CN111607594B - 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除猪IRF8基因的细胞系及其构建方法 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除猪IRF8基因的细胞系及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9编辑技术的敲除猪IRF8基因的细胞系及其构建方法，该细胞系采用以下步骤制备：(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：根据猪IRF8基因CDS区5’端设计sgRNA向导序列；(2)载体构建：将正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成双链DNA；将双链DNA与线性化的pGK1.1载体连接获得阳性打靶载体；(3)细胞转染：将阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC‑J2获得IRF8基因敲除的IPEC‑J2细胞。建立IRF8基因敲除的小肠上皮细胞系，可为深入揭示腹泻病原体致病机制、抗性基因挖掘与鉴定以及抗腹泻病转基因猪的培育和应用提供更直接有效的研究模型。

Description

一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除猪IRF8基因的细胞系 及其构建方法
技术领域
本发明涉及到一种利用CRISPR-Cas9特异性靶向敲除猪IRF8基因的细胞系及其构建方法。
背景技术
CRISPR-Cas9系统是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的一种获得性免疫系统，能针对噬菌体感染、质粒结合和转化所造成的基因导入而形成特异性的防御机制。本发明的原理和最核心的关键技术是一个Cas9核酸酶利用向导RNA(gRNA)就可以完成识别和切割靶双链DNA。该技术由于突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。
猪小肠上皮细胞(Porcine intestinal epithelial cells,IPEC-J2)是一种来源于空肠上皮细胞的非转化肠细胞系，为猪多种疾病研究提供了一种生物学相关的体外模型系统。
干扰素调节因子8(Interferon-regulatory factor 8,IRF8)作为IRF家族重要成员，参与调控机体先天、后天免疫系统反应，对干扰素和干扰素刺激基因的转录活性具有重要调控作用。目前尚未有猪IRF8基因的敲除载体及IRF8基因敲除的小肠上皮细胞模型。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9靶向敲除猪IRF8基因的sgRNA向导序列。
本发明的另一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9靶向敲除猪IRF8基因的双链DNA。
本发明的又一目的在于提供一种可打靶猪IRF8基因的CRISPR/Cas9敲除载体。
本发明的又一目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9特异性靶向敲除猪IRF8基因的细胞系。
本发明的又一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9靶向敲除猪IRF8基因的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种基于CRISPR/Cas9靶向敲除猪IRF8基因的sgRNA向导序列，该sgRNA向导序列包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3：
sgRNA1：CCGTTCCGGTCGCACATCCTCGG；
sgRNA2：aggATGTGCGACCGGAACGGCGG；
sgRNA3：GGATCCGGAACATGCTCTTCTGG。
一种基于CRISPR/Cas9靶向敲除猪IRF8基因的双链DNA，将上述sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM(NGG)序列，形成正链sgRNA序列(需要注意的是，如果sgRNA5’端的第一个碱基不是G，则添加CACCG)，将sgRNA向导序列反向互补，5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；将正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成双链DNA，该双链DNA包括(1)～(3)组双链DNA：
(1)sgRNA1F：5’-caccGCCGTTCCGGTCGCACATCCT-3’，sgRNA1R：5’-aaacAGGATGTGCGACCGGAACGGC-3’；
(2)sgRNA2F：5’-caccGAGGATGTGCGACCGGAACGG-3’，sgRNA2R：5’-aaacCCGTTCCGGTCGCACATCCTC-3’；
(3)sgRNA3F：5’-caccGGATCCGGAACATGCTCTTC-3’，sgRNA3R：5’-aaacGAAGAGCATGTTCCGGATCC-3’。
一种可打靶猪IRF8基因的CRISPR/Cas9敲除载体，该载体采用以下步骤构建：
(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：根据猪IRF8基因CDS区5’端设计如上所述的sgRNA向导序列，将sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM(NGG)序列，若sgRNA5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将sgRNA向导序列反向互补，5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
(2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如上所述的三组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体即为可打靶猪IRF8基因的CRISPR/Cas9敲除载体。
