧核苷酸碱基)，N20是与sgRNA的5’序列相同的20个碱基，NGG是PAM区(protospacer-adjacent motif)。Cas9核酸内切酶会在PAM附近的区域切割DNA双链，造成DNA双链断裂。这种可以人为修饰的导向RNA和基因组中PAM的高发率使得Cas9-sgRNA几乎可以打靶所有的基因元件来实现基因组编辑。
现阶段，普遍使用的基因编辑技术是将Cas9表达盒与sgRNA表达盒放在一个载体上打靶特定位点，这种方法使更换sgRNA上的引导序列变得复杂，需要通过II型酶酶切和引物退火的方式更换载体上sgRNA中20bp引导序列，构建出一个新的打靶载体，该操作过程繁琐，限制了CRISPR/Cas9系统的普及与应用。
现有研究中，已经有学者直接化学合成crRNA:tracrRNA，通过将其与Cas9共显微注射到小鼠受精卵中，成功得到了带有功能性的表达盒的基因敲入小鼠。但是化学合成全长crRNA:tracrRNA难度高并且耗资较高，不是适合广泛推广使用。
针对上述问题，亟需开发一种简便、高效、成本低且适用于高等生物的基因编辑工具。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种涉及T7RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法，所述方法将T7启动子-sgRNA片段、Cas9表达质粒和T7RNA聚合酶表达质粒共转入细胞，T7RNA聚合酶可以催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点出进行切割。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，所述方法基于T7RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子-sgRNA，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7RNA聚合酶催化T7启 动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处进行切割，完成基因编辑。
进一步地，所述构建T7启动子-sgRNA具体为：选取上游引物与下游引物，以Cas9-sgRNA共表达载体为模板进行PCR反应扩增，得到T7启动子-sgRNA的PCR产物。
进一步地，所述上游引物包括T7启动子序列、20bp sgRNA引导序列以及20bpsgRNA scaffold序列；所述下游引物为一段与sgRNA scaffold序列3’-5’方向匹配的序列。
进一步地，构建所述T7RNA聚合酶表达质粒具体为：
提取细菌BL21菌株的基因组，设计用于扩增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7RNApol-F和下游引物T7RNA pol-R，通过PCR反应得到T7RNA聚合酶PCR产物；
在所述上游引物T7RNA pol-F中引入BamHI酶切位点，在所述下游引物T7RNA pol-R中引入EcoRI酶切位点；
利用引入的BamHI和EcoRI酶切位点，将T7RNA聚合酶基因片段克隆进pcDNA3.1(+)载体中，得到T7RNA聚合酶表达质粒。
进一步地，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入HEK293T细胞具体为：利用转染试剂将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒、T7RNA聚合酶表达质粒以及报告载体共转染细胞，红色荧光数代表转染效率，绿色荧光数代表系统的工作效率，通过观察荧光数来检测系统的工作效率。
本发明的有益技术效果：
(1)本发明利用T7RNA聚合酶专一性识别T7启动子的原理，利用T7启动子启动下游sgRNA的转录，只需合成带有T7启动子序列的sgRNA序列，即可利用PCR反应，将T7-sgRNA以PCR产物的形式转染进入细胞，从而引导Cas9成功打靶基因组位点，发挥CRISPR/Cas9系统的基因编辑功能的同时提供一种更换sgRNA结构中20bp引导序列的简单方法。
(2)本发明将T7RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别的原理与CRISPR/Cas9系统的靶向切割功能结合起来，利用T7启动子表达sgRNA,简化了CRISPR/Cas9系统的设计步骤，使得能够快速简便使用CRISPR/Cas9这一基因编辑工具研究感兴趣的基因位点。
(3)本发明将Cas9和T7RNA聚合酶由两个载体分别表达，T7RNA聚合酶能特异性识别并催化T7启动子启动，通过PCR反应得到的大量的“T7启动子-sgRNA”产物,T7启动子启动下游sgRNA转录，成功转录的sgRNA将引导Cas9到靶位点处进行切割。
(4)与现有技术相比，本发明所述方法构建方便，适用于高等动物等。
附图说明
图1为构建T7启动子-sgRNA过程中所用上游引物的示意图；
图2为Cas9表达载体；
图3为T7RNA聚合酶表达载体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
实施例1
一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，所述方法基于T7RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子-sgRNA，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点出进行切割，完成基因编辑。
T7RNA聚合酶是一种RNA聚合酶，专门催化5’-3’方向的RNA的形成过程；T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，只转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的DNA片段或DNA复制品。
T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流启动子，启动子功能强大且专一性高，是原核表达的首选启动子。
所述方法具体为：
(1)构建T7启动子-sgRNA：选取上游引物与下游引物，以Cas9-sgRNA共表达载体为模板进行PCR反应扩增，得到T7启动子 -sgRNA(即T7promoter-sgRNA)的PCR产物；
所述Cas9-sgRNA共表达载体为现有技术中常用的Cas9-sgRNA共表达载体(px330)；
所述上游引物包括T7启动子序列、20bp sgRNA引导序列以及20bp sgRNAscaffold序列；在本实施例中，所述上游引物为合成的靶向CCR5a位点的上游引物T7-sgRNA(CCR5a)-F，该引物含有T7启动子序列、20bp靶向CCR5a位点的sgRNA引导序列以及20bpsgRNA scaffold序列(如图1所示)；
所述下游引物(sgRNA-R)为一段与sgRNA scaffold序列3’-5’方向匹配的序列。
(2)T7RNA聚合酶表达质粒的合成：
提取细菌BL21菌株的基因组，设计用于扩增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7RNApol-F和下游引物T7RNA pol-R，通过PCR反应得到T7RNA聚合酶PCR产物；
在所述上游引物T7RNA pol-F中引入BamHI酶切位点，在所述下游引物T7RNA pol-R中引入EcoRI酶切位点；
所述上游引物T7RNApol-F为：T7RNApol-BamHI-F:GCTGGATCCATGAACACGATTAACATCGCTAAG；
所述下游引物T7RNA pol-R为：T7RNA pol-EcoRI-R:GACGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG；
利用引入的BamHI和EcoRI酶切位点，将T7RNA聚合酶基因片段克隆进pcDNA3.1(+)载体中，得到T7RNA聚合酶表达质粒，命 名为pcDNA3.1-CMV-T7RNA pol(如图2所示)；
(3)将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞具体为：
1)利用厦门太阳马公司的梭华so-fast转染试剂，将T7启动子-sgRNA的PCR产物、表达Cas9的载体pll3.7-CMV-hSpCas9(如图3所示)、表达T7RNA聚合酶的载体(pcDNA3.1-CMV-T7RNA pol)以及报告载体Re.SSA(EF1α).CCR5a共转染人胚胎肾细胞HEK293T细胞，红色荧光数代表转染效率(单位面积内红色荧光数越多代表转染效率越高)，绿色荧光数代表系统的工作效率(单位面积内绿色荧光越多代表系统工作效率越高)，通过观察荧光来检测系统的工作效率；
2)利用T7启动子启动sgRNA的转录，对于sgRNA的转染使用浓度做了梯度试验，并选择工作效率最高的浓度进行后续的实验；
3)基因组水平的检测：利用厦门太阳马公司的梭华so-fast转染试剂，将T7-sgRNA的PCR产物、表达Cas9的载体(pll3.7-CMV-hSpCas9)、表达T7RNA聚合酶的载体(pcDNA3.1-CMV-T7RNA pol)以及可以通过puromycin筛选并富集基因编辑过的阳性细胞的报告载体pB-CMV-DsRed-CAG-CCR5a.200bp repeat.Puro-T2A-GFP共转染HEK293T细胞。
4)转染48h后向培养基(DEME)中加入终浓度为0.3μg/ml的puromycin并每天更换新鲜的培养基(DMEM)以去除死掉的细胞，连续 筛选五天后撤掉puromycin，等待细胞长成细胞单克隆后挑取细胞单克隆入48孔细胞培养板继续培养；
5)待48孔细胞培养板中的细胞单克隆长大后提取单克隆基因组，利用实验室已有的CCR5a位点的上下游检测引物CCR5a-F、CCR5a-R，以细胞单克隆基因组为模板，扩增细胞单克隆基因组的CCR5a位点基因片段；
6)PCR产物利用1％的琼脂糖胶检测产物的特异性，切下特定大小的条带并利用omega公司的DNA纯化试剂盒进行DNA回收，回收产物测序公司进行测序。
测序结果显示：80％的样品中CCR5a位点PAM附近都有碱基的插入和缺失(Indel)，该结果证明本发明可以成功地实现特定位点的基因编辑。

