CN106755049B

CN106755049B - 基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法

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Publication number: CN106755049B
Application number: CN201611020358.6A
Authority: CN
Inventors: 张智英; 邵斯旻; 徐坤; 韩芙蓉; 沈俊岑; 白义春
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2036-11-14
Also published as: CN106755049A

Abstract

本发明公开了一种基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法，包括由插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列构建的双荧光报告系统表达载体，本发明所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统利用并模拟真核细胞内的不同修复机制对报告系统中的相应的荧光表达盒进行修复，可通过流式细胞仪对双荧光报告系统表达载体两种报告基因的表达进行量化，在载体水平一次性报告检测真核细胞中某一确定基因位点HR、SSA和NHEJ的修复效率。

Description

基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一套基于人工核酸酶介导的快速、高效、可视化细胞修复效率报告系统的构建方法，具体涉及应用基因工程技术在报告载体水平模拟真核细胞内特定基因位点的损伤，对不同修复通路的修复效率进行可视化的粗略定量和流式分析精确定量的方法。

背景技术

基因组编辑技术是针对基因组进行基因修饰和改造的一种生物工程技术，该技术是人们认识、鉴定基因功能的“金钥匙”。早期的转基因技术主要是利用随机插入的方式将外源基因整合到基因组中，比较常用且高效的手段是转座子系统介导的转座效应和逆转录病毒介导的整合效应。但是利用以上两种效应介导的基因敲入一般具有一定的随机性、多拷贝性和细胞毒性，有着潜在的安全问题，因此在基因治疗和转基因育种等领域的研究应用中受到了很大的限制。基因组靶向编辑技术则可以针对基因组某一特定位点进行靶向编辑和修饰操作，避免了随机性和多拷贝性，降低了细胞毒性。传统的基因组靶向编辑技术通过打靶载体，利用细胞内自发的同源重组(Homologous recombination,HR)效应实现目的基因的定点插入。打靶载体需要含有两段很长的同源臂(基因组中靶基因的序列)、筛选标记基因以及需要引入的外源基因序列。在基因组DNA复制过程中，打靶载体的同源臂在自发同源重组的机制下能整合至基因组相应位点，同时将外源基因插入靶基因位点。最后通过筛选标记基因筛选获得目的基因插入的阳性细胞克隆。但是，对于高等动物而言，这种自发重组的效率非常低(10^-6～10^-7左右)，且单纯地延长打靶载体中同源臂序列的长度并不能有效的提高其重组效率。因此，这种依靠自发重组所介导的基因组靶向编辑技术由于效率低、经费时间投入大和实验技术要求高等缺点，已经难以满足应用的需求；特异性和高效性一度成为该技术中的两个重点和难点。

人工核酸内切酶(Engineered endonuclease,EEN)的出现，为基因组靶向编辑技术带了新的革命。新型的基因组靶向编辑技术主要是通过人工核酸内切酶特异性地在基因组靶序列处引入双链断裂(Double-stranded breaks,DSBs)，利用含有同源臂的供体DNA介导同源重组修复机制，进而实现基因的插入、删除和点编辑。人工核酸内切酶可以根据特异性靶序列DNA进行专门的改造和定制，大大提高了基因组靶向编辑的特异性；同时，在基因组DNA中引入双链断裂后，基因组靶向编辑的效率也得到了飞跃性的提高。目前，应用于基因组靶向编辑技术中的人工核酸内切酶主要包括3种：锌指核酸酶技术(Zinc fingernucleases,ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9核酸酶技术(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas))。

自然情况下细胞基因组中发生DSBs后主要通过以下3种机制进行修复：(1)非同源末端连接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)是细胞中DSBs的主要修复方式，断裂DNA分子两端可以直接通过非特异性的末端连接实现修复，同时可能会引入少量核苷酸碱基的插入或缺失(Insertions and deletions,Indels)，进而可能导致移码并引起基因破坏甚至是基因敲除；(2)单链退火(Single Strand Annealing,SSA)，这种机制是同源重组的一种特殊情况，即在DSBs两边有一定的正向重复序列(Direct Repeat sequences,DRs)的情况下，断裂DNA分子直接通过SSA机制修复，在删除一个DR及中间包含的序列的情况下实现基因修复；(3)同源重组(HR)，即断裂DNA分子在有与之同源的序列存在的情况下，可以通过同源重组机制来修复，所谓的同源的序列可以是姐妹染色单体、同源染色体或者是包含同源臂的外源供体DNA，在哺乳动物细胞中发生DSBs的同源重组效率要比没有DSBs时的自发重组提高1000～50000倍。

综上所述，利用基因编辑技术可进行动物育种乃至将来应用于人类的基因治疗，简单来说就是在真核生物的基因组中的某位点引入DSB并提供相应的供体模版，让其按照人们的意愿进行精确编辑，从而实现快速动物育种或者基因治疗的目的。

可以看出HR方式的高效修复直接影响目的位点的精确编辑，而NHEJ这种优势修复方式也会伴随HR修复方式同时存在且与HR互为竞争。提高HR的效率、降低NHEJ的效率是基因编辑研究工作的重中之重；同时，进行基因编辑相关工作的科研人员也迫切的希望知道当人为的针对真核细胞基因组中某一特定的靶位点引入人工核酸酶及相应供体后，该位点发生NHEJ和HR的效率分别是多少？当断裂位点的两段含有合适的重复片段序列时，同时发生SSA的效率又究竟是多少？为了快速的对真核细胞基因组中断裂位点处发生的不同种修复方式的效率进行量化，需要构建报告细胞系或报告载体系统对修复效率进行量化。报告细胞系是将报告基因直接整合到细胞的基因组中，当核酸酶作用于靶序列时，可以通过报告基因的表达来反映修复效率的高低。报告细胞系的优点是靶序列整合到基因组中，和靶细胞基因组的情况类似，效率接近且稳定。但是由于哺乳动物基因组不易操作，将含靶序列的报告基因整合入基因组难度大，费时费力，并且一种细胞系只能检测一个或几个核酸酶的活性，有一定的局限性。而报告载体系统是游离于细胞染色体之外，将核酸酶表达系统、供体模版和报告载体系统共转染至细胞中，通过载体系统中的报告基因的表达来间接的反映真核细胞中各通路的修复效率。报告载体的靶序列虽然不能完全等同于基因组中靶序列的环境，但也有其自身明显的优势，例如构建方便快捷，靶序列易于改变，不需要整合入基因组，并且通过荧光标记或者药物筛选标记对阳性细胞进行分选实现对目的细胞的收集。因此，报告载体相对于报告细胞系有更为广泛的应用价值。

现在还没有发现将同种报告基因利用其不同修复方式整合到一个载体系统中同时反映真核细胞中特定位点各修复通路效率的工具，已知的报告载体系统大都只能独立间接反映真核细胞中某一种通路的修复效率。

发明内容

针对上述问题，基于非整合型报告载体系统的优势及科研需求，本发明提供了一种快速、高效的基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，包括CRISPR/Cas9表达载体以及双荧光报告系统表达载体；所述CRISPR/Cas9表达载体包括用于表达对目的基因靶位点具有剪切活性的Cas9核酸酶的序列；双荧光报告系统表达载体包括顺次设置的以下元件：插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是仅作为修复模板的自转录起始点截短的报告基因I阅读框片段。

所述CRISPR/Cas9表达载体包括顺次设置的抗性筛选基因表达盒、目的基因靶位点sgRNA序列表达盒和hSpCas9基因表达盒。

所述报告基因I选自荧光蛋白报告基因GFP，所述报告基因II选自荧光蛋白报告基因DsRed。

所述报告基因I表达盒包括顺次设置的EF1a启动子、位于目的基因靶位点插入位置之前的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-L、目标基因靶位点、位于目的基因靶位点插入位置之后的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-R以及polyA；所述报告基因II表达盒包括顺次设置的CMV启动子、荧光蛋白报告基因DsRed阅读框以及β-globinpolyA。

所述双荧光报告系统表达载体还包括抗性筛选基因表达盒。

所述报告基因I的截短序列为缺少起始密码子的荧光蛋白报告基因GFP阅读框。

所述细胞为真核细胞，例如哺乳动物细胞。

基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统的建立方法，包括以下步骤：

1)确定目的基因靶位点，根据目的基因靶位点构建CRISPR/Cas9表达载体；

2)将报告基因I的截短序列、报告基因II表达盒以及插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒顺次插入同一骨架载体，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是仅作为修复模板的自转录起始点截短的报告基因I阅读框片段。

所述步骤1)具体包括以下步骤：

1.1)根据目的基因靶位点通过设计的退火引物拟合得到目的基因靶位点序列片段；

1.2)将所述靶位点序列片段插入pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体的BbsI多克隆位点，获得中间载体pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9；

1.3)从中间载体pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9中克隆剪切目的基因靶位点所需的sgRNA和Cas9表达盒片段，将该片段插入pLL3.7载体的多克隆位点，得到基于pLL3.7骨架的CRISPR/Cas9表达载体。

所述步骤2)具体包括以下步骤：

2.1)将不含PolyA尾的荧光蛋白报告基因DsRed表达盒插入pXL-BAC II载体的多克隆位点，获得中间载体pXL-DsRed box without polyA，将β-globin polyA片段插入中间载体pXL-DsRed box without polyA，获得包含完整表达盒的荧光蛋白报告基因DsRed表达载体pXL-DsRed；

2.2)构建阅读框中插入有目的基因靶位点的荧光蛋白报告基因GFP表达盒片段，将该片段插入pXL-DsRed中的多克隆位点，获得中间载体pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed；

2.3)将荧光蛋白报告基因GFP的截短序列插入到pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed中的多克隆位点，获得双荧光报告系统表达载体。

本发明的有益效果体现在：

本发明所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统利用并模拟真核细胞内的不同修复机制对报告系统中的相应的荧光报告基因表达盒进行修复，可通过流式细胞仪对双荧光报告系统表达载体两种报告基因的表达进行量化(例如GFP荧光蛋白和DsRed荧光蛋白的发光数量)，在载体水平一次性报告检测真核细胞中某一确定基因位点HR、SSA和NHEJ的修复效率，该系统还具有应用的延伸性，例如在工作需要的基础上，可以应用带有分选功能的流式细胞仪对阳性细胞进行分选从而获得阳性细胞。

附图说明

图1为CRISPR/Cas9表达载体pLL3.7-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9质粒图谱；

图2为ScRad52表达载体pLL3.7-ScRad52质粒图谱；

图3为双荧光报告系统表达载体pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP的元件序列结构示意图；

图4为双荧光报告系统表达载体pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP质粒图谱；

图5为可视化报告系统在HEK 293T细胞中的修复、工作示意图；

图6为VEGFA位点实验组及对照组可视化报告系统的检测荧光效果图；

图7为可视化报告系统的流式结果图；

图8为真核细胞中报告载体水平VEGFA位点修复效率结果图；

图9为筛选出的真核细胞基因组中VEGFA位点的测序结果图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合利用酵母源的Rad52蛋白(简称ScRad52)和CRISPR-Cas9编辑人的VEGFA基因，检测ScRad52提高CRISPR-Cas9打靶后的HR的效率的实施例，对本发明作进一步的详细说明。

1.靶位点选择

基于CRISPR/Cas9系统打靶位点的特点，在基因组中寻找含有PAM(NGG/NGGNG)的靶位点。再经过CRISPR Dsign网站(http://crispr.mit.edu/)的筛选，选择出以下位点作为VEGFA靶位点(VEGFA target)：CTCGGCCACCACAGGGAAGC(参见SEQ.ID.NO.1，左起为5`端)

2.CRISPR/Cas9表达载体(pLL3.7-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9)的构建

CRISPR/Cas9表达载体为本实验室改造构建，即将可以表达步骤1中选择的VEGFA靶位点的sgRNA的序列和酿脓链球菌Cas9序列(SpCas9)串联插入到骨架载体pLL3.7(Addgene，Plasmid#11795)中，如图1所示。从图1可以看出，构建的CRISPR/Cas9表达载体包括的元件依次为AmpR启动子、Ampicillin抗性基因、U6启动子、VEGFA靶位点序列(靶位点只有20个bp，VEGFA靶位点加后面的gRNA序列表达后才是VEGFA.sgRNA序列)、CBh启动子、hSpCas9基因序列和BGH polyA。载体的具体构建方法如下：

2.1根据步骤1确定的VEGFA靶位点设计拟合VEGFA靶位点片段所需引物，分别命名为VEGFA target.F和VEGFA target.R，引物设计如表1：

表1：VEGFA靶位点片段引物设计表

2.2PCR获得所需的VEGFA靶位点片段

Annealing反应体系如表2所述，反应条件为：95℃5min，之后降到室温待用。获得两端含有BbsI悬臂的VEGFA靶位点片段

表2：VEGFA靶位点片段Annealing体系(北京全式金生物技术，货号AP111)

2.3中间载体pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9的构建

用BbsI酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体(Addgene,Plasmid#42230)作为骨架，酶切体系见表3，胶回收目的片段(8484bp)。将骨架和步骤2.2获得的VEGFA靶位点片段(Annealing产物)连接(连入骨架的BbsI位点)，连接体系见表4。经过16℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h，提质粒。获得中间载体pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9。

表3：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9酶切体系(New England Biolabs，#R0539S)

表4：pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9连接体系(New England Biolabs，#R0539S)

2.4 pLL3.7-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9的构建

用NotI和PciI酶切pLL3.7载体(Addgene,Plasmid#11795)作为骨架，同时用NotI和PciI酶切2.3获得的中间载体pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9，获得所需的sgRNA表达盒片段和Cas9表达盒片段，命名U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9，酶切体系见表5、表6，胶回收目的片段(片段大小分别为6230bp和5770bp)，将骨架和片段连接(用pLL3.7作为骨架，一是为了和ScRad52表达载体统一，二是pLL3.7骨架应用更广)，连接体系见表7。经过16℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h，提质粒。最终获得pLL3.7-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9。

表5：pLL3.7酶切体系(New England Biolabs，#R3189S和#R0655S)

表6：U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9片段酶切体系(New England Biolabs，#R3189S和#R0655S)

表7：pLL3.7-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9连接体系(New England Biolabs，#M0202S)

3. ScRad52表达载体(pLL3.7-ScRad52)的构建

参考NCBI中公布的ScRad52基因的核苷酸序列(GenBank accession number NC_001145.3)，利用Clone ManagerV7软件进行引物设计，设计可以特异扩增ScRad52基因片段的引物：

AgeI-ScRad52.F:5'-tacACCGGTATGAATGAAATTATGGATATGGATG-3'(SEQ.ID.NO.4)EcoRI-ScRad52.R:5'-ccgGAATTCTCAAGTAGGCTTGCGTGCATGC-3'(SEQ.ID.NO.5)

引物开头的小写字母为保护碱基，大写斜体字母代表酶切位点，下划线部分代表与酵母基因组匹配的序列，以酵母菌株AH109(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，2011年实验室提取-80℃保存)的基因组为模版，PCR扩增获得ScRad52的完整基因序列，插入到骨架载体pLL3.7中，如图2所示，包括两个方向相反的表达盒，一个为ScRad52表达盒，另一个为Ampicillin抗性基因表达盒。载体的具体构建方法如下：

3.1 ScRad52基因序列的获得

以酵母菌株AH109基因组为模版PCR扩增获得ScRad52基因序列，PCR反应体系如表8所述，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每个循环的退火温度降1℃；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；最后72℃延伸10min。

表8：扩增ScRad52基因序列PCR体系(北京全式金生物技术，货号AP111和AP211)

3.2 pLL3.7-ScRad52的构建

用AgeI和EcoRI酶切pLL3.7载体(Addgene,Plasmid#11795)作为骨架，同时用AgeI和EcoRI酶切步骤3.1中获得的ScRad52基因序列，酶切体系见表9、表10，胶回收目的片段(片段大小分别为6916bp和1422bp)。将骨架和片段连接，连接体系见表11。经过16℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h，提质粒。

表9：pLL3.7酶切体系(New England Biolabs，#R3552S和#R3101S)

表10：ScRad52基因序列酶切体系(New England Biolabs，#R3552S和#R3101S)

表11：pLL3.7-ScRad52连接体系(New England Biolabs，#M0202S)

4.双荧光报告系统表达载体pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP的构建

该载体由两个独立的表达盒片段和一段截短的GFP片段组成，表达盒1设计为启动子-插入目的基因靶位点的GFP打断序列(靶位点放入后GFP的阅读框被打断，密码子发生移码突变，翻译的氨基酸错误，GFP蛋白不能正确表达，打断位置在阅读框的内部)-终止子序列，表达盒2转录方向与表达盒1相反，设计为启动子-完整的DsRed阅读框序列-终止子序列。通过不同的限制性内切酶的酶切位点将各个片段连在一起(图3)。

已知的报告载体系统大都只能独立间接反映真核细胞中某一种通路的修复效率。若要需要得到与本发明类似的结果，工作量至少需要增加三倍，工作时间也需要相应的延长。本发明提出的可视化的双荧光报告系统既可以通过观察荧光数量进行粗略、初步定量，又可以通过流式细胞仪进行计数精确定量，还可以通过流式分选获得所需的特定修复方式的细胞作为其延伸应用。另外，由于使用了真核细胞中常见的强启动子，可使其对多种真核模式动物细胞有效，具有应用的广泛性。

构建该载体需要三步。第一步，扩增获得完整的DsRed表达盒，并插入含有多克隆位点的pXL-BAC II骨架载体，获得pXL-DsRed表达载体；第二步，构建含有VEGFA靶位点的被打断的GFP表达盒片段，再将该片段插入pXL-DsRed中，获得pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed；第三步，PCR扩增获得截短的GPF片段(其设计原则是截短的GFP开放阅读框片段5`端要与第二步中被VEGFA target打断的GFP表达盒的打断位置上游的阅读框序列GFP-L含有同源部分，同源部分的范围是150-350bp)，并通过引物引入酶切位点，将片段插入到pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed中，最终获得pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP双荧光报告系统的表达载体(图4)。载体的具体构建和检测方法如下：

4.1 pXL-DsRed表达载体的构建

4.1.1扩增DsRed box without polyA

以pTCCR克隆载体(GenBank,Accession#:AY569779.1)为模版，利用CloneManager V7软件进行引物设计，设计能够特异扩增CMV启动子序列和DsRed开放阅读框序列(即不含polyA尾的DsRed表达盒，DsRed box without polyA)的引物，分别命名为SpeI-BclI-DsRed Box.F和NotI-DsRed Box.R，并分别在相应的位置引入所需的酶切位点。引物设计如表12：

表12：DsRed box without polyA片段引物设计表

其中：引物5’端的下划线标注的大写字母为酶切位点，前面的小写字母为保护碱基。

4.1.2中间载体pXL-DsRed box without polyA

以实验室保存的pTCCR克隆载体(GenBank,Accession#:AY569779.1)为模版PCR获得DsRed box without polyA片段(1361bp)，PCR反应体系如表13，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每个循环的退火温度降1℃；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；最后72℃延伸10min。

表13：DsRed box without polyA片段PCR体系(北京全式金生物技术，货号AP111和AP211)

用NotI和SpeI酶切pXL-BAC II克隆载体(本实验室保存，购自Addgene，该克隆载体已下架，具体信息参考Addgene，Plasmid#26852)作为骨架，同时用NotI和SpeI酶切DsRedbox without polyA片段，酶切体系见表14、表15，胶回收目的片段(片段大小分别为4087bp和1347bp)。将骨架和酶切回收的DsRed box without polyA片段连接，连接体系见表16。经过16℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h，提质粒。

表14：pXL-BAC II酶切体系(New England Biolabs，#R3189S和#R3133S)

表15：DsRed box without polyA片段酶切体系(New England Biolabs，#R3189S和#R3133S)

表16：pXL-DsRed box without polyA连接体系(New England Biolabs，#M0202S)

4.1.3扩增β-globin polyA terminators片段

以质粒pL3-TRE-MCS-polyA-2L(Addgene,Plasmid#11719)为模版，利用CloneManagerV7软件进行引物设计，设计可以特异扩增β-globin polyA terminators片段(以下简称rb_glob_PA_terminator片段)的引物NotI-rb_glob_PA.F和BglII-rb_glob_PA.R(引物设计如表17)，PCR反应体系和条件参考4.1.2，不再赘述。

表17：β-globin polyA terminators片段引物设计表

其中：引物5’端的下划线大写字母为酶切位点，前面的小写字母为保护碱基。

4.1.4 pXL-DsRed表达载体的构建

用NotI和BglII酶切4.1.2构建的中间载体pXL-DsRed box without polyA作为骨架，同时，PCR获得rb_glob_PA_terminator片段(464bp)后，片段用NotI和BglII酶切；酶切体系见表18、表19，胶回收目的片段(片段大小分别为5380bp和450bp)。将骨架和酶切回收的rb_glob_PA_terminator片段连接，连接体系见表20。经过16℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h，提质粒。最终获得pXL-DsRed表达载体。

表18：pXL-DsRed box without polyA酶切体系(New England Biolabs，#R3189S和#R0144S)

表19：rb_glob_PA_terminator片段酶切体系(New England Biolabs，#R3189S和#R0144S)

表20：pXL-DsRed连接体系(New England Biolabs，#M0202S)

4.2 pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed表达载体的构建

4.2.1 PCR扩增获得EF1a.GFP(VEGFA target)-L片段

以质粒pEF-GFP(Addgene,Plasmid#11154)为模版，利用Clone ManagerV7软件进行引物设计，设计可以特异扩增EF1a.GFP(VEGFA target)-L片段(包括EF1a启动子、该启动子后至打断位置间的1-292bp部分GFP阅读框GFP-L、靶位点序列以及打断位置后用于构造重叠区的部分GFP阅读框)的引物HindIII-EF1a-GFPL.F和EF1a-GFPL.R(引物设计如表21-1)，PCR反应体系和条件参考4.1.2，不再赘述。

表21-1：EF1a.GFP(VEGFA target)-L片段引物设计表

其中：引物5’端的下划线字体为酶切位点，前面的小写字母为保护碱基，斜体代表Overlap区(重叠区)。斜体部分内加框的局部序列即靶位点的反向互补序列。

4.2.2 PCR扩增获得GFP(VEGFA target)-R-PolyA片段

与4.2.1相似，以质粒pEF-GFP(Addgene,Plasmid#11154)为模版，利用CloneManagerV7软件进行引物设计，设计可以特异扩增GFP(VEGFA target)-R-PolyA片段(包括靶位点、GFP阅读框的其余293-720bp部分GFP-R以及终止子序列)的引物GFPR-polyA.F和ClaI-GFPR-polyA.R(引物设计如表21-2)，PCR反应体系和条件参考4.1.2，此处不再赘述。

表21-2：GFP(VEGFA target)-R-PolyA片段引物设计表

其中：引物5’端的下划线字体为酶切位点，前面的小写字母为保护碱基，斜体代表Overlap区，斜体部分内加框的局部序列即靶位点。

4.2.3重叠PCR扩增获得GFP(VEGFA target)片段

以4.2.1和4.2.2获得的EF1a.GFP(VEGFA target)-L片段和GFP(VEGFA target)-R-PolyA片段为模版，HindIII-EF1a-GFPL.F(表21-1)和ClaI-GFPR-polyA.R(表21-2)为上下游引物，Overlap PCR扩增获得GFP(VEGFA target)片段(即插入有靶位点的GFP表达盒，片段大小为2528bp)，PCR体系见表22。

表22：GFP(VEGFA target)片段Overlap PCR体系(北京全式金生物技术，货号AP111和AP211)

4.2.4 pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed表达载体的构建

用HindIII和ClaI酶切4.1中构建的表达载体pXL-DsRed作为骨架，同时，将4.2.3获得的GFP(VEGFA target)片段用HindIII和ClaI酶切。酶切体系见表23、表24，胶回收骨架及目的片段(片段大小分别为5825bp和2517bp)。将骨架和片段连接，连接体系见表25。经过16℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h，提质粒。最终获得pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed表达载体。

表23：pXL-DsRed酶切体系(New England Biolabs，#R3104S和#R0197S)

表24：GFP(VEGFA target)片段酶切体系(New England Biolabs，#R3104S和#R0197S)

表25：pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed连接体系(New England Biolabs，#M0202S)

4.3 pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP表达载体的构建

4.3.1 PCR扩增获得截短的GFP片段(即Truncated GFP片段，简称TrGFP片段)以实验室保存的pEGFP-C1Vector(GenBank,Accession#:U55763)为模版，利用Clone ManagerV7软件进行引物设计，设计可以特异扩增TrGFP片段的引物BclI-TrGFP.F和SpeI-TrGFP.R(引物设计如表26)，PCR反应体系和条件参考4.1.2，在此不再赘述。TrGFP片段在本例中具体是GFP阅读框的4bp至720bp部分。

表26：TrGFP片段引物设计表

其中：引物5’端的下划线字体为酶切位点，前面的小写字母为保护碱基，框内字母代表终止密码子。

4.3.2 pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP表达载体的构建

用BclI和SpeI酶切4.2中构建的表达载体pXL-EF1a.GFP(VEGFAtarget)-DsRed作为骨架，同时，将4.3.1获得的TrGFP片段(片段大小为744bp)用BclI和SpeI酶切。酶切体系见表27、表28，胶回收骨架及目的片段(片段大小分别为8334bp和732bp)。将骨架和片段连接，连接体系见表29。经过16℃过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h，提质粒。最终获得pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP表达载体。

表27：pXL-EF1a.GFP(VEGFA target)-DsRed酶切体系(New England Biolabs，#R0160S和#R313 3S)

表28：TrGFP片段酶切体系(New England Biolabs，#R0160S和#R3133S)

表29：pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP连接体系(New England Biolabs，#M0202S)

5 HEK293T细胞中双荧光报告系统的应用

质粒经酶切鉴定、测序正确后，将报告系统表达质粒pXL-EF1a.GFP(VEGFA)-DsRed-TrGFP、CRISPR/Cas9表达质粒pLL3.7-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9共转染HEK293T细胞，检测该套可视化的双荧光报告系统是否可以通过模拟真核细胞中的修复机制后正确的表达红色荧光或者绿色荧光，再通过流式细胞仪读取GFP荧光蛋白和DsRed荧光蛋白的发光数量，一次性检测真核细胞中确定基因位点HR、SSA和NHEJ的修复效率。

5.1载体系统转染HEK293T细胞

HEK 293T细胞系置于含10％胎牛血清、100μg/mL青链霉素的DMEM培养基中，37℃、5％的CO₂培养箱培养。HEK 293T细胞系的转染：以12孔板为例，接种HEK 293T细胞至12孔板中，待细胞密度接近70％时，更换新鲜的DMEM培养基。吸出12孔板中的培养基，每孔加入37℃预热的新鲜培养基1mL，2-4小时后开始转染。取两个1.5mL灭菌EP管，一个加入共计约4.5μg的质粒，然后加入Opti-MEM至总体积50μL；另一个EP管内加入3μL So-Fast转染试剂和Opti-MEM至50μL。轻轻混匀两个EP管内的混合物，然后将含转染试剂的Opti-MEM缓慢加入含质粒的EP管中，边加边轻轻震荡，使其充分混匀。混匀后，将混合物置于室温20min，然后将转染混合体系滴加至12孔板中，轻轻晃动几下，将培养板放回培养箱，12小时后换新鲜培养基。转染所用的体系如表30。

表30：可视化的双荧光报告系统检验工作效率的转染体系(12孔板)

5.2可视化的双荧光报告系统的荧光检测

转染48h后，利用荧光显微镜观察分别观察每个孔的红色荧光和绿色荧光。图5是报告系统进入真核细胞后的工作原理示意图，共有3中可能的工作方式：(1)当报告系统通过NHEJ通路发生修复时，含靶位点的GFP序列被Cas9蛋白切割后直接发生NHEJ修复，GFP蛋白的阅读框无法正确修复(在靶位点处发生了双链断裂，双链断裂会造成碱基丢失或者插入，然后会造成密码子的移码突变，造成GFP不能正确的表达)，GFP蛋白不能正常表达，而DsRed蛋白可以正常表达，即细胞不发绿光只发红光；(2)当报告系统通过SSA通路发生修复时，前面含靶位点的GFP序列和后面截短的GFP片段含有一段同源臂，通过SSA修复后，中间的DsRed蛋白序列被重组降解掉，因此GFP蛋白可以正常表达而DsRed蛋白不可表达，即细胞只发绿光；(3)当报告系统通过HR通路发生修复时，前面含靶位点的GFP序列以后面截短的GFP片段为模版，通过同源重组后前面打断的GFP序列被修复成完整的GFP表达盒正常表达GFP蛋白，后面的DsRed表达盒也不受影响正常表达，细胞既发绿光也发红光。VEGFA位点实验组和对照组的荧光照片如图6所示，图6中Phase表示的是白光下的细胞状态。