一种利用CRISPR/Cas9特异性靶向敲除猪IRF8基因的细胞系，该细胞系为将如上所述的三种阳性打靶载体混合电转入IPEC-J2细胞并进行筛选和验证得到的。优选为电转入处于对数生长期的IPEC-J2细胞悬浮液中。
一种基于CRISPR/Cas9靶向敲除猪IRF8基因的方法，该方法包括以下步骤：
(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：根据猪IRF8基因CDS区5’端设计如上所述的sgRNA向导序列，将sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM(NGG)序列，若sgRNA5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将sgRNA向导序列反向互补，5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
(2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如上所述的三组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体即为可打靶猪IRF8基因的CRISPR/Cas9敲除载体；
(3)细胞转染：将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2并进行筛选验证和培养获得IRF8基因敲除的IPEC-J2细胞。
作为一种优选技术方案，上述方法的步骤(2)中得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体的过程为：将连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，摇菌提质粒，根据sgRNA向导序列设计PCR引物，进行PCR筛选验证获得三种阳性打靶载体；所述的PCR引物为将上游引物VSP primer 5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’分别与下游负链Oligo IRF8-1R：AGGATGTGCGACCGGAACGGC，IRF8-2R：CCGTTCCGGTCGCACATCCTC，IRF8-3R：GAAGAGCATGTTCCGGATCC引物组合。
作为一种优选技术方案，上述方法的步骤(3)中所述筛选验证的过程为：
(Ⅰ)将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2，经嘌呤霉素药筛后提取细胞基因组DNA，在敲除靶位点附近设计高特异性的引物，引物序列为：IRF8-seqF：TGAAGCGGCACCTCTGTCCT，IRF8-seqR：AAAGAAACCGGAGTCCTGTG；
(Ⅱ)CruiserTM酶切PCR产物验证所设计的sgRNA可高效敲除IRF8基因；
(Ⅲ)PCR产物测序验证，获得IRF8基因敲除的IPEC-J2细胞。
上述的sgRNA向导序列、双链DNA、敲除载体或细胞系在猪抗病育种中的应用。
上述的方法在猪抗病育种中的应用。
本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC-J2细胞中的IRF8基因序列，建立IRF8基因敲除的IPEC-J2细胞系，可用于IRF8基因在猪抗病育种中的功能验证，揭示IRF8基因在疾病抗性中的作用机制。
本发明利用CRISPR-Cas9特异性靶向敲除猪IRF8基因的技术中，sgRNA向导序列的设计起关键作用，sgRNA设计不好，后面单克隆筛选的细胞即没有敲除效率，因此sgRNA的序列为本发明的重要发明点之一。本发明通过实验从众多的sgRNA可能的序列中筛选出可以高效敲除猪IRF8基因sgRNA向导序列。
本发明相对于现有技术，具有以下优点：
1、首次利用CRISPR/Cas9技术构建IRF8基因敲除的IPEC-J2细胞系，可作为猪疾病研究的理想细胞模型；
2、CRISPR/Cas9基因敲除技术相比于基因沉默、干扰等技术手段更为有效，有助于研究IRF8蛋白的功能；
3、测序结果显示IRF8基因序列缺失，可造成IRF8基因功能缺失，是较为理想的IRF8基因敲除的IPEC-J2细胞模型；
4、CRISPR/Cas9敲除方法简单，设计的sgRNA序列可对靶基因进行高效敲除。
附图说明
图1为菌液PCR凝胶电泳检测图；
图2为菌液PCR产物测序峰图：图2A为sgRNA1对应打靶载体测序峰图；图2B为sgRNA2对应打靶载体测序峰图；图2C为sgRNA3对应打靶载体测序峰图；
图3为敲除载体测序结果；图3A为sgRNA1对应IRF8基因敲除细胞DNA序列与未敲除细胞DNA序列对比结果；图3B为sgRNA2对应IRF8基因敲除细胞DNA序列与未敲除细胞DNA序列对比结果；图3C为sgRNA3对应IRF8基因敲除细胞DNA序列与未敲除细胞DNA序列对比结果；
图4为CruiserTM酶切筛选IRF8基因敲除细胞DNA PCR产物凝胶电泳检测图；
图5为CruiserTM酶切筛选IRF8基因敲除细胞DNA PCR产物测序峰图；
图6为IRF8基因敲除细胞DNA序列与IRF8基因未敲除细胞DNA序列对比分析结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做更进一步的说明。
实施例1
1.靶位点设计及sgRNA序列的合成：
根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取猪IRF8基因(登录号：NM_001252427.2)的转录本CDS序列，根据CDS区5’端进行敲除靶位点设计，应用CRISPRDesign(http://crispr.mit.edu/)设计三条sgRNA向导序列sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，
sgRNA1：CCGTTCCGGTCGCACATCCTCGG；
sgRNA2：aggATGTGCGACCGGAACGGCGG；
sgRNA3：GGATCCGGAACATGCTCTTCTGG。
在三条sgRNA向导序列5’端添加碱基CACC并去除3’端的PAM(NGG)序列，形成正链sgRNA序列(需要注意的是，如果sgRNA序列的5’端的第一个碱基不是G，需要添加CACCG，第一个碱基是G，只需要添加CACC)；把设计的三条sgRNA向导序列反向互补，5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列。三对sgRNA序列为：
IRF8-1F：CACCGCCGTTCCGGTCGCACATCCT
IRF8-1R：AAACAGGATGTGCGACCGGAACGGC
IRF8-2F：CACCGAGGATGTGCGACCGGAACGG
IRF8-2R：AAACCCGTTCCGGTCGCACATCCTC
IRF8-3F：CACCGGATCCGGAACATGCTCTTC
IRF8-3R：AAACGAAGAGCATGTTCCGGATCC。
2.打靶载体的构建：
(1)将合成后的正、负链sgRNA序列退火形成dsDNA，反应体系如下：
将上述体系震荡离心后置于37℃30min，95℃孵育5min，梯度降温5℃/min，室温20min。
(2)利用BbsI酶对pGK1.1载体(购自Genloci，货号GP0132)进行酶切使其线性化，反应体系如下：
37℃孵育4h，对线性化的载体pGK1.1进行纯化回收。
(3)取退火后的dsDNA与线性化的载体pGK1.1进行连接，反应体系如下：
将上述体系震荡离心后16℃孵育30min，获得连接产物。
(4)取10μL连接产物加入Trans 1-T1 Phase Resistant感受态细胞(购自TransGen，货号：CD501-03)中，轻弹管子使感受态和DNA混匀，冰上放置30min；将管子在42℃水浴90s；迅速将管子插入冰中，预冷3min；每个管子加入800μL无抗LB培养基，摇床(200rpm/min)37℃培养1h，使细菌复苏并表达抗性基因；准备含氨苄青霉素(50μg/mL)的固体培养基，提前倒好平板，倒置晾干；加入200μL菌液进行涂板，37℃倒置培养，转化的克隆在12-16h会出现。
根据敲除载体pGK1.1和三条sgRNA序列设计三对PCR引物：
F1：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’
R1：5’-AGGATGTGCGACCGGAACGGC-3’；
F2：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’
R2：5’-CCGTTCCGGTCGCACATCCTC-3’；
F3：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’
R3：5’-GAAGAGCATGTTCCGGATCC-3’；
菌液PCR：取1mL含氨苄的LB培养液，挑取单克隆菌落，摇床7-8h。向PCR管中添加上述上、下游引物各1μL，菌液8μL，Mix 10μL。反应程序：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环，72℃8min。
图1为菌液PCR凝胶电泳检测图，M为100bp DNA Marker，1-6为阳性菌落PCR条带，说明获得了三种阳性打靶载体。
对得到的阳性菌落PCR产物进一步测序验证，如图2所示，阳性打靶载体基因序列与pGK1.1载体和sgRNA序列吻合，具体碱基序列比对结果见图3。对三种阳性打靶载体采用常规方法扩大培养，进行质粒提取，用于后续实验。
3.细胞转染
将处于对数生长期的约2×106个IPEC-J2细胞置于15mL离心管中，1000rpm/4min离心弃上清，用DPBS悬浮细胞，转移至1.5mL离心管中。取3种阳性打靶载体各6μg加入含有悬浮细胞的离心管中制备混合液，将混合液用专用电转枪头转移至电转杯中，待液面凸起，盖上电击杯盖放入电转仪，650V/30ms进行电转，之后将细胞转移至六孔板中进行培养。
4.IRF8基因的敲除
电转48h后，观察荧光情况，以3μg/mL浓度的嘌呤霉素进行药筛，待细胞长满，用有限稀释法稀释细胞至96孔板中进行培养，培养条件为含5％CO2的37℃恒温培养箱，观察单克隆生长情况，半个月后将单克隆细胞转移至48孔中扩大培养，持续扩大培养至24孔板中，细胞长满后分离出部分细胞，使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
5.PCR扩增
根据IRF8基因序列，在敲除靶位点附近设计高特异性的引物，序列为：
IRF8-seqF：TGAAGCGGCACCTCTGTCCT；
IRF8-seqR：AAAGAAACCGGAGTCCTGTG。
PCR扩增反应体系如下：
PCR反应体系为：95℃1.5min，95℃10s，60℃10s，72℃20s，35个循环，72℃5min，95℃3min。
6.IRF8基因敲除细胞的筛选与验证：
(1)CruiserTM酶切筛选IRF8基因敲除细胞
使用识别错配的CruiserTM酶对上述PCR产物进行酶切，体系如下：
45℃20min，向反应体系中加入2μL 6×Stop Buffer，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
图4为CruiserTM酶切IRF8基因敲除细胞结果，扩增产物大约在370bp，扩增片段明显变小的克隆是阳性克隆，图中102#克隆和34#克隆则为sgRNA的阳性克隆。
(2)IRF8基因敲除细胞DNA PCR产物测序验证
对CruiserTM酶切筛选出来的IRF8基因敲除细胞PCR产物进行测序验证，如图5所示，混合转染sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3三种打靶载体的细胞为IRF8基因敲除细胞。对IRF8基因敲除细胞DNA做TA克隆后送测序，与IRF8基因未敲除细胞DNA序列进行比对，发生缺失的细胞DNA序列突变为107bp和86bp(图6)。
图6为TA克隆测序分析IRF8基因敲除序列。其中，第一行为IRF8基因缺失序列1，缺失107bp，第二行为缺失序列2，缺失86bp，第三行为IRF8基因未发生敲除的序列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除猪IRF8基因的细胞系及其构建方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgttccggt cgcacatcct cgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggatgtgcg accggaacgg cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatccggaa catgctcttc tgg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccgccgtt ccggtcgcac atcct 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaacaggatg tgcgaccgga acggc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccgaggat gtgcgaccgg aacgg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacccgttc cggtcgcaca tcctc 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccggatcc ggaacatgct cttc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacgaagag catgttccgg atcc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catatgctta ccgtaacttg aaag 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggatgtgcg accggaacgg c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgttccggt cgcacatcct c 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaagagcatg ttccggatcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgaagcggca cctctgtcct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaagaaaccg gagtcctgtg 20

Claims (4)

1.一种基于CRISPR/Cas9靶向敲除猪IRF8基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）靶位点设计及sgRNA序列的合成：根据猪IRF8基因CDS区5’端设计sgRNA向导序列，将sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM序列，若sgRNA 5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将sgRNA向导序列反向互补，5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
（2）载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成三组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体即为可打靶猪IRF8基因的CRISPR/Cas9敲除载体；
（3）细胞转染：将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2并进行筛选验证和培养获得IRF8基因敲除的IPEC-J2细胞；
所述的sgRNA向导序列由sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3组成：
sgRNA1：CCGTTCCGGTCGCACATCCTCGG；
sgRNA2：aggATGTGCGACCGGAACGGCGG；
sgRNA3：GGATCCGGAACATGCTCTTCTGG；
所述的三组双链DNA由（1）~（3）组双链DNA组成：
（1）sgRNA1F：5’-caccGCCGTTCCGGTCGCACATCCT-3’，sgRNA1R：5’-aaacAGGATGTGCGACCGGAACGGC-3’；
（2）sgRNA2F：5’-caccGAGGATGTGCGACCGGAACGG-3’，sgRNA2R：5’-aaacCCGTTCCGGTCGCACATCCTC-3’；
（3）sgRNA3F：5’-caccGGATCCGGAACATGCTCTTC-3’，sgRNA3R：5’-aaacGAAGAGCATGTTCCGGATCC-3’。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体的过程为：将连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，摇菌提质粒，根据sgRNA向导序列设计PCR引物，进行PCR筛选验证获得三种阳性打靶载体；所述的PCR引物为将上游引物VSP primer 5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’分别与下游负链Oligo IRF8-1R：AGGATGTGCGACCGGAACGGC，IRF8-2R：CCGTTCCGGTCGCACATCCTC，IRF8-3R：GAAGAGCATGTTCCGGATCC引物组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述筛选验证的过程为：
（Ⅰ）将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2，经嘌呤霉素药筛后提取细胞基因组DNA，在敲除靶位点附近设计高特异性的引物，引物序列为：IRF8-seqF：TGAAGCGGCACCTCTGTCCT，IRF8-seqR：AAAGAAACCGGAGTCCTGTG；
（Ⅱ）Cruiser™酶切PCR产物验证所设计的sgRNA可高效敲除IRF8基因；
（Ⅲ）PCR产物测序验证，获得IRF8基因敲除的IPEC-J2细胞。
4.权利要求1所述的方法在猪抗病育种中的应用。
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