Claims (3)

1.一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子-sgRNA，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处进行切割，完成基因编辑；
其中，所述T7启动子-sgRNA的构建方法为：选取上游引物与下游引物，以Cas9-sgRNA共表达载体为模板进行PCR反应扩增，得到T7启动子-sgRNA的PCR产物；
所述上游引物包括T7启动子序列、20bp sgRNA引导序列以及20bp sgRNA scaffold序列；所述下游引物为一段与sgRNA scaffold序列3’-5’方向匹配的序列。
2.根据权利要求1所述一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，构建所述T7 RNA聚合酶表达质粒具体为：
提取细菌BL21菌株的基因组，设计用于扩增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7 RNA pol-F和下游引物T7 RNA pol-R，通过PCR反应得到T7RNA聚合酶PCR产物；
所述上游引物T7 RNA pol-F的序列为：GCTGGATCCATGAACACGATTAACATCGCTAAG；
所述下游引物T7 RNA pol-R的序列为：GACGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG；
在所述上游引物T7 RNA pol-F中引入BamHI酶切位点，在所述下游引物T7 RNA pol-R中引入EcoRI酶切位点；
利用引入的BamHI和EcoRI酶切位点，将T7 RNA聚合酶基因片段克隆进pcDNA3.1(+)载体中，得到T7 RNA聚合酶表达质粒。
3.根据权利要求1所述一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞具体为：利用转染试剂将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒、T7 RNA聚合酶表达质粒以及报告载体共转染细胞，红色荧光数代表转染效率，绿色荧光数代表系统的工作效率，通过观察荧光数来检测系统的工作效率。
CN201610261461.3A 2016-04-25 2016-04-25 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法 Expired - Fee Related CN105861552B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610261461.3A CN105861552B (zh) 2016-04-25 2016-04-25 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610261461.3A CN105861552B (zh) 2016-04-25 2016-04-25 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105861552A CN105861552A (zh) 2016-08-17
CN105861552B true CN105861552B (zh) 2019-10-11

