CN113046379B - 基于CRISPRCas9连续基因编辑方法 - Google Patents
基于CRISPRCas9连续基因编辑方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，首先将CRISPRCas9质粒pRedCas9‑N20转入目的菌株，再将体外扩增的带有PAM以及抗性marker序列的donor片段导入大肠杆菌，配合CRISPRCas9质粒基于Red同源重组将带有PAM序列的donor整合入基因组，再通过配合CRISPRCas9对PAM序列进行切割，再进行同源重组DSB修复，将标记maker消除，以及基因组无痕编辑，如果还需继续编辑，只需重新设计线性片段，无需再设计PAM序列，同样用于编辑使用的质粒可大量准备，用于多个菌株编辑，且本发明编辑效率高，单基因编辑时间短，编辑出的PAM序列固定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPRCas9连续基因编辑方法。
背景技术
CRISPRCAS9技术是目前运用广泛的进行基因编辑的技术手段，相比之前的编辑手段，高效，靶向性精确，易操作，缩短了实验周期，减少了实验成本，将Red同源重组、Cas9蛋白、sgRNA整合于一个质粒，减少编辑所需质粒数；标记基因marker，插入基因insection，Cas9蛋白切割位点整合于一个体外扩增的供体DNA片段中，而非传统的将Cas9蛋白识别位点设计与基因组中，并且切割基因组；设计的sgRNA识别的PAM序列为细菌基因组中不存在且稳定不会脱靶的PAM序列，可作为今后基因编辑细菌基因组使用的固定编辑PAM序列，无需像传统每编辑一次即需要设计和预测多个PAM序列，简便基因编辑操作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于CRISPRCas9连续基因编辑方法。
本发明解决的技术问题：
现有基因编辑方法为两个质粒与线性片段进行编辑，该方法的转化次数为两次，单基因编辑时间较长，且对于编辑不同基因，需要设计多个PAM验证其稳定性。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：将构建好的质粒pRedCas9-N20转化进入目的菌株中，在LB、Kan、质量浓度1％的葡萄糖混合板，温度为30-35℃的条件下，进行培养；
步骤S2：取步骤S1培养的单克隆，在LB单管中，温度为30-35℃的条件下，进行过夜培养；
步骤S3：从步骤S2的单管中取出1mL种子液加入到150mL/500mLLB培养基锥形瓶中，添加阿拉伯糖诱导剂和相应Kan抗性，进行培养后，测OD600值；
步骤S4：取出三角瓶，迅速将培养菌液的三角瓶放入事先准备好的冰盒中，冰浴30min，并摇动三角瓶；
步骤S5：将冷却后的菌液加入预冷过的50mLEP管中，将50mLEP管放在天平上配平后，放入冷冻离心机上，进行离心后，从离心机中取出50mLEP管，放入冰盒中，在超净台上取出，弃掉上清中的残余培养基；
步骤S6：待残液弃净后，在超净台中打开50mLEP管的盖子，使用DDH2O悬浮沉淀，盖上50mLEP管的盖子，放入离心机离心，进行离心，再使用10％甘油重复洗两次，清洗完毕后，打开50mLEP管的盖子，弃去上清，再进行倒置，以保证残液完全弃完；
步骤S7：按照每份100μL液体在超净台中向50mLEP管中加入10％甘油，摇动50mLEP管，将沉淀的菌体悬浮，然后事先准备干净的1.5mL已经灭菌处理的预冷EP管，按照每份100μL分装后写上相应感受态的标记以及制作感受态的时间后，丢入液氮中速冻后，在温度为-80℃的条件下，进行保藏备用；
步骤S8：将带有抗性标记的donor片段，加到感受态细胞内，置于冰上备用，制得感受态混合液；
步骤S9：打开电转仪，将电转细菌调至Ec2，将100μL感受态混合液加入电转杯中，进行电击后，向电击杯中加入SOC培养基500μL，混匀后，全部吸到1.5mL的EP管中插入冰上备用；
步骤S10：将步骤S9得到EP管放入摇床中，进行孵育后，进行离心并涂Kan+cm抗性平板进行培养后，编辑位点PCR菌检验证基因组是否得到成功编辑；
步骤S11：将步骤S10得到成功克隆转移到含Kan的LB中，进行摇菌2h后，加入IPTG和L-阿拉伯糖诱导CRISPRCas9系统的表达，培养6h后，涂布在LB、Kan、L-arabinose琼脂、IPTG混合平板上，在温度为30-35℃的条件下，进行培养；
步骤S12：将步骤S11培养的菌落进行PCR，验证作为标记的marker的cm抗性基因是否移除成功，并涂布在cm抗性平板再次验证cm抗性是否得到去除；
步骤S13：若还需继续编辑，从步骤S2开始至重复步骤S12，进行连续编辑。若无需继续编辑，进行步骤S14；
步骤S14：敲除成功编辑的菌株，在含Kan的LB平板上划线接种，在温度为42℃的条件下，进行孵育24h后，挑取单菌落依次接种在Kan和Cm对应部位；
步骤S15：将作为标记抗性加pRedCas9-N20质粒去除的正确编辑的菌株，进行保存，完成基因编辑。
进一步，步骤S3所述的种子液的加入量为LB培养基质体积的1％，阿拉伯糖诱导剂的终浓度为2g/L。
进一步，步骤S3所述的培养温度为30-35℃，培养时间5-6h，OD600为0.6。
进一步，步骤S5所述的离心温度为4℃，转速为5000r/s，离心时间5min。
进一步，步骤S10所述的孵育温度为30-35℃，孵育时间2h。
进一步，步骤S11所述的IPTG的加入量为0.1mM，L-阿拉伯糖的加入量为2g/L。
本发明的有益效果：首先将CRISPRCas9质粒pRedCas9-N20转入目的菌株，再将体外扩增的带有PAM以及抗性marker序列的donor片段导入大肠杆菌，配合CRISPRCas9质粒基于Red同源重组将带有PAM序列的donor整合入基因组，再通过配合CRISPRCas9对PAM序列进行切割，再进行同源重组DSB修复，将标记maker消除，以及基因组无痕编辑，如果还需继续编辑，只需重新设计线性片段，无需再设计PAM序列，同样用于编辑使用的质粒可大量准备，用于多个菌株编辑，且本发明通过一个质粒与线性片段进行编辑，编辑效率高，单基因编辑时间短，编辑出的PAM序列固定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中基因编辑流程图；
图2为本发明中细菌编辑设计以及体内过程详解图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，如图1和图2所示，具体包括如下步骤：
步骤S1：将构建好的质粒pRedCas9-N20转化进入目的菌株中，在LB、Kan、质量浓度1％的葡萄糖混合板，温度为30℃的条件下，进行培养；
步骤S2：取步骤S1培养的单克隆，在LB单管中，温度为30℃的条件下，进行过夜培养；
步骤S3：从步骤S2的单管中取出1mL种子液加入到150mL/500mLLB培养基锥形瓶中，添加阿拉伯糖诱导剂和相应Kan抗性，在温度为30℃的条件下，进行培养5h，测OD600为0.6；
步骤S4：取出三角瓶，迅速将培养菌液的三角瓶放入事先准备好的冰盒中，冰浴30min，并摇动三角瓶；
步骤S5：将冷却后的菌液加入预冷过的50mLEP管中，将50mLEP管放在天平上配平后，放入冷冻离心机上，在温度为4℃，转速为5000r/s的条件下，进行离心5min，离心后从离心机中取出50mLEP管，放入冰盒中，在超净台上取出，弃掉上清中的残余培养基；
步骤S6：待残液弃净后，在超净台中打开50mLEP管的盖子，使用DDH2O悬浮沉淀，盖上50mLEP管的盖子，放入离心机离心，进行离心，再使用10％甘油重复洗两次，清洗完毕后，打开50mLEP管的盖子，弃去上清，再进行倒置，以保证残液完全弃完；
步骤S7：按照每份100μL液体在超净台中向50mLEP管中加入10％甘油，摇动50mLEP管，将沉淀的菌体悬浮，然后事先准备干净的1.5mL已经灭菌处理的预冷EP管，按照每份100μL分装后写上相应感受态的标记以及制作感受态的时间后，丢入液氮中速冻后，在温度为-80℃的条件下，进行保藏备用；
步骤S8：将带有抗性标记的donor片段，加到感受态细胞内，置于冰上备用，制得感受态混合液；
步骤S9：打开电转仪，将电转细菌调至Ec2，将100μL感受态混合液加入电转杯中，进行电击后，向电击杯中加入SOC培养基500μL，混匀后，全部吸到1.5mL的EP管中插入冰上备用；
步骤S10：将步骤S9得到EP管放入摇床中，在温度为30℃的条件下，进行孵育2h后，进行离心并涂Kan+cm抗性平板进行培养后，编辑位点PCR菌检验证基因组是否得到成功编辑；
步骤S11：将步骤S10得到成功克隆转移到含Kan的LB中，进行摇菌2h后，加入IPTG(0.1mM)和L-阿拉伯糖(2g/L)诱导CRISPRCas9系统的表达，培养6h后，涂布在LB、Kan、L-arabinose琼脂、IPTG混合平板上，在温度为30℃的条件下，进行培养；
步骤S12：将步骤S11培养的菌落进行PCR，验证作为标记的marker的cm抗性基因是否移除成功，并涂布在cm抗性平板再次验证cm抗性是否得到去除；
步骤S13：若还需继续编辑，从步骤S2开始至重复步骤S12，进行连续编辑。若无需继续编辑，进行步骤S14；
步骤S14：敲除成功编辑的菌株，在含Kan的LB平板上划线接种，在温度为42℃的条件下，进行孵育24h后，挑取单菌落依次接种在Kan和Cm对应部位；
步骤S15：将作为标记抗性加pRedCas9-N20质粒去除的正确编辑的菌株，进行保存，完成基因编辑。
实施例2
一种基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：将构建好的质粒pRedCas9-N20转化进入目的菌株中，在LB、Kan、质量浓度1％的葡萄糖混合板，温度为35℃的条件下，进行培养；
步骤S2：取步骤S1培养的单克隆，在LB单管中，温度为35℃的条件下，进行过夜培养；
步骤S3：从步骤S2的单管中取出1mL种子液加入到150mL/500mLLB培养基锥形瓶中，添加阿拉伯糖诱导剂和相应Kan抗性，在温度为35℃的条件下，进行培养6h，测OD600为0.6；
步骤S4：取出三角瓶，迅速将培养菌液的三角瓶放入事先准备好的冰盒中，冰浴30min，并摇动三角瓶；
步骤S5：将冷却后的菌液加入预冷过的50mLEP管中，将50mLEP管放在天平上配平后，放入冷冻离心机上，在温度为4℃，转速为5000r/s的条件下，进行离心5min，离心后从离心机中取出50mLEP管，放入冰盒中，在超净台上取出，弃掉上清中的残余培养基；
步骤S6：待残液弃净后，在超净台中打开50mLEP管的盖子，使用DDH2O悬浮沉淀，盖上50mLEP管的盖子，放入离心机离心，进行离心，再使用10％甘油重复洗两次，清洗完毕后，打开50mLEP管的盖子，弃去上清，再进行倒置，以保证残液完全弃完；
步骤S7：按照每份100μL液体在超净台中向50mLEP管中加入10％甘油，摇动50mLEP管，将沉淀的菌体悬浮，然后事先准备干净的1.5mL已经灭菌处理的预冷EP管，按照每份100μL分装后写上相应感受态的标记以及制作感受态的时间后，丢入液氮中速冻后，在温度为-80℃的条件下，进行保藏备用；
步骤S8：将带有抗性标记的donor片段，加到感受态细胞内，置于冰上备用，制得感受态混合液；
步骤S9：打开电转仪，将电转细菌调至Ec2，将100μL感受态混合液加入电转杯中，进行电击后，向电击杯中加入SOC培养基500μL，混匀后，全部吸到1.5mL的EP管中插入冰上备用；
步骤S10：将步骤S9得到EP管放入摇床中，在温度为30-35℃的条件下，进行孵育2h后，进行离心并涂Kan+cm抗性平板进行培养后，编辑位点PCR菌检验证基因组是否得到成功编辑；
步骤S11：将步骤S10得到成功克隆转移到含Kan的LB中，进行摇菌2h后，加入IPTG(0.1mM)和L-阿拉伯糖(2g/L)诱导CRISPRCas9系统的表达，培养6h后，涂布在LB、Kan、L-arabinose琼脂、IPTG混合平板上，在温度为35℃的条件下，进行培养；
步骤S12：将步骤S11培养的菌落进行PCR，验证作为标记的marker的cm抗性基因是否移除成功，并涂布在cm抗性平板再次验证cm抗性是否得到去除；
步骤S13：若还需继续编辑，从步骤S2开始至重复步骤S12，进行连续编辑。若无需继续编辑，进行步骤S14；
步骤S14：敲除成功编辑的菌株，在含Kan的LB平板上划线接种，在温度为42℃的条件下，进行孵育24h后，挑取单菌落依次接种在Kan和Cm对应部位；
步骤S15：将作为标记抗性加pRedCas9-N20质粒去除的正确编辑的菌株，进行保存，完成基因编辑。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤S1：将构建好的质粒pRedCas9-N20转化进入目的菌株中，在LB、Kan、质量浓度1％的葡萄糖混合板，温度为30-35℃的条件下，进行培养；
步骤S2：取步骤S1培养的单克隆，在LB单管中，温度为30-35℃的条件下，进行过夜培养；
步骤S3：从步骤S2的单管中取出1mL种子液加入到150mL/500mLLB培养基锥形瓶中，添加阿拉伯糖诱导剂和相应Kan抗性，进行培养后，测OD600值；
步骤S4：取出三角瓶，迅速将培养菌液的三角瓶放入事先准备好的冰盒中，冰浴30min，并摇动三角瓶；
步骤S5：将冷却后的菌液加入预冷过的50mLEP管中，将50mLEP管放在天平上配平后，放入冷冻离心机上，进行离心后，从离心机中取出50mLEP管，放入冰盒中，在超净台上取出，弃掉上清中的残余培养基；
步骤S6：待残液弃净后，在超净台中打开50mLEP管的盖子，使用DDH2O悬浮沉淀，盖上50mLEP管的盖子，放入离心机离心，进行离心，再使用10％甘油重复洗两次，清洗完毕后，打开50mLEP管的盖子，弃去上清，再进行倒置，以保证残液完全弃完；
步骤S7：按照每份100μL液体在超净台中向50mLEP管中加入10％甘油，摇动50mLEP管，将沉淀的菌体悬浮，然后事先准备干净的1.5mL已经灭菌处理的预冷EP管，按照每份100μL分装后写上相应感受态的标记以及制作感受态的时间后，丢入液氮中速冻后，在温度为-80℃的条件下，进行保藏备用；
步骤S8：将带有抗性标记和PAM的donor片段，加到感受态细胞内，置于冰上备用，制得感受态混合液；
步骤S9：打开电转仪，将电转细菌调至Ec2，将100μL感受态混合液加入电转杯中，进行电击后，向电击杯中加入SOC培养基500μL，混匀后，全部吸到1.5mL的EP管中插入冰上备用；
步骤S10：将步骤S9得到EP管放入摇床中，进行孵育后，进行离心并涂Kan+cm抗性平板进行培养后，编辑位点PCR菌检验证基因组是否得到成功编辑；
步骤S11：将步骤S10得到成功克隆转移到含Kan的LB中，进行摇菌2h后，加入IPTG和L-阿拉伯糖诱导CRISPRCas9系统的表达，培养6h后，涂布在LB、Kan、L-arabinose琼脂、IPTG混合平板上，在温度为30-35℃的条件下，进行培养；
步骤S12：将步骤S11培养的菌落进行PCR，验证作为标记的marker的cm抗性基因是否移除成功，并涂布在cm抗性平板再次验证cm抗性是否得到去除；
步骤S13：若还需继续编辑，从步骤S2开始至重复步骤S12，进行连续编辑，若无需继续编辑，进行步骤S14；
步骤S14：敲除成功编辑的菌株，在含Kan的LB平板上划线接种，在温度为42℃的条件下，进行孵育24h后，挑取单菌落依次接种在Kan和Cm对应部位；
步骤S15：将作为标记抗性加pRedCas9-N20质粒去除的正确编辑的菌株，进行保存，完成基因编辑；
步骤S11所述的IPTG的加入量为0.1mM，L-阿拉伯糖的加入量为2g/L。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，其特征在于：步骤S3所述的种子液的加入量为LB培养基质体积的1％，阿拉伯糖诱导剂的终浓度为2g/L。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，其特征在于：步骤S3所述的培养温度为30-35℃，培养时间5-6h，OD600为0.6。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，其特征在于：步骤S5所述的离心温度为4℃，转速为5000r/s，离心时间5min。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，其特征在于：步骤S10所述的孵育温度为30-35℃，孵育时间2h。
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| Development of a fast and easy method for Escherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9;Dongdong Zhao et al;《Microb Cell Fact》;20161201;第15卷(第1期);摘要、方法、结果 * |
| 代谢工程大肠杆菌催化中链游离脂肪酸合成ω-羟基脂肪酸的研究;何乔飞;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》;20210115;第35页第4.3节 * |
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| PB01 | Publication | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 239000 No. 69, qifushi West Road, Chuzhou economic and Technological Development Zone, Anhui Province Applicant after: General Biology (Anhui) Co.,Ltd. Address before: 239000 No. 69, qifushi West Road, Chuzhou economic and Technological Development Zone, Anhui Province Applicant before: GENERAL BIOSYSTEMS (ANHUI), Inc. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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