5.3可视化报告系统的荧光计数及细胞修复效率的初步计算

转染48h后，取各组细胞过流式细胞仪，统计发红光和发绿光的细胞占细胞总数的百分比，结果如图7和图8所示。由于实验组共转染ScRad52表达载体，ScRad52具有提高HR修复效率的能力，因此实验组HR的修复效率更高，导致的双荧光结果较对照组增多，表明可视化报告系统可以正常工作。

5.4利用可视化报告系统的流式分选及阳性基因组测序

同5.3转染48h后，通过对转染后细胞进行流式筛选，提取基因组后测序(图9，给出了部分测序结果比对图)，发现实验组基因组中的NHEJ效率低于对照组效率(与5.3中的结果类似)，实验组基因组HR效率高于对照组效率(约3倍，与5.3结果中的2.34倍类似)。另外因为基因组本位点中不含SSA修复所需的短同源序列，因此基因组该位点SSA的修复效率理论上为零(与5.3结果中的接近于0的较低SSA效率对应)，确定了三种修复的发生频率与上述5.3的结果具有一致性。

总之，本发明提出的可视化的双荧光报告系统可以方便、快速的检测真核细胞中某个确定VEGFA基因位点HR、SSA和NHEJ的修复效率，同时，如果将本实验所用的VEGFA基因靶序列更换成其它功能基因靶序列，使用的真核细胞更换成其他的模式真核细胞，同样可以方便的获得它类真核细胞中其他确定基因位点发生的各DNA修复效率，因此本发明为真核细胞中细胞修复效率方面相关研究的概念验证提供了一套可靠、高效的工具。

核苷酸序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法

<160> 15

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens (human)

<400> 1

ctcggccacc acagggaagc 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caccgctcgg ccaccacagg gaagc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaacgcttcc ctgtggtggc cgagc 25

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tacaccggta tgaatgaaat tatggatatg gatg 34

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccggaattct caagtaggct tgcgtgcatg c 31

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cggactagtt gatcaagctt tagttattaa tagtaatcaa ttac 44

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atttgcggcc gctacaggaa cag 23

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atttgcggcc gcgatctttt tccctctgcc aaaa 34

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggaagatctt tcataagaga agagggacag c 31

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cccaagcttc gtgaggctcc ggtgccc 27

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttagtcactt agcttccctg tggtggccga gtgcgctcct ggacgtagcc 50

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ctcggccacc acagggaagc taagtgacta accatcttct tcaaggacga cg 52

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

cccatcgatg agaagaggga cagctatgac 30

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ctatgatcag tgagcaaggg cgaggagc 28

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cggactagtt tagagtccgg acttgtacag c 31

Claims

1.基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：包括CRISPR/Cas9表达载体以及双荧光报告系统表达载体；所述CRISPR/Cas9表达载体包括用于表达对目的基因靶位点具有剪切活性的Cas9核酸酶的序列；双荧光报告系统表达载体包括顺次设置的以下元件：插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是仅作为修复模板的自转录起始点截短的报告基因I阅读框片段。

2.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述CRISPR/Cas9表达载体包括顺次设置的抗性筛选基因表达盒、目的基因靶位点sgRNA序列表达盒和hSpCas9基因表达盒。

3.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I选自荧光蛋白报告基因GFP，所述报告基因II选自荧光蛋白报告基因DsRed。

4.根据权利要求1或3所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I表达盒包括顺次设置的EF1a启动子、位于目的基因靶位点插入位置之前的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-L、目标基因靶位点、位于目的基因靶位点插入位置之后的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-R以及polyA；所述报告基因II表达盒包括顺次设置的CMV启动子、荧光蛋白报告基因DsRed阅读框以及β-globin polyA。

5.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述双荧光报告系统表达载体还包括抗性筛选基因表达盒。

6.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I的截短序列为缺少起始密码子的荧光蛋白报告基因GFP阅读框。

7.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述细胞为真核细胞。

8.基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤2)具体包括以下步骤：

2.2)构建阅读框中插入有目的基因靶位点的荧光蛋白报告基因GFP表达盒片段，将该片段插入pXL-DsRed中的多克隆位点，获得中间载体pXL-EF1a.GFP-DsRed；

2.3)将荧光蛋白报告基因GFP的截短序列插入到pXL-EF1a.GFP-DsRed中的多克隆位点，获得双荧光报告系统表达载体。