Family

ID=56628314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610261461.3A Expired - Fee Related CN105861552B (zh) 2016-04-25 2016-04-25 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105861552B (zh)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US20190225955A1 (en) 2015-10-23 2019-07-25 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
KR102547316B1 (ko) 2016-08-03 2023-06-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
EP3516056A1 (en) * 2016-09-23 2019-07-31 DSM IP Assets B.V. A guide-rna expression system for a host cell
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
CN106755049B (zh) * 2016-11-14 2020-04-21 西北农林科技大学 基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN108330138B (zh) * 2018-03-29 2018-09-25 上海欣百诺生物科技有限公司 一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒
US20210147915A1 (en) * 2018-06-26 2021-05-20 The Broad Institute, Inc. Crispr/cas and transposase based amplification compositions, systems and methods
CN110835635B (zh) * 2018-08-16 2024-01-09 深圳华大生命科学研究院 不同启动子启动多个串联sgRNA表达的质粒构建方法
CN108998483B (zh) * 2018-08-17 2021-04-30 武汉核圣生物技术有限公司 利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法
CN109266685B (zh) * 2018-09-20 2022-08-19 赵永祥 快速基因编辑构建灵长类动物疾病模型的方法
CN109853046A (zh) * 2018-11-13 2019-06-07 云南中烟工业有限责任公司 一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法
CA3130488A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 David R. Liu Methods and compositions for editing nucleotide sequences
GB2614813A (en) 2020-05-08 2023-07-19 Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN113046379B (zh) * 2021-02-26 2023-03-31 通用生物(安徽)股份有限公司 基于CRISPRCas9连续基因编辑方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104109687A (zh) * 2014-07-14 2014-10-22 四川大学 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104109687A (zh) * 2014-07-14 2014-10-22 四川大学 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRISPR/Cas9 Nuclease-Mediated Gene Knock-In in Bovine-Induced Pluripotent Cells;Young Tae Heo,et al;《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》;20141231;1-11页 *
T7 Polymerase Expression of Guide RNAs in vivo Allows Exportable CRISPR-Cas9 Editing in Multiple Yeast Hosts;Nicholas J. Morse,et al;《ACS Synth. Biol》;20180322;1075-1084页 *
T7 RNA聚合酶表达系统的真核化及其偶联表达系统的建立;郑海学等;《生物工程学报》;20070930;第23卷(第5期);947-952页 *
基于细菌T7 RNA聚合酶的酵母CRISPR-Cas9基因编码系统的开发;Peter Girigis Tawfek Kalds;《西北农林科技大学》;20181231;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105861552A (zh) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861552B (zh) 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法
CN104805099B (zh) 一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体
CN105518135B (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
US10883095B1 (en) Mad nucleases
CN105821075A (zh) 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法
CN111201329A (zh) 具有减少的扩增偏倚的高通量单细胞测序
US20150247191A1 (en) Accurate genome sequencing of single cells by single-stranded amplification and sequencing
CN108699101B (zh) 用于基因组dna片段的靶向纯化的制备型电泳方法
US11306298B1 (en) Mad nucleases
KR20230021657A (ko) Ruvc 도메인을 포함하는 효소
JP2022543375A (ja) 遺伝子変異分析
CN1399684A (zh) 使用转座和重组以操作和测序核酸分子的方法
Tüzmen et al. Techniques for nucleic acid engineering: The foundation of gene manipulation
WO2017215517A1 (zh) 测序文库构建中5'和3'接头连接副产物的去除方法
CN109207559B (zh) 一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法
KR102648886B1 (ko) 세포의 유전체에서 표적 핵산을 변형시키는 방법
CN110499334A (zh) CRISPR/SlugCas9基因编辑系统及其应用
CN114391043A (zh) 哺乳动物dna的甲基化检测及分析
CN113897416A (zh) 一种CRISPR/Cas12f的检测体系及其应用
Dhokane et al. Genome editing in Chlamydomonas reinhardtii using Cas9-gRNA ribonucleoprotein complex: A step-by-step guide
JP3845697B2 (ja) 放射線抵抗性細菌／大腸菌シャトルベクター
CN110551763B (zh) CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用
Bost et al. Application of the endogenous CRISPR-Cas type ID system for genetic engineering in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius
CN110863004A (zh) 酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用
KR102421129B1 (ko) 신규 프로토스페이서 인접 모티프 서열 및 이를 이용한 세포의 유전체에서 표적 핵산을 변형시키는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20191011

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee